Agradecemos a productos farmacéuticos Jalale para proporcionar CDDO-DFPA. También reconocemos el apoyo de la Jane y Lee Seidman Cátedra de innovación de cáncer pediátrico (John Letterio). Este trabajo fue financiado por el Departamento de defensa [W81XWH-12-1-0452]; la iniciativa de investigación de cáncer en adultos, Angie Fowler adolescentes y jóvenes, en el caso centro integral del cáncer; y el premio académico graduado de Callahan Hsi-Ju Wei de F.J. Callahan Fundación.

Todos los estudios se realizaron en cumplimiento de procedimientos aprobados por del caso Western Reserve University School of Medicine institucional Animal cuidado y uso.
1. preparación de células dendríticas derivadas de la médula ósea (BMDCs)
<ol><li>Esterilizar todos los instrumentos quirúrgicos a través de autoclave y realizar el experimento en clase con los procedimientos de seguridad apropiados de seguridad biológica II.</li>
	<li>Eutanasia a ratones C57BL/6 8-10 semanas de edad mediante el uso de CO2 cámara. Coloque el ratón sobre una tabla de disección y enjuagar con etanol al 70%. Impuestos especiales-tibia-peroné y fémur huesos usando una tijera quirúrgica y colocarlos con etanol al 70% en una placa de cultivo de 10 cm.</li>
	<li>Utilizar hojas para bisturí y pinzas para disecar tejido lejos tanto como sea posible en la tapa del 10 cm plato de la cultura y aislar las tibias y fémures colocarlos con etanol al 70% en una placa de cultivo de 6 cm.</li>
	<li>Utilice láminas quirúrgicas para recortar ambos extremos de la tibia y fémur. Use 3 mL de PBS en jeringa de 3 ml con una aguja de 23G para vaciar el contenido de médula ósea de uno de los extremos de los huesos a un tubo cónico que contiene 12 ml de PBS. Repetir la operación 3 x cada extremo de los huesos.</li>
	<li>Centrifugue la suspensión de células a 300 x g durante 5 minutos.</li>
	<li>Quite el sobrenadante y resuspender el sedimento celular con 1 ml del tampón lisis de ACK por 5 minutos eliminar las células de sangre rojas.</li>
	<li>Añadir 9 ml de PBS para diluir el buffer lisis ACK y centrifugar a 300 x g durante 5 minutos.</li>
	<li>Quite el sobrenadante y resuspender con 10 ml medio de cultivo (RPMI-1640 más L-glutamina, 10% FBS, 1% no esenciales aminoácidos (100 x), 10 mM HEPES, 50 nM β-mercaptoetanol y 5% penicilina/estreptomicina). Nota: Nivel de endotoxinas debe ser inferior a 0,1 UE/ml de SBF.</li>
	<li>Pasar la suspensión celular a través de un tamiz de 40 μm celular y tomar 20 μl de la suspensión celular y se mezclan con 80 μl de trypan azul para contar el número de células vivas mediante el uso de citometría.</li>
	<li>Ajustar el número de celular a 1 x 106 células/ml con GM-CSF de 15 ng/ml y 10 ng/ml de IL-4.</li>
	<li>3 ml de 1 x 106 células/ml en cada pocillo de la placa de 6 pozos de la placa e incubar a las células a 37 ° C, 5% CO2y 95% de humedad en la incubadora de CO2 . Nota: Las células de la médula ósea de un ratón es alrededor de 3-5 x 107 células, indicando que se puede colocar de 2 a 3 placas de 6 pozos.</li>
	<li>El día 3, quitar todo medio de cultivo de 3 ml de cada bien, agregar 2 ml PBS fresco en cada pozo, y luego agitar suavemente la placa para asegurarse de eliminar todas las células no adherentes.</li>
	<li>Vuelva a colocar 3 ml medio de cultivo fresco con GM-CSF de 15 ng/ml y 10 ng/ml de IL-4 en cada pozo. Incube las células a 37 ° C, 5% CO2y 95% de humedad en la incubadora de CO2 .</li>
	<li>El día 5, directamente agregar otro medio de cultivo fresco de 3 ml con GM-CSF de 15 ng/ml y 10 ng/ml de IL-4 en cada pozo. Incube las células a 37° C, 5% CO2 y 95% de humedad en la incubadora de CO2 . Nota: El volumen total en cada pozo es ahora 6 ml.</li>
	<li>En el día 7, poner toda la placa de hielo durante 10 minutos. Pipetee suavemente el medio de cultivo en cada pozo para desalojar el ligeramente adherente BMDCs como CDI en suspensión. Nota: Los macrófagos adherentes estén fijados a la placa. Procedimientos y suavemente la baja temperatura son la clave para evitar la activación de la DC para más experimentos.</li>
	<li>Centrifugue la suspensión de células a 300 x g durante 5 minutos y resuspender con medio fresco de cultivo para experimentos adicionales. Nota: BMDCs puede identificarse con el anticuerpo marcado con fluorescencia de CD11c por citometría de flujo y mostramos nuestra estrategia bloquea de BMDCs para otros experimentos en la figura 1.</li>
</ol>2. caracterizar el perfil de proteína y gen TolDC
<ol><li>Placa de 2 ml de 1 x 106 BMDCs/ml por pozo de placa de 6 pozos con medio de cultivo en la presencia o ausencia de 100-400 nM DFPA CDDO para incubar 1 h a 37 ° C, 5% CO2 y 95% de humedad en la incubadora de CO2 . Nota: CDDO-DFPA, un triterpenoide sintético, es un factor nuclear (derivados del eritroide 2) - como - 2 inductor de factor (Nrf2) y el inhibidor del factor nuclear-κB (NF-κB). Aplicar a otros agentes para la inducción de TolDCs de la CDI, como IL-10, vitamina D3, dexametasona o Bahía 11-7085 y modificar este paso a una condición óptima para cada agente.</li>
	<li>Añadir 10 o 100 ng/ml de LPS para incubar 4-24 horas para inducir la mDCs (tiempo de incubación es diferente debido a la medición de mRNA o proteína).</li>
	<li>Pipetear el medio de cultivo en cada pozo y la suspensión de células de la cosecha utilizando la pipeta de 1 ml. Centrifugar a 300 x g durante 5 minutos recoger las células y del sobrenadante, respectivamente.</li>
	<li>Analizar los ligandos de la superficie de los pellets de células por citometría de flujo, como ligandos estimulantes: CD40, CD80, CD86, MHC-II, OX40L, ICOSL o ligandos inhibidores: PD-L1, PD-L2, ILT3 ILT4.</li>
	<li>Aislar el RNA de los pellets de célula y analizar las RNA y sobrenadante muestras de los niveles del cytokine perfil y gene y proteína por PCR en tiempo real cuantitativa (qRT-PCR) y ELISA, respectivamente. Nota: por ejemplo, citoquinas proinflamatorias: TNF-α, IFNγ, EDN-1, IL-6, IL-12 y IL-23 o antiinflamatorias citoquinas: IL-4, IL-10, IL-15, el TGF-β1 y la HO-1.</li>
</ol>3. evaluar la función de TolDCs In Vitro e In Vivo
<ol><li>
Ensayo de Syngeneic de la proliferación de células T
	<ol>
<li>Esterilizar todos los instrumentos quirúrgicos a través de autoclave y realizar el experimento en clase con los procedimientos de seguridad apropiados de seguridad biológica II.</li>
		<li>Preparar el tampón de Mac utilizando 0.5% albúmina de suero bovino (BSA) y 2 mM de EDTA en 500 ml de PBS. Esterilizar el búfer por filtración a través de un filtro de 0.2 μm. Nota: Mantenga el buffer en el hielo durante el siguiente experimento.</li>
		<li>Para obtener CD4+ T células, eutanasia ratones transgénicos de OT-II T-cell receptor (TCR) 8-10 semanas de edad mediante el uso de CO2 cámara. Coloque el ratón sobre una tabla de disección y enjuagar con etanol al 70%. Aislar el bazo del lado izquierdo del abdomen mediante el uso de fórceps y tijeras quirúrgicas.</li>
		<li>Poner el bazo con 2 ml de PBS en una placa de cultivo de 6 cm y la parte posterior de la varilla de empuje de la jeringa de 3 ml para picar el bazo por pasar un tamiz de 40 μm células.</li>
		<li>Recoge las suspensión y centrifugar a 300 x g durante 5 minutos.</li>
		<li>Resuspender el precipitado de células en 400 μl de tampón de MACS.</li>
		<li>Añada 100 μl de CD4+ T Cell biotina anticuerpo cóctel a 4° C por 5 minutos. Nota: El cóctel de anticuerpos se une a otros tipos de células excepto CD4+ T de las células, tales como CD8a, CD11b, CD11c, CD19, CD25, CD45R (B220), CD49b (DX5), CD105, Anti-MHC de clase II, Ter-119 y TCRγ/δ.</li>
		<li>Añadir 300 μl de tampón de MACS y 200 μl de anti-biotina granos (Tabla de materiales) a 4° C durante 10 minutos.</li>
		<li>Lugar la columna compuesta de esferas ferromagnéticas (Tabla de materiales) y el filtro de separación previa en el magnético campo y enjuagar luego con 3 ml de tampón de MACS.</li>
		<li>Añadir 9 ml de tampón de MACS en las células y centrifugar a 300 x g durante 5 minutos.</li>
		<li>Resuspender el precipitado de células en 3 ml de tampón de MACS y se aplican sobre la columna. Recoge paso con CD4+ T las células.</li>
		<li>Lavar la columna con otro 3 ml de tampón de MACS y recoger también el flujo a través.</li>
		<li>Para obtener el pan bazo DCs, eutanasia ratones C57BL/6 8-10 semanas de edad mediante el uso de CO2 cámara. Coloque el ratón sobre una tabla de disección y enjuagar con etanol al 70%. Aislar el bazo del lado izquierdo del abdomen mediante el uso de fórceps y tijeras quirúrgicas. Poner el bazo en una placa de cultivo de 6cm que contiene 2 ml de solución de colagenasa D (colagenasa de 2 mg/ml D disuelto en HBSS conteniendo calcio, magnesio).</li>
		<li>Inyectar 1 ml de solución de colagenasa D el bazo dos veces con una jeringa de 1 ml y una aguja de 25G. Corte del bazo en trozos pequeños con unas tijeras pequeñas.</li>
		<li>Agitar e incubar a temperatura ambiente durante 25 minutos.</li>
		<li>Añadir 500 μl de EDTA de 0,5 M a temperatura ambiente durante 5 minutos. Nota: Los pasos de 3.1.13-3.1.14 son fundamentales para aumentar el rendimiento de DCs.</li>
		<li>Ahora uso la parte trasera de la varilla de empuje de la jeringa de 3 ml a moler la mezcla de bazo por pasar un tamiz de 40 μm células y recoger la suspensión de células por centrifugación a 300 x g durante 5 minutos.</li>
		<li>Resuspender el precipitado de células en 350 μl de tampón de MACS, 50 μl de reactivo de bloqueo de FcR y 100 μl de Pan biotina anticuerpo de célula dendríticas cóctel a 4° C durante 10 minutos. Nota: El anticuerpo cóctel contra los antígenos que se expresan no por DCs.</li>
		<li>Lavar las células añadiendo 9 ml de tampón de MACS y centrifugar a 300 x g durante 5 minutos.</li>
		<li>Resuspender el precipitado de células en 800 μl de tampón Mac y agregar 200 μl de anti-biotina cuentas a 4 ° C durante 10 minutos.</li>
		<li>Repita los pasos del 3.1.9-3.1.11 para recoger DCs.</li>
		<li>Lavar la columna con otro 3 ml de tampón de Mac dos veces y también recoger el flujo a través.</li>
		<li>Tratar el 2 x 105 DCs/ml en la presencia o ausencia de células de T de 100-400 nM CDDO-DFPA a 37 ° C por 1 hr. por separado, etiqueta el CD4+ (1 x 107/ml) con 1 μM CFSE a 37 ° C durante 15 minutos, lavar con PBS y vuelva a ajustar el volumen para obtener la concentración final en 2 x 106 T células/ml.</li>
		<li>A continuación, en una placa de 96 pocillos, co cultura 100 μl de las células dendríticas tratadas con el mismo volumen de CFSE-labeled CD4+ T de las células, tanto de los pasos anteriores para conseguir 1:10 cociente. Ahora se añadirá 100 péptidos de ovoalbúmina (OVA) 323-329 ng/mL por pozo y medir la intensidad de la CFSE de los linfocitos T por citometría de flujo 2-3 días de incubación. Nota: El número de células y el cociente de DCs y T, las células han sido optimizadas de nuestro anterior trabajo37.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Pasivo de inducir EAE inyectando BMDCs pulsada con la glicoproteína del Oligodendrocyte del Myelin (MOG) (35-55)
	<ol>
<li>Placa de 2 ml de 1 x 106 BMDCs/ml por pozo de placa de 6 pozos con medio de cultivo en la presencia o ausencia de 100-400 nM DFPA CDDO para incubar 1 hora.</li>
		<li>Añadir 10 ng/ml de LPS para incubación de 24 hrs.</li>
		<li>Añadir 100 μg/ml de MOG (35-55) para incubación de 4 horas.</li>
		<li>La cosecha la suspensión y centrifugar a 300 x g durante 5 minutos.</li>
		<li>Resuspender el precipitado de células con PBS y contar las células.</li>
		<li>Inyectar por vía subcutánea 200 μl de 2 x 106 células a ratones C57BL/6 femeninos de 8-10 semanas (100 μl en cada pata trasera).</li>
		<li>En el día de la inyección de BMDC y 48 hrs. más tarde, inyectar 200 ng de toxina de pertussis (PTX) en cada ratón.</li>
		<li>Repita los pasos 3.2.6-3.2.7 una vez por semana durante 4 semanas consecutivas.</li>
		<li>Evaluar los síntomas clínicos de EAE diario utilizando criterios estándar37 (final 0.5-cojera, blando 1 cola, 2-moderada extremidades debilidad, debilidad de extremidades 3-severo, parálisis de extremidades 4-completo, estado 5-tetraplejía o moribundo, 6-muerte).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Este papel describe un protocolo eficiente que puede utilizarse para reproducible en generar CDI y posteriormente diferenciarlas en TolDCs, y proponemos que esto se puede aplicar para evaluar la capacidad de los nuevos agentes diana molecular para inducir a la TolDC fenotipo. Como se describe en este informe, hemos seguido una secuencia en la que Analizábamos primero TolDC expresión de ligandos de superficie por citometría de flujo, seguido de una evaluación del perfil de citoquina de CC medida por qRT-PCR y ELISA. Finalmente, la función de inmunoregulador de TolDCs fue confirmada demostrando su capacidad para reducir la proliferación de la célula de T en vitro y su eficacia para suprimir la autoinmunidad en vivo, usando el modelo EAE murino preclínico de MS.
En nuestro protocolo, CDI generaron y diferenciados a partir de precursores de médula ósea murina con la combinación de GM-CSF e IL-4. Otros protocolos han utilizado ligandos de formas-como tirosina quinasa 3 (Flt3L) en el medio de cultivo para generar CDI44. Aunque el uso de Flt3L aumenta el rendimiento de CDI, estos CDI suelen tener 2 días (9 días) para la cosecha, en comparación con el GM-CSF/IL-4 adición (7 días)44. Más importante aún, iDC generado a partir de Flt3L a menudo se diferencian en dos cDCs (CD8– y CD8+) y PDC45 que eran funcionalmente y fenotípicamente equivalente a estado estacionario DCs en vivo. Sin embargo, GM-CSF/IL-4 induce invariablemente la diferenciación de iDC hacia cDCs (CD8–) sólo44 y durante la maduración, manifestaron caracteres similares de inflamatoria DCs46. Es importante saber que GM-CSF/IL-4 se utiliza a menudo en ensayos clínicos y la investigación básica debido a la ventaja de diferenciar DCs de monocitos o CD34+ progenitores44. Se ha demostrado que CDI generados a partir de estos dos métodos de produce las células morfológicamente diferentes, que también poseen marcadores de superficie de diferentes células y exhiben perfiles de citocinas distintas a su activación. Además, TolDCs inducidas por estos métodos varían en su capacidad de migrar en respuesta a factores quimiotácticos y para inducir a la célula de T antígeno-específica respuestas44,45. Entendemos que CD8+ DCs puede exhibir más potencial en la inducción de TolDC debido a su capacidad única de tolerancia cruzada47. Sin embargo, entonces se necesita más la célula clasificación de BMDCs derivados por Flt3L para investigar el CD8 específicas+ DC subconjunto. Además, desde entonces, GM-CSF/IL-4 inducida por BMDCs son superiores a la estimulación de células T y la producción de mediadores inflamatorios después de LPS tratamiento44,45, encontramos esta estrategia dio resultados más reproducibles en nuestros experimentos.
BMDCs derivados de GM-CSF/IL-4 Inicio expresan CD11c alrededor del día 4 y enriquecer la expresión después del día 648. Este procedimiento de cultura pueda mantenerse hasta el día 10-12 con una menor densidad de placas de células de médula ósea y una baja dosis de GMC-SF día 8-1049. En este protocolo, CDDO-DFPA (triterpenoides sintético) y LPS fueron agregados en tándem como agentes para inducir tolerancia DC y maduración, respectivamente. Nos informó recientemente que la CDI de culturas utilizando este método de generación de BMDC exhibe un fenotipo de TolDC funcional cuando pretratados con DFPA CDDO37. Es de destacar que CDDO-DFPA, que fue agregado solamente a culturas después de iDC de la cosecha (día 7)37, en contraste con agentes como la vitamina D3 que se debe añadir a las culturas varias veces durante el iDC diferenciación (día 2, 4, 6)50. Por otra parte, esta inducción de TolDCs por la vitamina D3 puede depender de diversos mecanismos que deben ser iniciados durante y después de la diferenciación de iDC51. Nuestros datos sugieren que la adición de DFPA CDDO durante la diferenciación de iDC no tuvo ningún impacto en la pureza de CD11c + DCs pero dosis dependiente bajar el rendimiento de la CDI en el día 7 (datos no mostrados). Nuestros análisis también sugieren que la mayor concentración de CDDO-DFPA utilizado en estos experimentos puede ser tóxica para las células progenitoras de médula ósea, aunque iDC demostró viabilidad normal con esta concentración de DFPA CDDO37. Se prevé que TolDC inducción puede ser optimizada por el cuidadoso análisis del impacto de la sincronización y duración de la exposición a agentes como CDDO-DFPA.
Es importante considerar los métodos alternativos y mecanismos a través del cual CDI puede ser inducida a MDC por otros que LPS, como CD40L, TNF-α y IFN-γ52. Maduración de DC por LPS a través de receptores Toll-like 4(TLR4) conduce a la activación de varios factores de transcripción, incluyendo el factor nuclear-κB (NF-κB), kinase de proteína mitogen-activados p38 (p38 MAPK), c-Jun N-terminal quinasa (JNK) y extracelular kinase de proteína regulada por señal (ERK1/2). Respectivamente, la maduración de DCs de CD40L y TNF-α a través de receptores de CD40 y TNF induce la vía del NF-κB. En cambio, IFN-γ estimula una vía diferente, incluyendo la activación de la cinasa Janus (JAK), tirosina quinasa (TYK) y el transductor de señal y activador de proteínas de transcripción (STATs), y estos efectos aguas abajo también se complementaron con la activación de la vía NF-κB52. Además, mientras que el perfil de expresión génica de maduración CD40L/TNF-α-base DC sugiere que estos DCs polarizan las células T hacia una de respuesta celular Th253, maduración de DC por IFN-γ está sesgada fuertemente hacia células Th1 respuesta54. Por lo tanto, en este Protocolo no se emplean estos otros inductores de la maduración de DC que están relacionados con la diferenciación hacia células específicas T subconjuntos.
Varios informes han demostrado que ex vivo-DCs diferenciadas son capaces de inducir todo el espectro de síntomas clínicos de la EAE y la patología en ratones55. Se ha adoptado el método de la inducción de EAE pasiva por DCs ex vivo activados con diversas modificaciones por diferentes laboratorios. La combinación de la inducción de EAE pasiva y activa por administración de MOG cebada BMDCs, 7 días antes de la inmunización con MOG y completa adyuvante de Freund (CFA) da lugar a mayores puntuaciones de los síntomas clínicos (máximo puntuación clínica: 3.5) en comparación con la EAE pasiva inducción por la administración de MOG cebada BMDCs solamente (máximo puntuación clínica: 2)56. Resultados con este método combina la MOG cebada BMDCs con MOG inmunización sugiere que inicio de la enfermedad ocurre en el día 9 después de la inmunización con MOG y CFA56. Sin embargo, ya se sabe que el CFA causa inflamación significativa en el sitio de administración57, hemos utilizado pasiva inducción de EAE administración de DCs solamente en nuestro protocolo para analizar eficazmente el efecto de TolDCs durante la EAE. Para confirmar más el fenotipo funcional de TolDCs, uno debe también prueba en suprimir los síntomas clínicos de ratones EAE activadas. La vía de administración de DCs es también crítica para la inducción de EAE síntomas58. Como se informó por nuestro laboratorio y por otros, la inyección subcutánea de BMDCs en la región de flanco de ratones C57BL/6 una vez por semana para un total de 3-4 inyecciones induce una puntuación clínica pico de EAE alrededor de 2-2.5 con inicio de enfermedad reproducible en día 11-1237 ,58. Proporcionamos un breve clip para demostrar los diferentes síntomas clínicos entre activa y pasiva inducción de EAE (Video 1).
Las limitaciones reconocidas de nuestro protocolo incluyen el tiempo requerido por los métodos empleados y la dependencia de un microambiente fisiológico no relevante para la diferenciación de BMDC. Sin embargo, mientras que el anticuerpo enriquecido métodos de separación de la columna de la colección para DCs y las células de T de bazo de ratón pueden ser eficiente más tiempo, sufre de un bajo rendimiento de la población deseada de DC. Así, la ventaja del método de desarrollo DC derivadas de la médula ósea es la producción más alta de la escala log de las poblaciones de CC en comparación con la separación de columnas anticuerpo del bazo entero. Como se señaló anteriormente, el DCs generadas en vitro por este método requiere una alta concentración de suplementación de citoquinas que no es fisiológicamente relevante para DCs en vivo microambiente59 y también asegura a largo plazo sostenibilidad de DC. También, el GM-CSF utilizado en nuestro protocolo no es una citocina esencial para la normal diferenciación DC en vivo60. Sin embargo, el protocolo propuesto de generación BMDC reproducible rinde una alta fracción de funcionalmente TolDCs y debe ser visto como un método altamente confiable y reproducible para la generación de DCs funcionales con propiedades tolerogénicas.
En conclusión, los TolDCs generados por el protocolo descrito aquí puede efectivamente caracterizarse mediante la evaluación de sus perfiles de expresión génica y proteínas, mediante la determinación de su capacidad para modular las respuestas inmunes dependientes de células T en vitroy por evaluar su función como terapia celular adoptiva para suprimir la inducción de EAE en vivo. Nuestro protocolo proporciona un marco para la evaluación de nuevos agentes cree que la capacidad para inducir TolDCs y para acelerar aún más el proceso de desarrollo terapéutico para TolDCs de banco a la clínica.

Las células dendríticas (DCs) son una parte integral del sistema inmune innato y primero fueron descubiertas y caracterizadas por Ralph Steinman y Zanvil Cohn en 1973 como el principal antígeno profesional que presenta las células1. DCs han demostrado jugar un papel importante en la activación inmune por presentar antígenos procesados a las células T y las células B por medio de complejos de histocompatibilidad (MHC) en órganos linfoides secundarios para vincular los sistemas inmunitarios innato y adaptativo2. En el sistema inmune mamífero, hay al menos dos categorías de DCs que se han descrito como mieloide DCs plasmacytoid DCs (PDC)3. DCs mieloides, también conocidas como DCs convencionales (CDC), se caracterizan por la expresión de CD11c y puede ser distinguido como inmaduros DCs (iDCs) in vitro de células progenitoras de médula ósea o de monocitos de sangre periférica utilizando factor del granulocyte-macrófago-estimulante de colonias (GM-CSF) e IL-4 en murinas y humanas especies, respectivamente4.
Señales de activación de 'peligro', tales como patrones moleculares asociados a patógenos (PAMP) o patrones moleculares asociados a daño (húmedo), conducirá CDI maduración hacia DCs inmunogénicas como DCs madurados (mDCs) vía atar varios receptores de reconocimiento de patrón la superficie DC5. Inmunogénicas DCs más prime ingenuo T proliferación y diferenciación celular a través de la regulación al alza de MHCII2ligandos coestimuladoras (CD80, CD86 y CD40)6, citocinas y otros mediadores solubles7. Una cascada de producción pro-inflamatoria del mediador de DCs inmunogénica es esencial para la diferenciación de células T mediada por citocinas. Por ejemplo, IFN-γ y la IL-12 son necesarios para la diferenciación de Th18 e IL-1, IL-6 e IL-23 son críticos para ingenuos polarización de la célula de T hacia Th17 células9. Aunque DCs madurados reaccionan ante antígenos extraños, activación incontrolada de la DC por los antígenos del uno mismo puede hacer ablación de la tolerancia y fomentar el desarrollo de enfermedades autoinmunes mediante la generación de células autorreactivas T cuya activación conduce a la destrucción del tejido10 .
Los informes recientes han proporcionado evidencia clara de la plasticidad de la DC, ejemplificado por su capacidad para interactuar con diferentes señales dentro de su microambiente del tejido y diferenciar en subgrupos distintos efector supresor DC. Los mediadores antiinflamatorios, tales como IL-1011, TGF-β12y13 de la HO-1 han demostrado jugar un papel importante en la supresión inmune induciendo tolerogénicas DCs (TolDCs). Estos TolDCs adquirir funciones reguladoras y suprimir la proliferación de la célula de T14. Además, la falta de estimulación conjunta por DCs y la producción de mediadores antiinflamatorios de TolDCs contribuyen a la inducción de células T reguladoras (Tregs) y también inhibe Th1 y Th17 diferenciación y expansión15. En más allá de dos décadas, se ha reportado el potencial terapéutico de TolDCs por varios investigadores. En estos estudios, la administración del ex-vivo genera síntomas patológicos TolDCs mejorada no sólo en diversos modelos preclínicos de enfermedades autoinmunes16 pero también condujo al desarrollo de tolerancia inmunológica en pacientes17 ,18. Curiosamente, hoy en día la terapia de TolDCs ha sido considerada como un enfoque alternativo o complementario para enfermedades autoinmunes en varios ensayos clínicos, incluyendo tipo 1 diabetes mellitus19-artritis reumatoide20, 21, esclerosis múltiple (EM)22,23,24y enfermedad25 de Crohn.
Hay una variedad de protocolos que han sido empleados para el desarrollo de TolDCs y varios laboratorios han informado de métodos para la generación y caracterización fenotípica de TolDCs. Estos métodos pueden utilizarse para generar reproducible TolDCs en vitro de progenitores hematopoyéticos y mantener estable en un tolerogénicas estado en vivo26,27,28,29. El CDI se puede convertir en TolDCs por la exposición a diversos agentes farmacológicos inmunomoduladores o citoquinas antiinflamatorias. Por ejemplo, la vitamina D3 es un conocido agente farmacológico conocido para aumentar la producción de IL-10 y suprimir la secreción de IL-12 de DCs y así potenciar su función inmunosupresora30. Por otra parte, cuando DCs están expuestos a estímulos inflamatorios potentes, como los lipopolisacáridos (LPS), varios agentes farmacológicos tales como dexametasona31, rapamicina32y33 de los corticosteroides han demostrado para inducir la Fenotipo TolDC reduciendo la expresión de superficie de DC de CD40, CD80, CD86 y MHCII34. IL-10 y TGF-β son las citocinas antiinflamatorias más estudiado para inducir tolerancia de DC35 y la exposición concomitante a cada una de estas citoquinas se han demostrado para inducir un fenotipo tolerogénicas en DCs36.
Desde el tolerogénicas que DC se define por características funcionales en lugar de marcadores fenotípicos, hay una gran necesidad de desarrollar un método consistente para celular y caracterización funcional de TolDCs. Por otra parte, un protocolo riguroso y consistente debe establecerse para la constante evaluación y caracterización del fenotipo DC tolerogénicas sea eficaz y reproducible comparar la capacidad de nuevos agentes para inducir el fenotipo de TolDC en el laboratorio. Aquí proporcionamos un protocolo detallado con métodos paso a paso para aislar CDI de progenitores hematopoyéticos de ratones y posteriormente analizar la eficacia de nuevos agentes bajo evaluación de su capacidad para convertir CDI TolDCs, proporcionando una sólida caracterización fenotípica y funcional de TolDCs in vitro e in vivo. Esta descripción incluye un elaborado método para caracterizar la TolDCs por sus ligandos de superficie, perfil del cytokine y funciones inmunosupresoras en vitro. También ofrecemos un ejemplo de un método para explorar la posible aplicación terapéutica de estas TolDCs en un modelo preclínico de la EM, la encefalomielitis autoinmune experimental (EAE). Este protocolo establecido ayudará a los investigadores a evaluar la capacidad de nuevos agentes para promover la inducción de TolDCs y facilitará el esfuerzo por ampliar el alcance del desarrollo terapéutico TolDC.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>CDDO-DFPA (RTA-408)</td>
			<td>Reata Pharmaceuticals</td>
			<td>in house synthesis</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse GM-CSF</td>
			<td>Peprotech Inc.</td>
			<td>315-03</td>
			<td>BMDC differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IL-4</td>
			<td>Peprotech Inc.</td>
			<td>214-14</td>
			<td>BMDC differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharides (LPS)</td>
			<td>Sigma Aldrich Inc.</td>
			<td>L2880</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma Aldrich Inc.</td>
			<td>516732</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pertussis toxin (PTX)</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>3097</td>
			<td>EAE induction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOG (35&#8211;55) peptide</td>
			<td>21stCentury Biochemicals</td>
			<td>in house synthesis</td>
			<td>EAE induction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Gibco, Life Technologies</td>
			<td>15250-061</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 plus L-glutamine</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11875-093</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-essential amino acid (100X)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11140050</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15630080</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin/streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#956;m cell strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352340</td>
			<td>Cell isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-conjugated CD80</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>557227</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-conjugated CD86</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555665</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-conjugated PD-L1</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>124307</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC-conjugated MHCII</td>
			<td>Miltenyi Biotec Inc.</td>
			<td>130-112-388</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC-conjugated CD11c</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>340544</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isotype matched PE</td>
			<td>Miltenyi Biotec Inc.</td>
			<td>130-091-835</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isotype matched APC</td>
			<td>Miltenyi Biotec Inc.</td>
			<td>130-091-836</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFSE</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>423801</td>
			<td>T cell proliferation assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pan dendritic cell isolation kit</td>
			<td>Miltenyi Biotec Inc.</td>
			<td>130-100-875</td>
			<td>T cell proliferation assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FcR Blocking Reagent</td>
			<td>Miltenyi Biotec Inc.</td>
			<td>130-100-875</td>
			<td>T cell proliferation assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pan Dendritic Cell Biotin-Antibody Cocktail</td>
			<td>Miltenyi Biotec Inc.</td>
			<td>130-100-875</td>
			<td>T cell proliferation assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Biotin MicroBeads</td>
			<td>Miltenyi Biotec Inc.</td>
			<td>130-100-875</td>
			<td>T cell proliferation assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD4+ T cell isolation kit</td>
			<td>Miltenyi Biotec Inc.</td>
			<td>130-104-454</td>
			<td>T cell proliferation assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD4+ T cell Biotin-Antibody Cocktail</td>
			<td>Miltenyi Biotec Inc.</td>
			<td>130-104-454</td>
			<td>T cell proliferation assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Biotin MicroBeads</td>
			<td>Miltenyi Biotec Inc.</td>
			<td>130-104-454</td>
			<td>T cell proliferation assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK lysing buffer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A1049201</td>
			<td>BMDC differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml syringe</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>309626</td>
			<td>T cell proliferation assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 ml syringe</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>309588</td>
			<td>BMDC differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25G needle</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>309626</td>
			<td>T cell proliferation assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>23G needle</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>309588</td>
			<td>BMDC differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma Aldrich Inc.</td>
			<td>A2058</td>
			<td>T cell proliferation assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15575020</td>
			<td>T cell proliferation assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS Column</td>
			<td>Miltenyi Biotec Inc.</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td>T cell proliferation assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pre-Separation Filter</td>
			<td>Miltenyi Biotec Inc.</td>
			<td>130-095-823</td>
			<td>T cell proliferation assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>collagenase D</td>
			<td>Sigma Aldrich Inc.</td>
			<td>11088858001</td>
			<td>T cell proliferation assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14025076</td>
			<td>T cell proliferation assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ovalbumin (OVA) peptide 323&#8211;329</td>
			<td>Sigma Aldrich Inc.</td>
			<td>O1641</td>
			<td>T cell proliferation assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IFN-&#947; TaqMan probe</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Mm01168134_m1</td>
			<td>qRT-PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IL-12a TaqMan probe</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Mm00434165</td>
			<td>qRT-PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IL-12 p70 DuoSet ELISA</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>DY419-05</td>
			<td>ELISA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse EDN-1 ELISA</td>
			<td>RayBiotech</td>
			<td>ELM-EDN1-1</td>
			<td>ELISA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNF-&#945; TaqMan probe</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Mm00443258</td>
			<td>qRT-PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse TNF-&#945; Quantikine ELISA Kit</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>MTA00B</td>
			<td>ELISA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-6 TaqMan probe</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Mm00446190</td>
			<td>qRT-PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IL-6 Quantikine ELISA Kit</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>M6000B</td>
			<td>ELISA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-23a TaqMan probe</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Mm01160011</td>
			<td>qRT-PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IL-23 DuoSet ELISA</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>DY1887-05</td>
			<td>ELISA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-4 TaqMan probe</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Mm99999154_m1</td>
			<td>qRT-PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-10 TaqMan probe</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Mm01288386_m1</td>
			<td>qRT-PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TGF-&#946; TaqMan probe</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Mm01178820_m1</td>
			<td>qRT-PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Heme Oxygenase 1 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab13248</td>
			<td>Western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-&#946;-actin antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab8226</td>
			<td>Western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System</td>
			<td>Bio-Rad Inc.</td>
			<td></td>
			<td>qRT-PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSCalibur Cell Analyzer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

development and functional characterization of murine tolerogenic dendritic cells

El sistema inmune funciona manteniendo un equilibrio ajustado entre la coordinación de las respuestas contra antígenos extraños y mantener un estado insensible contra antígenos del uno mismo, así como los antígenos derivados de microorganismos comensales. La interrupción de esta homeostasis inmune puede conducir a la inflamación crónica y al desarrollo de autoinmunidad. Las células dendríticas (DCs) son las células presentadoras de antígeno profesionales del sistema inmune innato implicado en la activación de las células Naive T para iniciar la respuesta inmune contra antígenos extraños. Sin embargo, el DCs se pueden distinguir también en TolDCs que actúan para mantener y promover la tolerancia de la célula de T y para suprimir células efectoras contribuyendo con el desarrollo de cualquier condiciones de inflamación crónica o autoinmune. El reciente avance en nuestra comprensión de TolDCs sugiere que se puede conseguir tolerancia DC modulando sus condiciones de diferenciación. Este fenómeno ha conducido a un enorme crecimiento en el desarrollo de terapias TolDC para numerosos trastornos del sistema inmune causadas por romper en tolerancia inmunológica. Exitos estudios en modelos murinos de autoinmunidad preclínicos más han validado la utilidad inmunoterapéutico de TolDCs en el tratamiento de los trastornos autoinmunitarios. Hoy en día, TolDCs se han convertido en una herramienta prometedora de la inmunoterapia en la clínica para reintegro de tolerancia inmunológica en varios desordenes inmunes apuntando las respuestas autoinmunes patógenas dejando inmunidad protectora intacta. Aunque una variedad de estrategias ha sido propuesta por varios laboratorios para inducir TolDCs, no hay consistencia en la caracterización del fenotipo celular y funcional de estas células. Este protocolo proporciona a una guía paso a paso para el desarrollo de la médula ósea DCs en grandes números, un método único utilizado para diferenciarlos en TolDCs con un triterpenoide sintético 2-cyano-3,12-dioxooleana-1,9-dien-28-oic difluoro-propil-amida del ácido (CDDO-DFPA) y las técnicas utilizadas para confirmar su fenotipo, incluyendo análisis de firmas moleculares esenciales de TolDCs. Por último, os mostramos un método para evaluar la función de TolDC por prueba su respuesta inmunosupresora en vitro e in vivo en un modelo preclínico de la esclerosis múltiple.

La diferenciación y selección de BMDCs:
Las células progenitoras de médula ósea fueron cultivadas en Medio RPMI completo en presencia de GM-CSF e IL-4 se diferencian en CDI por 7 días (figura 1A). El día 1, las células eran de tamaño pequeñas y demostraron morfología esférica. Lavado con PBS antes de la sustitución de medio fresco en 3 días ayudó a las células a clusters de forma y también aumentó la población de CD11c+ las células. El día 4, BMDCs fueron agrandadas de tamaño e inició la formación de grupos. Macrófagos adheridos también fueron convertidos y observados en la parte inferior de la placa con una forma alargada. El día 5, se forman racimos de tamaño grandes de BMDCs. El día 6, también se observaron un gran número de BMDCs semi-adherentes y flotantes. BMDCs fueron cosechadas en el día 7 y analizadas por citometría de flujo para la expresión de CD11c como un marcador específico de DCs murinos. Como se muestra en una parcela de citometría de flujo representativo en la figura 1B, alrededor 83,6% de la BMDCs expresión de CD11c fueron obtenidos por este método.
Inducción y caracterización genética de TolDCs:
Algunos de los agentes que se sabe para inducir TolDCs, como la vitamina D338 y dexametasona39, se saben que abajo-regulan la expresión de ligandos de superficie de DC, incluyendo MHC II y moléculas coestimuladoras, CD40, CD80 y CD86. Por el contrario, en el contexto de LPS u o CD40L inducida por la maduración de DCs, inhibidores de la calcineurina ciclosporina A y FK506 no mostraron efecto sobre la expresión de CD83, CD80, CD86 y MHC II33. Según lo demostrado por análisis de citometría de flujo, la inducción de TolDC por CDDO-DFPA no tuvo efectos significativos sobre la expresión del ligando de superficie inducida por LPS de DCs, incluyendo CD80, CD86, MHC II, PD-L1 y CD40. (Figura 2).
Por otra parte, el análisis comparativo del transcriptoma y del cytokine de BMDCs tratados con o sin CDDO-DFPA en presencia o ausencia de LPS había representado perfil gen inflamatorias modulada. CDDO-DFPA tratamiento redujo significativamente LPS inducidas genes de citoquinas pro inflamatorias como IFN-γ, IL-12, EDN1, TNFα, IL-6 e IL-23 (Figura 3A-3F). Se conocen citoquinas de Th1 (IFN-γ y la IL-12) y Th17 (IL-6 e IL-23) diferenciación celular. Además, CDDO-DFPA tratados BMDCs demostradas la mayor expresión de genes de citoquinas antiinflamatorias como IL-4, IL-10, TGF-β y HO-1 (Figura 4A-4D). Estos genes antiinflamatorios son conocidos modulador de autoinmunidad por promoción de Th2 (IL-4) y diferenciación de las células Treg (IL-10 y TGF-β). 40 aquí es importante tener en cuenta que el distintivo de la IL-12−; IL-10+ cytokine producción36, la inducción de la HO-1 expresión13y la inhibición de la EDN-141 inducida por tratamiento CDDO-DFPA, son todos conocido para autenticar DCs tolerogénicas función.
Celular y caracterización funcional de TolDCs in vitro
Proliferación de células T mediada por la DC se conoce mediante la contratación de costimulatory ligando superficial así como la secreción de citoquinas y mediadores solubles7. Sin embargo, TolDCs inhibir respuestas de células T a través de varios mecanismos: mediante la inducción de anergia de células T, promoviendo activamente la eliminación de células autorreactivas y promoviendo la polarización de la ingenua T las células Tregs42. Ya hemos reportado la caracterización funcional de DFPA CDDO inducida por TolDCs37. Anergia de células t y la eliminación de células autorreactivas T pueden ser analizadas independientemente de verificación marcadores superficiales o manchas de anexina V/7-AAD. Sin embargo, se confirmó indirectamente este fenotipo mediante la medición de índice de proliferación de células T. Para ello, utilizaron ratones transgénicos C57BL/6 OTII células T y expuestos a DCs syngeneic extraído de ratones C57BL/6 y tratados con o sin CDDO-DFPA. Estos DCs lavadas y cultivadas conjuntamente con CFSE teñido de células T con el péptido de OVA. Se observó una reducción significativa en la proliferación de la célula de T por DCs tratadas previamente CDDO-DFPA, sugiriendo su fenotipo de tolerogénicas (figura 5).
En vivo caracterización funcional de TolDCs en un modelo preclínico de la autoinmunidad
Por último, la funcionalidad de TolDCs DFPA-inducida puede probarse en cualquiera de una serie de preclínica en vivo modelos caracterizados autoinmunes o inflamatorias características. Desde entonces, EAE es un ampliamente aceptado modelo murino preclínico de la enfermedad clínica inmune-mediada del sistema nervioso central, MS43, utilizamos esto en nuestro estudio actual. Con el fin de examinar más lejos el en vivo funcionalidad de DFPA CDDO inducida por TolDCs, desafió en un modelo murino preclínico de EAE pasiva. Para esto, BMDCs fueron cultivados con o sin CDDO-DFPA en presencia de LPS y MOG (35-55). Estas células fueron inyectadas luego repetidamente como protocolo programado representado en la figura 6A y ratones se observaron sistemáticamente para la manifestación de signos clínicos. Como era de esperar, LPS y MOG (35-55) pulsada BMDCs mostraron síntomas clínicos de la EAE, sin embargo; CDDO-DFPA había cebada BMDCs tratados grupo mostrada la aparición retardada de la enfermedad con síntomas clínicos significativamente reducidas (Figura 6B). Estos resultados validan el fenotipo inmunosupresor de TolDCs inducida por el tratamiento de DFPA CDDO.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57637/57637fig1.jpg"> Figura 1: desarrollo y caracterización fenotípica de BMDCs: (A) médula ósea fueron arrastrada de los huesos de tibia y fémur de ratones C57BL/6 y más distinguido al BMDCs. Una formación de grupos de célula apropiada fue rastreado por microscopia ligera durante todo el periodo de diferenciación (barras de escala, 100μm). (B) la diferenciación de BMDCs fue confirmada por la expresión superficial de CD11c, como analiza por FACS. Gráficas representan el porcentaje de CD11c ampliado+ población de la célula. Gating (C) estrategia de BMDCs. células primero fueron cerrada para excluir los residuos (FSC y SSC). Una puerta de exclusión doblete fue utilizada para la puerta en Maillots células (FL2-W vs FL2-A). Dentro de las células de la camiseta, células vivas fueron bloqueadas en la parcela 7-AAD (7-AAD vs FSC). Entonces las células eran más analizadas y cerradas sobre la expresión de CD11c. <a href="/files/ftp_upload/57637/57637fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57637/57637fig2.jpg"> Figura 2: la expresión del ligand superficie celular DC es inalterada por CDDO-DFPA. Las células fueron tratadas previamente en la presencia o ausencia de DFPA CDDO (200 nM) por 1 hora antes de la estimulación con LPS (100 ng/ml) durante 24 horas. Expresión superficial de la célula de CD80, CD86, MHC II, PD-L1 y CD40 fue analizada por citometría de flujo. Esta figura ha sido modificada desde Informes científicos 7, número de artículo: 9886 (2017), doi:10.1038 / s41598-017-06907-4. Reproducido y republicado con permiso del autor. <a href="/files/ftp_upload/57637/57637fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57637/57637fig3.jpg"> Figura 3: CDDO-DFPA altera el fenotipo genético y proteínas del sistema inmunitario DCs. BMDCs fueron tratados previamente en la presencia o ausencia de CDDO-DFPA (50-400 nM) durante 1 hora antes de la adición de LPS (100 ng/ml), y ya sea para la extracción de RNA (4 hrs.) o medio de cultivo de la condición de 24 hrs. antes de la recogida para el análisis del cytokine. Se midieron los niveles de IL-12 (B), D de TNFα, IL-6 (E) y IL-23 (F) por qRT-PCR y ELISA. Mientras que el nivel de IFN-γ (A) se midió por qRT-PCR y EDN-1 (C) por ELISA solo. Los resultados se expresan como media ± D.S. de tres experimentos. * P < 0.05, ** P < 0.01, *** P < 0.001 en comparación con los grupos tratados con LPS. Prueba t de student no pareado. Esta figura ha sido modificada desde Informes científicos 7, número de artículo: 9886 (2017), doi:10.1038 / s41598-017-06907-4. Reproducido y republicado con el permiso de derechos de autor". <a href="/files/ftp_upload/57637/57637fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57637/57637fig4.jpg"> Figura 4: CDDO-DFPA inducida por fenotipo de TolDCs confirmada por la expresión de genes y proteínas. BMDCs fueron tratadas previamente en la presencia o ausencia de CDDO-DFPA (10-400 nM) durante 1 hora antes de la adición de LPS (100 ng/ml), y las células se cosecharon para extracción de RNA después de 24 hrs. Se midieron los niveles de IL-4 (A), IL-10 (B) y TGF-β (C) por qRT-PCR. (D) de la célula proteína lisados fueron recogidos a las 12 hrs. para el análisis y los niveles de HO-1 y β-actina expresión determinó por borrar occidental. Los resultados se expresan como media ± D.S. de tres experimentos. * P < 0.05, ** P < 0.01, *** P < 0.001 en comparación con los grupos tratados con LPS. Prueba t de student no pareado. <a href="/files/ftp_upload/57637/57637fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57637/57637fig5.jpg"> Figura 5: CDDO-DFPA expuesto DCs suprimir la proliferación de célula T. DCs fueron tratadas previamente con CDDO-DFPA (100-400 nM) por 1 hora solamente se lavado y co cultivada con CFSE tiñe las células de T en un 1:10 cociente. (A) esplénico células T y DCs fueron aislados de ratones transgénicos C57BL/6 OTII y ratones C57BL/6, respectivamente. CDDO-DFPA pretratados DCs fueron cultivadas conjuntamente con CFSE teñido de células T (w) o sin (sin) además de los huevos durante la incubación. Proliferación de la célula de t fue determinada por citometría de flujo en el día 2. Gráficas representan el porcentaje de división de las células de T con respecto a números de división de la célula de T. Los datos están una representación de 3 experimentos independientes. Esta figura ha sido modificada desde Informes científicos 7, número de artículo: 9886 (2017), doi:10.1038 / s41598-017-06907-4. Reproducido y republicado con permiso del autor. <a href="/files/ftp_upload/57637/57637fig5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57637/57637fig6.jpg"> Figura 6: MOG preparado DC-inducida pasiva EAE es abrogado por TolDCs. (A) inducción de EAE por MOG (35-55)-pulsado BMDCs. BMDCs maduros fueron tratados en la presencia o ausencia de DFPA CDDO (400 nM) y posteriormente pulsada con MOG (35-55) para 4 hrs. Un total de 200 μl de 2 x 106 células fue administrado por inyección subcutánea en la región de flanco de ratones C57BL/6 una vez por semana para un total de cuatro inyecciones. Cada vez, PTX fue administrado por inyección i.p. de inmediato y otra vez 2 días después (día 0 en el 4 º ciclo). (B) puntuaciones clínicas fueron registradas después de las cuatro inyecciones, utilizando criterios estándar. Todos los datos fueron presentados como la media ± SEM * P < 0.05. Múltiples pruebas t con el análisis de Holm-Sidak (n = 7 ratones de cada grupo). Esta figura ha sido modificada desde Informes científicos 7, número de artículo: 9886 (2017), doi:10.1038 / s41598-017-06907-4. Reproducido y republicado con permiso del autor. <a href="/files/ftp_upload/57637/57637fig6large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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Development and Functional Characterization of Murine Tolerogenic Dendritic Cells

Aquí, presentamos un protocolo para desarrollar y caracterizar células dendríticas tolerogénicas (TolDCs) y evaluar su utilidad de la inmunoterapia.

Desarrollo y caracterización funcional de células dendríticas tolerogénicas murino

The immune system operates by maintaining a tight balance between coordinating responses against foreign antigens and maintaining an unresponsive state ...

development-functional-characterization-murine-tolerogenic-dendritic

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

10.5K vistas.  Case Western Reserve University. Aquí, presentamos un protocolo para desarrollar y caracterizar células dendríticas tolerogénicas (TolDCs) y evaluar su utilidad de la inmunoterapia.

Video: Development and Functional Characterization of Murine Tolerogenic Dendritic Cells

Segmentation and Measurement of Fat Volumes in Murine Obesity Models Using X-ray Computed Tomography

Obesity is associated with increased morbidity and mortality as well as reduced metrics in quality of life.1 Both environmental and genetic factors are associated with obesity, though the precise underlying mechanisms that contribute to the disease are currently being delineated.2,3 Several small animal models of obesity have been developed and are employed in a variety of studies.4 A critical component to these experiments involves the collection of regional and/or total animal fat content data under varied conditions.
Traditional experimental methods available for measuring fat content in small animal models of obesity include invasive (e.g. ex vivo measurement of fat deposits) and non-invasive (e.g. Dual Energy X-ray Absorptiometry (DEXA), or Magnetic Resonance (MR)) protocols, each of which presents relative trade-offs. Current invasive methods for measuring fat content may provide details for organ and region specific fat distribution, but sacrificing the subjects will preclude longitudinal assessments. Conversely, current non-invasive strategies provide limited details for organ and region specific fat distribution, but enable valuable longitudinal assessment. With the advent of dedicated small animal X-ray computed tomography (CT) systems and customized analytical procedures, both organ and region specific analysis of fat distribution and longitudinal profiling may be possible. Recent reports have validated the use of CT for in vivo longitudinal imaging of adiposity in living mice.5,6 Here we provide a modified method that allows for fat/total volume measurement, analysis and visualization utilizing the Carestream Molecular Imaging Albira CT system in conjunction with PMOD and Volview software packages.

Fat content analysis is routinely conducted in studies utilizing murine obesity models. Emerging methods in small animal CT imaging and analysis are providing for longitudinal detail rich fat content analysis. Here we detail step by step procedures for performing small animal CT imaging, analysis, and visualization.

La segmentación y la medición de los volúmenes de grasa en modelos murinos de obesidad Usando rayos X de tomografía computarizada

Obesity is associated with increased morbidity and mortality as well as reduced metrics in quality of life.1 Both environmental and genetic factors are ...

Investigación

Medicina

Development of Obliterative Bronchiolitis in a Murine Model of Orthotopic Lung Transplantation

Orthotopic lung transplantation in rats was first reported by Asimacopoulos and colleagues in 1971 1. Currently, this method is well accepted and standardized not only for the study of allo-rejection but also between syngeneic strains for examining mechanisms of ischemia-reperfusion injury after lung transplantation. Although the application of the rat and other large animal model 2 contributed significantly to the elucidation of these studies, the scope of those investigations is limited by the scarcity of knockout and transgenic rats. Due to no effective therapies for obliterative bronchiolitis, the leading cause of death in lung transplant patients, there has been an intensive search for pre-clinical models that replicate obliterative bronchiolitis. The tracheal allograft model is the most widely used and may reproduce some of the histopathologic features of obliterative bronchiolitis 3. However, the lack of an intact vasculature with no connection to the recipient's conducting airways, and incomplete pathologic features of obliterative bronchiolitis limit the utility of this model 4. Unlike transplantation of other solid organs, vascularized mouse lung transplants have only recently been reported by Okazaki and colleagues for the first time in 2007 5. Applying the basic principles of the rat lung transplant, our lab initiated the obliterative bronchiolitis model using minor histoincompatible antigen murine orthotopic single-left lung transplants which allows the further study of obliterative bronchiolitis immunopathogenesis6.

Obliterative bronchiolitis is the key impediment to the long-term survival of lung transplant recipients and the lack of a robust preclinical model precludes examining obliterative bronchiolitis immunopathogenesis. Unlike other solid organ transplants, vascularized mouse lung transplantation has only recently been developed. Here we show our independently developed obliterative bronchiolitis model after murine orthotopic single-lung transplantation.

El desarrollo de bronquiolitis obliterante en un modelo murino de trasplante de pulmón ortotópico

Orthotopic lung transplantation in rats was first reported by Asimacopoulos and colleagues in 1971 1. Currently, this method is well accepted and ...

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human pulp-derived stem cells (hDPSCs) possess high proliferation potential with multi-lineage differentiation capacity compare to the ordinary source of adult stem cells1-8; therefore, hDPSCs could be the good candidates for autologous transplantation in tissue engineering and regenerative medicine. Along with these benefits, possessing the mesenchymal stem cells (MSC) features, such as immunolodulatory effect, make hDPSCs more valuable, even in the case of allograft transplantation6,9,10. Therefore, the primary step for using this source of stem cells is to select the best protocol for isolating hDPSCs from pulp tissue. In order to achieve this goal, it is crucial to investigate the effect of various isolation conditions on different cellular behaviors, such as their common surface markers &amp; also their differentiation capacity.
Thus, here we separate human pulp tissue from impacted third molar teeth, and then used both existing protocols based on literature, for isolating hDPSCs,11-13 i.e. enzymatic dissociation of pulp tissue (DPSC-ED) or outgrowth from tissue explants (DPSC-OG). In this regards, we tried to facilitate the isolation methods by using dental diamond disk. Then, these cells characterized in terms of stromal-associated Markers (CD73, CD90, CD105 &amp; CD44), hematopoietic/endothelial Markers (CD34, CD45 &amp; CD11b), perivascular marker, like CD146 and also STRO-1. Afterwards, these two protocols were compared based on the differentiation potency into odontoblasts by both quantitative polymerase chain reaction (QPCR) &amp; Alizarin Red Staining. QPCR were used for the assessment of the expression of the mineralization-related genes (alkaline phosphatase; ALP, matrix extracellular phosphoglycoprotein; MEPE &amp; dentin sialophosphoprotein; DSPP).14

The method described isolation and characterization of human Dental Pulp Stem Cells (hDPSCs) by using either enzymatic dissociation of pulp (DPSC-ED) or direct outgrowth of stem cells from pulp tissue explants (DPSC-OG). Then followed by in vitro comparative differentiation of both types of hDPSCs into odontoblasts.

Diferenciación de aislamiento, caracterización y comparativo de las células madre derivadas de la Pulpa Dental de los dientes permanentes mediante dos métodos diferentes

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for progression-free and overall survival. Therefore, translational research needs to provide further molecular evidence to improve targeted therapies for malignant melanomas. In the past, oncogenic mechanisms related to melanoma were extensively studied in established cell lines. On the way to more personalized treatment regimens based on individual genetic profiles, we propose to use patient-derived cell lines instead of generic cell lines. Together with high quality clinical data, especially on patient follow-up, these cells will be instrumental to better understand the molecular mechanisms behind melanoma progression.
Here, we report the establishment of primary melanoma cultures from dissected fresh tumor tissue. This procedure includes mincing and dissociation of the tissue into single cells, removal of contaminations with erythrocytes and fibroblasts as well as primary culture and reliable verification of the cells' melanoma origin.
Recent reports revealed that melanomas, like the majority of tumors, harbor a small subpopulation of cancer stem cells (CSCs), which seem to exclusively fuel tumor initiation and progression towards the metastatic state. One of the key markers for CSC identification and isolation in melanoma is CD133. To isolate CD133+ CSCs from primary melanoma cultures, we have modified and optimized the Magnetic-Activated Cell Sorting (MACS) procedure from Miltenyi resulting in high sorting purity and viability of CD133+ CSCs and CD133- bulk, which can be cultivated and functionally analyzed thereafter.

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

This article describes the preparation of freshly obtained melanoma tissue into primary cell cultures, and how to remove contaminations of erythrocytes and fibroblasts from the tumor cells. Finally, we describe how CD133+ putative melanoma stem cells are sorted from the CD133- bulk using Magnetic Activated Cell Sorting (MACS).

Paciente celulares derivadas Cultura y aislamiento de CD133<sup&gt; +</sup&gt; Putativos células madre del cáncer de melanoma

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for ...

Quantitative Analysis and Characterization of Atherosclerotic Lesions in the Murine Aortic Sinus

Atherosclerosis is a disease of the large arteries and a major underlying cause of myocardial infarction and stroke. Several different mouse models have been developed to facilitate the study of the molecular and cellular pathophysiology of this disease. In this manuscript we describe specific techniques for the quantification and characterization of atherosclerotic lesions in the murine aortic sinus and ascending aorta. The advantage of this procedure is that it provides an accurate measurement of the cross-sectional area and total volume of the lesion, which can be used to compare atherosclerotic progression across different treatment groups. This is possible through the use of the valve leaflets as an anatomical landmark, together with careful adjustment of the sectioning angle. We also describe basic staining methods that can be used to begin to characterize atherosclerotic progression. These can be further modified to investigate antigens of specific interest to the researcher. The described techniques are generally applicable to a wide variety of existing and newly created dietary and genetically-induced models of atherogenesis.

We describe procedures to quantify and characterize atherosclerotic lesions in mouse models using precision sectioning of the aortic sinus and ascending aorta combined with histochemical and immunohistochemical analysis.

Atherosclerosis is a disease of the large arteries and a major underlying cause of myocardial infarction and stroke. Several different mouse models have ...

Isolation and Functional Characterization of Human Ventricular Cardiomyocytes from Fresh Surgical Samples

Cardiomyocytes from diseased hearts are subjected to complex remodeling processes involving changes in cell structure, excitation contraction coupling and membrane ion currents. Those changes are likely&#160;to be responsible for the increased arrhythmogenic risk and the contractile alterations leading to systolic and diastolic dysfunction in cardiac patients. However, most information on the alterations of myocyte function in cardiac diseases has come from animal models.
Here we describe and validate a protocol to isolate viable myocytes from small surgical samples of ventricular myocardium from patients undergoing cardiac surgery operations. The protocol is described in detail. Electrophysiological and intracellular calcium measurements are reported to demonstrate the feasibility of a number of single cell measurements in human ventricular cardiomyocytes obtained with this method.
The protocol reported here can be useful for future investigations of the cellular and molecular basis of functional alterations of the human heart in the presence of different cardiac diseases. Further, this method can be used to identify novel therapeutic targets at cellular level and to test the effectiveness of new compounds on human cardiomyocytes, with direct translational value.

Current knowledge on the cellular basis of cardiac diseases mostly relies on studies on animal models. Here we describe and validate a novel method to obtain single viable cardiomyocytes from small surgical samples of human ventricular myocardium. Human ventricular myocytes can be used for electrophysiological studies and drug testing.

Aislamiento y caracterización funcional de Human ventricular cardiomiocitos a partir de muestras quirúrgicas recientes

Cardiomyocytes from diseased hearts are subjected to complex remodeling processes involving changes in cell structure, excitation contraction coupling and ...

Assessment of Ovarian Cancer Spheroid Attachment and Invasion of Mesothelial Cells in Real Time

Ovarian cancers metastasize by shedding into the peritoneal fluid and dispersing to distal sites within the peritoneum. Monolayer cultures do not accurately model the behaviors of cancer cells within a nonadherent environment, as cancer cells inherently aggregate into multicellular structures which contribute to the metastatic process by attaching to and invading the peritoneal lining to form secondary tumors. To model this important stage of ovarian cancer metastasis, multicellular aggregates, or spheroids, can be generated from established ovarian cancer cell lines maintained under nonadherent conditions. To mimic the peritoneal microenvironment encountered by tumor cells in vivo, a spheroid-mesothelial co-culture model was established in which preformed spheroids are plated on top of a human mesothelial cell monolayer, formed over an extracellular matrix barrier. Methods were then developed using a real-time cell analyzer to conduct quantitative real time measurements of the invasive capacity of different ovarian cancer cell lines grown as spheroids. This approach allows for the continuous measurement of invasion over long periods of time, which has several advantages over traditional endpoint assays and more laborious real time microscopy image analyses. In short, this method enables a rapid, determination of factors which regulate the interactions between ovarian cancer spheroid cells invading through mesothelial and matrix barriers over time.

Ovarian cancer cell invasion into the mesothelial lining of the peritoneum is a dynamic process over time. Utilizing a real time analyzer, the invasive capacity of ovarian cancer cells in a spheroid-mesothelial cell co-culture model can be quantified over prolonged time periods, providing insights into factors regulating the metastatic process.

Evaluación de Cáncer de Ovario esferoide El apego y la invasión de células mesoteliales en Tiempo real

Ovarian cancers metastasize by shedding into the peritoneal fluid and dispersing to distal sites within the peritoneum. Monolayer cultures do not ...

High Throughput Characterization of Adult Stem Cells Engineered for Delivery of Therapeutic Factors for Neuroprotective Strategies

Mesenchymal stem cells (MSCs) derived from bone marrow are a powerful cellular resource and have been used in numerous studies as potential candidates to develop strategies for treating a variety of diseases. The purpose of this study was to develop and characterize MSCs as cellular vehicles engineered for delivery of therapeutic factors as part of a neuroprotective strategy for rescuing the damaged or diseased nervous system. In this study we used mouse MSCs that were genetically modified using lentiviral vectors, which encoded brain-derived neurotrophic factor (BDNF) or glial cell-derived neurotrophic factor (GDNF), together with green fluorescent protein (GFP). 
Before proceeding with in vivo transplant studies it was important to characterize the engineered cells to determine whether or not the genetic modification altered aspects of normal cell behavior. Different culture substrates were examined for their ability to support cell adhesion, proliferation, survival, and cell migration of the four subpopulations of engineered MSCs. High content screening (HCS) was conducted and image analysis performed. 
Substrates examined included: poly-L-lysine, fibronectin, collagen type I, laminin, entactin-collagen IV-laminin (ECL). Ki67 immunolabeling was used to investigate cell proliferation and Propidium Iodide staining was used to investigate cell viability. Time-lapse imaging was conducted using a transmitted light/environmental chamber system on the high content screening system.
Our results demonstrated that the different subpopulations of the genetically modified MSCs displayed similar behaviors that were in general comparable to that of the original, non-modified MSCs. The influence of different culture substrates on cell growth and cell migration was not dramatically different between groups comparing the different MSC subtypes, as well as culture substrates. 
This study provides an experimental strategy to rapidly characterize engineered stem cells and their behaviors before their application in long-term in vivo transplant studies for nervous system rescue and repair.

This study describes an experimental platform to rapidly characterize engineered stem cells and their behaviors before their application in long-term in vivo transplant studies for nervous system rescue and repair.

Alto rendimiento caracterización de células madre adultas de ingeniería para la entrega de los factores terapéuticos de estrategias neuroprotectoras

Mesenchymal stem cells (MSCs) derived from bone marrow are a powerful cellular resource and have been used in numerous studies as potential candidates to ...

In vitro Functional Characterization of Mouse Colorectal Afferent Endings

This video demonstrates in detail an in vitro single-fiber electrophysiological recording protocol using a mouse colorectum-nerve preparation. The approach allows unbiased identification and functional characterization of individual colorectal afferents. Extracellular recordings of propagated action potentials (APs) that originate from one or a few afferent (i.e., single-fiber) receptive fields (RFs) in the colorectum are made from teased nerve fiber fascicles. The colorectum is removed with either the pelvic (PN) or lumbar splanchnic (LSN) nerve attached and opened longitudinally. The tissue is placed in a recording chamber, pinned flat and perfused with oxygenated Krebs solution. Focal electrical stimulation is used to locate the colorectal afferent endings, which are further tested by three distinct mechanical stimuli (blunt probing, mucosal stroking and circumferential stretch) to functionally categorize the afferents into five mechanosensitive classes. Endings responding to none of these mechanical stimuli are categorized as mechanically-insensitive afferents (MIAs). Both mechanosensitive and MIAs can be assessed for sensitization (i.e., enhanced response, reduced threshold, and/or acquisition of mechanosensitivity) by localized exposure of RFs to chemicals (e.g., inflammatory soup (IS), capsaicin, adenosine triphosphate (ATP)). We describe the equipment and colorectum&#8211;nerve recording preparation, harvest of colorectum with attached PN or LSN, identification of RFs in the colorectum, single-fiber recording from nerve fascicles, and localized application of chemicals to the RF. In addition, challenges of the preparation and application of standardized mechanical stimulation are also discussed.

In vitro Functional Characterization of Mouse Colorectal Afferent Endings

This video demonstrates a protocol for conducting single-fiber electrophysiological recordings on an in vitro mouse colorectum-nerve preparation.

In vitro Caracterización funcional de ratón colorrectal aferente Endings

This video demonstrates in detail an in vitro single-fiber electrophysiological recording protocol using a mouse colorectum-nerve preparation. The ...

Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells

To date, the available surgical and pharmacological treatments for cardiovascular diseases (CVD) are limited and often palliative. At the same time, gene and cell therapies are highly promising alternative approaches for CVD treatment. However, the broad clinical application of gene therapy is greatly limited by the lack of suitable gene delivery systems. The development of appropriate gene delivery vectors can provide a solution to current challenges in cell therapy. In particular, existing drawbacks, such as limited efficiency and low cell retention in the injured organ, could be overcome by appropriate cell engineering (i.e., genetic) prior to transplantation. The presented protocol describes the efficient and safe transient modification of endothelial cells using a polyethyleneimine superparamagnetic magnetic nanoparticle (PEI/MNP)-based delivery vector. Also, the algorithm and methods for cell characterization are defined. The successful intracellular delivery of microRNA (miR) into human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) has been achieved without affecting cell viability, functionality, or intercellular communication. Moreover, this approach was proven to cause a strong functional effect in introduced exogenous miR. Importantly, the application of this MNP-based vector ensures cell magnetization, with accompanying possibilities of magnetic targeting and non-invasive MRI tracing. This may provide a basis for magnetically guided, genetically engineered cell therapeutics that can be monitored non-invasively with MRI.

Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells

This manuscript describes the efficient, non-viral delivery of miR to endothelial cells by a PEI/MNP vector and their magnetization. Thus, in addition to genetic modification, this approach allows for magnetic cell guidance and MRI detectability. The technique can be used to improve the characteristics of therapeutic cell products.

Preparación y<em&gt; In Vitro</em&gt; Caracterización de Magnetized miR-modificado células endoteliales

To date, the available surgical and pharmacological treatments for cardiovascular diseases (CVD) are limited and often palliative. At the same time, gene ...