Los autores agradecen a Jung Yeon-Joo por su apoyo experimental durante la purificación de synaptosome y Jungjoo Corea Parque imágenes de sinaptosomas con exposición de PS. Además, agradecemos a todos los miembros del laboratorio de Chung de discusión útil. Este trabajo fue financiado por la Fundación Nacional de investigación de concesión de Corea (NRF) financiado por el gobierno coreano (MSIP) (NRF-2016M3C7A1905391 y NRF-2016R1C1B3006969) (W. S. C).

<ol>
	<li>Singh, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes+Assemble+Thalamocortical+Synapses+by+Bridging+NRX1alpha+and+NL1+via+Hevin.">Astrocytes Assemble Thalamocortical Synapses by Bridging NRX1alpha and NL1 via Hevin.</a> Cell. 164 (1-2), 183-196 (2016).</li><li>Allen, N. 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Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axon+degeneration+induces+glial+responses+through+Draper-TRAF4-JNK+signalling.">Axon degeneration induces glial responses through Draper-TRAF4-JNK signalling.</a> Nat Commun. 8, 14355 (2017).</li><li>Dunkley, P. R., Jarvie, P. E., Robinson, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+Percoll+gradient+procedure+for+preparation+of+synaptosomes.">A rapid Percoll gradient procedure for preparation of synaptosomes.</a> Nat Protoc. 3 (11), 1718-1728 (2008).</li><li>Stigliani, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glia+re-sealed+particles+freshly+prepared+from+adult+rat+brain+are+competent+for+exocytotic+release+of+glutamate.">Glia re-sealed particles freshly prepared from adult rat brain are competent for exocytotic release of glutamate.</a> J Neurochem. 96 (3), 656-668 (2006).</li><li>Foo, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+method+for+the+purification+and+culture+of+rodent+astrocytes.">Development of a method for the purification and culture of rodent astrocytes.</a> Neuron. 71 (5), 799-811 (2011).</li><li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents.">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> J Vis Exp. (65), (2012).</li><li>Cahoy, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transcriptome+database+for+astrocytes,+neurons,+and+oligodendrocytes:+a+new+resource+for+understanding+brain+development+and+function.">A transcriptome database for astrocytes, neurons, and oligodendrocytes: a new resource for understanding brain development and function.</a> J Neurosci. 28 (1), 264-278 (2008).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

En este artículo se presentan métodos para un largo plazo imágenes viven en vitro fagocitosis ensayo usando células gliales purificadas y sinaptosomas conjugado con indicador de pH. Se muestra que en comparación con la microglia, astrocitos poseen diferente capacidad de inmersión y degradación durante la fagocitosis de sinaptosomas. Además, nuestros datos sugieren que factores secretados de astrositos, que contienen moléculas puente como GAS6, proteínas y MEGE8, son esenciales para la fagocitosis depende PS eficiente de células gliales en el cerebro. Por otra parte, Megf10 KO astrocitos muestran fagocitosis defectuosa de sinaptosomas.
Para realizar con éxito este experimento, los medios y la DPBS deba intercambiarse cuidadosamente durante las etapas de lavado (sección 5). Primaria cultivadas astrocitos y microglía, especialmente microglía, son vulnerable a la exposición al aire. Por lo tanto, reduciendo los intervalos de tiempo entre pasos de lavado es fundamental para el mantenimiento de células vivas. Para configurar imágenes de vivir a largo plazo con instrumentos en vivo-la proyección de imagen, enfoque manual se recomienda auto enfoque puede aumentar el tiempo de exposición láser/LED, que puede dañar las células.
En este método, la purificación de synaptosome protocolo19 se modifica ligeramente. El documento original separa soluciones de gradiente en 3%, 10%, 15% y 23%. Sin embargo, hemos creado soluciones gradiente de 3%, 10% y 23% para aumentar el rendimiento de sinaptosomas purificadas. Las instrucciones para immunopanning de astrocitos y células de la microglía se modifican también en este método. El objetivo de la original panorámica protocolo21 es purificar solamente astrocitos y utilizar BSL-1, sólo secundario, CD45, O4 y Itgb5 (HepaCAM para ratón) como la orden de immunopanning. Puesto que las placas BSL-1 y secundaria sólo elimina las células endoteliales, así como microglia, cambiamos el orden para CD45, sólo secundario, BSL-1, O4 y Itgb5 (HepaCAM de ratón) para aumentar el rendimiento de la microglía de la CD45 batea plato. En este protocolo, inundada también crías de rata SD (~ P7-P10) con DPBS a través del sistema circulatorio para extraer varias células de la sangre para minimizar la contaminación de las poblaciones no microglial CD45 positivo.
Hay varias ventajas de la prueba de fagocitosis en vitro . El indicador de pH utilizado en la conjugación de synaptosome sólo emite fluorescencia roja en condiciones de pH bajo. Por lo tanto, al procesar los datos, nosotros podemos directamente cuantificar la fluorescencia roja como señal de eventos fagocíticas sin un procedimiento de enfriamiento para eliminar señales de fondo o complicados análisis de imágenes para obtener señales Co localizadas de material engullido dentro de fagocitos. Además, este método permite un seguimiento en tiempo real de la fagocitosis glial por tomar imágenes de la intensidad del indicador de pH dentro de un determinado retorno de la inversión en varios puntos del tiempo. Generando un gráfico con la intensidad del indicador de pH hasta 100 h, la inmersión como degradación capacidades pueden controlarse fácilmente entre diferentes células y condiciones. Otra ventaja es el uso de sinaptosomas. Ya que los astrocitos ensheathe sinapsis procesos todo el tiempo con sus bellas y han demostrado que engullen las sinapsis en vivo4, usando sinaptosomas es muy conveniente para la medición de la capacidad fagocitaria en vitro de astrocitos. Por último, este ensayo de fagocitosis en vitro tiene el potencial para ser desarrollado para estudiar la fagocitosis glial de beta escombros o amiloide mielina, que se relaciona con diversos trastornos neurológicos.
Con mayor esperanza de vida, es inevitable un aumento dramático en el número de pacientes con enfermedades neurodegenerativas. Pérdida de sinapsis a través de las células gliales es uno de los factores principales en varias enfermedades de neurodegenerative13,14. Además, poda de sinapsis anormales y un desequilibrio de la homeostasis cerebral pueden asociarse con defectos de fagocitosis glial. Por lo tanto, identificar factores y compuestos que pueden controlar la capacidad de inmersión y la degradación de astrocitos podría resultar fundamental para encontrar tratamientos eficaces para los varios desordenes neurológicos. Puesto que este ensayo de fagocitosis en vitro puede ampliarse fácilmente con placas de pocillos, este método puede utilizarse como una plataforma conveniente para varios exámenes para identificar dichos factores.

Células gliales, que se refieren a las células no excitables en el cerebro, son el tipo de células principales en el sistema nervioso central (SNC). Anteriormente, las células glial fueron miradas como meras células de soporte que principalmente desempeñan un papel pasivo en el mantenimiento de propiedades sinápticas basals y la supervivencia neuronal. Sin embargo, nuevas pruebas ha revelado que las células gliales desempeñan un papel más activo en diversos aspectos de la neurobiología, como mantenimiento de la homeostasis cerebral, mediar la sinapsis formación1,2,3 y sinapsis eliminación4,5y modulando la plasticidad sináptica6,7. Las células gliales en el SNC son los astrocitos, microglia y oligodendrocitos. Entre estas células, los astrocitos y microglia han demostrado que desempeñan funciones fagocíticas por englobamiento sinapsis4,5, de células apoptotic8, desechos neuronales9y proteínas patógenas, tales como beta amiloide placas10,11. En el cerebro en desarrollo, los astrocitos eliminan sinapsis en el núcleo geniculado lateral dorsal (dLGN) a través de fagocitosis dependiente del MERTK y MEGF104. Del mismo modo, microglia también eliminan sinapsis C1q cubierto durante etapas de desarrollo a través de la cascada de complemento clásico5. Curiosamente, se ha sugerido que defectos en la poda de la sinapsis pueden ser uno de los iniciadores de varios desordenes neurológicos. Por ejemplo, se ha demostrado que las mutaciones en componente del complemento 4 (C4), que aumenta la poda de la sinapsis mediada por el complemento por microglía, son fuertemente asociadas con la prevalencia de la esquizofrenia en los seres humanos12. Un trabajo reciente también ha demostrado que la vía clásica del complemento es ligerament en las etapas de iniciación de AD e induce pérdida de sinapsis temprana de esta enfermedad13.
En comparación con la fagocitosis mediada por la microglía, si fagocitosis mediada por astrositos contribuye a la iniciación y progresión de varias enfermedades neurológicas es menos clara. Sin embargo, un artículo reciente sugiere que factores que alteran el ritmo de poda normal de la sinapsis por astrocitos pueden alterar la homeostasis cerebral y contribuyen a la patología y susceptibilidad de anuncio14. El tipo de poda de la sinapsis por astrocitos es poderosamente controlado por ApoE isómeros, con un alelo protector para AD (ApoE2) aumentar fuertemente la tasa y un alelo de riesgo para la EA (ApoE4) reducir significativamente la tasa de. Por otra parte, los ratones transgénicos que expresaban ApoE4 acumulan C1q sináptica mucho más que control o ApoE2 ratones14. Estos datos sugieren que deteriorada fagocitosis mediada por astrositos en principios cerebro AD puede inducir la acumulación de desechos senescentes revestido de C1q sinapsis/synaptic que activa fagocitosis complemento-mediada microglial, conducción sináptica degeneración . La capacidad fagocítica deteriorada de astrocitos en portadores ApoE4 puede también contribuir a la acumulación incontrolada de las placas de beta amiloide en los cerebros afectados por el anuncio.
Además, se ha demostrado que células gliales en el cerebro de Drosophila de perder su capacidad fagocítica por disminución traducción de Draper, un homólogo de Megf10 que los astrocitos phagocytosing la sinapsis. Restauración de niveles de Draper rescató la capacidad fagocitaria de las células gliales, que eficientemente dañado escombros axonal en el cerebro envejecido a un grado similar que en el cerebro joven, indicando que envejecimiento inducido por alteraciones en la capacidad fagocitaria de astrocytes pueden contribuir a la interrupción de la homeostasis cerebral15.
Partiendo de estos nuevos hallazgos, modulando la capacidad fagocitaria de astrocytes puede ser una estrategia terapéutica atractiva para prevenir y tratar diversos trastornos neurológicos. En este sentido, ha habido varios intentos para mejorar la capacidad fagocitaria de los astrocitos, por ejemplo, induciendo la acidificación de los lisosomas con nanopartículas ácidos16 y overexpressing el factor de transcripción EB (TFEB), que puede mejorar de la biogénesis del lisosoma17. A pesar de estos intentos, no está todavía claro cómo los astrocitos y las células microgliales se diferencian en su cinética fagocítico y si nosotros debemos aumentar o disminuir su capacidad fagocítica en diversas enfermedades.
En este trabajo presentamos un ensayo de novela en vitro para la detección de la capacidad fagocitaria de los astrocitos en tiempo real. Los datos muestran diferentes cinéticas de inmersión y degradación en astrocitos y microglía. Medio condicionado por astrositos (ACM), que contiene factores secretados de astrocitos, es esencial para la fagocitosis eficaz de astrocitos y microglia. Además, Megf10, un receptor fagocítico en astrocitos y un homólogo de Ced-1 y Draper, juega un papel crítico en la fagocitosis mediada por astrositos8,18.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Synaptosome purification</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll</td>
			<td>GE healthcare life sciences</td>
			<td>17-0891-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick Start Bradford Protein Assay Kit 2</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>5000202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH indicator conjugation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide(DMSO)</td>
			<td>LPS solution</td>
			<td>DMSO100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pHrodo red, succinimidyl ester</td>
			<td>Molecula probes</td>
			<td>P36600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immunopanning</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X Earle&#8217;s balanced salt solution (EBSS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E7510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Bovogen</td>
			<td>BSA025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyrebonuclease 1 (DNase)</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>Is002007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(DMEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11960-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(dPBS)</td>
			<td>Welgene</td>
			<td>LB001-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16000-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Griffonia Simplicifolia Lectin(BSL-1)</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>L-1100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG+IgM(H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>115-005-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgM (&#956;-chain)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>115-005-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin-binding epidermal growth factor</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E4643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human HepaCAM antibody</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>MAB4108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Integrin beta 5 monoclonal antibody (KN52)</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>14-0497-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-cysteine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-acetly-L-cyteine (NAC)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8199</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal media</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O4 hybridoma supernatant(mouse IgM)</td>
			<td>Bansal et al.23</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>Is003126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluristrainer 20 &#956;m</td>
			<td>PluriSelect</td>
			<td>43-50020-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Progesterone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8783</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Putrescine dihydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified rat anti-mouse CD45</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>550539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified mouse anti-rat CD45</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>554875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium selenite</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transferrin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin inhibitor</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS003086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-clear tube (Tube, Thinwall, Ultra-Clear)</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>344059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collect IP-ACM</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Macrosep Advance Centrifugal Devices with Omega Membrane (10k)</td>
			<td>PALL</td>
			<td>MAP010C37</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Macrosep Advance Centrifugal Devices with Omega Membrane (30k)</td>
			<td>PALL</td>
			<td>MAP030C37</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phagocytosis live imaging assay</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Juli stage</td>
			<td>NanoEntek</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Time Series Analyzer V3 plugins</td>
			<td>https://imagej.nih.gov/ij/plugins/time-series.html</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a novel in vitro live-imaging assay of astrocyte-mediated phagocytosis using ph indicator-conjugated synaptosomes

Los astrocitos son las células principales en el cerebro y contacta directamente con las sinapsis y los vasos sanguíneos. Aunque las células microgliales se han considerado las principales células inmunes y solamente fagocitos en el cerebro, estudios recientes han demostrado que los astrocitos también participan en diversos procesos fagocíticos, tales como eliminación de sinapsis desarrollo y despacho de placas de beta amiloide en la enfermedad de Alzheimer (AD). A pesar de estos resultados, la eficiencia de la inmersión de astrositos y degradación de sus objetivos es confusos en comparación con la de microglia. Esta falta de información se debe principalmente a la falta de un sistema de ensayo en el que la cinética de fagocitosis mediada por astrositos y microglía son fácilmente comparables. Para lograr este objetivo, hemos desarrollado un a largo plazo vivir-proyección de imagen en vitro ensayo fagocitosis para evaluar la capacidad fagocitaria de purificada astrocitos y microglía. En este ensayo, detección en tiempo real de la inmersión y la degradación es posible usando sinaptosomas conjugado con indicador de pH, que emiten fluorescencia roja brillante en orgánulos ácidos, tales como lisosomas. Nuestro ensayo novela proporciona una detección simple y eficaz de la fagocitosis a través de imágenes en vivo. Además, este ensayo de fagocitosis en vitro puede utilizarse como una plataforma de proyección para identificar productos químicos y compuestos que pueden potenciar o inhibir la capacidad fagocitaria de los astrocitos. Como mal funcionamiento de la poda sináptica y acumulación de la proteína patógena han demostrado como causantes de trastornos mentales y enfermedades neurodegenerativas, productos químicos y compuestos que modulan la capacidad fagocitaria de las células gliales deberán ser útiles en el tratamiento de varios trastornos neurológicos.

En este en vitro fagocitosis análisis con imágenes en vivo a largo plazo, utilizamos sinaptosomas de homogenados de cerebro de ratón adulto, que se separaron de la solución gradiente entre solución gradiente 23% y 10% degradado por ultracentrifugación ( Figura 3). Después de la preparación, sinaptosomas expusieron PS en su membrana externa (figura 4), sugiriendo que perdieron su función y pueden ser reconocidos por receptores de PS en astrocitos y microglía. Como se muestra en la figura 5, sinaptosomas conjugado con indicador pH emiten fluorescencia roja brillante cuando fueron engullidas por los astrocitos. Comparación en tiempo real de las capacidades de inmersión y la degradación de las células gliales es posible tomar imágenes múltiples de un ROI cada 1 o 2 h (complementario 1 película, adicional 2 de la película). Con este método, hemos demostrado la diferente cinética de fagocitosis mediada por astrositos y microglia (figura 6). Para cuantificar la fagocitosis de las células gliales, se midió el área (μm2) de la señal de fluorescencia roja, que se refiere al índice fagocítico en la Figura 6B y figura 7. Aunque los astrocitos parecen ser eficientes en phagocytosing grandes cantidades de sinaptosomas de conjugado con indicador de pH, microglia eran más rápidos que azota y degradantes sinaptosomas (Figura 6B). Microglia demostró intensidad del indicador de pH máximo en 26 h después del tratamiento de synaptosome conjugado con indicador de pH, mientras que los astrocitos demostraron su máximo en 45 h (p-valor < 0.05, ANOVA de dos vías entre astrositos con 1 X ACM y microglia con ACM de X 1). Además, las células microgliales demostraron una reducción del 20,7% en intensidad de indicador de pH total 40 h después del punto de pico, mientras que astrocitos demostraron una reducción del 17% en intensidad de indicador pH total durante el mismo período de tiempo. Curiosamente, nuestros datos demostraron que factores secretados de astrositos, que figuraban en el ACM, son esenciales para incrementar ambos fagocitosis mediada por astrositos y microglia (Figura 6B). Astrocitos han demostrado al liberar moléculas de puente, como MFGE8, GAS6 y proteínas, que pueden salvar e inducir interacciones entre receptores fagocíticos y "comer-me" señales como PS23. Como se mencionó anteriormente, astrocitos eliminan sinapsis del MERTK y MEGF10 vías4. MEGF10 sólo se expresa por los astrocitos en el cerebro y participa en la inmersión de la sinapsis a través del reconocimiento de "comer-me" señales con identidades desconocidas. De acuerdo con los resultados anteriores, el ensayo demostró que en comparación con el tipo salvaje (WT) ratón los astrocytes, Megf10 knock-out (KO) ratón astrocitos poseen significativamente deteriorada capacidad fagocítica (figura 7). En comparación con los astrocitos de la WT, Megf10 KO astrocitos demostraron un aproximadamente 40% de reducción en intensidad de indicador de pH total en el punto máximo (31 h) (figura 7).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56647/56647fig1.jpg"> Figura 1. Esquema de purificación astrositos utilizando métodos de immunopanning. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56647/56647fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56647/56647fig2.jpg"> Figura 2. Esquema de análisis de imágenes en vivo de fagocitosis. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56647/56647fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56647/56647fig3.jpg"> Figura 3. Fraccionamiento de homogeneizado de cerebro representante en el gradiente soluciones. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56647/56647fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56647/56647fig4.jpg"> Figura 4. Imágenes representativas de sinaptosomas expuestos a PS. (A) A imagen de campo claro de astrocitos con sinaptosomas. Sinaptosomas se unen a los astrocitos. (B) una imagen fluorescente de sinaptosomas tdTomato-positivas, que son purificados de ratón tdTomato-expresando los cerebros. (C) pSIVA se une a PS, que se expone a la membrana externa de synaptosome y emite fluorescencia verde. PS (D) detectada por pSIVA (verde) es co localizada con sinaptosomas de tdTomato positivo (rojo). Barra de escala: 20 μm <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56647/56647fig4large.jpg" target="_blank">haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56647/56647fig5.jpg"> Figura 5. Representante de campo brillante e imágenes fluorescentes de astrocitos con sinaptosomas conjugado con indicador de pH en dos puntos del tiempo. A las 11 h después del tratamiento (panel inferior), sinaptosomas conjugado con indicador de pH son engullidas por los astrocitos y emiten fluorescencia roja mientras que hacen no a 1 h después del tratamiento (panel superior). Barra de escala: 50 μm. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56647/56647fig5large.jpg" target="_blank">haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56647/56647fig6.jpg"> Figura 6. Cinética fagocítico de rata astrocitos y microglía a través de imágenes en vivo a largo plazo. (A) A esquema de un ensayo de fagocitosis en vitro usando purificados astrocitos y microglia junto con sinaptosomas conjugado con indicador de pH. Tenga en cuenta que antes de tomaron imágenes en vivo, independientes sinaptosomas son arrastrados después de 40 min de incubación. (B) los gráficos representativos mostrando la inmersión y la degradación cinética de astrocitos y microglia. ACM, que contiene factores secretados de astrositos, mejora significativamente ambos absorción de synaptosome mediada por astrositos y microglia. Astrositos: Control vs astrositos con ACM 1 X, ***, Tukey del test de comparaciones múltiples. Microglia: Control vs Microglia con ACM 1 X, ***, Tukey de prueba de comparación múltiple. Barras de error indican SEM *p ≤ 0.05, *** p ≤ 0.0001, ANOVA de dos vías. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56647/56647fig6large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56647/56647fig7.jpg"> Figura 7. Disminución capacidad fagocítica de los astrocytes del ratón de Megf10 KO con 1 X ACM comparado con el de astrocitos de ratón WT con ACM de X 1. PESO vs Megf10 KO astrocitos con ACM de X 1, ***, ANOVA de dos vías. Barras de error indican SEM * p ≤ 0.05, ** p ≤ 0.01, *** p ≤ 0.001 ANOVA de dos vías. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56647/56647fig7large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Tabla 1: recetas de solución. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56647/JoVE_Materials_R.xls">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Película suplementario 1. Un representante en vivo-proyección de imagen de video la fagocitosis del pH sinaptosomas conjugado con indicador por astrocitos. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56647/Supplementary_data_Movie_1A_Astrocytes.mp4">Por favor haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Película adicional 2. Un video de imágenes en vivo representante mostrando fagocitosis del pH sinaptosomas conjugado con indicador por las células microgliales. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56647/Supplementary_data_Movie_1B_Microglia.mp4">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>

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A Novel In Vitro Live-imaging Assay of Astrocyte-mediated Phagocytosis Using pH Indicator-conjugated Synaptosomes

Este protocolo presenta un en vitro en vivo-proyección de imagen de fagocitosis ensayo para medir la capacidad fagocitaria de los astrocitos. Microglia y astrocitos de rata purificados se utilizan junto con sinaptosomas conjugado con indicador de pH. Este método puede detectar cinética en tiempo real de la inmersión y la degradación y proporciona una plataforma de proyección adecuado para identificar factores de modulación de fagocitosis de los astrositos.

Un pH de novela In Vitro Live-proyección de imagen de ensayo de astrositos mediado fagocitosis usando sinaptosomas conjugado con indicador

Astrocytes are the major cell type in the brain and directly contact synapses and blood vessels. Although microglial cells have been considered the major ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

A Novel In Vitro Live-imaging Assay of Astrocyte-mediated Phagocytosis Using pH Indicator-conjugated Synaptosomes

12.0K vistas.  Korea Advanced Institute of Science and Technology. Este protocolo presenta un en vitro en vivo-proyección de imagen de fagocitosis ensayo para medir la capacidad fagocitaria de los astrocitos. Microglia y astrocitos de rata purificados se utilizan junto con sinaptosomas conjugado con indicador de pH. Este método puede detectar cinética en tiempo real de la inmersión y la degradación y proporciona una plataforma de proyección adecuado para identificar factores de modulación de fagocitosis de los astrositos....

Video: A Novel In Vitro Live-imaging Assay of Astrocyte-mediated Phagocytosis Using pH Indicator-conjugated Synaptosomes

Live-imaging of PKC Translocation in Sf9 Cells and in Aplysia Sensory Neurons

Protein kinase Cs (PKCs) are serine threonine kinases that play a central role in regulating a wide variety of cellular processes such as cell growth and learning and memory. There are four known families of PKC isoforms in vertebrates: classical PKCs (&alpha;, &beta;I, &beta;II and &gamma;), novel type I PKCs (&#949; and &eta;), novel type II PKCs (&delta; and &theta;), and atypical PKCs (&zeta; and &iota;). The classical PKCs are activated by Ca2+ and diacylclycerol (DAG), while the novel PKCs are activated by DAG, but are Ca2+-independent. The atypical PKCs are activated by neither Ca2+ nor DAG. In Aplysia californica, our model system to study memory formation, there are three nervous system specific PKC isoforms one from each major class, namely the conventional PKC Apl I, the novel type I PKC Apl II and the atypical PKC Apl III. PKCs are lipid-activated kinases and thus activation of classical and novel PKCs in response to extracellular signals has been frequently correlated with PKC translocation from the cytoplasm to the plasma membrane. Therefore, visualizing PKC translocation in real time in live cells has become an invaluable tool for elucidating the signal transduction pathways that lead to PKC activation. For instance, this technique has allowed for us to establish that different isoforms of PKC translocate under different conditions to mediate distinct types of synaptic plasticity and that serotonin (5HT) activation of PKC Apl II requires production of both DAG and phosphatidic acid (PA) for translocation 1-2. Importantly, the ability to visualize the same neuron repeatedly has allowed us, for example, to measure desensitization of the PKC response in exquisite detail 3. In this video, we demonstrate each step of preparing Sf9 cell cultures, cultures of Aplysia sensory neurons have been described in another video article 4, expressing fluorescently tagged PKCs in Sf9 cells and in Aplysia sensory neurons and live-imaging of PKC translocation in response to different activators using laser-scanning microscopy.

In this video, we demonstrate visualization of PKC translocation in living cells using fluorescently tagged PKCs.

En vivo de imágenes de la translocación de PKC en células Sf9 y en las neuronas sensoriales Aplysia

Protein kinase Cs (PKCs) are serine threonine kinases that play a central role in regulating a wide variety of cellular processes such as cell growth and ...

Investigación

Neurociencias

Time-lapse Live Imaging of Clonally Related Neural Progenitor Cells in the Developing Zebrafish Forebrain

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To understand the behavior of neural progenitor cells in the complex in vivo environment, time-lapse live imaging of neural progenitor cells in an intact brain is critically required. In this video, we exploit the unique features of zebrafish embryos to visualize the development of forebrain neural progenitor cells in vivo. We use electroporation to genetically and sparsely label individual neural progenitor cells. Briefly, DNA constructs coding for fluorescent markers were injected into the forebrain ventricle of 22 hours post fertilization (hpf) zebrafish embryos and electric pulses were delivered immediately. Six hours later, the electroporated zebrafish embryos were mounted with low melting point agarose in glass bottom culture dishes. Fluorescently labeled neural progenitor cells were then imaged for 36hours with fixed intervals under a confocal microscope using water dipping objective lens. The present method provides a way to gain insights into the in vivo development of forebrain neural progenitor cells and can be applied to other parts of the central nervous system of the zebrafish embryo.

The present video demonstrates a method which takes advantage of the combination of electroporation and confocal microscopy to perform live imaging on individual neural progenitor cells in the developing zebrafish forebrain. In vivo analysis of the development of forebrain neural progenitor cells at a clonal level can be achieved in this way.

Time-lapse de imágenes en vivo de la relación clonal con células progenitoras neurales en el cerebro anterior El desarrollo de pez cebra

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To ...

Live Imaging of Dorsal Root Axons after Rhizotomy

The primary sensory axons injured by spinal root injuries fail to regenerate into the spinal cord, leading to chronic pain and permanent sensory loss. Regeneration of dorsal root (DR) axons into spinal cord is prevented at the dorsal root entry zone (DREZ), the interface between the CNS and PNS. Our understanding of the molecular and cellular events that prevent regeneration at DREZ is incomplete, in part because complex changes associated with nerve injury have been deduced from postmortem analyses. Dynamic cellular processes, such as axon regeneration, are best studied with techniques that capture real-time events with multiple observations of each living animal. Our ability to monitor neurons serially in vivo has increased dramatically owing to revolutionary innovations in optics and mouse transgenics. Several lines of thy1-GFP transgenic mice, in which subsets of neurons are genetically labeled in distinct fluorescent colors, permit individual neurons to be imaged in vivo1. These mice have been used extensively for in vivo imaging of muscle2-4 and brain5-7, and have provided novel insights into physiological mechanisms that static analyses could not have resolved. Imaging studies of neurons in living spinal cord have only recently begun. Lichtman and his colleagues first demonstrated their feasibility by tracking injured dorsal column (DC) axons with wide-field microscopy8,9. Multi-photon in vivo imaging of deeply positioned DC axons, microglia and blood vessels has also been accomplished10. Over the last few years, we have pioneered in applying in vivo imaging to monitor regeneration of DR axons using wide-field microscopy and H line of thy1-YFP mice. These studies have led us to a novel hypothesis about why DR axons are prevented from regenerating within the spinal cord11.
In H line of thy1-YFP mice, distinct YFP+ axons are superficially positioned, which allows several axons to be monitored simultaneously. We have learned that DR axons arriving at DREZ are better imaged in lumbar than in cervical spinal cord. In the present report we describe several strategies that we have found useful to assure successful long-term and repeated imaging of regenerating DR axons. These include methods that eliminate repeated intubation and respiratory interruption, minimize surgery-associated stress and scar formation, and acquire stable images at high resolution without phototoxicity.

An in vivo imaging protocol to monitor primary sensory axons following dorsal root crush is described. The procedures utilize wide-field fluorescence microscopy and thy1-YFP transgenic mice, and permit repeated imaging of axon regeneration over 4 cm in the PNS and axon interactions with the interface of the CNS.

Imágenes en vivo de los axones de la raíz dorsal después de rizotomía

The primary sensory axons injured by spinal root injuries fail to regenerate into the spinal cord, leading to chronic pain and permanent sensory loss. ...

Ex vivo Live Imaging of Single Cell Divisions in Mouse Neuroepithelium

We developed a system that integrates live imaging of fluorescent markers and culturing slices of embryonic mouse neuroepithelium. We took advantage of existing mouse lines for genetic cell lineage tracing: a tamoxifen-inducible Cre line and a Cre reporter line expressing dsRed upon Cre-mediated recombination. By using a relatively low level of tamoxifen, we were able to induce recombination in a small number of cells, permitting us to follow individual cell divisions. Additionally, we observed the transcriptional response to Sonic Hedgehog (Shh) signaling using an Olig2-eGFP transgenic line 1-3 and we monitored formation of cilia by infecting the cultured slice with virus expressing the cilia marker, Sstr3-GFP 4. In order to image the neuroepithelium, we harvested embryos at E8.5, isolated the neural tube, mounted the neural slice in proper culturing conditions into the imaging chamber and performed time-lapse confocal imaging. Our ex vivo live imaging method enables us to trace single cell divisions to assess the relative timing of primary cilia formation and Shh response in a physiologically relevant manner. This method can be easily adapted using distinct fluorescent markers and provides the field the tools with which to monitor cell behavior in situ and in real time.

Ex vivo Live Imaging of Single Cell Divisions in Mouse Neuroepithelium

Here we develop the tools necessary for ex vivo live imaging to trace single cell divisions in the mouse E8.5 neuroepithelium

Ex vivo de imágenes en vivo de las divisiones sola celda en ratón neuroepitelio

We developed a system that integrates live imaging of fluorescent markers and culturing slices of embryonic mouse neuroepithelium. We took advantage of ...

Live Imaging of Drosophila Larval Neuroblasts

Stem cells divide asymmetrically to generate two progeny cells with unequal fate potential: a self-renewing stem cell and a differentiating cell. Given their relevance to development and disease, understanding the mechanisms that govern asymmetric stem cell division has been a robust area of study. Because they are genetically tractable and undergo successive rounds of cell division about once every hour, the stem cells of the Drosophila central nervous system, or neuroblasts, are indispensable models for the study of stem cell division. About 100 neural stem cells are located near the surface of each of the two larval brain lobes, making this model system particularly useful for live imaging microscopy studies. In this work, we review several approaches widely used to visualize stem cell divisions, and we address the relative advantages and disadvantages of those techniques that employ dissociated versus intact brain tissues. We also detail our simplified protocol used to explant whole brains from third instar larvae for live cell imaging and fixed analysis applications.

Live Imaging of Drosophila Larval Neuroblasts

This protocol details a streamlined method used to conduct live cell imaging in the context of an intact larval brain. Live cell imaging approaches are invaluable for the study of asymmetric neural stem cell divisions as well as other neurogenic and developmental processes, consistently uncovering mechanisms that were previously overlooked.

Imágenes en vivo de<em&gt; Drosophila</em&gt; larvales neuroblastos

Stem cells divide asymmetrically to generate two progeny cells with unequal fate potential: a self-renewing stem cell and a differentiating cell. Given ...

Live Imaging of the Ependymal Cilia in the Lateral Ventricles of the Mouse Brain

Multiciliated ependymal cells line the ventricles in the adult brain. Abnormal function or structure of ependymal cilia is associated with various neurological deficits. The current ex vivo live imaging of motile ependymal cilia technique allows for a detailed study of ciliary dynamics following several steps. These steps include: mice euthanasia with carbon dioxide according to protocols of The University of Toledo&#8217;s Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC); craniectomy followed by brain removal and sagittal brain dissection with a vibratome or sharp blade to obtain very thin sections through the brain lateral ventricles, where the ependymal cilia can be visualized. Incubation of the brain&#8217;s slices in a customized glass-bottom plate containing Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium (DMEM)/High-Glucose at 37 &#176;C in the presence of 95%/5% O2/CO2 mixture is essential to keep the tissue alive during the experiment. A video of the cilia beating is then recorded using a high-resolution differential interference contrast microscope. The video is then analyzed frame by frame to calculate the ciliary beating frequency. This allows distinct classification of the ependymal cells into three categories or types based on their ciliary beating frequency and angle. Furthermore, this technique allows the use of high-speed fluorescence imaging analysis to characterize the unique intracellular calcium oscillation properties of ependymal cells as well as the effect of pharmacological agents on the calcium oscillations and the ciliary beating frequency. In addition, this technique is suitable for immunofluorescence imaging for ciliary structure and ciliary protein localization studies. This is particularly important in disease diagnosis and phenotype studies. The main limitation of the technique is attributed to the decrease in live motile cilia movement as the brain tissue starts to die.

Using high-resolution differential interference contrast (DIC) microscopy, an ex vivo observation of the beating of motile ependymal cilia located within the mouse brain ventricles is demonstrated by live-imaging. The technique allows a recording of the unique ciliary beating frequency and beating angle as well as their intracellular calcium oscillation pacing properties.

Imágenes en vivo de la ependimarios cilios en los ventrículos laterales del cerebro del ratón

Multiciliated ependymal cells line the ventricles in the adult brain. Abnormal function or structure of ependymal cilia is associated with various ...

Novel Assay for Cold Nociception in Drosophila Larvae

How organisms sense and respond to noxious temperatures is still poorly understood. Further, the mechanisms underlying sensitization of the sensory machinery, such as in patients experiencing peripheral neuropathy or injury-induced sensitization, are not well characterized. The genetically tractable Drosophila model has been used to study the cells and genes required for noxious heat detection, which has yielded multiple conserved genes of interest. Little is known however about the cells and receptors important for noxious cold sensing. Although, Drosophila does not survive prolonged exposure to cold temperatures (&#8804;10 &#186;C), and will avoid cool, preferring warmer temperatures in behavioral preference assays, how they sense and possibly avoid noxious cold stimuli has only recently been investigated.
Here we describe and characterize the first noxious cold (&#8804;10 &#186;C) behavioral assay in Drosophila. Using this tool and assay, we show an investigator how to qualitatively and quantitatively assess cold nociceptive behaviors. This can be done under normal/healthy culture conditions, or presumably in the context of disease, injury or sensitization. Further, this assay can be applied to larvae selected for desired genotypes, which might impact thermosensation, pain, or nociceptive sensitization. Given that pain is a highly conserved process, using this assay to further study&#160;thermal nociception will likely glean important understanding of pain processes in other species, including vertebrates.

Novel Assay for Cold Nociception in Drosophila Larvae

Here we demonstrate a novel assay to study cold nociception in Drosophila larvae. This assay utilizes a custom-built Peltier probe capable of applying a focal noxious cold stimulus and results in quantifiable cold-specific behaviors. This technique will allow further cellular and molecular dissection of cold nociception.

Ensayo novedoso para la nocicepción en frío<em&gt; Drosophila</em&gt; Las larvas

How organisms sense and respond to noxious temperatures is still poorly understood. Further, the mechanisms underlying sensitization of the sensory ...

Live Imaging of Primary Cerebral Cortex Cells Using a 2D Culture System

During cerebral cortex development, progenitor cells undergo several rounds of symmetric and asymmetric cell divisions to generate new progenitors or postmitotic neurons. Later, some progenitors switch to a gliogenic fate, adding to the astrocyte and oligodendrocyte populations. Using time-lapse video-microscopy of primary cerebral cortex cell cultures, it is possible to study the cellular and molecular mechanisms controlling the mode of cell division and cell cycle parameters of progenitor cells. Similarly, the fate of postmitotic cells can be examined using cell-specific fluorescent reporter proteins or post-imaging immunocytochemistry. More importantly, all these features can be analyzed at the single-cell level, allowing the identification of progenitors committed to the generation of specific cell types. Manipulation of gene expression can also be performed using viral-mediated transfection, allowing the study of cell-autonomous and non-cell-autonomous phenomena. Finally, the use of fusion fluorescent proteins allows the study of symmetric and asymmetric distribution of selected proteins during division and the correlation with daughter cells fate. Here, we describe the time-lapse video-microscopy method to image primary cerebral cortex murine cells for up to several days and analyze the mode of cell division, cell cycle length and fate of newly generated cells. We also describe a simple method to transfect progenitor cells, which can be applied to manipulate genes of interest or simply label cells with reporter proteins.

Live imaging is a powerful tool to study cellular behaviors in real time. Here, we describe a protocol for time-lapse video-microscopy of primary cerebral cortex cells that allows a detailed examination of the phases enacted during the lineage progression from primary neural stem cells to differentiated neurons and glia.

Proyección de imagen de las células de la corteza Cerebral primaria usando un sistema 2D de la cultura en vivo

During cerebral cortex development, progenitor cells undergo several rounds of symmetric and asymmetric cell divisions to generate new progenitors or ...

In Vitro Phagocytosis of Myelin Debris by Bone Marrow-Derived Macrophages

Bone marrow-derived macrophages (BMDMs) are mature leukocytes that serve a critical physiological role as professional phagocytes capable of clearing a variety of particles. Normally, BMDMs are restricted from the central nervous system (CNS), but following an injury, they can readily infiltrate. Once within the injured CNS tissue, BMDMs are the primary cell type responsible for the clearance of injury-derived cellular debris, including large quantities of lipid rich myelin debris. The neuropathological ramifications of BMDM infiltration and myelin debris phagocytosis within the CNS are complex and not well understood. The protocols described here, allow for the direct in vitro study of BMDMs in the context of CNS injury. We cover murine BMDM isolation and culture, myelin debris preparation, and assays to assess BMDM myelin debris phagocytosis. These techniques produce robust quantifiable results without the need for significant specialized equipment or materials, yet can be easily customized to meet the needs of researchers.

In Vitro Phagocytosis of Myelin Debris by Bone Marrow-Derived Macrophages

We present methods to assess the phagocytic capacity of primary murine bone marrow-derived macrophages using fluorescently labeled myelin debris and intracellular lipid droplet staining.

In Vitro Fagocitosis de la ruina del Myelin por macrófagos derivados de médula ósea

Bone marrow-derived macrophages (BMDMs) are mature leukocytes that serve a critical physiological role as professional phagocytes capable of clearing a ...

Assay Development for High Content Quantification of Sod1 Mutant Protein Aggregate Formation in Living Cells

Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a fatal neurodegenerative disease that can be caused by inherited mutations in the gene encoding copper-zinc superoxide dismutase 1 (SOD1). The structural instability of SOD1 and the detection of SOD1-positive inclusions in familial-ALS patients supports a potential causal role for misfolded and/or aggregated SOD1 in ALS pathology. In this study, we describe the development of a cell-based assay designed to quantify the dynamics of SOD1 aggregation in living cells by high content screening approaches. Using lentiviral vectors, we generated stable cell lines expressing wild-type and mutant A4V SOD1 tagged with yellow fluorescent protein and found that both proteins were expressed in the cytosol without any sign of aggregation. Interestingly, only SOD1 A4V stably expressed in HEK-293, but not in U2OS or SH-SY5Y cell lines, formed aggregates upon proteasome inhibitor treatment. We show that it is possible to quantify aggregation based on dose-response analysis of various proteasome inhibitors, and to track aggregate-formation kinetics by time-lapse microscopy. Our approach introduces the possibility of quantifying the effect of ALS mutations on the role of SOD1 in aggregate formation as well as screening for small molecules that prevent SOD1 A4V aggregation.

We describe a method to quantify the aggregation of misfolded proteins. Our protocol details lentiviral induced stable cell line generation, automated confocal imaging, and image analysis of protein aggregates. As an illustrative application, we studied the effect of small molecules in promoting SOD1 aggregation in a time- and dose-dependent manner.

Desarrollo de ensayos para cuantificación de contenido alto de Sod1 mutante de la proteína total formación en células vivas

Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a fatal neurodegenerative disease that can be caused by inherited mutations in the gene encoding copper-zinc ...

Un pH de novela In Vitro Live-proyección de imagen de ensayo de astrositos mediado fagocitosis usando sinaptosomas conjugado con indicador

Resumen

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