Este trabajo es apoyado por la investigación de NIH (A1R03AI120027 (RN) y 1R21AI20012 (RN)), beca de investigación institucional (RN), puesta en marcha conceder (RN), y semilla de MD Anderson CIC concede (RN).

Todos los métodos aquí descritos han sido aprobados por el cuidado institucional del Animal y el Comité uso (IACUC) de la Universidad de Texas MD Anderson Cancer Center.
1. preparación de péptidos para la vacuna
<ol><li>Disolver el péptido liofilizado con solución salina tamponada con fosfato (PBS) a la concentración adecuada y el vortex durante 30 s. Nota: Para hgp10025–33, la concentración final es de 1 mg/mL y para OVA257–264, la concentración final es de 0,5 mg/mL. Reconstituir el péptido antes de la inyección. No guarde después de la reconstitución.</li>
</ol>2. aislamiento de esplenocitos de ratón transgénico
Nota: Aislamiento de células desde el bazo debe realizarse de forma estéril.
<ol><li>
Eutanasia el ratón transgénico de OT-1 utilizando el método de asfixia aprobado de CO2 y extirpar el bazo. Nota: Ratón transgénico apropiado se utiliza en este paso específico para el péptido de elección.<ol>
<li>Coloque el ratón sobre su lado derecho. Rocíe el lado izquierdo del ratón con 70% de etanol (EtOH). Tire de la piel con unas pinzas y cortar la piel con tijeras quirúrgicas; el bazo será visible dentro de la cavidad peritoneal. Con cuidado corte la cavidad peritoneal para acceder al bazo. Extirpar el bazo con unas pinzas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Separar el bazo colocando un filtro μm 70 en una placa Petri con medio de 2 mL A (PBS con 1% de suero bovino fetal (FBS)) y rotura del bazo con el extremo de un émbolo.
	<ol>
<li>Recoger los esplenocitos de la placa de Petri y el lugar en un tubo cónico de 50 mL. Lave la placa de Petri con 5 mL de medio A dos veces a recoger todas las células. Añada medio un up a 25 mL y centrifugar las células durante 5 minutos a temperatura ambiente a 475 x g.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aspirar las células y resuspender en 1 mL / por tampón de lisis de glóbulos rojos (gr) de bazo. Incubar a temperatura ambiente durante 5 minutos agregar 10 mL de medio A centrifugar a temperatura ambiente a x 475 g. Resuspender el precipitado en 10 mL de medio A y eliminar los desechos por la suspensión de células a través de un filtro de 70 μm en un limpio cónico de 50 mL de filtrado.</li>
	<li>
Contar celdas con azul de tripán y un hemocitómetro. Resuspender las células en PBS a una concentración final de 106 - 1006 células/mL. Para OVA257–264 específico matar, suspender 106 células/ml y para hgp10025–33 específico matar, resuspender en 1006 células/mL.
	<ol>
<li>Vuelta las células restantes a temperatura ambiente durante 5 minutos a 475 x g. aspiración el sobrenadante y resuspender en 15 mL PBS frío para lavar las células. Repetir una vez más la etapa de lavado. Vuelta las células a temperatura ambiente durante 5 minutos a 475 x g. aspiración el sobrenadante y resuspender en PBS frío según volumen final determinado en el paso 2.4.</li>
		<li>Transferir la suspensión unicelular a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL y no en hielo hasta su inyección en el receptor del ratón C57/BL6.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. inyección de esplenocitos de ratones transgénicos
<ol><li>Coloque el ratón C57/BL6 destinatario en un limitador con el lado dorsal hacia arriba. Rocíe el área base de la cola de inyección con alcohol isopropílico al 70%. Administrar por vía intravenosa 100 μl de suspensión de célula (sección 2) en la vena de la cola utilizando una aguja de 27 G con el bisel hacia arriba.</li>
</ol>4. Covax administración
Nota: Si las células se inyectan en la tarde, covax debe administrarse dentro de las 18 h de la inyección de células a la mañana siguiente.
<ol><li>Coloque el ratón en una caja claro la anestesia con isoflurano 1-3%. Después de ratones son completamente anestesiados, transferir los ratones a los conos de nariz conectados al colector de la cámara de anestesia. Mantener los ratones restringidos con el lado dorsal hacia arriba. Nota: Anestesia es confirmada por una pizca de breve del dedo del pie para comprobar que una respuesta de retirada no se produce. La ley federal restringe el uso de isoflurano del orden de un veterinario con licencia.</li>
	<li>Rocíe el área base de la cola de inyección con alcohol isopropílico al 70%. Inyectar 100 μl de solución de péptidos (de la sección 1) por vía subcutánea con una aguja de 27 G con la jeringa penetra 4-5 mm en la región base de la cola, la aguja bisel hacia arriba. Nota: Los ratones son vacunados en un costado con la inyección subcutánea en la base de la cola10.</li>
	<li>Inyectar 100 lateral de μl anti-CD40 anticuerpo (valores de 0,5 mg/mL) para el sitio de la inyección de la vacuna.</li>
	<li>Aplique cuidadosamente el imiquimod crema 50 mg/ratón en los sitios de vacunación. Frote la crema de imiquimod sobre la superficie hasta que la crema ya no es visible y es absorbida completamente.</li>
	<li>Inyectar 100 μl de proteína de rhIL-2 de 100,000 UI/mL por vía intraperitoneal (i.p.) en la región abdominal inferior. Observar los ratones durante 5 minutos después de recuperarse totalmente de la anestesia. Nota: El experimento se pausa en este punto durante 3 días.</li>
</ol>5. aislamiento de esplenocitos de destino para el etiquetado con CFSE
Nota: Aislamiento de células desde el bazo debe realizarse de forma estéril.
<ol><li>Eutanasia a los ratones C57BL/6 según el método de asfixia aprobado de CO2 . Retire el spleen(s) como en el paso 2.1.1. Desagregación del bazo y lavar esplenocitos como en los pasos 2.2.1 - 2.2.3. Lyse células de sangre rojas como en los pasos 2,3 - 2.3.2.</li>
	<li>Extraer células para contar utilizando un hemocitómetro y calcular para una concentración final de células a 106 células/mL en solución de etiquetado CFSE (descrito en el paso 7). Células restantes a temperatura ambiente durante 5 minutos a 475 x aspirar sobrenadante de g. de la vuelta.</li>
</ol>6. péptido pulsación de esplenocitos de destino
Nota: Péptido pulsación debe realizarse de forma estéril.
<ol><li>Resuspender las células en 106 células/mL en medios de información (medios RPMI 1640 con 10% FBS, 1% L-glutamina (L-Gln), 1% de penicilina/estreptomicina (Pen/Strep)). Las células se dividen en 2 tubos (etiquetadores de 15 mL). Etiquetar cada tubo de pulsado o unpulsed.</li>
	<li>
Añadir péptido al tubo etiquetado pulsada. Para OVA257–264 pulsación, añadir 1 μg/mL y hgp10025–33 pulsación, añadir 2 μg/mL. Nota: Las células unpulsed se someten a la misma incubación como las células pulsadas sólo sin la adición del péptido.<ol>
<li>Incube las células + péptido a 37 ° C durante 1 hora.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Añadir 10 mL de medio completo (medios RPMI 1640 con 10% FBS, 1% L-glutamina (L-Gln), 1% de penicilina/estreptomicina (Pen/Strep)) a cada tubo para lavar tanto pulsada y unpulsed las células diana. Células restantes a temperatura ambiente durante 5 minutos a 475 x aspirar sobrenadante de g. de la vuelta.</li>
</ol>7. preparación de la CFSE para el etiquetado de esplenocitos de destino
<ol><li>
Preparar la solución de etiquetado CFSE durante la célula en paso 6.3; las células pulsadas serán marcadas como CFSEHola y el unpulsed como CFSElo. Preparar 1 mL de solución de etiquetado CFSE 106 células. Nota: CFSE es sensible a la luz y debe protegerse de la luz en todo momento.<ol>
<li>Preparar CFSEHola -etiquetado de los medios de comunicación mediante la adición de 1 uL/mL CFSE (solución stock de 5 mM) para una concentración final de 5 μm/mL en Medio RPMI 1640 con un 2% FBS.</li>
		<li>Preparar CFSElo -etiquetado de los medios de comunicación mediante la adición de 1 uL/mL CFSE (solución 0.5m m) para una concentración final de 0,5 media de μm/mL RPMI 1640 con un 2% FBS.</li>
	</ol>
</li>
</ol>8. etiquetado de esplenocitos de destino con CFSE
Nota: CFSE etiquetado debe realizarse de forma estéril.
<ol><li>Resuspender las células de la blanco pulsada y unpulsed (de paso 6.3) a 106 células/mL etiquetado CFSE medios de comunicación. Resuspender las células pulsadas con preparados CFSEHola-etiquetado de los medios de comunicación y las células unpulsed con preparados CFSElo-etiquetado de los medios de comunicación.</li>
	<li>Mezcle las células y medios etiquetado CFSE por inversión suave o remolinos. No mezclar con un vórtex. Incube las células y medios etiquetado CFSE a 37 ° C durante 15 minutos Remix las células cada 5 min.</li>
	<li>Añadir 10 mL de medio completo a cada células de suspensión y giro de celular a temperatura ambiente durante 5 min a x 475 g.</li>
	<li>Aspirar el sobrenadante y resuspender las células en 10 mL de PBS frío. Girar las células a 4 ° C por 5 min a x 475 g.</li>
	<li>Repetir el punto 8.4.</li>
	<li>Contar las células y la mezcla de péptidos-pulsada, CFSEHola-etiquetado con unpulsed, CFSElo-etiqueta las células en una proporción de 1:1 para su inyección en ratones receptores. Mantener una alícuota de 1 x 106 mezclado las células a utilizar para una evaluación inicial de citometría de flujo (sección 11). Nota: El volumen de inyección final es 100 μl por ratón. El recuento final de la célula es 10e6 células. Pérdida de volumen en la jeringa y la aguja debe ser tomado en cuenta y debe ser estimada en 500 μl.</li>
</ol>9. inyección de las células diana
Nota: Mantenga las células marcado con CFSE protegidas de la luz antes y durante la inyección lo más posible.
<ol><li>Coloque el receptoras ratones C57BL/6 en un limitador con el lado dorsal hacia arriba. Rocíe el área base de la cola de inyección con alcohol isopropílico al 70%. 100 μl de suspensión celular solo administrar por vía intravenosa en la vena de la cola con el bisel hacia arriba.</li>
</ol>10. su aislamiento de las células diana
Nota: El momento de este paso es crítico y depende de la fuerza del antígeno para la estimulación y la citotoxicidad CTL. Para la evaluación de matar a un objetivo pulsado OVA257–264 , las células necesitan ser cosechado 4-6 h después de la inyección. Ya que células marcado con CFSE bazos sensibles, proceso luz en la oscuridad.
<ol><li>Eutanasia el receptoras ratones C57BL/6 según el método de asfixia aprobado de CO2 .</li>
	<li>Retire el spleen(s) como en el paso 2.1.1. Desagregación del bazo y lavar esplenocitos como en los pasos 2.2.1 - 2.2.3. Lyse células de sangre rojas como en los pasos 2,3 - 2.3.2.</li>
	<li>Resuspender las células en células de fluorescencia activada 1 mL buffer (FACs) (1% BSA + PBS) de clasificación para la evaluación por citometría de flujo.</li>
</ol>11. compuerta lógica para determinar la actividad CTL por citometría de flujo
<ol><li>
Realizar evaluación de la actividad CTL utilizando un protocolo de citometría de flujo estándar. Adquirir las células mediante el canal FITC en un citómetro de flujo con láser 488 nm para la excitación11.
	<ol>
<li>Puerta en linfocitos vivo usando los parámetros de dispersión (SSC) lado de forward scatter (FSC) vs. Subgate dentro de la puerta en linfocitos de la población total de CFSE-positivo. Nota: Las células inyectadas CFSE-labeled formarán un pequeño subconjunto de los linfocitos totales presentes en el bazo. Las células positivas de CSFE deben aparecer como dos poblaciones distintas en la escala log.</li>
		<li>Utilice un formato de histograma para determinar el porcentaje de la unpulsed (izquierda pico, CFSElo) y pulsada (razón pico, CFSEHola) poblaciones. Pérdida de las células CFSEHola indica actividad CTL antígeno-específica.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Liu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+and+quantification+of+T+cell-mediated+cytotoxicity+using+cell-permeable+fluorogenic+caspase+substrates.">Visualization and quantification of T cell-mediated cytotoxicity using cell-permeable fluorogenic caspase substrates.</a> Nat Med. 8 (2), 185-189 (2002).</li><li>Wherry, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage+relationship+and+protective+immunity+of+memory+CD8+T+cell+subsets.">Lineage relationship and protective immunity of memory CD8 T cell subsets.</a> Nat Immunol. 4 (3), 225-234 (2003).</li><li>He, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sensitive+flow+cytometry-based+cytotoxic+T-lymphocyte+assay+through+detection+of+cleaved+caspase+3+in+target+cells.">A sensitive flow cytometry-based cytotoxic T-lymphocyte assay through detection of cleaved caspase 3 in target cells.</a> J Immunol Methods. 304 (1-2), 43-59 (2005).</li><li>Barber, D. L., Wherry, E. J., Ahmed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutting+edge:+rapid+in+vivo+killing+by+memory+CD8+T+cells.">Cutting edge: rapid in vivo killing by memory CD8 T cells.</a> J Immunol. 171 (1), 27-31 (2003).</li><li>Quah, B. J., Wijesundara, D. K., Ranasinghe, C., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+fluorescent+target+arrays+for+assessment+of+T+cell+responses+in+vivo.">The use of fluorescent target arrays for assessment of T cell responses in vivo.</a> J Vis Exp. (88), e51627 (2014).</li><li>Johansson, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+killer+cell+education+in+mice+with+single+or+multiple+major+histocompatibility+complex+class+I+molecules.">Natural killer cell education in mice with single or multiple major histocompatibility complex class I molecules.</a> J Exp Med. 201 (7), 1145-1155 (2005).</li><li>Hailemichael, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistent+antigen+at+vaccination+sites+induces+tumor-specific+CD8(+)+T+cell+sequestration,+dysfunction+and+deletion.">Persistent antigen at vaccination sites induces tumor-specific CD8(+) T cell sequestration, dysfunction and deletion.</a> Nat Med. 19 (4), 465-472 (2013).</li><li>Overwijk, W. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+regression+and+autoimmunity+after+reversal+of+a+functionally+tolerant+state+of+self-reactive+CD8++T+cells.">Tumor regression and autoimmunity after reversal of a functionally tolerant state of self-reactive CD8+ T cells.</a> J Exp Med. 198 (4), 569-580 (2003).</li><li>Cho, H. I., Celis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+peptide+vaccines+eliciting+extensive+CD8+T-cell+responses+with+therapeutic+antitumor+effects.">Optimized peptide vaccines eliciting extensive CD8 T-cell responses with therapeutic antitumor effects.</a> Cancer Res. 69 (23), 9012-9019 (2009).</li><li>Ya, Z., Hailemichael, Y., Overwijk, W., Restifo, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+model+for+pre-clinical+study+of+human+cancer+immunotherapy.">Mouse model for pre-clinical study of human cancer immunotherapy.</a> Curr Protoc Immunol. 108, 21-43 (2015).</li><li>Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+protocols+for+surface+and+intracellular+antigen+analyses+of+neural+cell+types.">Flow cytometry protocols for surface and intracellular antigen analyses of neural cell types.</a> J Vis Exp. (94), (2014).</li><li>Durward, M., Harms, J., Splitter, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen+specific+killing+assay+using+CFSE+labeled+target+cells.">Antigen specific killing assay using CFSE labeled target cells.</a> J Vis Exp. (45), (2010).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Si bien este protocolo es sencillo, hay algunos pasos críticos que deben realizarse con cuidado. El cebado covax después de la inyección de la célula de T específicas de antígeno sometido a prueba es necesario ver todo asesinato de objetivos pulsados. Aunque es posible que la vacunación a base de agua covax crea una condición inflamatoria aguda, para la fase inflamatoria crónica, cambiar la formulación a base de agua de breve duración con un enfoque de base de aceite de liberación lenta del antígeno puede producir un mejor resultado7,12.
Además, la CFSE-rotulación de las células diana antígeno necesidades pulsación uniforme para una lectura de citometría de flujo ideal. El etiquetado de la CFSEHola con 5 μm y el CFSElo con 0,5 μm fue encontrado para ser ideal en este sistema para proporcionar una diferencia de registro en las poblaciones que podían distinguirse fácilmente.
Este protocolo es fácil de modificar para el sistema de antígeno específico de la prueba. En primer lugar, se debe confirmar la concentración de péptido administrado como parte de la covax. Una manera simple de determinar esta concentración adecuada es vacunar y seguimiento de la expansión de las células T inyectadas, específica de antígeno en la sangre. En este caso, un antígeno débil (hgp10025-33) requiere dos veces ḿas péptido como un antígeno fuerte (OVA257–264). Las concentraciones validadas utilizadas en este protocolo sería un razonable punto de partida para otros antígenos basados en la fuerza del estímulo de prueba. Un punto de la modificación sería simplemente vacunar el ratón de tipo salvaje con un antígeno de interés seguida por péptido pulsada objetivos para evaluar la función de CTL. Sin embargo, esta modificación se basaría en la activación y expansión de la respuesta específica de antígeno endógeno y hasta el momento de la transferencia de la célula objetivo probablemente necesitaría ocurren entre 7 y 14 días después de la inmunización. Además, el nivel de antígeno específico homicidio puede ser reducido en comparación con que observa al transferir células T transgénicas. Un problema con esta modificación es que el nivel de respuesta CTL en el destino puede ser demasiado bajo para ser detectada.
Además de la cantidad de antígeno necesaria para el cebado del T-cell, el tiempo del re-aislamiento de las células blanco marcado con CFSE debe optimizarse para una determinada hipótesis. Modificaciones a la célula de T está probaron que resultado en diferencial matando capacidades puede requerir ajustes en el momento del nuevo aislamiento. Una célula de T con una función de la mayor matanza debe tener objetivos evaluados mucho más rápido que su contraparte de tipo salvaje. Este perfil cinético debería estudiarse cuidadosamente para determinar el punto óptimo para abordar la hipótesis probada. En general, hemos encontrado que varían entre 4 y 24 h después de la inyección de las células diana.
Una limitación del análisis es que las células efectoras no han sido estimuladas crónicamente para inducir un estado agotado. Por lo tanto, función CTL está restringida a células efectoras activadas recientemente. Es posible que este método podría modificarse para evaluar la función de memoria de una capacidad de población o matar la memoria de un subconjunto de crónicamente activa específica de antígeno la célula de T, que sería interesante para futuras aplicaciones.
Este método de prueba de función CTL en vivo permite la detección rápida de en vivo de la matanza supera algunas de las limitaciones de una en vitro . Un sistema inmune intacto y el oscurecimiento de las células T transferidos mediante el método covax se basa en la presentación de péptidos y la estimulación por las células presentadoras de antígeno endógenas. A diferencia de otros en vivo matando a ensayos, este método no requiere una infección o la presencia de un objetivo de tumor. Sin embargo, la adición de un objetivo de tumor proporcionaría un comparador adicional y se podría agregar para el ensayo antes de la inyección de las células T antígeno específicas y administración covax para futuras aplicaciones de este método.

Existen múltiples protocolos para evaluar el citolíticos (CTL) potencial de un CD8+ o CD4+ T-cell. Esta evaluación puede hacerse fácilmente en vitro en condiciones controladas1,2,3. Además, modelos de enfermedades infecciosas, tales como LCMV, clásicamente han examinado la función CTL a través diferencialmente CFSE (-(and 6) 5-Carboxyfluorescein diacetato succinimidyl éster) etiquetado como células diana donde la CFSEhi-las células marcadas están pulsada con un péptido y CFSElo-destino etiquetado células quedan unpulsed. Las células son inyectadas en una proporción 1:1 y evaluó la pérdida de la CFSEHola-etiquetado objetivos pulsadas por citometría de flujo4. Vacuna y rechazo de modelos también han utilizado estrategias similares para la evaluación de en vivo de la matanza por ambos CD8+ y CD4+ T las células así como NK células5,6. Esto es un ensayo potente, pero requiere el uso de agentes infecciosos y que prime el sistema inmunológico antes de la inyección de destino.
Este protocolo, por el contrario, requiere una infección previa del huésped y en su lugar utiliza una estrategia de vacunación para cebar el sistema inmunológico antes de la inyección de destino. Esta vacuna se compone de una formulación a base de agua de vacuna peptídica que requiere la provisión de un inmunoestimulador cóctel llamado covax7, que consiste en un peaje-como el receptor 7 (TLR7) agonista (imiquimod crema), un anti-CD40 agonística anticuerpo y la interleucina-2 (IL-2) a la combinación sinérgica de los agentes inmunoestimulantes para la obtención de péptidos específicos cebado y respuesta inmune robusta. Como tal, este ensayo proporciona una lectura rápida de la función CTL como la vacuna se administra junto con las células para la evaluación de la función de sólo tres días antes de la inyección de las células diana. Además, el cebado covax es lo suficientemente fuerte como para que la capacidad de matanza de la célula de T específicas de antígeno preparada puede verse entre 4 y 24 h después de la inyección.
La limitación principal de este protocolo es identificar la línea de tiempo en vivo para la detección de la matanza de destino apropiado para el antígeno y la hipótesis ensayada. Cuidadosa evaluación debe realizarse, como variaciones en la fuerza de antígeno así como alteraciones genéticas siendo probado en las células T podría resultar en función diferencial de CTL que requiera una detección de diferentes tiempos de asesinato de destino. Además, si bien la concentración adecuada de péptido de vacunación ha sido optimizada para el antígeno de melanoma humano glicopéptido 100 (hgp10025-33) y ovoalbúmina257-264 (OVA257-264)8,9 , uso de otro modelo de antígeno que puede ser más apropiado para un determinado estudio requiere mayor validación. Debido a diferencias esperadas en la capacidad de los antígenos de un objetivo para estimular la función efectora CTL en combinación con el covax como coadyuvante, optimización de la frecuencia de dosis y concentración de dosis IL-2 puede ser esencial para lograr el objetivo deseado. En general, este protocolo permite una evaluación rápida de la función en vivo y puede ser adaptado a cualquier antígeno determinado.

<table style="border-collapse:collapse;width:523pt" width="697">
	<colgroup>
		<col style="width:199pt" width="265" />
		<col style="width:110pt" width="146" />
		<col style="width:89pt" width="119" />
		<col style="width:125pt" width="167" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20" style="height:15.0pt">
			<td height="20" style="width:199pt;height:15.0pt" width="265">6- to 12-week old female C57BL/6 mice&#160;</td>
			<td class="xl69" style="width:110pt" width="146">Charles River</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">027</td>
			<td style="width:125pt" width="167">C57 Black 6 mice</td>
		</tr>
		<tr height="20" style="height:15.0pt">
			<td class="xl71" height="20" style="width:199pt;height:15.0pt" width="265">OT-1 6-12-week old female mice&#160;</td>
			<td class="xl70" style="width:110pt" width="146">Jackson Labs</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">003831</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24" style="height:18.0pt">
			<td height="24" style="height:18.0pt">hgp10025&#8211;33&#160;</td>
			<td class="xl69">CPCScientific</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">834139</td>
			<td>KVPRNQDWL</td>
		</tr>
		<tr height="24" style="height:18.0pt">
			<td height="24" style="height:18.0pt">OVA 257&#8211;264&#160;</td>
			<td class="xl69">CPCScientific</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">MISC-012</td>
			<td>SIINFEKL</td>
		</tr>
		<tr height="20" style="height:15.0pt">
			<td height="20" style="height:15.0pt">Imiquimod cream 5%&#160;</td>
			<td class="xl69">Fougera</td>
			<td class="xl73">51672-4145-6</td>
			<td>Aldara Cream</td>
		</tr>
		<tr height="20" style="height:15.0pt">
			<td height="20" style="height:15.0pt">CD40-specific mAb&#160;</td>
			<td class="xl69">BioXcell</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">BE0016-2</td>
			<td>clone FGK4.5</td>
		</tr>
		<tr height="20" style="height:15.0pt">
			<td height="20" style="height:15.0pt">rhIL-2 protein&#160;</td>
			<td class="xl69">Hoffman LaRoche Inc</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">136</td>
			<td>Recombinant human IL-2 protein</td>
		</tr>
		<tr height="20" style="height:15.0pt">
			<td height="20" style="height:15.0pt">70% isopropyl alcohol Prep&#160;</td>
			<td class="xl69">Kendall</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">S-17474</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20" style="height:15.0pt">
			<td height="20" style="height:15.0pt">PBS</td>
			<td class="xl69">Life Technologies</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">10010-023</td>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
		</tr>
		<tr height="20" style="height:15.0pt">
			<td class="xl71" height="20" style="width:199pt;height:15.0pt" width="265">FBS</td>
			<td class="xl70" style="width:110pt" width="146">Life Technologies</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">26140-079</td>
			<td>fetal bovine serum</td>
		</tr>
		<tr height="20" style="height:15.0pt">
			<td class="xl71" height="20" style="width:199pt;height:15.0pt" width="265">RBC lysis buffer&#160;</td>
			<td class="xl70" style="width:110pt" width="146">Life Technologies</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">A10492-01</td>
			<td>red blood cell lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr height="20" style="height:15.0pt">
			<td class="xl71" height="20" style="width:199pt;height:15.0pt" width="265">RPMI 1640 Media</td>
			<td class="xl70" style="width:110pt" width="146">Life Technologies</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">11875119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20" style="height:15.0pt">
			<td class="xl71" height="20" style="width:199pt;height:15.0pt" width="265">L-Glutamine&#160;</td>
			<td class="xl70" style="width:110pt" width="146">Life Technologies</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20" style="height:15.0pt">
			<td class="xl71" height="20" style="width:199pt;height:15.0pt" width="265">Pen/Strep</td>
			<td class="xl70" style="width:110pt" width="146">Life Technologies</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">15140122</td>
			<td>penicillin/streptomycin</td>
		</tr>
		<tr height="20" style="height:15.0pt">
			<td class="xl71" height="20" style="width:199pt;height:15.0pt" width="265">CFSE</td>
			<td class="xl70" style="width:110pt" width="146">Life Technologies</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">C34554</td>
			<td>5-(and 6)-Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester</td>
		</tr>
		<tr height="20" style="height:15.0pt">
			<td class="xl71" height="20" style="width:199pt;height:15.0pt" width="265">Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td class="xl70" style="width:110pt" width="146">Sigma&#160;</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">A4503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20" style="height:15.0pt">
			<td class="xl71" height="20" style="width:199pt;height:15.0pt" width="265">1.5 mL MCT graduated natural&#160;</td>
			<td class="xl70" style="width:110pt" width="146">Fisher</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">05-408-129</td>
			<td>microcentrifuge tube</td>
		</tr>
		<tr height="20" style="height:15.0pt">
			<td class="xl71" height="20" style="width:199pt;height:15.0pt" width="265">70% ethanol</td>
			<td class="xl70" style="width:110pt" width="146">Fisher</td>
			<td class="xl73">BP8201500</td>
			<td>EtOH</td>
		</tr>
		<tr height="20" style="height:15.0pt">
			<td class="xl71" height="20" style="width:199pt;height:15.0pt" width="265">Trypan blue solution, 0.4%&#160;&#160;</td>
			<td class="xl70" style="width:110pt" width="146">Life Technologies</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20" style="height:15.0pt">
			<td class="xl71" height="20" style="width:199pt;height:15.0pt" width="265">Hemocytometer</td>
			<td class="xl70" style="width:110pt" width="146">Fisher</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">267110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20" style="height:15.0pt">
			<td class="xl71" height="20" style="width:199pt;height:15.0pt" width="265">27 gauge needle</td>
			<td class="xl70" style="width:110pt" width="146">BD</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">305109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20" style="height:15.0pt">
			<td class="xl71" height="20" style="width:199pt;height:15.0pt" width="265">1 mL syringe</td>
			<td class="xl70" style="width:110pt" width="146">BD</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">309659</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo assay for detection of antigen-specific t-cell cytolytic function using a vaccination model

Las metodologías actuales para la matanza de específica de antígeno son limitadas para uso in vitro o utilizadas en modelos de enfermedades infecciosas. Sin embargo, existe no un protocolo diseñado específicamente para medir el antígeno específico homicidio sin una infección. Este protocolo está diseñado y se describen métodos para superar estas limitaciones por lo que permite la detección de antígeno específico matando de una célula diana por CD8 células+ T en vivo. Esto se logra por la fusión de un modelo de vacunación con el objetivo marcado con CFSE tradicional matando a ensayo. Esta combinación permite al investigador evaluar el potencial CTL específica de antígeno directamente y rápidamente como el ensayo no es dependiente sobre el crecimiento del tumor o infección. Además, la lectura se basa en citometría de flujo y por lo tanto debe ser accesible a la mayoría de los investigadores. La principal limitación del estudio es identificar la línea de tiempo en vivo que sea apropiada a la hipótesis de ser probada. Variaciones en fuerza de antígeno y mutaciones en las células de T que pueden producir la función citolítica diferencial deben ser evaluados cuidadosamente para determinar el momento óptimo para la cosecha celular y la evaluación. La concentración adecuada de péptidos para la vacunación ha sido optimizada para hgp10025-33 y OVA257-264, pero además se necesitarían validación de otros péptidos que pueden ser más apropiados para un determinado estudio. En general, este protocolo permite una evaluación rápida de la función en vivo y puede ser adaptado a cualquier antígeno determinado.

Antes de la inyección de las células diana marcada con CFSE, corre a la mezcla 1:1 células en un citómetro de flujo para determinar las frecuencias de línea de base del CFSEHola y CFSElo las células diana. Figura 1 A muestra la estrategia bloquea para detectar cambios en las poblaciones de la CFSE, una puerta inicial está hecha usando parámetros de FSC y SSC. Las células positivas de CFSE total entonces se subgated antes de evaluar cambios en la frecuencia, ya que esta población es relativamente pequeña en comparación con los esplenocitos endógena sin etiqueta. La frecuencia relativa de la CFSEHola CFSElo poblaciones y es el calculado mediante el establecimiento de la población total de CFSE-positivo al 100%. Este análisis puede hacerse utilizando un formato de trama de histograma o punto. En la figura 1Bse muestra un ejemplo de la frecuencia relativa de las poblaciones de CFSE antes de la inyección. Esta relación rara vez será exactamente 1:1 pero debe estar razonablemente cerca. La necesidad de cebado de la covax se muestra en la figura 1C donde ningún asesinato del antígeno pulsada, CFSEHola las células diana se observa en el post inyección de 24 h. Figura 1 D demuestra la muerte efectiva del antígeno pulsada, CFSEHola-etiquetado como células blanco como el pico que se observó antes de la inyección es casi desapercibido y la relación se cambia de puesto dramáticamente de 50% a 1% de detección. La figura también muestra la cinética de antígenos pulsada, CFSEHola-etiquetado matanza de la célula blanco mediante la evaluación de la pérdida de esta población en 24 h post inyección y 6 h.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56255/56255fig1.jpg"> Figura 1: Comparación de células marcadas al inicio y después de la inyección de las células diana marcada con CFSE. (A) se muestra la estrategia bloquea para la evaluación de la función CTL. Brevemente, energizados linfocitos son cerrados utilizando parámetros de forward scatter (FSC) vs lado scatter (SSC). Total células de CSFE-positivas son subgated dentro de la puerta de la célula viva. La relación de CFSEHola y CFSElo basa en su frecuencia respectiva dentro de la población total de CFSE-positivo. (B) siguientes CFSE etiquetado, células diana se mezclan 1:1 y evaluó la relación de CFSEHola y CFSElo las células mediante citometría de flujo. Los números indican la frecuencia de los picos correspondientes en un histograma (izquierda) y CFSE vs SSC punto trama formatos (derecha). (C) Esto demuestra la falta de células blanco matando sin vacunación previa con covax régimen. Esplenocitos fueron cosechada 24 h después de la inyección. (D) Esto demuestra la matanza de las antígeno-pulsada CFSEHola células diana a las 6 h (gráficos superior) y (gráficos inferiores) las 24 horas post inyección. Los números indican la frecuencia de los picos marcados con CFSE en un histograma (izquierda) y el formato (derecha) de CFSE vs SSC punto trama. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56255/56255fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

El objetivo de este protocolo es permitir la detección de en vivo matando de una célula de la blanco en un modelo murino de específica de antígeno.

En Vivo Ensayo para la detección de la función citolítica de células T específicas de antígeno utilizando un modelo de vacunación

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol ...

in-vivo-assay-for-detection-antigen-specific-t-cell-cytolytic

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

9.8K vistas.  University of Texas MD Anderson Cancer Center. El objetivo de este protocolo es permitir la detección de en vivo matando de una célula de la blanco en un modelo murino de específica de antígeno.

Video: In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

Antigen Specific In Vivo Killing Assay using CFSE Labeled Target Cells

Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) can be used to easily and quickly label a cell population of interest for in vivo investigation. This labeling has classically been used to study proliferation and migration. In the method presented here, we have shortened the timeline after adoptive transfer to look at survival and killing of epitope specific CFSE labeled target cells4-6. The level of specific killing of a CD8 + T cell clone can indicate the quality of the response, as their quantity may be misleading. Specific CD8+ T cells can become functionally exhausted over time with a decline in cytokine production and killing7,8. Also, certain CD8 + T cell clones may not kill as well as others with differing TCR specificities9. For effective Cell Mediated Immunity (CMI), antigens must be identified that produce not only adequate numbers of responding T cells, but also functionally robust responding T cells. Here we assess the percent cell specific killing of two peptide specific T cell clones in BALB/c mice.

Antigen Specific In Vivo Killing Assay using CFSE Labeled Target Cells

Many infections elicit a strong CTL response, but occasionally, the quantity of responding cells does not correlate to control of the pathogen1. One measure of CTL quality is their ability to kill specifically2. CFSE labeling of target cells can be used to investigate this CTL response quality in vivo3,4.

Antígeno Específico de la En Vivo Matar ensayo utilizando CFSE células diana marcadas

Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) can be used to easily and quickly label a cell population of interest for in vivo investigation.  ...

Investigación

Inmunología e Infección

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological deficiencies. GVHD is caused by mature alloreactive T cells present in the bone marrow graft that are infused into the recipient and cause damage to host organs. However, in mice, T cells must be added to the bone marrow inoculum to cause GVHD. Although extensive work has been done to characterize T cell responses post transplant, bioluminescent imaging technology is a non-invasive method to monitor T cell trafficking patterns in vivo. 
Following lethal irradiation, recipient mice are transplanted with bone marrow cells and splenocytes from donor mice. T cell subsets from L2G85.B6 (transgenic mice that constitutively express luciferase) are included in the transplant. By only transplanting certain T cell subsets, one is able to track specific T cell subsets in vivo, and based on their location, develop hypotheses regarding the role of specific T cell subsets in promoting GVHD at various time points. At predetermined intervals post transplant, recipient mice are imaged using a Xenogen IVIS CCD camera. Light intensity can be quantified using Living Image software to generate a pseudo-color image based on photon intensity (red = high intensity, violet = low intensity). 
Between 4-7 days post transplant, recipient mice begin to show clinical signs of GVHD. Cooke et al.1 developed a scoring system to quantitate disease progression based on the recipient mice fur texture, skin integrity, activity, weight loss, and posture. Mice are scored daily, and euthanized when they become moribund. Recipient mice generally become moribund 20-30 days post transplant. 
Murine models are valuable tools for studying the immunology of GVHD. Selectively transplanting particular T cell subsets allows for careful identification of the roles each subset plays. Non-invasively tracking T cell responses in vivo adds another layer of value to murine GVHD models.

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Murine bone marrow transplantation is a widely used technique to study immunological mechanisms governing graft-versus-host disease in humans. The ability to monitor T cell trafficking patterns in vivo allows for detailed analysis of the development and perpetuation of T cell responses during graft-versus-host disease.

La inducción de la enfermedad de injerto contra huésped y<em&gt; En Vivo</em&gt; T Monitoreo Celular Utilizando un modelo murino MHC de concordancia

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological ...

Trans-vivo Delayed Type Hypersensitivity Assay for Antigen Specific Regulation

Delayed-type hypersensitivity response (DTH) is a rapid in vivo manifestation of T cell-dependent immune response to a foreign antigen (Ag) that the host immune system has experienced in the recent past. DTH reactions are often divided into a sensitization phase, referring to the initial antigen experience, and a challenge phase, which usually follows several days after sensitization. The lack of a delayed-type hypersensitivity response to a recall Ag demonstrated by skin testing is often regarded as an evidence of anergy. The traditional DTH assay has been effectively used in diagnosing many microbial infections.
Despite sharing similar immune features such as lymphocyte infiltration, edema, and tissue necrosis, the direct DTH is not a feasible diagnostic technique in transplant patients because of the possibility of direct injection resulting in sensitization to donor antigens and graft loss. To avoid this problem, the human-to-mouse "trans-vivo" DTH assay was developed 1,2. This test is essentially a transfer DTH assay, in which human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) and specific antigens were injected subcutaneously into the pinnae or footpad of a na&iuml;ve mouse and DTH-like swelling is measured after 18-24 hr 3. The antigen presentation by human antigen presenting cells such as macrophages or DCs to T cells in highly vascular mouse tissue triggers the inflammatory cascade and attracts mouse immune cells resulting in swelling responses. The response is antigen-specific and requires prior antigen sensitization. A positive donor-reactive DTH response in the Tv-DTH assay reflects that the transplant patient has developed a pro-inflammatory immune disposition toward graft alloantigens.
The most important feature of this assay is that it can also be used to detect regulatory T cells, which cause bystander suppression. Bystander suppression of a DTH recall response in the presence of donor antigen is characteristic of transplant recipients with accepted allografts 2,4-14. The monitoring of transplant recipients for alloreactivity and regulation by Tv-DTH may identify a subset of patients who could benefit from reduction of immunosuppression without elevated risk of rejection or deteriorating renal function.
A promising area is the application of the Tv-DTH assay in monitoring of autoimmunity15,16 and also in tumor immunology 17.

We describe a valuable diagnostic assay that could potentially be used to decide the withdrawal of immunosuppression after transplant without elevated risk of graft rejection. The assay uses the principles of Delayed Type Hypersensitivity and provides accurate assessment of both donor specific effector and regulatory immune responses mounted by recipients.

Trans-vivo hipersensibilidad de tipo retardada Ensayo para Antigen Reglamento Específico

Delayed-type hypersensitivity response (DTH) is a rapid in vivo manifestation of T cell-dependent immune response to a foreign antigen (Ag) that the host ...

In Vitro Assay to Evaluate the Impact of Immunoregulatory Pathways on HIV-specific CD4 T Cell Effector Function

T cell exhaustion is a major factor in failed pathogen clearance during chronic viral infections. Immunoregulatory pathways, such as PD-1 and IL-10, are upregulated upon this ongoing antigen exposure and contribute to loss of proliferation, reduced cytolytic function, and impaired cytokine production by CD4 and CD8 T cells. In the murine model of LCMV infection, administration of blocking antibodies against these two pathways augmented T cell responses. However, there is currently no in vitro assay to measure the impact of such blockade on cytokine secretion in cells from human samples. Our protocol and experimental approach enable us to accurately and efficiently quantify the restoration of cytokine production by HIV-specific CD4 T cells from HIV infected subjects.
Here, we depict an in vitro experimental design that enables measurements of cytokine secretion by HIV-specific CD4 T cells and their impact on other cell subsets. CD8 T cells were depleted from whole blood and remaining PBMCs were isolated via Ficoll separation method. CD8-depleted PBMCs were then incubated with blocking antibodies against PD-L1 and/or IL-10R&#945; and, after stimulation with an HIV-1 Gag peptide pool, cells were incubated at 37 &#176;C, 5% CO2. After 48 hr, supernatant was collected for cytokine analysis by beads arrays and cell pellets were collected for either phenotypic analysis using flow cytometry or transcriptional analysis using qRT-PCR. For more detailed analysis, different cell populations were obtained by selective subset depletion from PBMCs or by sorting using flow cytometry before being assessed in the same assays. These methods provide a highly sensitive and specific approach to determine the modulation of cytokine production by antigen-specific T-helper cells and to determine functional interactions between different populations of immune cells.

In Vitro Assay to Evaluate the Impact of Immunoregulatory Pathways on HIV-specific CD4 T Cell Effector Function

We developed an in vitro assay to investigate the role of immunoregulatory pathways in the regulation of cytokine secretion by HIV-specific CD4 T cells.

Ensayo in vitro para evaluar el impacto de inmunoreguladoras Caminos de CD4 T función específica para el VIH efector celular

T cell exhaustion is a major factor in failed pathogen clearance during chronic viral infections. Immunoregulatory pathways, such as PD-1 and IL-10, are ...

An Ex vivo Model of an Oligodendrocyte-directed T-Cell Attack in Acute Brain Slices

Death of oligodendrocytes accompanied by destruction of neurons and axons are typical histopathological findings in cortical and subcortical grey matter lesions in inflammatory demyelinating disorders like multiple sclerosis (MS). In these disorders, mainly CD8+ T-cells of putative specificity for myelin- and oligodendrocyte-related antigens are found, so that neuronal apoptosis in grey matter lesions may be a collateral effect of these cells. Different types of animal models are established to study the underlying mechanisms of the mentioned pathophysiological processes. However, although they mimic some aspects of MS, it is impossible to dissect the exact mechanism and time course of &#8216;&#8216;collateral&#8217;&#8217; neuronal cell death. To address this course, here we show a protocol to study the mechanisms and time response of neuronal damage following an oligodendrocyte-directed CD8+ T cell attack. To target only the myelin sheath and the oligodendrocytes, in vitro activated oligodendrocyte-specific CD8+ T-cells are transferred into acutely isolated brain slices. After a defined incubation period, myelin and neuronal damage can be analysed in different regions of interest. Potential applications and limitations of this model will be discussed.

An Ex vivo Model of an Oligodendrocyte-directed T-Cell Attack in Acute Brain Slices

To address mechanisms of demyelination and neuronal apoptosis in cortical lesions of inflammatory demyelinating disorders, different animal models are used. We here describe an ex vivo approach by using oligodendrocyte-specific CD8+ T-cells on brain slices, resulting in oligodendroglial and neuronal death. Potential applications and limitations of the model are discussed.

Una<em&gt; Ex vivo</em&gt; Modelo de un ataque de células T Oligodendrocyte dirigida en Rebanadas cerebral agudo

Death of oligodendrocytes accompanied by destruction of neurons and axons are typical histopathological findings in cortical and subcortical grey matter ...

Whole-animal Imaging and Flow Cytometric Techniques for Analysis of Antigen-specific CD8+ T Cell Responses after Nanoparticle Vaccination

Traditional vaccine adjuvants, such as alum, elicit suboptimal CD8+ T cell responses. To address this major challenge in vaccine development, various nanoparticle systems have been engineered to mimic features of pathogens to improve antigen delivery to draining lymph nodes and increase antigen uptake by antigen-presenting cells, leading to new vaccine formulations optimized for induction of antigen-specific CD8+ T cell responses. In this article, we describe the synthesis of a &#8220;pathogen-mimicking&#8221; nanoparticle system, termed interbilayer-crosslinked multilamellar vesicles (ICMVs) that can serve as an effective vaccine carrier for co-delivery of subunit antigens and immunostimulatory agents and elicitation of potent cytotoxic CD8+ T lymphocyte (CTL) responses. We describe methods for characterizing hydrodynamic size and surface charge of vaccine nanoparticles with dynamic light scattering and zeta potential analyzer and present a confocal microscopy-based procedure to analyze nanoparticle-mediated antigen delivery to draining lymph nodes. Furthermore, we show a new bioluminescence whole-animal imaging technique utilizing adoptive transfer of luciferase-expressing, antigen-specific CD8+ T cells into recipient mice, followed by nanoparticle vaccination, which permits non-invasive interrogation of expansion and trafficking patterns of CTLs in real time. We also describe tetramer staining and flow cytometric analysis of peripheral blood mononuclear cells for longitudinal quantification of endogenous T cell responses in mice vaccinated with nanoparticles.

We describe whole-animal imaging and flow cytometry-based techniques for monitoring expansion of antigen-specific CD8+ T cells in response to immunization with nanoparticles in a murine model of vaccination.

Imaging Whole-animal y de citometría de flujo Las técnicas para T CD8 + respuestas celulares Análisis de antígeno-específicos después de nanopartículas Vacunación

Traditional vaccine adjuvants, such as alum, elicit suboptimal CD8+ T cell responses. To address this major challenge in vaccine development, various ...

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, including phagocytosis of damaged synapses or cells, debris, and/or invading pathogens. Impaired phagocytic function has been implicated in the pathogenesis of diseases such as Alzheimer's and age-related macular degeneration, where amyloid-&#946; plaque and drusen accumulate, respectively. Despite its importance, microglial phagocytosis has been challenging to assess in vivo. Here, we describe a simple, yet robust, technique for precisely monitoring and quantifying the in vivo phagocytic potential of retinal microglia. Previous methods have relied on immunohistochemical staining and imaging techniques. Our method uses flow cytometry to measure microglial uptake of fluorescently labeled particles after intravitreal delivery to the eye in live rodents. This method replaces conventional practices that involve laborious tissue sectioning, immunostaining, and imaging, allowing for more precise quantification of microglia phagocytic function in just under six hours. This procedure can also be adapted to test how various compounds alter microglial phagocytosis in physiological settings. While this technique was developed in the eye, its use is not limited to vision research.

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Microglial phagocytosis is critical for the maintenance of tissue homeostasis and inadequate phagocytic function has been implicated in pathology. However, assessing microglia function in vivo is technically challenging. We have developed a simple but robust technique for precisely monitoring and quantifying the phagocytic potential of microglia in a physiological setting.

La evaluación de la función retiniana Microglial fagocítica<em&gt; En Vivo</em&gt; El uso de un ensayo basado en citometría de flujo

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, ...

Generating De Novo Antigen-specific Human T Cell Receptors by Retroviral Transduction of Centric Hemichain

T cell receptors (TCRs) are used clinically to direct the specificity of T cells to target tumors as a promising modality of immunotherapy. Therefore, cloning TCRs specific for various tumor-associated antigens has been the goal of many studies. To elicit an effective T cell response, the TCR must recognize the target antigen with optimal affinity. However, cloning such TCRs has been a challenge and many available TCRs possess sub-optimal affinity for the cognate antigen. In this protocol, we describe a method of cloning de novo high affinity antigen-specific TCRs using existing TCRs by exploiting hemichain centricity. It is known that for some TCRs, each TCR&#945; or TCR&#946; hemichain do not contribute equally to antigen recognition, and the dominant hemichain is referred to as the centric hemichain. We have shown that by pairing the centric hemichain with counter-chains differing from the original counter-chain, we are able to maintain the antigen specificity, while modulating its interaction strength for the cognate antigen. Thus, the therapeutic potential of a given TCR can be improved by optimizing the pairing between the centric and counter hemichains.

Generating De Novo Antigen-specific Human T Cell Receptors by Retroviral Transduction of Centric Hemichain

Herein we describe a novel method to generate antigen-specific T cell receptors (TCRs) by pairing the TCR&#945; or TCR&#946; of an existing TCR, possessing the antigen-specificity of interest, with complementary hemichain of the peripheral T cell receptor repertoire. The de novo generated TCRs retain antigen-specificity with varying affinity.

Generando<em&gt; De Novo</em&gt; T humanas receptores de células específicas de antígeno por retroviral Transducción de Centric Hemichain

T cell receptors (TCRs) are used clinically to direct the specificity of T cells to target tumors as a promising modality of immunotherapy. Therefore, ...

Detection and Enrichment of Rare Antigen-specific B Cells for Analysis of Phenotype and Function

B cells reactive with a specific antigen usually occur at a frequency of &lt;0.05% of lymphocytes. For decades researchers have sought methods to isolate and enrich these rare cells for studies of their phenotype and biology. Approaches are inevitably based on the principle that B cells recognize native antigen by virtue of cell surface receptors that are representative in specificity of antibodies that will eventually be secreted by their differentiated daughters. Perhaps the most obvious approach to the problem involves use of fluorochrome-conjugated antigens in conjunction with fluorescence-activated cell sorting (FACS). However, the utility of these methods is limited by cell frequency and the achievable rate of analysis and isolation by electronic sorting. A novel method to enrich rare antigen-specific B cells using magnetic nanoparticles that results in high yield enrichment of antigen-reactive B cells from large starting cell populations is described. This method enables improved monitoring of the phenotype and biology of antigen reactive cells before and following in vivo antigen encounter, such as after immunization or during development of autoimmunity.

A simple yet effective method that employs magnetic nanoparticles to detect and enrich antigen-reactive B cells for functional and phenotypic analysis is described.

Detección y enriquecimiento de Rare células B específicas de antígeno para el análisis del fenotipo y la función

B cells reactive with a specific antigen usually occur at a frequency of &lt;0.05% of lymphocytes. For decades researchers have sought methods to isolate ...

A Protein Microarray Assay for Serological Determination of Antigen-specific Antibody Responses Following Clostridium difficile Infection

We provide a detailed overview of a novel high-throughput protein microarray assay for the determination of anti-Clostridium difficile antibody levels in human sera and in separate preparations of polyclonal intravenous immunoglobulin (IVIg). The protocol describes the methodological steps involved in sample preparation, printing of arrays, assay procedure, and data analysis. In addition, this protocol could be further developed to incorporate diverse clinical samples including plasma and cell culture supernatants. We show how protein microarray can be used to determine a combination of isotype (IgG, IgA, IgM), subclass (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2), and strain-specific antibodies to highly purified whole C. difficile toxins A and B (toxinotype 0, strain VPI 10463, ribotype 087), toxin B from a C. difficile toxin-B-only expressing strain (CCUG 20309), a precursor form of a B fragment of binary toxin, pCDTb, ribotype-specific whole surface layer proteins (SLPs; 001, 002, 027), and control proteins (tetanus toxoid and Candida albicans). During the experiment, microarrays are probed with sera from individuals with C. difficile infection (CDI), individuals with cystic fibrosis (CF) without diarrhea, healthy controls (HC), and from individuals pre- and post-IVIg therapy for the treatment of CDI, combined immunodeficiency disorder, and chronic inflammatory demyelinating polyradiculopathy. We encounter significant differences in toxin neutralization efficacies and multi-isotype specific antibody levels between patient groups, commercial preparations of IVIg, and sera before and following IVIg administration. Also, there is a significant correlation between microarray and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for antitoxin IgG levels in serum samples. These results suggest that microarray could become a promising tool for profiling antibody responses to C.difficile antigens in vaccinated or infected humans. With further refinement of antigen panels and a reduction in production costs, we anticipate that microarray technology may help optimize and select the most clinically useful immunotherapies for C. difficile infection in a patient-specific manner.

A Protein Microarray Assay for Serological Determination of Antigen-specific Antibody Responses Following Clostridium difficile Infection

This article describes a simple protein microarray method for profiling humoral immune responses to a 7-plex panel of highly purified Clostridium difficile antigens in human sera. The protocol can be extended for the determination of specific antibody responses in preparations of polyclonal intravenous immunoglobulin.

Un análisis de Microarray de proteínas para la determinación serológica de anticuerpos las respuestas siguientes infección por Clostridium difficile específica de antígeno

We provide a detailed overview of a novel high-throughput protein microarray assay for the determination of anti-Clostridium difficile antibody levels in ...