Disparar meristems apical controlan el crecimiento y la reproducción de la planta. Este método nos ayuda a investigar la morfología y las estructuras internas de los meristemas apicales de brote no sólo en las especies modelo, sino también en diferentes cultivos. Esta técnica es un procedimiento muy eficiente.
Shoot apical meristem se puede visualizar directamente en una alta resolución celular sin ningún paso de fijación de muestras y seccionamiento de tejido que requiere mucho trabajo. Para empezar, cultivar arabidopsis, tomate, y plantas de soja como se detalla en el protocolo de texto. Corta el ápice de la inflorescencia de las plantas de Arabidopsis atornilladas.
Sostenga la parte basal del tallo principal y use fórceps para extraer tantos órganos florales más antiguos como sea posible del tallo principal. Continúe eliminando el resto de las flores en el campo del microscopio estéreo hasta que el meristem apical de disparo se pueda ver desde los oculares. Para ver los meristemas apicales de brote vegetativo de tomate o soja, disecciona los cotiledones, hojas y raíces de la planta.
Sostenga los hipocotilos de la planta bajo el microscopio estéreo, y utilice fórceps para diseccionar aún más las hojas y la primordia de la hoja que cubre los meristemas apicales de brote vegetativo. Pipeta 50 microlitros de solución de yoduro propidium en un plato Petri limpio y vacío. Sumerja todo el ápice diseccionado en tinte durante dos minutos.
Durante el proceso de tinción, sumerja toda la inflorescencia brote apical meristem o brote vegetativo apical meristem en la solución de yoduro de propidium para lograr una tinción uniforme. Enjuague el ápice de la picadura teñida dos veces en agua estéril y desionizada. Ahora, perfora un agujero en el centro de un plato de imágenes preparado usando fórceps, y pega el ápice de la toma teñida erguido en el medio.
Llene el plato de imágenes con agua estéril y desionizada para sumergir completamente la muestra. Vea la muestra a través del microscopio estéreo. Pipetear hacia arriba y hacia abajo para eliminar las burbujas de aire atrapadas alrededor del meristem.
A continuación, ajuste el ángulo del tallo en el agar para asegurarse de que el meristem apical de brote es totalmente visible desde directamente arriba. Ahora, coloque el plato de imágenes en la etapa de muestra del microscopio confocal. Baje la lente de inmersión en agua y suba la etapa de la muestra del microscopio para dejar que la punta de la lente se sumerja en el agua.
Abra el software de microscopio confocal y utilice los oculares para localizar y centrarse en el meristem apical de disparo en el campo brillante. Operar la función adquisición en el software de microscopio confocal. Inicie el modo en vivo para ver la muestra desde la pantalla del ordenador y configure todos los parámetros para el experimento de escaneo láser.
Al ajustar los parámetros, utilice la función Indicador de rango para definir si la señal está saturada o no. El mismo software que se utilizó para la adquisición de imágenes se puede utilizar para visualizar una proyección transparente tridimensional. Abra el archivo confocal original, haga clic en el menú 3D y seleccione Transparente para generar una vista de proyección 3D.
Opcionalmente, seleccione Transparencia para ajustar tres parámetros de la proyección, incluidos Umbral, Rampa y Máximo para la transparencia de la imagen 3D. Ahora, seleccione Luz para ajustar el brillo de la imagen 3D. Exporte las imágenes proyectadas y guárdelas como archivos TIFF.
Para visualizar la vista de codificación de profundidad de las imágenes 3D, utilice el mismo software. Una vez más, haga clic en el menú 3D y seleccione Apariencia. Seleccione Especial y codificación de profundidad.
Exporte las imágenes proyectadas y guárdelas como archivos TIFF. Esta imagen desde la sección ortogonal hasta el centro del meristem apical de arabidopsis muestra que las paredes horizontales están manchadas con yoduro propidium en casi todas las células en múltiples capas celulares. Una vista de una sección transversal a través del corpus del meristem apical de la toma de inflorescencia muestra que las celdas del plano XY también están claramente imágenes.
La vista de proyección 3D revela que el meristem de inflorescencia forma una estructura similar a una cúpula y está rodeada por la primordia de la flor en desarrollo. Esta imagen de la sección ortogonal a través de la mitad del meristem apical de brote de tomate también muestra que las paredes horizontales están manchadas con yoduro de propidio en múltiples capas celulares, aunque la señal de yoduro propidium de la región interior profunda es ligeramente más baja. Una imagen de una sección transversal a través de las capas profundas del meristem apical de brote vegetativo revela las células de los planos XY y el límite formado entre el meristem vegetativo y la primordia de la hoja.
La vista de proyección 3D puede proporcionar una vista completa de la forma y la organización del meristem vegetativo del tomate. Aquí se muestra una vista ortogonal a través del medio del meristem apical de brote de soja y una proyección 3D del mismo meristem apical de brote. El meristem vegetativo similar a la cúpula y su nueva primordia de hoja derivada también son observables.
El yoduro propidium puede manchar fácilmente las células dañadas o muertas, lo que influirá en gran medida en la calidad de las imágenes, por lo que es importante evitar cualquier daño físico mientras se preparan muestras de meristem apical.
