Este protocolo demuestra un procedimiento novedoso para la inmunofluorescencia secuencial y la inmunohistoquímica en las criocciones de las embroys de peces cebra en etapa temprana, lo que permite análisis precisos de la co-localización en poblaciones celulares específicas. La principal ventaja de este protocolo es su flexibilidad. Combina técnicas de inmunofluorescencia e inmunohistoquímica utilizando una sola criocosección para maximizar la morfología tisular, la co-localización de la expresión y la compatibilidad de anticuerpos.
Este protocolo podría aplicarse a otros peces o modelos anfibios, ya que estos investigadores a menudo se enfrentan a complicaciones similares con la disponibilidad de anticuerpos y a menudo realizan tipos similares de experimentos. Trabajar con criocciones embrionarias en etapa temprana puede ser complicado ya que son pequeñas y la criocisión puede ser un desafío, pero la preparación y la práctica avanzadas ayudarán a aliviar cualquier lucha en este método. Hay múltiples pasos en nuestro protocolo que requieren un manejo y cuidado particulares y pueden ser difíciles de dominar sin ver a alguien demostrar las técnicas.
Para empezar, transfiera los embriones de pez cebra quiméricos fijos y preparados previamente de cuarenta y ocho horas de fertilización de un tubo con 15 25 OCT de mezcla a un molde de plástico utilizando fórceps minimizando cualquier transferencia de la mezcla. Llene el molde aproximadamente la mitad con el medio OCT y mezcle suavemente los embriones en él. Prepare moldes de plástico etiquetados y transfiera los embriones deseados a los moldes de plástico con etiqueta vacíos, minimizando el arrastre del medio OCT.
A continuación, llene suavemente con el medio OCT hasta la parte superior de los moldes con embriones. Trabajando bajo un microscopio estéreo ligero para la visualización, utilice agujas para organizar embriones en la orientación deseada. A continuación, coloque los moldes preparados en un recipiente aislado con una plataforma metálica y congénelos sobre hielo seco.
Coloque un cubo de hielo suavemente sobre la plataforma metálica para crear una cámara fría y congelar durante aproximadamente 30 minutos. Usando un criostato establecido en menos 20 grados Celsius, corte los embriones incrustados en criocirios de 10 a 12 micrómetros de espesor mientras comprueba periódicamente la profundidad de la sección en un microscopio para monitorear la ubicación y el tejido. Coloque las secciones sobre los portaobjetos de vidrio cargados y séquelos al aire a temperatura ambiente durante la noche.
Lave los portaobjetos tres veces durante cinco minutos en 1X PBS en un recipiente adecuado. Poner los portaobjetos sobre una superficie plana en una cámara húmeda. Utilice un lápiz de barrera para delinear las secciones y mantener el líquido en las diapositivas.
Pipetear 200 microlitros de tampón de bloque por sección e incubar en tampón de bloque durante dos horas a temperatura ambiente. Preparar la dilución de anticuerpos primarios y bloquear el tampón y mezclar bien por pipeteo. Incline suavemente los portaobjetos para drenar el tampón de bloque y volver a la cámara húmeda.
Pipetear 200 microlitros de solución de anticuerpos primarios por sección en las guías y 200 microlitros de tampón de bloque en las secciones apropiadas como control. Incubar los portaobjetos a cuatro grados centígrados durante la noche en una cámara húmeda llena de agua desionizada asegurándose de sellar los bordes de la cámara para ayudar a retener la humedad. Lave los portaobjetos tres veces durante cinco minutos en 1X PBS y en un recipiente apropiado.
Preparar la dilución de anticuerpos secundarios durante el lavado y bloquear el tampón y mezclar bien por pipeteo. Después de colocar los portaobjetos sobre una superficie plana en una cámara húmeda, agregue 200 microlitros de solución de anticuerpos secundarios por sección. Incubar los portaobjetos en solución secundaria de anticuerpos a temperatura ambiente en la oscuridad durante 30 minutos.
Lave los portaobjetos tres veces durante cinco minutos en 1X PBS en un recipiente adecuado. Después de colocar los portaobjetos sobre una superficie plana, agregue la solución de tinción nuclear en cada sección e incubar cubierto durante 10 minutos. Después de drenar la solución de tinción nuclear, monte los portaobjetos con un soporte de montaje fluorescente no endurecido y un resbalón de cubierta de vidrio.
Asegúrese de mantenerlos en la oscuridad a cuatro grados centígrados hasta que se hagan imágenes. Coloque los portaobjetos en recipientes individuales con 1X PBS y guárdelos a cuatro grados centígrados durante la noche, mientras agita suavemente para aflojar los resbalones de la cubierta lo suficiente para que se apaguen cuando se agitan. Asegúrese de no presionar hacia abajo en el resbalón de la cubierta o intente quitar el resbalón de la cubierta manualmente, pero espere hasta que se salgan con un movimiento forzado mínimo.
Después de retirar los resbalones de la cubierta, transfiera suavemente los portaobjetos a un recipiente con 1 PBS fresco. Retire el PBS 1X e incubar los portaobjetos en solución salina trillada 1X con 0,1% de un tensioactivo no iónico tres veces durante cinco minutos a temperatura ambiente. Incubar los portaobjetos en solución de peróxido de hidrógeno al 3% a temperatura ambiente durante 15 minutos.
A continuación, coloque la diapositiva plana y agregue la caída del búfer de bloque sabiamente a la superficie. Incline suavemente las diapositivas para drenar el tampón de bloque. Seque el área alrededor de las secciones y coloque los portaobjetos planos en una cámara húmeda.
Añadir 200 microlitros de solución de anticuerpos primarios por sección en los portaobjetos e incubar en cámara húmeda a cuatro grados centígrados durante la noche. Incline suavemente los portaobjetos para drenar la solución primaria de anticuerpos y lave dos veces durante cinco minutos en 1X TBST. A continuación, aplicar listo para usar fondo reduciendo la caída del reactivo de bloqueo sabiamente a cada sección, e incubar en cámara húmeda a temperatura ambiente durante 20 minutos.
Incline suavemente las diapositivas para drenar el tampón de bloque. Seque cuidadosamente el área alrededor de las secciones y coloque los portaobjetos planos en una cámara húmeda. Aplicar una solución de anticuerpos secundaria lista para usar en cada gota de sección e incubar en cámara húmeda a temperatura ambiente durante 30 minutos.
Incline suavemente los portaobjetos para drenar la solución secundaria de anticuerpos y lave dos veces durante cinco minutos en 1X TBST. Después de secar el área alrededor de las secciones, coloque los portaobjetos sobre una superficie plana y agregue 200 microlitros del sustrato cromogénico HRP a cada sección. Inicie un temporizador cuando el sustrato se haya aplicado al primer portaobjetos e incubar a temperatura ambiente durante tres minutos.
Escurra la solución del sustrato. Enjuague brevemente los portaobjetos en un recipiente apropiado con 1X PBS y lávelos en agua desionizada dos veces durante cinco minutos con agitación suave. Contrarresta los portaobjetos colocándolos en la solución de tinción de hematoxilina durante un máximo de 30 segundos y lávelos tres veces durante cinco minutos cada uno en agua desionizada.
Incubar los portaobjetos en un recipiente que contenga El Agua de Scott durante un minuto y luego lavar de nuevo tres veces durante cinco minutos en agua desionizada. Deshidratar los portaobjetos a través de una serie de grados de etanol diluidos en agua desionizada y xileno en una capucha química. Después de retirar las diapositivas del xileno, agregue inmediatamente el medio de montaje a base de tolueno y coloque un resbalón de cubierta.
Para asegurar el éxito mientras la cubierta resbala, es importante trabajar de un lado de la diapositiva al otro mientras se baja lentamente el resbalón de la cubierta para evitar burbujas que oscurezcan el tejido. Por último, visualice e imagine las diapositivas utilizando un microscopio de luz compuesto y una cámara digital con un aumento de 100X. Anticuerpos específicos utilizados aquí para detectar simultáneamente células proliferantes y células donantes identificadas y cuantificadas células donantes que están proliferando activamente.
Después de la inmunofluorescencia y la inmunohistoquímica es esencial generar imágenes de alta calidad para identificar con precisión las células individuales. Se utilizó un programa de análisis de imágenes para realizar la superposición de imágenes. Al intentar este procedimiento es más importante manchar y contrarrestar adecuadamente los portaobjetos durante la inmunohistoquímica.
Después de este procedimiento se pueden realizar métodos adicionales como modificaciones en el protocolo original, como el uso de diferentes combinaciones de anticuerpos, tipos de tejido o especies. Las imágenes también se pueden analizar de varias maneras para obtener datos relevantes. Esta técnica nos permitió considerar la co-localización y múltiples antecedentes genéticos como una forma de investigar las interacciones entre células y podría aplicarse de manera similar a otras técnicas que requieren un análisis detallado de la co-localización.
Muchos de los reactivos de la inmunohistoquímica son peligrosos y deben tratarse en consecuencia. El trabajo con etanol, xileno y rigidez de montaje debe realizarse en la campana. Los residuos DAB deben eliminarse como residuos peligrosos y los lavados posteriores a DAB deben blanquearse.
