Nos gustaría reconocer Cruz de San Jorge de asesoramiento general sobre la biología tripanosoma. Este trabajo también fue apoyado por una beca de la CME Fundación Bill y Melinda Gates para DS, un NSF Graduate Research Fellowship (DGE-1325261) para MRM y un NIH / NIAID (subvención # AI085973) para FNP. Agradecemos a Galadriel Hovel-Miner para el uso de la cepa que contiene el gen y el reconocimiento del sitio I-SCEI.

NOTA: Durante todo el procedimiento, es necesario para mantener las células en hielo. medios fríos también deben utilizarse en todas partes. La recolección de la muestra 1. <ol><li> Crecer Lister 427 tripanosomas cepa del torrente sanguíneo a una densidad de 0,5 - 1 millones / ml. Lo mejor es comenzar culturas con un pequeño número de parásitos. Centrifugar 50 x 10 6 células / muestra durante 10 minutos a 1.500 x g. Asegúrese de dejar 1 x 10 6 células en cultivo para su uso posterior como controles de anticuerpos positivos y negativos. NOTA: Este protocolo también se puede utilizar en tripanosomas aisladas a partir de sangre de animales (véase la discusión para los detalles). </li><li> Pipeta o verter fuera la mayor parte del sobrenadante (dejar alrededor de 750 l). Transferir las células a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. </li><li> Girar las células a 4 ° C durante 4 min a 5.200 xg en una microcentrífuga y eliminar el sobrenadante. </li></ol> 2. El etiquetado Magnética <ol><li> Resuspender las células en 150 l de medio de cultivo (HMI-9 wiTH suero por ejemplo) + anticuerpo anti-VSG primario a la dilución apropiada. NOTA: El anticuerpo anti-VSG está hecho en casa y se utiliza en una dilución de 1:50. Es importante usar un anticuerpo primario anti-VSG que no está marcado con un fluoróforo. </li><li> células Vortex utilizando un vórtice adaptador-60 a una velocidad de 6-8 en una habitación fría a 4 ° C durante 10 min. Se lava con 800 - 1.000 l fría HMI-9 con suero. </li><li> Giran a 4 ° C durante 4 minutos a 5.200 xg y aspirar el sobrenadante. Se lava con 1 ml de HMI-9 con suero y girar como antes. Aspirar el sobrenadante. sedimento se vuelve a suspender en 100 l de HMI-9 con suero. </li><li> Añadir 110 l de células activadas por la clasificación magnética microperlas (MSC). Utilice anti-ratón, anti-conejo, o perlas anti-biotina como apropiado para el anticuerpo anti-VSG primaria. Mezclar bien. células de vórtice en una habitación fría a 4 ° C durante 10 min. </li><li> Mientras que las células se vórtex, configurar una columna de separación / muestra magnético activado en un imán separación. Asegúrese de tener una rereceptáculo (se utiliza un tubo de centrífuga de 15 ml) en la columna para recoger el flujo continuo. La instalación del equipo en una habitación fría. </li><li> Añadir 2 ml de HMI-9 con suero a la columna de primera. Después de cebar lugar un tubo de centrífuga de 15 ml en la columna para recoger flujo a través de cada muestra. </li><li> Después de los 10 minutos de incubación en el paso 2.4, añadir 800-1.000 l fría HMI-9 con suero. Giran a 4 ° C durante 4 minutos a 5.200 xg y retirar el sobrenadante para eliminar el anticuerpo no unido. Lavar con 1 ml de HMI-9 con suero y repetición dejando 100 l del sobrenadante. </li><li> Flick el tubo de centrífuga vigorosamente e inspeccione visualmente el tubo para asegurarse de que el sedimento se resuspendió completamente. Añadir 1 ml de HMI-9 con suero y la pipeta hacia arriba y hacia abajo para asegurarse de que las células se volvieron a suspender bien. </li></ol> 3. Separación Magnética <ol><li> Asegúrese de que las columnas están preparados como se describe anteriormente. Aplicar las células a la columna. Suma de flujo continuo con las células que expresan el VS no dominanteG. 1 ml de medio + tripanosomas típicamente se lleva a 6 - 7 min a fluir a través de la columna. </li><li> Lavar 2 veces con 1 ml de HMI-9 con suero y recoger de flujo continuo en el mismo tubo como en el paso 3.1. </li><li> flujo a través Divide (3 ml) en dos tubos de microcentrífuga de 1,5 ml. NOTA: Estas se pueden combinar más tarde o medio se pueden utilizar para aislar el ARN, etc. </li><li> Retirar la columna del imán. Añadir 3 ml de HMI-9 con suero a la columna y hundir la columna en un tubo de centrífuga de 15 ml para obtener células que expresan la partida, dominante VSG. Eliminar 300 l de material eluido para su posterior análisis. Mantener estas células en hielo. </li><li> Para su uso como un positivo y un control negativo, una duración aproximada de 1 millón de células del cultivo a partir de células de control cada vez mayor a 37 ° C (los que no se espera que cambie con frecuencia) y pipeta de ellos en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. NOTA: Las células de control positivo se tiñeron con anticuerpo marcado con fluoróforo en el paso 4.1. Negativo células de control remaen sin teñir en el resto del protocolo. </li><li> muestras de giro de flujo continuo y positivo muestra de control de anticuerpos a 4 ° C durante 4 minutos a 5.200 xg y eliminar el sobrenadante. NOTA: Otra alícuota 300 l de células eluidas se puede utilizar como un control positivo para la tinción de anti-VSG. </li></ol> 4. La tinción para identificar los contaminantes y de Conmutación <ol><li> muestras de flujo a través de Resuspender las células de control positivo y en 100 l de HMI-9 con suero +, anticuerpo primario, marcada con fluoróforo anti-VSG a la dilución apropiada. NOTA: El anticuerpo anti-VSG marcado está hecho en casa y se utiliza en una dilución de 1: 1000. El fluoróforo marcado, anti-VSG puede ser de la misma fuente que el anticuerpo no marcado en la separación MACS step.There debe ser de 3 ml de muestra de flujo a través de dos tubos de microcentrífuga siguientes paso 3.5. </li><li> Para analizar todo el flujo de paso por citometría de flujo, se combinan las bolitas en los dos tubos de microcentrífuga mientras que re-susen espera de las muestras en 100 l de HMI-9 con el anticuerpo anti-VSG + suero. Mezclar bien. </li><li> células de vórtice en una habitación fría a 4 ° C durante 10 min. Añadir 800 - 1000 l fría HMI-9 con suero. muestras de giro a 4 ° C durante 4 minutos a 5.200 xg y eliminar el sobrenadante para eliminar el anticuerpo no unido. </li><li> Lavar las células con 1 ml de HMI-9 con suero. muestras de giro a 4 ° C durante 4 minutos a 5.200 xg y eliminar el sobrenadante. Durante este último giro, centrifugar las muestras eluidas-desde el paso 3.4 y la muestra de control negativo. </li><li> Volver a suspender todo el filtrado y muestras eluidas en: 148,5 l HMI-9 con suero, 25 l contar bolas absoluto y 1,5 l solución yoduro de propidio (175 l en total) tinción. Volver a suspender las muestras de control positivas y negativas de anticuerpos en 175 l HMI-9 con suero. Asegúrese de registrar el número de contar bolas absolutos / 25 l para el lote particular usado. </li><li> Ejecutar todas las muestras a través de un citómetro de flujo y recoger datos. Las células muertas manchar como PI <sup&gt; +. Los contaminantes se tiñen como PI - VSG +. Sensores, se tiñen como PI - VSG - 8. </li><li> Calcular las frecuencias de conmutación utilizando citometría de flujo de datos. NOTA: Para obtener instrucciones sobre cómo calcular las frecuencias de conmutación, por favor consulte el archivo suplementario <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54715/Flow_Cytometry_Calculations.docx" target="_blank">Citometría de Flujo Calculations.docx</a> y en la Tabla 1. </li></ol>

<ol>
	<li>Horn, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigenic+variation+in+African+trypanosomes.">Antigenic variation in African trypanosomes.</a> Molecular &amp; Biochemical Parasitology. 195 (2), 123-129 (2014).</li><li>Lamont, G. S., Tucker, R. S., Cross, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+antigen+switching+rates+in+Trypanosoma+brucei.">Analysis of antigen switching rates in Trypanosoma brucei.</a> Parasitology. 92 (Pt 2), 355-367 (1986).</li><li>Rudenko, G., McCulloch, R., Dirks-Mulder, A., Borst, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomere+exchange+can+be+an+important+mechanism+of+variant+surface+glycoprotein+gene+switching+in+Trypanosoma+brucei.">Telomere exchange can be an important mechanism of variant surface glycoprotein gene switching in Trypanosoma brucei.</a> Mol Biochem Parasitol. 80 (1), 65-75 (1996).</li><li>Turner, C. M., Barry, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+frequency+of+antigenic+variation+in+Trypanosoma+brucei+rhodesiense+infections.">High frequency of antigenic variation in Trypanosoma brucei rhodesiense infections.</a> Parasitology. 99 (Pt 1), 67-75 (1989).</li><li>Miller, E. N., Turner, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+antigenic+types+appearing+in+first+relapse+populations+of+clones+of+Trypanosoma+brucei.">Analysis of antigenic types appearing in first relapse populations of clones of Trypanosoma brucei.</a> Parasitology. 82 (1), 63-80 (1981).</li><li>Horn, D., Cross, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Trypanosoma+brucei+vsg+expression+site+switching+in+vitro.">Analysis of Trypanosoma brucei vsg expression site switching in vitro.</a> Mol Biochem Parasitol. 84 (2), 189-201 (1997).</li><li>Figueiredo, L. M., Janzen, C. J., Cross, G. A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+histone+methyltransferase+modulates+antigenic+variation+in+African+trypanosomes.">A histone methyltransferase modulates antigenic variation in African trypanosomes.</a> PLoS Biol. 6 (7), e161 (2008).</li><li>Boothroyd, C. E., Dreesen, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+yeast-endonuclease-generated+DNA+break+induces+antigenic+switching+in+Trypanosoma+brucei.">A yeast-endonuclease-generated DNA break induces antigenic switching in Trypanosoma brucei.</a> Nature. 459 (7244), 278-281 (2009).</li><li>Engstler, M., Pfohl, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrodynamic+Flow-Mediated+Protein+Sorting+on+the+Cell+Surface+of+Trypanosomes.">Hydrodynamic Flow-Mediated Protein Sorting on the Cell Surface of Trypanosomes.</a> Cell. 131 (3), 505-515 (2007).</li><li>Mugnier, M. R., Cross, G. A. M., Papavasiliou, F. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+in+vivo+dynamics+of+antigenic+variation+in+Trypanosoma+brucei.">The in vivo dynamics of antigenic variation in Trypanosoma brucei.</a> Science. 347 (6229), 1470-1473 (2015).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Con respecto a la técnica experimental, el componente más crítico del protocolo es mantener todas las muestras frío. Los tripanosomas internalizan muy rápidamente anticuerpo unido a su superficie 9, pero este proceso es dependiente de la motilidad, y no influye en el ensayo, siempre y cuando las células se mantienen a 4 ° C. Todas las muestras deben mantenerse siempre en hielo, y pipeteo debe hacerse rápidamente para minimizar la exposición al ambiente de laboratorio C 25 °. Fría HMI-9 con suero debe estar disponible al inicio del experimento y se debe mantener en hielo en todo momento. El aislamiento de los tripanosomas mediante la ejecución de ellos sobre la columna debe hacerse en una habitación fría, ya que toma 5 - 7 min para ejecutar una muestra de 1 ml a través de la columna. Si hay más muestras que las unidades de separación magnética disponibles, el aislamiento magnético se puede hacer en la secuencia, siempre que las muestras no están separados de forma activa se mantienen en hielo. También es fundamental que las muestras sean muy bien af ​​mixtoter del último lavado tras la incubación con las microperlas y antes del aislamiento sobre el imán. Esto se puede lograr con un movimiento rápido agresiva del tubo de centrífuga o vórtex luz. Sin pellets o grupos de células deben ser visibles antes de la adición de la muestra a la columna de separación, que se puede comprobar observando el nivel de microscopía óptica. Si grupos están presentes, el nivel de contaminación en la muestra de flujo a través de las células que expresan la VSG dominante es generalmente mucho más alta de lo deseable. Cuando se realiza el cálculo para el número de conmutadores en la muestra al final del protocolo, es importante tener en cuenta si se ha utilizado todo el flujo a través de análisis de citometría de flujo, o si se utilizó un medio. Si se utiliza sólo la mitad, el número total de conmutadores calculados debe ser multiplicado por 2. Al retirar el sobrenadante durante las etapas de lavado, no es necesario pipetear fuera hasta la última gota, y típicamente 15 - 25 l sonla izquierda que rodea el sedimento de células. Esto es especialmente importante durante las etapas finales de la tinción y el lavado, porque en este punto gránulos rara vez se ven en las muestras de flujo continuo porque hay tan pocas células cambiaron. Mientras que la final mancha anti-VSG se realiza típicamente con anticuerpo purificado, marcado con fluoróforo anti-VSG, la primera mancha anti-VSG antes del aislamiento magnético se puede hacer con anticuerpo purificado o suero. También hemos utilizado sobrenadante biorreactor derivado a partir de hibridomas que expresan anticuerpos anti-VSG. En cualquier caso, el material utilizado para la mancha inicial debe ajustarse para asegurar una buena separación de las células que hacen o no expresan el, VSG a partir dominante. Es típico que la población de células en el flujo a través de estar contaminados con células que expresan el VSG dominante. Mientras que esta contaminación debe ser mínimo, en nuestra experiencia, es raro que la población sea totalmente desprovista de células expresaning la VSG dominante. También es importante tener en cuenta que las células que han pasado por el procedimiento de aislamiento no se manchan tan intensamente con el anticuerpo anti-VSG como los que no han sido a través del procedimiento. Nuestra hipótesis es que dos cosas podrían explicar esta diferencia. La primera es que los tripanosomas hilado determina la descamación de la VSG, y hay muchos giros que intervienen en el procedimiento de aislamiento. Esto era de esperar para disminuir la intensidad de la señal para la final mancha anti-VSG. La segunda es que la primera etapa del protocolo implica la tinción con un anticuerpo anti-VSG primaria. Si los epítopos reconocidos por el anticuerpo utilizado en esta primera etapa son los mismos que o ocluyen los epítopos reconocidos por el anticuerpo en la mancha final, sería de esperar que la intensidad de la señal sea menor que si se utiliza un solo anticuerpo. Por esta razón, es importante para titular el anticuerpo que se utiliza en la etapa final, de manera que la señal de una célula positivamente manchado es aproximadamente dosórdenes de magnitud mayor que el de una célula teñida negativamente. De esta manera, incluso si la intensidad de señal de una célula con tinción positiva se reduce en las células que se han sometido al procedimiento de aislamiento, estas células positivas todavía será bien separado de las células negativas en la trama de citometría de flujo. Si se utiliza la auto-compensación, las muestras de control de manchas individuales deben estar preparados. Los anticuerpos que hemos generado están disponibles para su compra en las instalaciones de anticuerpos del Centro de Cáncer Sloan monocolonal Memorial. Hemos tenido el mejor éxito con el uso de anticuerpos IgG monoclonal no marcado. Hemos llevado a cabo el protocolo con anticuerpos policlonales VSG, pero los anticuerpos policlonales de vez en cuando podemos reconocer otros VSG se prefieren los anticuerpos monoclonales así. identidad VSG se puede determinar por secuenciación de cDNA VSG generada a partir de la amplificación de secuencias conservadas en la VSG 3&#39;UTR y el líder empalmado. Un anticuerpo particular puede hacerse la prueba de especificidad en aislados previamente conmutadalas células que la identidad VSG se ha determinado como se acaba de describir. El protocolo que se presenta aquí tiene una serie de ventajas. Se puede utilizar tanto para aislar conmutadores para su posterior análisis y para cuantificar el número de conmutadores en una población dada. También se puede utilizar para aislar una variante particular de interés, siempre que un anticuerpo está disponible para que la variante. También es posible llevar a cabo este protocolo usando tripanosomas aisladas de animales, a condición de que las células rojas de la sangre se eliminan usando perlas anti-Ter119 recubierto magnéticos de acuerdo con el protocolo del fabricante. No hemos probado el límite inferior para el número de tripanosomas necesarios, pero hemos realizado con éxito utilizando el protocolo de 2,5 - 10 millones tripanosomas de 250 l de sangre. Finalmente, el protocolo se puede utilizar en conjunción con el análisis de fluctuación para obtener la frecuencia de conmutación en una población dada. El procedimiento de aislamiento es bastante fast, teniendo 3-4 hr de principio a fin en función del número de muestras, y por lo tanto es más eficiente que los métodos anteriores que requerían la inmunización previa de ratones o cepas especializadas que contienen marcadores de resistencia a fármacos. El método está limitada por el hecho de que se requieren anticuerpos contra el VSG de partida, sin embargo. Sin tales reactivos, un método alternativo, como VSG-ss podría ser una opción más apropiada para medir los cuales VSG se expresan en una población dada 10.

El parásito protozoario Trypanosoma brucei, es un agente causal de las enfermedades que afectan a los seres humanos (a través de brucei gambiense y Trypanosoma rhodesiense Trypanosoma brucei) y animales (a través de Trypanosoma brucei brucei) en toda el África subsahariana. Se transmite al huésped de mamífero a través de la saliva de la mosca tsé-tsé vector. Tanto humanos como la tripanosomiasis africana animales causan una carga económica grave en las regiones endémicas, y pocos fármacos están disponibles o en desarrollo para tratar cualquiera de las enfermedades. La comprensión de los mecanismos de evasión inmune es crítico para el desarrollo de fármacos para la tripanosomiasis. La variación antigénica de la densa, la variante glicoproteína de superficie (VSG) la capa que cubre el parásito es uno de los principales medios por los cuales T. brucei evade la respuesta de anticuerpos de los mamíferos. Existen aproximadamente 2000 variantes del gen VSG en el genoma tripanosoma, pero sólo uno se transcribe en un momento dado de una de ~ 15 expressitios de Sión. &#39;Cambio&#39; de la VSG expresada puede ocurrir ya sea mediante la copia de un gen VSG en el sitio de expresión activa, o por la activación transcripcional de un sitio de expresión previamente silenciosa (revisado en 1). Aunque mucho trabajo se ha dedicado a la comprensión de la variación antigénica en T. brucei, los factores que influyen en la frecuencia de conmutación son aún poco conocidos. Los estudios realizados hasta la fecha se han visto obstaculizados por el hecho de que mientras que la conmutación se produce estocásticamente in vitro, frecuencias de conmutación son muy bajos, del orden de 1 a unos 10 6 células 2. Esto hace que sea difícil de medir si un determinado factor aumenta o disminuye la frecuencia de conmutación, ya que el cambio es difícil de detectar en el primer lugar. Antes de 2009, los métodos para el aislamiento de los conmutadores en una población dada eran muy largo y laborioso. Estas células pases a través de tripanosomas ratones inmunizados contra la VSG dominante y luego, la cosecha incluidosun día más tarde 3, o contar cientos de células por inmunofluorescencia 4,5. Otra estrategia se basa en la selección para la resistencia a los medicamentos para aislar conmutadores 6. Debido a que los tripanosomas africanos cultivadas in vitro se hacen típicamente de una gran población que expresa una variante importante, y una población mucho más pequeña de conmutadores que expresan variantes alternativas, nos referimos a la variante importante en todo este documento como la VSG dominante, de partida. Al hacerlo, que de ninguna manera deseamos dar a entender que esta importante variante tiene una mayor aptitud que otras variantes en la población. Aquí se describe un método que se puede medir de manera fiable el número de tripanosomas que expresa un VSG no dominante en una población dada en 3-4 horas. Este método es particularmente útil para cuando se quiere determinar si una manipulación genética dado o tratamiento con fármacos aumenta el número de células de conmutación en una población. En lugar de liberar a la población de células que expresan el dominante, a partir VSG través de las drogas o por medios inmunológicos, estas células son eliminadas por primera recubrimiento con perlas magnéticas acopladas al anticuerpo contra la VSG dominante y luego aislarlos en una columna magnética. La población de conmutación se recoge entonces en el flujo a través y se tiñó otra vez con un anticuerpo marcado anti-VSG fluoróforo para identificar contaminantes. La cuantificación se logra mediante la adición de un número definido de contar bolas absolutas para cada muestra de manera que la relación de perlas a células se puede determinar y se usa para cuantificar el número de conmutadores en la población 7.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="644">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">unlabeled anti-VSG antibody</td>
			<td style="width:143px;">n/a</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td style="width:167px;">VSG antibody is made in house</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">fluorophore labeled anti-VSG antibody</td>
			<td style="width:143px;">n/a</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td style="width:167px;">VSG antibody is made in house</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HMI-9 media</td>
			<td style="width:143px;">n/a</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td style="width:167px;">HMI-9 is made in house</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Propidium Iodide</td>
			<td style="width:143px;">BD Pharmingen</td>
			<td>556463</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">CountBright absolute counting beads</td>
			<td style="width:143px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td>C36950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">LD columns</td>
			<td style="width:143px;">Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-042-901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MACS magnet</td>
			<td style="width:143px;">Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-042-303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MACS magnetic separator</td>
			<td style="width:143px;">Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-042-302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">vortex adapter-60</td>
			<td style="width:143px;">ThermoFisher scientific</td>
			<td>AM10014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">flow cytometer</td>
			<td style="width:143px;">Coulter</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">flow cytometer analysis software</td>
			<td style="width:143px;">FloJo</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of trypanosoma brucei variant surface glycoprotein switching by magnetic activated cell sorting and flow cytometry

Trypanosoma brucei, a protozoan parasite that causes both Human and Animal African Trypanosomiasis (known as sleeping sickness and nagana, respectively) cycles between a tsetse vector and a mammalian host. It evades the mammalian host immune system by periodically switching the dense, variant surface glycoprotein (VSG) that covers its surface. The detection of antigenic variation in Trypanosoma brucei can be both cumbersome and labor intensive. Here, we present a method for quantifying the number of parasites that have 'switched' to express a new VSG in a given population. The parasites are first stained with an antibody against the starting VSG, and then stained with a secondary antibody attached to a magnetic bead. Parasites expressing the starting VSG are then separated from the rest of the population by running the parasites over a column attached to a magnet. Parasites expressing the dominant, starting VSG are retained on the column, while the flow-through contains parasites that express a new VSG as well as some contaminants expressing the starting VSG. This flow-through population is stained again with a fluorescently labeled antibody against the starting VSG to label contaminants, and propidium iodide (PI), which labels dead cells. A known number of absolute counting beads that are visible by flow cytometry are added to the flow-through population. The ratio of beads to number of cells collected can then be used to extrapolate the number of cells in the entire sample. Flow cytometry is used to quantify the population of switchers by counting the number of PI negative cells that do not stain positively for the starting, dominant VSG. The proportion of switchers in the population can then be calculated using the flow cytometry data.

El método aquí descrito se utilizó para demostrar que las roturas de doble hebra dentro del sitio de expresión VSG aumentado el número de conmutadores en una población 8. Aquí, mostramos los resultados representativos de una población de tripanosomas que han sido inducidos de manera similar para generar una rotura de doble cadena en el lugar de expresión. Comparamos estos tripanosomas a aquellos que no han sido inducidos para generar una rotura de doble cadena. La figura 1 muestra un resultado representativo citometría de parcelas a partir de células de la ONU-inducidos e inducidos recogidos en el flujo a través de la clasificación de células activadas por la columna magnética. Para este experimento particular, la VSG a partir dominante era VSG2. Los paneles a mano izquierda de la Figura 1A muestran hacia adelante y dispersión lateral, que permite que las puertas que se pueden extraer alrededor de los granos de conteo absolutos y las células que muestran una firma hacia adelante y dispersión lateral que es característica de las células vivas. Tenga en cuenta que las puertas puedenredactarse para incluir más celdas porque las células muertas se pueden eliminar con la tinción PI; sin embargo, la puerta debe mantenerse el mismo para todas las muestras. Los paneles de la derecha de la figura 1A muestran sólo aquellas células que caen dentro de la puerta &#39;en vivo&#39; en los paneles de la izquierda. Las células que se tiñen positivamente para PI (Q1 y Q2) son las células muertas. Las células que se tiñen positivamente para la VSG dominante y negativa para PI en la Q3 son contaminantes. Las células que se tiñen negativamente tanto para PI y la VSG dominante en Q4 son células vivas que han cambiado. Se puede observar que el porcentaje de contaminantes en la Q3 es menor para aquellas células en las que se ha inducido una rotura de doble cadena. Sin embargo, los porcentajes en Q3 no se pueden usar para inferir si hay más conmutadores en una población dada. Es solamente por la comparación de la relación entre el número de células en Q4 al número de granos recogidos que se puede calcular frecuencias de conmutación. La Tabla 1 muestra los números obtenidos de la floparcelas citometría w y el método para el cálculo de los conmutadores por ciento en estas poblaciones. Estos cálculos se realizaron en 3 muestras biológicas para obtener las frecuencias de conmutación observados se muestran en la Figura 1B. El nivel de conmutación estocástico in vitro es bastante baja, tal como se calcula aquí, en un promedio de 9,53 x 10 -5, mientras que la inducción de una rotura de los resultados en 1 - 6 x 10 -3 células que han cambiado a la VSG no dominante. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54715/54715fig1.jpg" /> Figura 1. Aislamiento y cuantificación de las poblaciones de tripanosoma conmutadas. (A) La citometría de flujo que muestra las fracciones de tripanosomas en la fracción de flujo continuo después de la selección de los no de conmutación en una de células activadas por la columna de clasificación magnética. Una población de células con un I-SCEI de doble filamento romper inducida se compara con una población de células sin un BRE inducidaak. (B) Calculado frecuencias de conmutación de células que tienen o no han sido inducidas con un I-SCEI rotura de cadena doble. El número que aparece en la gráfica representa los resultados de una prueba t de dos colas, no emparejado. Las barras de error representan SD. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54715/54715fig1large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> Archivo suplementario 1. Los cálculos citometría de flujo. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54715/Flow_Cytometry_Calculations.docx" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.</a> <img alt="tabla 1" src="/files/ftp_upload/54715/54715tbl1.jpg" /> Tabla 1. Cálculo de las frecuencias de conmutación. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54715/54715tbl1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta tabla.</a>

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Detection of Trypanosoma brucei Variant Surface Glycoprotein Switching by Magnetic Activated Cell Sorting and Flow Cytometry

African trypanosomes grown in vitro undergo antigenic variation at a low rate, such that populations are made up of parasites expressing a dominant variant surface glycoprotein (VSG) type and a small population of "switched" variants. This protocol describes a fast method for detecting and quantifying these populations.

Detección de<em&gt; Trypanosoma brucei</em&gt; Variant glicoproteína de superficie de conmutación por Magnetic Activated Cell Sorting y Citometría de Flujo

Trypanosoma brucei, a protozoan parasite that causes both Human and Animal African Trypanosomiasis (known as sleeping sickness and nagana, respectively) ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Detection of Trypanosoma brucei Variant Surface Glycoprotein Switching by Magnetic Activated Cell Sorting and Flow Cytometry

8.7K vistas.  Rockefeller University. African trypanosomes grown in vitro undergo antigenic variation at a low rate, such that populations are made up of parasites expressing a dominant variant surface glycoprotein (VSG) type and a small population of "switched" variants. This protocol describes a fast method for detecting and quantifying these populations.

Video: Detection of Trypanosoma brucei Variant Surface Glycoprotein Switching by Magnetic Activated Cell Sorting and Flow Cytometry

Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)

Experimental and clinical studies often require highly purified cell populations.  FACS is a technique of choice to purify cell populations of known phenotype.  Other bulk methods of purification include panning, complement depletion and magnetic bead separation.  However, FACS has several advantages over other available methods.  FACS is the preferred method when very high purity of the desired population is required, when the target cell population expresses a very low level of the identifying marker or when cell populations require separation based on differential marker density.  In addition, FACS is the only available purification technique to isolate cells based on internal staining or intracellular protein expression, such as a genetically modified fluorescent protein marker.  FACS allows the purification of individual cells based on size, granularity and fluorescence.  In order to purify cells of interest, they are first stained with fluorescently-tagged monoclonal antibodies (mAb), which recognize specific surface markers on the desired cell population (1).  Negative selection of unstained cells is also possible.  FACS purification requires a flow cytometer with sorting capacity and the appropriate software.  For FACS, cells in suspension are passed as a stream in droplets with each containing a single cell in front of a laser.  The fluorescence detection system detects cells of interest based on predetermined fluorescent parameters of the cells.  The instrument applies a charge to the droplet containing a cell of interest and an electrostatic deflection system facilitates collection of the charged droplets into appropriate collection tubes (2).  The success of staining and thereby sorting depends largely on the selection of the identifying markers and the choice of mAb.  Sorting parameters can be adjusted depending on the requirement of purity and yield.  Although FACS requires specialized equipment and personnel training, it is the method of choice for isolation of highly purified cell populations.

Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting FACS

For many scientific studies requiring a biological and chemical analysis of cell populations the cells must be in a high state of purity. Fluorescence activated cell sorting (FACS) is a superior method in which to obtain pure cell populations.

La purificación de la población de células específicas de clasificación celular activado por fluorescencia (FACS)

Experimental and clinical studies often require highly purified cell populations.  FACS is a technique of choice to purify cell populations of known ...

Investigación

Inmunología e Infección

Examination of the Telomere G-overhang Structure in Trypanosoma brucei

The telomere G-overhang structure has been identified in many eukaryotes including yeast, vertebrates, and Trypanosoma brucei. It serves as the substrate for telomerase for de novo telomere DNA synthesis and is therefore important for telomere maintenance. T. brucei is a protozoan parasite that causes sleeping sickness in humans and nagana in cattle. Once infected mammalian host, T. brucei cell regularly switches its surface antigen to evade the host's immune attack. We have recently demonstrated that the T. brucei telomere structure plays an essential role in regulation of surface antigen gene expression, which is critical for T. brucei pathogenesis. However, T. brucei telomere structure has not been extensively studied due to the limitation of methods for analysis of this specialized structure. We have now successfully adopted the native in-gel hybridization and ligation-mediated primer extension methods for examination of the telomere G-overhang structure and an adaptor ligation method for determination of the telomere terminal nucleotide in T. brucei cells. Here, we will describe the protocols in detail and compare their different advantages and limitations.

Examination of the Telomere G-overhang Structure in Trypanosoma brucei

Telomeres are essential for chromosome stability and the telomere G-overhang structure is essential for telomerase-mediated telomere maintenance. We have recently adopted two methods for detecting the telomere G-overhang structure in Trypanosoma brucei, which are native in-gel hybridization and ligation-mediated primer extension, which will be described.

El examen de los telómeros G-Estructura en voladizo Trypanosoma brucei

The telomere G-overhang structure has been identified in many eukaryotes including yeast, vertebrates, and Trypanosoma brucei. It serves as the substrate ...

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam cells, immune cells, vascular endothelial and smooth muscle cells, platelets, extracellular matrix, and a lipid-rich core with extensive necrosis and fibrosis of surrounding tissues.1 The innate and adaptive arms of the immune response are involved in the initiation, development and persistence of atherosclerosis.2, 3 There is a significant body of evidence that different subsets of the immune cells, such as macrophages, dendritic cells, T and B lymphocytes, are present within the aortas of healthy and atherosclerosis-prone mice4. Additionally, immune cells are found in the surrounding aortic adventitia which suggests an important role of this tissue in atherogenesis.2
For some time, the quantitative detection of different types of immune cells, their activation status, and the cellular composition within the aortic wall was limited by RT-PCR and immunohistochemical methods for the study of atherosclerosis. Few attempts were made to perform flow cytometry using human aortas, and a number of problems, such as a high autofluorescence, have been reported5,6. Human atherosclerotic plaques were digested with collagenase 1, and free cells were collected and stained for CD14+/CD11c+ to highlight macrophage-derived foam cells. In this study, a "mock" channel was used to avoid false-positive staining.6 Necrotic materials accumulating during the digestion process give rise in a large amount of debris that generates a high autofluorescence in aortic samples. To resolve this problem, a panel of negative and positive controls has been proposed, but only double staining could be applied in these samples. We have developed a new flow cytometry-based method7 to analyze the immune cell composition and characterize the activation, proliferation, differentiation of immune cells in healthy and atherosclerosis-prone aorta. This method allows the investigation of the immune cell composition of the aortic wall and opens possibilities to use a broad spectrum of immunological methods for investigations of immune aspects of this disease.

This paper presents a flow cytometry-based method to investigate the immune composition of aortas. The paper also illustrates an additional technique that allows examining surrounding adventitia and vessel wall separately. This method opens possibilities to perform phenotypical analyses of aortic leukocytes and apply several immunological assays for atherosclerosis studies.

Análisis por citometría de flujo de células inmunes dentro de aortas murino

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

Examination of Thymic Positive and Negative Selection by Flow Cytometry

A healthy immune system requires that T cells respond to foreign antigens while remaining tolerant to self-antigens. Random rearrangement of the T cell receptor (TCR) &alpha; and &beta; loci generates a T cell repertoire with vast diversity in antigen specificity, both to self and foreign. Selection of the repertoire during development in the thymus is critical for generating safe and useful T cells. Defects in thymic selection contribute to the development of autoimmune and immunodeficiency disorders1-4. 
T cell progenitors enter the thymus as double negative (DN) thymocytes that do not express CD4 or CD8 co-receptors. Expression of the &alpha;&beta;TCR and both co-receptors occurs at the double positive (DP) stage. Interaction of the &alpha;&beta;TCR with self-peptide-MHC (pMHC) presented by thymic cells determines the fate of the DP thymocyte. High affinity interactions lead to negative selection and elimination of self-reactive thymocytes. Low affinity interactions result in positive selection and development of CD4 or CD8 single positive (SP) T cells capable of recognizing foreign antigens presented by self-MHC5.
Positive selection can be studied in mice with a polyclonal (wildtype) TCR repertoire by observing the generation of mature T cells. However, they are not ideal for the study of negative selection, which involves deletion of small antigen-specific populations. Many model systems have been used to study negative selection but vary in their ability to recapitulate physiological events6. For example, in vitro stimulation of thymocytes lacks the thymic environment that is intimately involved in selection, while administration of exogenous antigen can lead to non-specific deletion of thymocytes7-9. Currently, the best tools for studying in vivo negative selection are mice that express a transgenic TCR specific for endogenous self-antigen. However, many classical TCR transgenic models are characterized by premature expression of the transgenic TCR&alpha; chain at the DN stage, resulting in premature negative selection. Our lab has developed the HYcd4 model, in which the transgenic HY TCR&alpha; is conditionally expressed at the DP stage, allowing negative selection to occur during the DP to SP transition as occurs in wildtype mice10.
Here, we describe a flow cytometry-based protocol to examine thymic positive and negative selection in the HYcd4 mouse model. While negative selection in HYcd4 mice is highly physiological, these methods can also be applied to other TCR transgenic models. We will also present general strategies for analyzing positive selection in a polyclonal repertoire applicable to any genetically manipulated mice.

We present a flow cytometry-based method to examine T cell development in vivo using genetically manipulated mice on a wildtype or T cell receptor transgenic background.

El examen de selección tímica positivo y negativo por citometría de flujo

A healthy immune system requires that T cells respond to foreign  antigens while remaining tolerant to self-antigens. Random rearrangement of the  T cell ...

Detection of Fluorescent Nanoparticle Interactions with Primary Immune Cell Subpopulations by Flow Cytometry

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable method of analysis by flow cytometry to study nanoparticle interaction with immune cells. Primary immune cells can be easily purified from human or mouse tissues by antibody-mediated magnetic isolation. In the first instance, the different cell populations running in a flow cytometer can be distinguished by the forward-scattered light (FSC), which is proportional to cell size, and the side-scattered light (SSC), related to cell internal complexity. Furthermore, fluorescently labeled antibodies against specific cell surface receptors permit the identification of several subpopulations within the same sample. Often, all these features vary when cells are boosted by external stimuli that change their physiological and morphological state. Here, 50 nm FITC-SiO2 nanoparticles are used as a model to identify the internalization of nanostructured materials in human blood immune cells. The cell fluorescence and side-scattered light increase after incubation with nanoparticles allowed us to define time and concentration dependence of nanoparticle-cell interaction. Moreover, such protocol can be extended to investigate Rhodamine-SiO2 nanoparticle interaction with primary microglia, the central nervous system resident immune cells, isolated from mutant mice that specifically express the Green Fluorescent Protein (GFP) in the monocyte/macrophage lineage. Finally, flow cytometry data related to nanoparticle internalization into the cells have been confirmed by confocal microscopy.

Analysis of nanoparticle interaction with defined subpopulations of immune cells by flow cytometry.

La detección de nanopartículas fluorescentes Interacciones con inmunodeficiencia primaria subpoblaciones celulares por citometría de flujo

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable ...

High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

Improvements in mass spectrometry, sequencing and bioinformatics have generated large datasets of potentially interesting genes. Tagging these proteins can give insights into their function by determining their localization within the cell and enabling interaction partner identification. We recently published a fast and scalable method to generate Trypanosoma brucei cell lines that express a tagged protein from the endogenous locus. The method was based on a plasmid we generated that, when coupled with long primer PCR, can be used to modify a gene to encode a protein tagged at either terminus. This allows the tagging of dozens of trypanosome proteins in parallel, facilitating the large-scale validation of candidate genes of interest. This system can be used to tag proteins for localization (using a fluorescent protein, epitope tag or electron microscopy tag) or biochemistry (using tags for purification, such as the TAP (tandem affinity purification) tag). Here, we describe a protocol to perform the long primer PCR and the electroporation in 96-well plates, with the recovery and selection of transgenic trypanosomes occurring in 24-well plates. With this workflow, hundreds of proteins can be tagged in parallel; this is an order of magnitude improvement to our previous protocol and genome scale tagging is now possible.

High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

Addition of a tag to a protein is a powerful way of gaining insight into its function. Here, we describe a protocol to endogenously tag hundreds of Trypanosoma brucei proteins in parallel such that genome scale tagging is achievable.

De Alto Rendimiento de genes de marcado en las<em&gt; Trypanosoma brucei</em

Improvements in mass spectrometry, sequencing and bioinformatics have generated large datasets of potentially interesting genes. Tagging these proteins ...

Fluorescence-activated Cell Sorting for Purification of Plasmacytoid Dendritic Cells from the Mouse Bone Marrow

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method enables researchers to better understand the characteristics of a single cell population without the influence of other cells. Compared to other methods of cell enrichment, such as magnetic-activated cell sorting (MCS), FACS is more flexible and accurate for cell separation due to the ability of phenotype detection by flow cytometry. In addition, FACS is usually capable of separating multiple cell populations simultaneously, which improves the efficiency and diversity of experiments. Although FACS has some limitations, it has been broadly used to purify cells for functional studies in both in vitro and in vivo settings. Here we report a protocol using fluorescence-activated cell sorting to isolate a very rare population of immune cells, plasmacytoid dendritic cells (pDC), with high purity from the bone marrow of lupus-prone mice for in vitro functional studies of pDC.

We report a protocol using fluorescence-activated cell sorting to isolate plasmacytoid dendritic cells (pDC) with high purity from the bone marrow of lupus-prone mice for functional studies of pDC.

Clasificación de células activadas por fluorescencia para la purificación de células dendríticas plasmocitoide de la médula ósea de ratones

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method ...

Measurement of T Cell Alloreactivity Using Imaging Flow Cytometry

The measurement of immunological reactivity to donor antigens in transplant recipients is likely to be crucial for the successful reduction or withdrawal of immunosuppression. The mixed leukocyte reaction (MLR), limiting dilution assays, and trans-vivo delayed-type hypersensitivity (DTH) assay have all been applied to this question, but these methods have limited predictive ability and/or significant practical limitations that reduce their usefulness. Imaging flow cytometry is a technique that combines the multiparametric quantitative powers of flow cytometry with the imaging capabilities of fluorescent microscopy. We recently made use of an imaging flow cytometry approach to define the proportion of recipient T cells capable of forming mature immune synapses with donor antigen-presenting cells (APCs). Using a well-characterized mouse heart transplant model, we have shown that the frequency of in vitro immune synapses among T-APC membrane contact events strongly predicted allograft outcome in rejection, tolerance, and a situation where transplant survival depends on induced regulatory T cells. The frequency of T-APC contacts increased with T cells from mice during acute rejection and decreased with T cells from mice rendered unresponsive to alloantigen. The addition of regulatory T cells to the in vitro system reduced prolonged T-APC contacts. Critically, this effect was also seen with human polyclonally expanded, naturally occurring regulatory T cells, which are known to control the rejection of human tissues in humanized mouse models. Further development of this approach may allow for a deeper characterization of the alloreactive T-cell compartment in transplant recipients. In the future, further development and evaluation of this method using human cells may form the basis for assays used to select patients for immunosuppression minimization, and it can be used to measure the impact of tolerogenic therapies in the clinic.

This paper describes a method for measuring alloreactivity in a mixed population of T cells using imaging flow cytometry.

La medición de células T Alorreactividad recurriendo a imágenes de Citometría de Flujo

The measurement of immunological reactivity to donor antigens in transplant recipients is likely to be crucial for the successful reduction or withdrawal ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and their important role in lung development and function, as well as their lung-localized responses to infection and inflammation. To date, no unified method for identification, isolation, and handling of alveolar macrophages from humans and mice exists. Such a method is needed for studies on these important innate immune cells in various experimental settings. The method described here, which can be easily adopted by any laboratory, is a simplified approach to harvesting alveolar macrophages from bronchoalveolar lavage fluid or from lung tissue and maintaining them in vitro. Because alveolar macrophages primarily occur as adherent cells in the alveoli, the focus of this method is on dislodging them prior to harvest and identification. The lung is a highly vascularized organ, and various cell types of myeloid and lymphoid origin inhabit, interact, and are influenced by the lung microenvironment. By using the set of surface markers described here, researchers can easily and unambiguously distinguish alveolar macrophages from other leukocytes, and purify them for downstream applications. The culture method developed herein supports both human and mouse alveolar macrophages for in vitro growth, and is compatible with cellular and molecular studies.

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

This communication describes methodologies for isolation and culture of alveolar macrophages from humans and murine models for experimental purposes.

Aislamiento y cultivo In Vitro de los macrófagos alveolares murinos y humanos

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Discrimination of Seven Immune Cell Subsets by Two-fluorochrome Flow Cytometry

Immune cell characterization heavily relies on multicolor flow cytometry to identify subpopulations based on differential expression of surface markers. Setup of a classic multicolor panel requires high-end instruments, custom labeled antibodies, and careful study design to minimize spectral overlap. We developed a multiparametric analysis to identify major human immune populations (CD4+ and CD8+ T cells, &#947;&#948; T cells, B cells, NK cells and monocytes) in peripheral blood by combining seven lineage markers using only two fluorochromes. Our strategy is based on the observation that lineage markers are constantly expressed in a unique combination by each cell population. Combining this information with a careful titration of the antibodies allows investigators to record five additional markers, expanding the optical limit of most flow cytometers. Head-to-head comparison demonstrated that the vast majority of immune cell populations in peripheral blood can be characterized with comparable accuracy between our method and the classic &#34;one fluorochrome-one marker approach&#34;, although the latter is still more precise for identifying populations such as NKT cells and &#947;&#948; T cells. Combining seven markers using two fluorochromes allows for the analysis of complex immune cell populations and clinical samples on affordable 6-10 fluorochrome flow cytometers, and even on 2-3 fluorochrome field instruments in areas with limited resources. High-end instruments can also benefit from this approach by using extra fluorochromes to accomplish deeper flow cytometry analysis. This approach is also very well suited for screening several cell populations in the case of clinical samples with limited number of cells.

Here, we present a flow cytometric protocol to identify CD4+ and CD8+ T cells, &#947;&#948; T cells, B cells, NK cells and monocytes in human peripheral blood by using only two fluorochromes instead of seven. With this approach, five additional markers can be recorded on most flow cytometers.

Discriminación de siete subconjuntos de células inmunes por dos fluorocromo citometría de flujo

Immune cell characterization heavily relies on multicolor flow cytometry to identify subpopulations based on differential expression of surface markers. ...