Este método puede ayudar a responder preguntas clave en los campos biotecnológico y biomédico, como cuáles son la base molecular detrás de los efectos de Warburg y Crabtree. La principal ventaja de esta técnica es que permite el estudio de alto rendimiento de los efectos de ciertas sustancias en el metabolismo respiratorio y fermentativo. Comience por inocular un tubo cónico de 15 mililitros que contenga tres mililitros de frío, estéril 2% de dextrosa de peptona extracto de levadura, o caldo YPD, con 250 microlitros de células de levadura S.cerevisiae preservadas en glicerol a 20 grados Celsius negativos.
Incubar la levadura durante la noche en un agitador orbital a 30 grados celsius y 200 rpm. para rayar en un plato de Petri lleno de 60 mililitros, 2%YPD lleno de agar a la mañana siguiente. Cultivar el plato a 30 grados centígrados hasta que se observen colonias aisladas.
Luego inocular una sola colonia aislada en un nuevo tubo cónico que contiene 10 mililitros de caldo fresco y estéril de 2%YPD para cultivo nocturno a 30 grados centígrados con temblores. Para la configuración de la curva de crecimiento de la microplaca, añada 145 microlitros de un medio cultural experimental apropiado a cada pocócula de una microplaca estéril de 10 por 10 pocono con una tapa e inocular cada pocóculo con cinco microlitros del cultivo nocturno. A continuación, incubar la placa multi-pozo en un lector de microplacas a 30 grados Celsius con agitación constante a 200 rpm durante 48 horas, midiendo la densidad óptica a 600 nanómetros cada 30 o 60 minutos.
Para la configuración de la curva de crecimiento del matraz cónico agitado, inocular matraces cónicos de 20 mililitros que contengan 4,8 mililitros de un medio de cultivo estéril apropiado con 200 microlitros de cultivo pre-inóculo a una densidad óptica de 600 nanómetros de dos para incubación a 30 grados Celsius y 250 rpm. La agitación a 250 revoluciones por minuto es fundamental para lograr un crecimiento adecuado en bajas concentraciones de fuentes de carbono que ejercen un crecimiento respiratorio, ya que hemos observado un crecimiento reducido de la levadura en condiciones respiratorias a velocidades de agitación más bajas. Para permitir la medición de la densidad óptica a 600 nanómetros cada dos horas durante 24 horas, diluir 100 microlitros del cultivo de matraz cónico agitado en 900 microlitros de agua destilada en una cubetatómetro espectrofotómetro de un mililitro y mezclar suavemente por pipeta.
Para el procesamiento de datos, en un software de paquete estadístico adecuado, cree un nuevo archivo de proyecto, abra el nuevo menú de tabla y gráfico y seleccione XY. En el menú de datos de ejemplo, seleccione comenzar con una tabla de datos vacía y un gráfico de puntos y líneas de conexión. Deje la sección X sin seleccionar en subcolumnas para réplicas o valores de error. En la sección Y, seleccione 10 valores de réplica en subcolumnas en paralelo y la media de trazado y el error SD. A continuación, haga clic en crear.
Introduzca la hora a la que se obtuvieron las mediciones de OD en la columna X y los valores de OD obtenidos de las referencias culturales de la columna Y. Para identificar la fase de crecimiento exponencial que transforma los datos de la columna Y en logaritmos, haga clic en analizar y seleccionar el análisis de transformación. Utilice Y es igual al registro Y para seleccionar los valores Y y abrir la galería de resultados.
Seleccione la tabla de datos de transformación, haga clic en analizar y seleccione el análisis de regresión lineal, excluyendo los valores de densidad óptica que no siguen una tendencia lineal seleccionando los valores de la tabla y presionando el control y E.In la galería de tablas de datos, seleccione los datos de una tabla y haga clic en analizar. Seleccione el análisis de ajuste de curva de regresión no lineal y los conjuntos de datos que desea analizar y haga clic en Aceptar. A continuación, aplique los cuadrados mínimos que se ajusten a los datos, dejando la sección de interpolación sin seleccionar y haga clic en Aceptar. A continuación, abra un nuevo archivo de proyecto y, en el nuevo menú de tabla y gráfico, seleccione la opción de columna, comience con una tabla de datos vacía y el gráfico deseado. Establezca el gráfico para trazar la media con la desviación estándar y haga clic en Crear.
Copie los valores de tiempo medio o delta de la tabla de resultados de ajuste no lineal en la galería de resultados y pegue los datos en una columna. Por último, haga clic en analizar y seleccionar el análisis de interés en el menú de análisis de columnas para comparar los parámetros cinéticos de las diferentes condiciones nutrimentales. Los valores de umbral cinético de crecimiento varían entre las fortalezas y deben evaluarse de acuerdo con las condiciones que utilizamos en el análisis.
Los cultivos que demuestran un fenotipo fermentativo tienen una pequeña fase de retraso y una fase exponencial con una alta tasa de crecimiento. Los cultivos que obtienen energía principalmente por fosforilación oxidativa exhiben una fase de retraso más larga con una tasa lenta de crecimiento durante la fase exponencial. El cálculo de la tasa de crecimiento específica y el tiempo de duplicación de las curvas de crecimiento utilizando la ecuación de crecimiento exponencial permite el establecimiento de umbrales para los valores de crecimiento respiratorio y fermentativo.
Por ejemplo, en estos experimentos representativos, los efectos de diferentes concentraciones de resveratrol en las células S.cerevisiae BY4742 revelan la modificación del estado energético celular en respuesta a diferentes concentraciones de glucosa. Aquí, la suplementación con 10%glucosa demuestra que las concentraciones más bajas de amonio favorecen el metabolismo fermentativo como lo demuestra una fase de crecimiento exponencial extendida en estos cultivos, mientras que una mayor concentración induce un metabolismo-fermentativo como lo demuestra una fase de retraso extendida y una tasa de crecimiento más lenta durante la fase exponencial. Por último, se pueden observar fuertes diferencias en los valores de tiempo de duplicación fermentativa entre estas dos cepas de levadura diferentes cultivadas en las mismas condiciones, destacando la necesidad de validar el umbral de tiempo de duplicación para cada cepa analizada.
Al intentar este procedimiento, es importante recordar que este protocolo solo se utiliza para detectar el fenotipo. Los efectos específicos sobre la respiración y fermentación deben confirmarse mediante ensayos de consumo de oxígeno o por la acumulación de subproductos de fermentación, respectivamente.
