We thank Sidney Walker for providing technical help. This work was supported in part by a grant from the National Institute of Health (1R01EY024712-01A1).

Declaración de Ética: Los procedimientos que implican sujetos animales han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado de Animales y el empleo (IACUC) en Virginia Tech. Precaución: las precauciones extremas deben ser tomadas al manipular y desechar varios componentes utilizados en este protocolo. Antes de su uso, la directrices institucionales y las prácticas de salud y seguridad local debe establecer y seguir, en particular para el tetróxido de osmio, que es volátil y extremadamente venenosa, acetato de uranilo, que es a la vez un metal pesado y la fuente de radiactividad, y nitrato de plomo, que es un veneno de metales pesados. Tiocarbohidrazida (TCH) puede descomponerse para producir gases explosivos y tóxicos, por un manejo inadecuado. Muchas instituciones tendrán la facilidad de la base de EM en los que estos reactivos se utilizan de forma rutinaria y pueden proporcionar asistencia. 1. Preparación del tejido cerebral y SBFSEM Imaging <ol><li> Anestesiar a un joven (~ 2 - 4 meses de edad) C57 de ratón negro (C57BL / 6J) usando 4 - 5% isoflurane siguiendo las directrices institucionales. Confirmar la anestesia mediante el control de la pérdida de tono muscular, falta de movimientos voluntarios y las respuestas a los estímulos aversivos como un pellizco de la cola. </li><li> Pin el ratón sobre una bandeja de disección y hacer una incisión en la piel a lo largo de la línea media ventral. Hacer más incisiones en la piel para exponer la caja torácica del ratón. Incisión en el diafragma, y ​​cuidadosamente diseccionar la cavidad torácica a lo largo de la periferia para exponer el corazón latiendo, y luego hacer una incisión en la aurícula derecha. </li><li> El uso de una cánula de mariposa, canular el ventrículo izquierdo. Perfundir el ratón transcardially usando 10 - 20 ml de solución salina tampón fosfato (PBS) pH 7,2, hasta que la hemorragia es confirmado por un cambio en el color del hígado. Nota: Un cambio en el color de hígado se utiliza como una guía para determinar el grado de desangrado. Confirman que los cambios de color de hígado de color marrón rojizo a rosa pálido. </li><li> Perfundir el ratón transcardially usando 10 - 20 ml de 2% glutaraldehído y 4% de paraformaldehído hizo en tampón 0,10 M de cacodilato (pH 7,2), para fijar el tejido cerebral rápidamente desde dentro. La fijación se controla mediante la observación de la rigidez de la cola. Nota: Preparar 0,10 M tampón de cacodilato (pH 7,2) disolviendo 2,14 g de cacodilato de sodio en 80 ml de agua, añadir ácido clorhídrico para ajustar el pH, y completar el volumen a 100 ml con agua. </li><li> Tras la perfusión, decapitar el ratón, diseccionar el cerebro, seguido por fijación en tampón 0,10 M de cacodilato de sodio (pH 7,2) que contiene 2% de glutaraldehído y paraformaldehído al 4% durante 48 horas a 4 ° C </li><li> Después de 48 hr hacer 400 micras secciones coronales utilizando un vibratome y luego diseccionar cuidadosamente la región de interés en el cerebro (por ejemplo, el hipocampo) bajo el microscopio de disección 42. Recortar con precisión el tejido y tomar una foto para la conservación de la orientación. Nota: Enviar métodos de procesamiento de tinción de tejidos en SBFSEM combina una variedad de métodos de tinción de metales pesados ​​encon el fin de mejorar la resolución y se basan en el método desarrollado previamente por Deerinck et al 40. </li><li> Lavar los tejidos fijados con glutaraldehído 3 veces, 5 minutos cada uno en tampón cacodilato 0,1 M (pH 7,2). </li><li> Preparar la solución de ácido tánico 0,1% por disolución de ácido tánico en tampón de cacodilato de sodio 0,1 M (pH 7,2). Agitar hasta que se disuelva y filtrar a través de 0,45 micras filtro, si es necesario. </li><li> Postfix los tejidos con cacodilato tamponada 0,1% de ácido tánico por incubación en 1 ml de reactivo durante 30 - 60 min a TA. Nota: El tiempo de incubación depende del tamaño del tejido, pero 30 min funciona mejor para la mayoría de los tejidos. </li><li> Lavar tejidos 3 veces, 5 min cada uno en tampón de cacodilato (pH 7,2). </li><li> Disolver 0,3 g de ferrocianuro de potasio y 0,86 g cacodilato de sodio en 10 ml de H2O destilada (dH2O). Mantener la solución de ferrocianuro de potasio en hielo. Justo antes de su uso, añadir 10 ml de 4% tetróxido de osmio (OsO4). </li><li> Teñir los tejidos con 2% de SGsolución de ferrocianuro-prima durante 90 minutos, en hielo. Lavar 3 veces, 5 minutos cada uno en dH2O </li><li> Preparar 1% tiocarbohidrazida solución (TCH) disolviendo 0,1 g de TCH en 10 ml de dH2O Disolver en 60 ° C por agitación cada 10 min hasta que esté completamente disuelto. Observar las precauciones de seguridad durante la manipulación de TCH, sobre todo tener cuidado de evitar el uso de los metales, el calentamiento a alta temperatura, o permitiendo que la solución se seque. </li><li> Se tratan las muestras con 1% recién preparada TCH durante 20 min a RT. Lavar 3 veces, 5 minutos cada uno en dH2O </li><li> Diluir 4% OsO4 al 2% con dH 2 O, tejidos de manchas con 2% de tetróxido de osmio acuoso por incubación durante 1 hr. Lavar tejidos 3 veces, 5 minutos cada uno con dH2O </li><li> Se incuban las muestras S / N en acetato de uranilo al 1% en H2O destilada a 4 ° C. </li><li> Preparar la solución de aspartato ventaja de Walton (como se describe por Deerinck et al 40). <ol><li> Disolver 0,998 g L-aspartato en 250 ml de H2O destiladay luego añadir 10 N de hidróxido de potasio (KOH) de una manera gota a gota hasta que el pH alcanza 5,5. Después de ajuste del pH, añadir 0,066 g de nitrato de plomo en 10 ml aspártico Stock ácido y calor a 60 ° C durante 30 min. </li></ol></li><li> Enjuague tejidos en dH2O y se incuba con tinción aspartato ventaja de Walton durante 30 minutos en un horno a 60 ° C. Lavar 3 veces, 5 minutos cada uno en dH2O </li><li> Deshidratar muestras a través de una serie graduada de alcohol utilizando soluciones refrigerados de 20%, 50%, 75%, 85% y 95% de etanol durante 5 min cada uno, seguido de 100% de etanol 3 veces, 10 min cada uno. Nota: Utilizar el 100% de etanol de la botella recién abierta, como el etanol abierto absorbe el agua del aire y causar la incrustación a fallar. incubaciones más largas serán necesarias con muestras de tejido más grandes. </li><li> muestras de lavado 2 veces, 15 minutos cada uno en óxido de propileno. </li><li> Hacer resina plástica incrustación utilizando 25 ml de resina, 10,5 ml DDSA (dodecenilo anhídrido succínico), 15,5 ml NMA (anhídrido metil nádico) y 1 mlDMP-30 (2,4,6-Tris dimetilaminometil fenol). Mezclar la resina por agitación. Giro y permitir que la resina reposar hasta que las burbujas de determinación. Nota: Esta es la receta estándar de dureza media. Otros tipos de microscopía de resina plástica electrónica (EM) se pueden utilizar, pero deben ser probados con una muestra de control no esenciales de antemano ya que no todas las resinas trabajan para SBFSEM. </li><li> Incubar los tejidos O / N en un 50: Mezcla de 50 de óxido de propileno resina y la incorporación, en un vial que tiene un tope inicialmente, a continuación, sin tapar después de 2 hr de modo que el óxido de propileno se evapora durante el período de aproximadamente 8-10 horas. </li><li> La transferencia de los tejidos a la resina de incrustación fresco 100% en viales limpios para 2 hr. </li><li> Insertar en muestras de resina fresca, incrustación en moldes planos que contienen las etiquetas de papel impresos, y los cura en un horno a 60 ° C durante 48 horas. Después de aproximadamente 1 hora, revisar la colocación del tejido y la alineación de nuevo, y ajustar si es necesario. </li><li> Recorte muestras para el área de interés y montar en un pin de aluminio utilizando Gelling pegamento de cianoacrilato o una resina epoxi conductora, a continuación, la capa con plata coloidal pasta alrededor de los lados del bloque para proporcionar un camino conductor a la clavija de aluminio. </li><li> Examinar muestras de tejido utilizando un sistema de microscopio electrónico de barrido equipado con una etapa ultramicrotomo en la cámara y un detector de electrones retrodispersados ​​baja kV 32. Nota: Obtener la formación in situ instrumento- y en la microscopía electrónica de barrido (SEM) utilizar y convertirse en un usuario autorizado. Como alternativa, la colaboración con un centro investigador o núcleo de pequeños proyectos puede ser posible. la formación de radiación también puede ser necesaria como SEM generan rayos x. </li><li> A la imagen de las muestras, utilice los siguientes valores: 2,25 kV, en el de 5 - 10 nm / píxeles de resolución, con tamaños de campo entre 80 - 250 micras en x, y (los tamaños posibles de otro campo), y un grosor de corte de 50 - 100 nm, con un total de 250 - 600 rebanadas en un 16 - período de tiempo de 20 horas. Nota: Los ajustes varían sustancialmente entre los diferentes microscopios, indimuestras indivi- y resolución deseada. Estos ajustes deben producir imágenes que son fácilmente interpretables para muchas muestras. </li></ol> 2. Analizar el conjunto de datos de imágenes Nota: El software Image J / Fiji se utiliza para analizar el conjunto de datos y se basa en el plugin TrakEM2. pasos de preprocesamiento se pueden realizar usando una variedad de software, y pueden estar amplia o menor dependiendo del nivel de experiencia y las pilas obtenidas. Las principales transformaciones usando el software de código abierto (ver ImageJ 1.50b, FIJI Descargar 1 Oct, 2015) se describen aquí. <ol><li> Convertir imágenes en formato TIFF de 8 bits de las imágenes de 16 bits de propiedad originales mediante la apertura en el software y seleccionar elementos del menú Imagen → Tipo → 8 bits. <ol><li> Si la conversión automática de contraste / brillo durante este paso no es ideal para las imágenes, vuelva a abrir las imágenes de 16 bits, y la prensa de imagen → → Ajuste de brillo / contraste. Seleccionar un rango que funciona para todas las imágenes y pulse Aplicar. A continuación, realice cCONVERSIÓN. Nota: En algunos SEM, este paso puede requerir software del fabricante del microscopio. </li><li> Si es necesario, debido al movimiento de la imagen inaceptable entre rebanadas (por ejemplo. La deriva debido a la carga), regístrese / alinear las pilas de imágenes (elementos de menú Plugins → → El registro lineal StackAlignmentWithSIFT). En la mayoría de software de registro, creado para el modo de &quot;sólo la traducción&quot; en lugar de &quot;cuerpo rígido&quot;. Nota: Muchos enfoques y software pueden trabajar: el plug-in de registro de obras SIFT para muchas aplicaciones y existe una versión de pila virtual. <ol><li> Si es necesario, ampliar el tamaño del lienzo antes de la inscripción (Imagen → Ajustar → tamañolienzo) o reducirla a un área de interés (Imagen → Recortar). Nota: Puede producirse cierta deriva o ensanchamiento, y tratando otros plugins o software puede producir mejores resultados. Opciones manuales también están disponibles (por ejemplo. ImageJ / FIJI, Plugins → Registro → ManualLandmarkSelection). </li></ol></li><li> Si desired, imágenes en escala a un tamaño más pequeño, más manejable (por ejemplo. el 25%) utilizando ImageJ (Imagen → Escala). </li></ol></li><li> Iniciar el software, seleccione Archivo → Importar → secuencia de imágenes y luego seleccionar los archivos TIFF. </li><li> Poner en marcha el plugin seleccionando Archivo → Nuevo → TrakEM2 (espacio en blanco). Dos ventanas se abrirán; uno maneja el proyecto y area_lists y el otro maneja el rastreo, y se conoce como el &#39;lienzo&#39;. </li><li> Cargar la pila de imagen en el plugin haciendo un clic derecho sobre la importación de lona. Seleccione importación y haga clic en la pila de importación. En las opciones de pop-up, marca la casilla de pilas virtuales. Nota: Aunque las pilas de imágenes ya están abiertas en el software, sino que también se deben abrir en el complemento. El equipo puede funcionar sin problemas si la caja de pilas virtuales está marcada. </li><li> Después de los mipmaps se crean y se carga la pila, haga clic derecho de nombrar el proyecto bajo la ventana del plugin. Haga clic derecho sobre &quot;nuevo proyecto» en la col plantillaUMN, y seleccione &quot;añadir nuevo niño &#39;para ese proyecto. Haga clic derecho de nuevo para seleccionar &#39;area_list&#39;. </li><li> Establecer la escala del eje Z del proyecto de acuerdo con la configuración original micrografía electrónica haciendo clic derecho sobre el lienzo, a continuación, haga clic en la pantalla y seleccione la calibración. Además, ponga la Z escala mediante la selección de todas las capas en la ventana de plug-in, haga clic derecho para seleccionar la escala Z y grosor. </li><li> Haga clic y arrastre el &quot;proyecto&quot; y los &quot;niños&quot; en el proyecto de sección para crear las «listas de la zona &#39;en la pestaña&#39; espacio Z &#39;en la ventana de tela Objetos. </li><li> Seleccione la &#39;lista de áreas&#39; y haga clic derecho de seleccionar y establecer un color. Ahora, utilice la herramienta de pincel para trazar objetos tales como las mitocondrias, en las imágenes de micrografía electrónica. Uso &#39;Shift + clic&#39; que rellenar un círculo cerrado, &#39;Ctrl + scroll&#39; para acercar y alejar y, &#39;Alt + clic para hacer volver la pintura cursor del pincel en una goma de borrar. </li><li> Seleccionar dos áreas de ~ 10 - 15 micrasUnos 10 - 15 micras en la esquina superior izquierda y la esquina inferior derecha de la imagen e identificar todas las mitocondrias dentro de estas áreas para permitir el muestreo no sesgado de las mitocondrias en cada conjunto de datos. </li><li> En el &#39;lienzo&#39;, observar y rastrear las mitocondrias a través de las secciones. Nota: Las mitocondrias son orgánulos muy oscuros / densos que aparecen, de tamaño similar de diámetro y sin apretar cilíndricos. El crestas único formado por la membrana interna se distinguen fácilmente dentro de este orgánulo. </li><li> Cuando haya terminado con el rastreo, haga clic derecho en el area_list bajo la etiqueta de espacio Z, seleccione &#39;Show en 3D&#39;. Esto abrirá el plug-in visor 3D para ver una reconstrucción en 3D de la imagen trazada. <ol><li> Para realizar las mediciones de volumen mitocondrial, elija objeto en el visor 3D, haga clic en la pestaña &#39;Editar&#39; y seleccione &#39;Propiedades de objeto&#39;. La estimación del volumen mitocondrial aparece junto con varias otras mediciones. </li></ol></li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests. Emily K Benson is a paid employee of Renovo Neural Inc., and Grahame J Kidd serves as Scientific Director for 3DEM at Renovo Neural Inc., which is a commercial provider of serial block-face SEM services and analysis.

La complejidad del sistema nervioso plantea un reto importante en la reconstrucción de volúmenes de tejido grandes y el análisis de la morfología y distribución de los orgánulos tales como mitocondrias con una resolución adecuada. Varias células, incluyendo neuronas, oligodendrocitos y astrocitos con numerosos procesos extendidos en tres dimensiones interactúan dentro del tejido cerebral 43. Dado que las mitocondrias reside tanto en el soma de las células y los procesos distantes, la morfología mitocondrial es extremadamente pleomórfico en el sistema nervioso (Figura 1). Información estructural 3D adecuado, con suficiente resolución, por tanto, no puede ser adquirido mediante técnicas de microscopía de luz convencionales, tales como confocal o microscopía de dos fotones 44,45. La microscopía electrónica es la técnica sólo actualmente disponible que permite la reconstrucción de grandes volúmenes de tejido neural con una resolución suficientemente alta. Tradicionalmente, la reconstrucción 3D de tejido neural que se haya logradod por microscopía de transmisión serie de la sección de electrones (sstem) de 29 cortes ultrafinos. Sin embargo, los recientes avances tecnológicos han mejorado la calidad de adquisición de datos de microscopía electrónica de volumen y la automatización. SBFSEM es una técnica de imagen de bloque cara automatizado que combina seccionamiento en serie dentro de la cámara de un microscopio electrónico de barrido, con el fin de reconstruir la estructura del tejido 3D a través de cientos de micrómetros, con una resolución que es suficiente para seguir los procesos celulares más delgados e identificar pequeños orgánulos . Esta técnica se ha abierto la posibilidad de reconstruir los sistemas de forma rutinaria tanto nervioso de vertebrados e invertebrados. Se trata de múltiples etapas que incluyen la preparación de muestras, la operación microscopio electrónico de barrido, la adquisición de datos, la imagen post-procesamiento y análisis de imágenes. Estos procedimientos requieren una formación práctica y certificación para la operación microscopio electrónico de barrido especializados. Hay tres factores que son críticoAl decir. disección de la región anatómica correcta del cerebro, la obtención de imágenes de alta resolución, y la realización de análisis de imagen adecuada. Después de la disección de la región anatómica de interés de la rebanada vibratome del tejido cerebral fijo, es crucial para tomar la fotografía para preservar la orientación adecuada. De otro modo, puede ser difícil determinar el sitio correcto para la imagen. La obtención de imágenes de alta resolución depende de una adecuada fijación y los procedimientos adecuados de tinción posterior a la fijación. El cerebro tiende a sufrir un rápido deterioro en su ultraestructura después de la muerte. Por lo tanto, es crítico para fijar el cerebro en una solución de glutaraldehído utilizando el método de perfusión transcardial adecuada. Esto debe ser seguido por más de fijación del cerebro en solución de glutaraldehído durante al menos 24 h. Dado que la resolución de la imagen es completamente dependiente de la combinación de una variedad de métodos de tinción de metales pesados, es fundamental para seguir el método de post-fijación como se detalla en el protocolo para adquirir quantifiable imágenes. Las soluciones deben ser hechas como se describe en los métodos. Por último, para el análisis de la imagen exacta del orgánulo / s para ser analizados se debe identificar de forma inequívoca (por ejemplo. Mediante la visualización de las características ultraestructurales) antes de la localización, y las directrices de software debe respetarse escrupulosamente. La resolución de las imágenes adquiridas debe ser conocido para la conversión de píxeles de nanómetros para mediciones volumétricas. Además del software que se describe en el protocolo para la realización de análisis de imágenes, también se puede utilizar de otro software disponible como Reconstruir y Cnosos. Aunque el énfasis del protocolo descrito es sobre la visualización de las mitocondrias en el sistema nervioso, puede ser modificado para generar información de alta resolución 3D en varias otras estructuras subcelulares (retículo endoplásmico por ejemplo., Lisosomas etc.) En una variedad de tejidos. Mientras que una guía de solución de problemas detallada de microscopio electrónico de barrido operación está más allá del alcance de este artículo (véase el manual de usuario del instrumento de formación e información), algunos problemas habitualmente se producen durante los experimentos de imagen y la comprensión de cómo solucionar ellos pueden ayudar a los nuevos usuarios o los que la obtención de imágenes a través de fuentes comerciales de colaboración /. Un problema común está cargando de la muestra que se encuentra principalmente en las regiones de resinas que contienen poco o ningún material teñido. En una &quot;positiva&quot; de la imagen (es decir. Citosol muestra en blanco), los núcleos, los vasos sanguíneos y las extensiones de resina vacías pueden aparecer &quot;ennegrecido&quot;. Además, la carga también promueve la deriva haz locales que resulta en la deformación aparente imagen. Las posibles soluciones varían entre los instrumentos y muestras. La reducción de la configuración kV reduce el artefacto &quot;ennegrecimiento&quot;, pero puede promover más la deriva del haz. Utilizando un modo de vacío inferior, e incluyendo nitrógeno (N 2) de gas, vapor de agua, etc. en la cámara que también reduce la carga, pero a un costo sustancial de la resolución y signarelación de l-ruido. Un segundo problema común es la omisión de cuchillo. De exploración más lenta puede causar daño inducido haz a la superficie del bloque, que corta de manera desigual o no en absoluto por alguna de formación de imágenes / ciclos de corte (es decir. Imágenes sucesivas aparece el mismo). Varias soluciones existir incluyendo el aumento del grosor de la profundidad de corte / rebanada con una menor resolución Z, aumentando la velocidad de exploración y aceptar consecuentemente imágenes ruidosas, la reducción de tamaño de píxel y la aceptación más baja x / y resolución, y la elección de las muestras o áreas con tinción más intensa (como mal áreas teñidas cobran más, el daño más fácilmente, y requieren la exposición de haz más tiempo para obtener imágenes con aceptable señal -ruido proporciones). redeposición escombros en el bloque de cara es una fuente ocasional de artefacto en las imágenes, y si esto ocurre con frecuencia que puede requerir una pausa de la adquisición, y limpiando cuidadosamente el (aire soplado) cuchillo, o retrimming la muestra a un tamaño más pequeño. Bloque cara de carga también promueve la re-deposición, y los pasos anteriores puedeayuda. La corrección de enfoque y stigmation también puede ser necesaria ya que las muestras imágenes de microscopio de forma continua durante muchas horas a la semana, tiempo durante el cual la profundidad de vacío se incrementa en la cámara, que requieren stigmation correcciones. Cada microscopio electrónico de barrido difiere según la edad y características, y la experiencia es la mejor guía. dramáticos cambios repentinos en stigmation o el enfoque pueden ocurrir cuando el material seccionado se adhiere a los componentes de imagen de microscopio. La cámara debe ser abierta y material cuidadosamente desalojado a través del vacío o nitrógeno comprimido. Esto requiere absolutamente la formación especializada. Hay algunas desventajas de la tecnología SBFSEM con respecto a su utilidad en el análisis de las mitocondrias cerebrales. Una desventaja importante, común a todos microscopía de tejidos fijados, es que proporciona imágenes estáticas de un orgánulo extremadamente dinámico. Las mitocondrias se someten a ciclos de fisión y fusión continuas 26, son móviles y tráfico a lo largo de la neurite procesos 21. Los defectos en el tráfico mitocondrial y dinámicas que no son puramente numérica o estructural puede ser fácilmente perdido por este enfoque, aunque, mirando el número de mitocondrias en un espacio anatómico definido como presinapsis se puede interpretar si el transporte de las mitocondrias puede ser modificada 39 . Una segunda desventaja es que se lleva a cabo sólo en una pequeña parte del cerebro, por lo tanto, la circuitería defectos específicos en la distribución mitocondrial puede perder. Correlativa aproxima 28,46 permitirse la oportunidad de combinar la imagen confocal multifotónica y con la tecnología SBFSEM para generar tanto los datos moleculares y ultraestructurales. Para el análisis mitocondrial, por lo tanto, puede ser útil para realizar la SBFSEM después de un examen microscópico de luz de las secciones del cerebro ya sea usando el anticuerpo específico de antígeno mitocondrial o mediante el uso de un transgén que expresa orientado mitocondrialmente-proteína fluorescente. este combinatioestrategia final puede proporcionar una metodología sólida para identificar defectos mitocondriales en modelos de ratón de trastornos neurológicos y mitocondrial. También hay limitaciones técnicas comunes a muchas formas de microscopía electrónica debido al uso de fijadores duras, tinción de metales pesados ​​y la penetración desigual de los productos químicos. Otras limitaciones pueden provenir de la incrustación de plástico de muestras de tejido. Regiones vacías de resina y estructuras escasamente teñidas retienen los electrones durante la formación de imágenes, haciendo que de deflexión de haz y la deriva (warping imagen) así como las señales de carga de artefactos (por ejemplo. Los núcleos oscuros y los vasos sanguíneos de lumen), que tanto inciden en resolución. Beam daños a la resina también promueve corte desigual, y por esta razón, las imágenes requiere típicamente rebanadas de 50 - 100 nm a cortar desde el bloque de cara, produciendo voxels no isotrophic en los conjuntos de datos. Otras limitaciones para algunas aplicaciones incluyen que las secciones son destruidos y no pueden ser reexaminadas posteriormente,que pueden obligar a los usuarios para recoger imágenes de alta resolución de zonas que podrían no contener datos útiles. Una ventaja importante de SBFSEM es que automatiza el proceso de seccionamiento y la formación de imágenes bloques de tejido mediante la incorporación de un microtomo personalizado en un vacío bajo cámara de SEM 32,33. Dado que las imágenes se obtienen directamente desde el bloque de cara antes de cada corte, se evitan sustancialmente los problemas de la sección de formación de arrugas, la compresión y la pérdida durante el manejo, aunque la deposición de los residuos y la deformación de carga debido a bloquear cara no contribuir a una cierta pérdida de imagen y la distorsión . Además, las imágenes obtenidas en los conjuntos de datos primas ya están alineados y sólo requieren registro micrómetro escala para acomodar la deriva de haz con el fin de ser susceptibles de más análisis. Debido al proceso de corte automatizado, una vez que el vacío del sistema se ha estabilizado, grandes volúmenes de tejido se pueden obtener imágenes sin la participación por parte del operador. Existen múltiples ventajas de utilizar estela tecnología en la realización de estudios morfológicos y cuantitativos sobre los orgánulos y las estructuras intracelulares. Una de las ventajas es conseguir la información sobre la estructura 3D de las mitocondrias dentro de un período razonable de tiempo. La disponibilidad de paquetes de software de reconstrucción de código abierto como Reconstruir 47, 48 y TrakEM Knossos 49-51 han hecho que esta tecnología una poderosa herramienta analítica donde ultraestructura detallada 3D de la red neuronal en modelos animales experimentales se pueden comparar directamente. El análisis de imágenes semiautomático y completamente automatizado se acerca 52 son susceptibles de producir datos altamente mecanicistas en animales donde se espera que la morfología mitocondrial, la función y / o la biogénesis de ser afectados. SBFSEM análisis anterior se vio obstaculizado en gran medida debido a una resolución más baja, sin embargo las técnicas de preparación de muestras más recientes que implican métodos de tinción mejoradas 40 han mejorado considerablemente la resolución hasta el punto de que incluso una sola v sinápticaesicle se puede resolver fácilmente. En este resolución defectos ultraestructurales en las mitocondrias tales como vacuolización, disrupción de la membrana, y la pérdida de crestas se pueden observar fácilmente, y la distribución de las mitocondrias defectuosas dentro de las células se pueden determinar 38,39. La alta resolución de esta técnica proporciona una gran ventaja sobre la microscopía de luz donde la resolución se limita a ~ 200 nm en el eje XY y ~ 500 nm en el eje Z. Las mitocondrias son, por tanto, justo en el límite de resolución de la microscopía de luz 53. Aunque las mitocondrias tienen dimensiones por debajo del límite de resolución todavía pueden ser visualizadas por microscopía de luz, sus dimensiones no pueden ser medidos de forma fiable. Es importante destacar que las mitocondrias que están separados por una distancia menor que el límite de resolución de un microscopio de luz no pueden ser resueltos por microscopía de luz. Otra ventaja es que el análisis estructural mitocondrial puede realizarse en el contexto de los tejidos, sin aislamiento del orgánulo. Esta lata albaja para las comparaciones apropiadas dentro del tejido en base a la localización mitocondrial, por ejemplo axonal vs. somática y / o mitocondrias dendríticas. Una ventaja adicional es que por lo general es posible determinar si las mitocondrias son neuronal o neuroglial en la localización siguiendo los procesos a un orgánulo definir, tales como filamentos gliales y glucógeno para astrocitos o mielina de oligodendrocitos. Los procesos de las neuronas y las células neurogliales son a menudo en estrecha proximidad, y con 2D se acerca como TEM puede ser difícil asignar con confianza el que los procesos son neuronal y que son neuroglial. En conclusión, la tecnología SBFSEM ofrece pilas de imágenes en serie que cubren zonas de tejido 20 - 1000 micras de tamaño con la resolución ultraestructural de 5 a 10 nm o superior, lo que permite que las células enteras del sistema nervioso central y orgánulos tales como mitocondrias en ser fotografiado, medido y reconstruido . En el presente trabajo, hemos proprovisto algunos enfoques prácticos para hacer uso de esta tecnología. Las futuras aplicaciones incluyen el análisis de la estructura mitocondrial y distribución en una variedad de modelos animales de enfermedades neurológicas tales como modelos de la enfermedad del desarrollo neurológico y neurodegenerativas, así como el análisis de los diversos ultraestructuras subcelulares tales como retículo endoplasmático, el núcleo y / o los lisosomas en las células enteras o tejidos bajo sano y estados de enfermedad.

Las mitocondrias son orgánulos dinámicos que cambian su forma y ubicación en función de las señales y las necesidades celulares, en la interacción estrecha con el citoesqueleto celular, y en respuesta a eventos celulares tales como las corrientes de calcio en las neuronas 1. Las mitocondrias también interactúan con otros orgánulos celulares, por ejemplo, retículo endoplásmico, que a su vez regula el metabolismo de su dinámica y 2. Morfología mitocondrial muestra heterogeneidad en diferentes tipos de células, es decir. la forma de la orgánulo varía de tubular a la que consiste en hojas, sacos y óvalos 3. Se ha demostrado que la fusión y de fisión proteínas del ciclo mitocondriales pueden regular la ubicación, tamaño, forma y distribución de las mitocondrias 4. Además, cambios en la forma mitocondrial se asocian con la neurodegeneración, la plasticidad neuronal, la atrofia muscular, la señalización de calcio, la generación de especies reactivas del oxígeno, así como la vida útil y la muerte celular que implican a thala morfología mitocondrial de células T específica es crítico para el mantenimiento de la función celular normal 5-11. Una importante función bioenergética de la mitocondria es la generación de trifosfato de adenosina (ATP) mediante la ejecución de una serie de reacciones metabólicas que implican ruptura completa de nutrientes (es decir, glucosa, grasos de ácidos o aminoácidos) a través del ciclo de Krebs y la fosforilación oxidativa vías 12. El cerebro humano constituye sólo el 2% del peso corporal sin embargo, consume ~ 20% de la energía total producida por lo que es extremadamente demandante de energía de órganos 13. Por lo tanto, no es sorprendente que la disfunción mitocondrial en los seres humanos conduce a un gran número de manifestaciones neurológicas 14-17. Las mutaciones genéticas en los componentes de la fosforilación oxidativa que impiden la generación de ATP conduce a trastornos mitocondriales 17,18, que son clínicamente grupo heterogéneo de enfermedades con una prevalencia de 1: ~ 5.000 personas, y una de las causas más comunes de mtrastornos etabolic en niños y adultos. Déficit de ATP mitocondrias derivadas afecta a múltiples sistemas de órganos con órganos que demandan alta energía, como el cerebro, el corazón y los músculos esqueléticos están predominantemente afectados en estos pacientes 14,17,18. En los últimos años, varios estudios han proporcionado evidencia de disfunción mitocondrial en ambos trastornos del neurodesarrollo y neurodegenerativos 15-17,19,20. Dado que las mitocondrias son esenciales y fundamentales para el desarrollo y función del cerebro, es imperativo desarrollar protocolos que pueden analizar los cambios en el cerebro mitocondrial morfología, estructura, tamaño, número y distribución previstos en ambos estados sanos y enfermos. Los modelos de ratones con la proteína verde fluorescente dirigido mitocondrialmente (GFP) se han producido para visualizar los movimientos mitocondriales y localización en el cerebro 21,22. Si bien esta es una herramienta extremadamente útil para examinar la motilidad mitocondrial y la distribución general, hay algunos inconvenientes que Includresolución limitada e y la sensibilidad de la microscopía de fluorescencia. Estos atributos hacen que sea difícil realizar un seguimiento de las mitocondrias relativamente pequeñas de tamaño. Del mismo modo, la microscopía electrónica de transmisión de serie ha sido utilizado con éxito para ver mitocondrias sináptica 23, pero este método es mucho tiempo. Morfología mitocondrial es conocido por ser altamente dinámico ya que se someten a ciclos continuos de fusión y de fisión, y en la mayoría de las células de la mitocondria mantener una red altamente conectado 24-26. Las neuronas son células con múltiples dendritas y axones extendidas, y las mitocondrias que forman una red reticular conectado en el cuerpo de la célula altamente polarizada puede tener que separar ya que hacen su camino a través de estos axones (Figura 1). Esto hace que las mitocondrias cerebrales extremadamente variadas en tamaño y forma. Por ejemplo, utilizando el bloque cara microscopía electrónica de barrido de serie técnica (SBFSEM), se observó previamente que la diferencia en el volumen o tamaño de mitochondr extrasynapticia a las mitocondrias presentes en los terminales de los nervios puede ser tanto como dieciséis pliegan 27. Existen varios enfoques para la realización de los análisis del volumen 28, que incluye la sección de serie TEM 29, la cinta automatizadas para la recolección ultramicrotomo SEM 30, se centró haz de iones SEM 31 y 32 SBFSEM. El análisis SBFSEM tiene ventajas en que tiene la resolución para proporcionar datos cuantitativos sobre la forma morfológica, el tamaño, la distribución y el número de orgánulos tales como mitocondrias en áreas de hasta 1 mm del cerebro. La operación técnica es también la menos exigente, con la adquisición de datos y análisis dentro de las capacidades de muchos laboratorios biológicos que carecen de experiencia previa EM. El advenimiento de los instrumentos comerciales para la generación de la sección similar a imágenes en serie ha hecho 3D análisis ultraestructural de los tejidos de una técnica de rutina, que permite, además, un análisis volumétrico imparcial de una manera rápida y repetible 28 </sup&gt;. El SBFSEM fue descrita por primera vez y se utiliza en el campo de la neurobiología en 2004 32, basado en una idea introducida por Leighton en 1981 33. Múltiples estudios han establecido desde entonces esta técnica como una herramienta importante en el análisis de la reconstrucción de los circuitos neuronales 34. Además, para muchos proyectos de menor escala, se proporciona un análisis para identificar la reconstrucción orgánulos celulares 27,35-39. Puesto que, las imágenes adquiridas se derivan de baja tensión electrones retrodispersión, nuevos protocolos de tinción que se combinan diferentes técnicas conocidas de tinción de metales pesados ​​fueron desarrollados para aumentar la resolución 40. En este trabajo, ofrecemos un protocolo para la utilización de imágenes de microscopía electrónica 3D y el análisis volumétrico de las mitocondrias del cerebro sobre la base de métodos que han sido previamente utilizados por nosotros y otros 38,39,41. Los métodos de post-procesamiento de los tejidos utilizados fueron como se ha descrito anteriormente por Deerinck y col40.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>C57BL/6J mice</td>
			<td>Jackson laboratory&#160;</td>
			<td>664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>VETone, tradename Fluriso</td>
			<td>501017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection tray</td>
			<td>Fisher scientific&#160;</td>
			<td>S65105&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection scissors</td>
			<td>Ted Pella Inc.</td>
			<td>1316</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Butterfly canula</td>
			<td>Exel International</td>
			<td>26704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4417-100TAB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter (0.45 micron)</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>NC0813356</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZ61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome sectioning system</td>
			<td>Ted Pella Inc.</td>
			<td>Vibratome 3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Cacodylate</td>
			<td>EMS</td>
			<td>12300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tannic Acid</td>
			<td>EMS</td>
			<td>21700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Ferrocyanide</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>14459-95-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium Tetroxide 4% Solution</td>
			<td>EMS</td>
			<td>19150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiocarbohydrazide</td>
			<td>EMS</td>
			<td>21900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Aspartic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A93100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Hydroxide</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>43731000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lead Nitrate</td>
			<td>EMS</td>
			<td>17900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMbed-812 EMBEDDING KIT</td>
			<td>EMS</td>
			<td>14120</td>
			<td>Contains Embed 812&#160; resin, DDSA, NMA, and DMP-30.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde 25% EM Grade</td>
			<td>Polysciences Inc.</td>
			<td>1909</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>EMS</td>
			<td>19202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl Acetate</td>
			<td>EMS</td>
			<td>22400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>EMS</td>
			<td>15055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propylene Oxide</td>
			<td>EMS</td>
			<td>20400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embedding Mold</td>
			<td>EMS</td>
			<td>70907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum specimen pin</td>
			<td>EMS</td>
			<td>70446</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colloidal Silver Liquid</td>
			<td>EMS</td>
			<td>12630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor</td>
			<td>EMS</td>
			<td>72000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super Glue (Loctite Gel Control)</td>
			<td>Loctite</td>
			<td>234790</td>
			<td>Hardware/craft stores carry this item</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conductive epoxy</td>
			<td>Ted Pella Inc.</td>
			<td>16043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scanning electron microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Sigma VP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In chamber ultramicrotome for SEM</td>
			<td>Gatan Inc.</td>
			<td>3View2</td>
			<td>Can be designed for other SEMs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trimming microscope for pin preparation</td>
			<td>Gatan Inc.</td>
			<td colspan="2">supplied as part of 3View system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low kV backscattered electron detector</td>
			<td>Gatan Inc.</td>
			<td>3V-BSED</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ/ Fiji processing package&#160;</td>
			<td colspan="2">ImageJ ver 1.50b, FIJI download Oct 1, 2015</td>
			<td><a href="http://zoi.utia.cas.cz/files/imagej_api.pdf">http://zoi.utia.cas.cz/files/imagej_api.pdf</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>http://rsb.info.nih.gov/ij/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.icmr.ucsb.edu/programs/3DWorkshop/Uchic-2015_FIJI_Tutorial.pdf">http://www.icmr.ucsb.edu/programs/3DWorkshop/Uchic-2015_FIJI_Tutorial.pdf</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td><a href="http://fiji.sc/TrakEM2">http://fiji.sc/TrakEM2</a></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of brain mitochondria using serial block-face scanning electron microscopy

El cerebro humano es un órgano de alto consumo de energía que se basa principalmente en la glucosa como fuente de combustible. La glucosa se ​​cataboliza por las mitocondrias cerebrales a través de la glucólisis, las vías de ciclo y la fosforilación oxidativa de ácido tri-carboxílico (TCA) (fosforilación oxidativa) para producir la energía celular en forma de trifosfato de adenosina (ATP). Deterioro del valor de la producción de ATP mitocondrial causa los trastornos mitocondriales, que presentan clínicamente con síntomas neurológicos y myopathic prominentes. Defectos mitocondriales también están presentes en los trastornos del neurodesarrollo (por ejemplo, trastorno del espectro autista) y trastornos neurodegenerativos (por ejemplo, esclerosis lateral amiotrófica, enfermedad de Alzheimer y la enfermedad de Parkinson). Por lo tanto, hay un aumento de interés en el campo para la realización de análisis en 3D de mitocondrial morfología, estructura y distribución bajo ambos estados sanos y enfermedades. La morfología mitocondrial cerebro es extremadamente diverso, con algunas mitocondrias especialmente los dela región sináptica en el intervalo de &lt;200 nm de diámetro, que está por debajo del límite de resolución de la microscopía de luz tradicional. Expresar una proteína orientado mitocondrialmente-verde fluorescente (GFP) en el cerebro mejora significativamente la detección organellar por microscopía confocal. Sin embargo, no supera las limitaciones de la sensibilidad de detección de relativamente pequeñas mitocondrias de tamaño sin oversaturating las imágenes de gran tamaño mitocondrias. Mientras microscopía electrónica de transmisión de serie ha sido utilizado con éxito para caracterizar las mitocondrias en la sinapsis neuronal, esta técnica es extremadamente lento especialmente cuando se comparan múltiples muestras. La técnica de bloqueo cara microscopía electrónica de barrido de serie (SBFSEM) implica un proceso automatizado de seccionamiento, bloques de imagen de adquisición de datos y el tejido. A continuación, ofrecemos un protocolo para realizar SBFSEM de una región definida del cerebro de roedores para reconstruir y visualizar la morfología mitocondrial rápidamente. esta tecnologíanique también podría ser utilizado para proporcionar información precisa sobre el número mitocondrial, volumen, tamaño y distribución en una región del cerebro definido. Dado que la resolución de la imagen obtenida es alta (típicamente bajo 10 nm) también se pueden detectar los defectos morfológicos mitocondriales brutos.

Se demuestra que la morfología mitocondrial del cerebro y el tamaño es heterogénea en las diferentes sub-compartimentos neuronales. La microscopía confocal en cultivos neuronales de baja densidad transducidas con lentivirus que expresan la proteína verde fluorescente dirigido mitocondrialmente mostró que las mitocondrias que residen en el soma neuronal forman una red reticular, mientras que los que residen en las neuritas distales exhiben una morfología alargada discreta (Figura 1 AB). Utilizando la técnica de SBFSEM, la morfología mitocondrial, tamaño, volumen y distribución se analizaron en el cerebro del ratón. Tres (3D) imágenes tridimensionales de las mitocondrias fueron reconstruidos a partir de los dos neuritas y sinapsis en el hipocampo del cerebro del ratón. Se identificaron las mitocondrias presinápticos y el número de boutons presináptica que albergan las mitocondrias residentes cuantificados. La heterogeneidad en el tamaño de las mitocondrias se observó en el dendríticas frente compartimentos axonales (Figura 1 CD). Por otra parte, muchos pequeños compartimentos presináptica en el hipocampo del cerebro de ratones carecían de mitocondrias (Figura 2 AC). Las mediciones volumétricas de ambos mitocondrias presinápticos y extrasinápticos revelaron que el volumen o tamaño de las mitocondrias que residen dentro de los presynapses neuronal fue significativamente más pequeños que los que residen en la región extrasynaptic (Figura 2 DF). Curiosamente, los dos dimensiones (2D) la distribución del tamaño de las mitocondrias medidos a partir de un muestreo no sesgado de 200 mitocondrias no somáticos mostró que ~ 11% de la fracción mitocondrial se encuentra por debajo del límite de resolución del microscopio de luz (Figura 2G). Además, las imágenes 2D adquiridos por análisis SBFSEM proporcionan una mayor resolución para visualizar las características ultraestructurales de las mitocondrias individuales (Figura 3 AB). Debido a la topografía claramente visible del tejido, es posible además clasificar el borrador celularartamento de las mitocondrias mediante la determinación de su proximidad a estructuras fácilmente identificables como núcleo (somática) y las vesículas sinápticas (presináptico) (Figura 3) AB. Con el fin de identificar las mitocondrias presentes en los procesos neuronales, reconstruir el proceso individual como axón o la dendrita en base a la presencia o ausencia de boutons presináptica respectivamente 42. Basándose en estos resultados, proponemos que SBFSEM es una técnica analítica extremadamente valiosa para identificar la forma mitocondrial, tamaño, número y distribución en el tejido cerebral y que cualquier defecto brutos en la estructura y la distribución mitocondrial también se pueden determinar usando este método. Dado que las características ultraestructurales de diferentes tipos de células en el cerebro son distintos, por ejemplo. presencia de gránulos de glucógeno en los astrocitos, también es posible analizar las diferencias de células de tipo específico en las mitocondrias cerebrales. <img alt="Figura 1" src = &quot;/ files / ftp_upload / 54214 / 54214fig1.jpg&quot; /&gt; Figura 1:. La heterogeneidad en Neuronal mitocondrial morfología y distribución de cultivos corticales postnatal día 1 crías de ratón fueron transducidas con lentivirus que expresan la proteína verde fluorescente dirigido mitocondrialmente (mito-GFP). (A) muestra soma neuronal que expresa Mito-GFP, tenga en cuenta la red reticulada de la morfología mitocondrial; Nu = núcleo; barra de escala = 5 micras. (B) muestra la morfología mitocondrial alargado en neuritas distal; barra de escala = 5 micras. Representante imagen 2D a partir del conjunto de datos SBFSEM generado a partir del tejido cerebral del ratón (C), las mitocondrias son teñidas en verde, las dendritas se tiñen de azul y varices axonal se tiñen de marrón; barra de escala = 1 m. (D) reconstrucciones en 3D de las mitocondrias en las neuritas de tejido cerebral del ratón, tenga en cuenta la diferencia de tamaño entre dendríticas y indicat mitocondria axonalcado por grandes y pequeños de punta de flecha, respectivamente; barra de escala = 1 m. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54214/54214fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54214/54214fig2.jpg" /> Figura 2: Bloque cara Serial Microscopía Electrónica de Barrido (SBFSEM) análisis reveló baja abundancia de mitocondrias en los terminales presinápticos (A) ultramicrograph Representante 2D a partir del análisis conjunto de datos SBFSEM obtenido del hipocampo de ratones de tipo salvaje P15;. barra de escala = 1 m. (B) Muestra la reconstrucción 3D de 10 terminales nerviosas presinápticas. Tenga en cuenta que sólo 4 de cada 10 terminales presinápticos mostraron mitocondrias perceptible; barra de escala = 1 m. (C) Gráfico de barras que muestra la cuantificación de 173 reconstruye los terminales nerviosos presinápticos de la SBEl análisis conjunto de datos FSEM. Representante imagen 2D del conjunto de datos que muestra la mitocondria SBFSEM extrasináptico en las mitocondrias de color azul y verde en presináptica (D); barra de escala = 1 m. (E) reconstrucciones en 3D de las mitocondrias presináptica y extrasináptico del conjunto de datos SBFSEM el uso del software; barra de escala = 1 m. Gráfico (F) de barras que muestra el volumen de las mitocondrias y extrasinápticos presináptica. Los datos se representan como media ± SEM; n = 3 conjuntos de datos diferentes (incluye 62 mitocondrias presináptica y 80 mitocondrias extrasinápticos en total); * Representa el valor de p = 0,0405. (G) Un área de 15 por 15 micras en las cuatro esquinas de las imágenes fueron marcados y se identificaron todas las mitocondrias no somáticas para permitir un muestreo aleatorio. Se midió la dimensión mínima de ~ 200 mitocondrias. Pie gráfico muestra que ~ 11% de las mitocondrias no somáticos fueron &lt;200 nm de dimensión que está por debajo del límite de resolución del microscopio óptico. Esta figura tiene been una adaptación de Chavan et al 27. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54214/54214fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="figura 3" src="/files/ftp_upload/54214/54214fig3.jpg" /> Figura 3: 2D SBFSEM Las imágenes de la geniculado lateral Núcleos de cerebro de ratón (A) imagen bidimensional SBFSEM representante de los núcleo geniculado lateral (8/8 micras) que demuestran una topografía detallada de la región.. Soma y el núcleo se indican; barra de escala = 2 micras. (B) Una ampliación del área indicada por el cuadrado rojo en el panel A. Tenga en cuenta que las membranas externa e interna de las mitocondrias, así como la formación de crestas son claramente visibles. También se observa la topografía y las relaciones con otros orgánulos y estructura celular. PS indica ejemplo de las mitocondrias presinápticay NS indica ejemplo de no-sináptica (NS) mitocondrias somática; barra de escala = 1 m. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54214/54214fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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Analysis of Brain Mitochondria Using Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy

Análisis del Cerebro Las mitocondrias Usando serie Bloque-Cara Microscopía Electrónica de Barrido

Mitochondrial visualization and analysis from mammalian brain tissue is a challenging task. Here, we describe how three dimensional (3D) reconstruction analysis from the serial block-face scanning electron microscopy (SBFSEM) can be used to gain insights on the morphological and volumetric analysis of this critical energy generating organelle.

Human brain is a high energy consuming organ that mainly relies on glucose as a fuel source. Glucose is catabolized by brain mitochondria via glycolysis, ...

analysis-brain-mitochondria-using-serial-block-face-scanning-electron

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

14.0K vistas.  Virginia Tech Carilion Research Institute. Mitochondrial visualization and analysis from mammalian brain tissue is a challenging task. Here, we describe how three dimensional (3D) reconstruction analysis from the serial block-face scanning electron microscopy (SBFSEM) can be used to gain insights on the morphological and volumetric analysis of this critical energy generating organelle. 

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Focussed Ion Beam Milling and Scanning Electron Microscopy of Brain Tissue

This protocol describes how biological samples, like brain tissue, can be imaged in three dimensions using the focussed ion beam/scanning electron microscope (FIB/SEM). The samples are fixed with aldehydes, heavy metal stained using osmium tetroxide and uranyl acetate. They are then dehydrated with alcohol and infiltrated with resin, which is then hardened. Using a light microscope and ultramicrotome with glass knives, a small block containing the region interest close to the surface is made. The block is then placed inside the FIB/SEM, and the ion beam used to roughly mill a vertical face along one side of the block, close to this region. Using backscattered electrons to image the underlying structures, a smaller face is then milled with a finer ion beam and the surface scrutinised more closely to determine the exact area of the face to be imaged and milled. The parameters of the microscope are then set so that the face is repeatedly milled and imaged so that serial images are collected through a volume of the block. The image stack will typically contain isotropic voxels with dimenions as small a 4 nm in each direction. This image quality in any imaging plane enables the user to analyse cell ultrastructure at any viewing angle within the image stack.

This protocol describes how resin embedded brain tissue can be prepared and imaged in the three dimensions in the focussed ion beam, scanning electron microscope.

Haz de iones enfocado fresado y microscopía electrónica de barrido en el tejido cerebral

This protocol describes how biological samples, like brain tissue, can be imaged in three dimensions using the focussed ion beam/scanning electron ...

Investigación

Neurociencias

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains technically challenging. One approach, Activation-Induced Manganese-enhanced MRI (AIM MRI), has been used successfully to map neuronal activity in rodents 1-5. In AIM MRI, Mn2+ acts a calcium analog and accumulates in depolarized neurons 6,7. Because Mn2+ shortens the T1 tissue property, regions of elevated neuronal activity will enhance in MRI. Furthermore, Mn2+ clears slowly from the activated regions; therefore, stimulation can be performed outside the magnet prior to imaging, enabling greater experimental flexibility. However, because Mn2+ does not readily cross the blood-brain barrier (BBB), the need to open the BBB has limited the use of AIM MRI, especially in mice.
One tool for opening the BBB is ultrasound. Though potentially damaging, if ultrasound is administered in combination with gas-filled microbubbles (i.e., ultrasound contrast agents), the acoustic pressure required for BBB opening is considerably lower. This combination of ultrasound and microbubbles can be used to reliably open the BBB without causing tissue damage 8-11.
Here, a method is presented for performing AIM MRI by using microbubbles and ultrasound to open the BBB. After an intravenous injection of perflutren microbubbles, an unfocused pulsed ultrasound beam is applied to the shaved mouse head for 3 minutes. For simplicity, we refer to this technique of BBB Opening with Microbubbles and UltraSound as BOMUS 12. Using BOMUS to open the BBB throughout both cerebral hemispheres, manganese is administered to the whole mouse brain. After experimental stimulation of the lightly sedated mice, AIM MRI is used to map the neuronal response.
To demonstrate this approach, herein BOMUS and AIM MRI are used to map unilateral mechanical stimulation of the vibrissae in lightly sedated mice 13. Because BOMUS can open the BBB throughout both hemispheres, the unstimulated side of the brain is used to control for nonspecific background stimulation. The resultant 3D activation map agrees well with published representations of the vibrissae regions of the barrel field cortex 14. The ultrasonic opening of the BBB is fast, noninvasive, and reversible; and thus this approach is suitable for high-throughput and/or longitudinal studies in awake mice.

A technique is described for broadly opening the blood-brain barrier in the mouse using microbubbles and ultrasound. Using this technique, manganese can be administered to the mouse brain. Because manganese is an MRI contrast agent that accumulates in depolarized neurons, this approach enables imaging of neuronal activity.

Neuroimagen Funcional Utilizando ultrasonidos hematoencefálica perturbación de la barrera y la RM-manganeso mayor

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

La manipulación genética de las neuronas cerebelosa gránulo<em&gt; In Vitro</em&gt; Y<em&gt; En Vivo</em&gt; Estudiar Neuronal Morfología y Migración

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

Three-dimensional Imaging and Analysis of Mitochondria within Human Intraepidermal Nerve Fibers

The goal of this protocol is to study mitochondria within intraepidermal nerve fibers. Therefore, 3D imaging and analysis techniques were developed to isolate nerve-specific mitochondria and evaluate disease-induced alterations of mitochondria in the distal tip of sensory nerves. The protocol combines fluorescence immunohistochemistry, confocal microscopy and 3D image analysis techniques to visualize and quantify nerve-specific mitochondria. Detailed parameters are defined throughout the procedures in order to provide a concrete example of how to use these techniques to isolate nerve-specific mitochondria. Antibodies were used to label nerve and mitochondrial signals within tissue sections of skin punch biopsies, which was followed by indirect immunofluorescence to visualize nerves and mitochondria with a green and red fluorescent signal respectively. Z-series images were acquired with confocal microscopy and 3D analysis software was used to process and analyze the signals. It is not necessary to follow the exact parameters described within, but it is important to be consistent with the ones chosen throughout the staining, acquisition and analysis steps. The strength of this protocol is that it is applicable to a wide variety of circumstances where one fluorescent signal is used to isolate other signals that would otherwise be impossible to study alone.

This protocol uses three-dimensional (3D) imaging and analysis techniques to visualize and quantify nerve-specific mitochondria. The techniques are applicable to other situations where one fluorescent signal is used to isolate a subset of data from another fluorescent signal.

Proyección de imagen tridimensional y análisis de las mitocondrias en las fibras de nervio humano Intraepidermal

The goal of this protocol is to study mitochondria within intraepidermal nerve fibers. Therefore, 3D imaging and analysis techniques were developed to ...

Peering at Brain Polysomes with Atomic Force Microscopy

The translational machinery, i.e., the polysome or polyribosome, is one of the biggest and most complex cytoplasmic machineries in cells. Polysomes, formed by ribosomes, mRNAs, several proteins and non-coding RNAs, represent integrated platforms where translational controls take place. However, while the ribosome has been widely studied, the organization of polysomes is still lacking comprehensive understanding. Thus much effort is required in order to elucidate polysome organization and any novel mechanism of translational control that may be embedded. Atomic force microscopy (AFM) is a type of scanning probe microscopy that allows the acquisition of 3D images at nanoscale resolution. Compared to electron microscopy (EM) techniques, one of the main advantages of AFM is that it can acquire thousands of images both in air and in solution, enabling the sample to be maintained under near physiological conditions without any need for staining and fixing procedures. Here, a detailed protocol for the accurate purification of polysomes from mouse brain and their deposition on mica substrates is described. This protocol enables polysome imaging in air and liquid with AFM and their reconstruction as three-dimensional objects. Complementary to cryo-electron microscopy (cryo-EM), the proposed method can be conveniently used for systematically analyzing polysomes and studying their organization.

While ribosome structure has been extensively characterized, the organization of polysomes is still understudied. To overcome this lack of knowledge, we present here a detailed preparation protocol for accurate imaging of mammalian polysomes by atomic force microscopy (AFM) in air and liquid.

Asomándose al cerebro Polisomas con microscopía de fuerza atómica

The translational machinery, i.e., the polysome or polyribosome, is one of the biggest and most complex cytoplasmic machineries in cells. Polysomes, ...

Preparation of Non-human Primate Brain Tissue for Pre-embedding Immunohistochemistry and Electron Microscopy

Despite all the technological advances at the light microscopy&#160;level, electron microscopy remains the only tool in neuroscience to examine and characterize ultrastructural and morphological details of neurons, such as synaptic contacts. Good preservation of brain tissue for electron microscopy can be obtained by rigorous cryo-fixation methods, but these techniques are rather costly and limit the use of immunolabeling, which is crucial to understand the connectivity of identified neuronal systems. Freeze-substitution methods have been developed to allow the combination of cryo-fixation with immunolabeling. However, the reproducibility of these methodological approaches usually relies on costly freezing devices. Moreover, achieving reliable results with this technique is very time-consuming and skill-challenging. Hence, the traditional chemically fixed brain, particularly with acrolein fixative, remains a time-efficient and low-cost method to combine electron microscopy with immunohistochemistry. Here, we provide a reliable experimental protocol using chemical acrolein fixation that leads to the preservation of primate brain tissue and is compatible with pre-embedding immunohistochemistry and transmission electron microscopic examination.

Here, we provide an easy, low-cost, and time-efficient protocol to chemically fix primate brain tissue with acrolein fixative, allowing for long-term preservation that is compatible with pre-embedding immunohistochemistry for transmission electron microscopy.

Preparación de tejido cerebral de primates no humanos para Pre-incrustación de inmunohistoquímica y la microscopía electrónica de

Despite all the technological advances at the light microscopy&#160;level, electron microscopy remains the only tool in neuroscience to examine and ...

Chronic Implantation of Whole-cortical Electrocorticographic Array in the Common Marmoset

Electrocorticography (ECoG) allows the monitoring of electrical field potentials from the cerebral cortex with high spatiotemporal resolution. Recent development of thin, flexible ECoG electrodes has enabled conduction of stable recordings of large-scale cortical activity. We have developed a whole-cortical ECoG array for the common marmoset. The array continuously covers almost the entire lateral surface of cortical hemisphere, from the occipital pole to the temporal and frontal poles, and it captures whole-cortical neural activity in one shot. This protocol describes a chronic implantation procedure of the array in the epidural space of the marmoset brain. Marmosets have two advantages regarding ECoG recordings, one being the homologous organization of anatomical structures in humans and macaques, including frontal, parietal, and temporal complexes. The other advantage is that the marmoset brain is lissencephalic and contains a large number of complexes, which are more difficult to access in macaques with ECoG, that are exposed to the brain surface.These features allow direct access to most cortical areas beneath the surface of the brain. This system provides an opportunity to investigate global cortical information processing with high resolutions at a sub-millisecond order in time and millimeter order in space.

We have developed a whole-cortical electrocorticographic array for the common marmoset that continuously covers almost the entire lateral surface of cortex, from the occipital pole to the temporal and frontal poles. This protocol describes a chronic implantation procedure of the array in the epidural space of the marmoset brain.

Implantación crónica de todo cortical matriz electrocorticográfica en el tití común

Electrocorticography (ECoG) allows the monitoring of electrical field potentials from the cerebral cortex with high spatiotemporal resolution. Recent ...

Using Near-infrared Fluorescence and High-resolution Scanning to Measure Protein Expression in the Rodent Brain

Neuroscience is the study of how cells in the brain mediate various functions. Measuring protein expression in neurons and glia is critical for the study of neuroscience as cellular function is determined by the composition and activity of cellular proteins. In this article, we describe how immunocytochemistry can be combined with near-infrared high-resolution scanning to provide a semi-quantitative measure of protein expression in distinct brain regions. This technique can be used for single or double protein expression in the same brain region. Measuring proteins in this fashion can be used to obtain a relative change in protein expression with an experimental manipulation, molecular signature of learning and memory, activity in molecular pathways, and neural activity in multiple brain regions. Using the correct proteins and statistical analysis, functional connectivity among brain regions can be determined as well. Given the ease of implementing immunocytochemistry in a laboratory, using immunocytochemistry with near-infrared high-resolution scanning can expand the ability of the neuroscientist to examine neurobiological processes at a systems level.

Here, we present a protocol that uses near-infrared dyes in conjunction with immunohistochemistry and high-resolution scanning to assay proteins in brain regions.

Uso de fluorescencia de infrarrojo cercano y escaneo de alta resolución para medir la expresión de proteína en el cerebro de roedores

Neuroscience is the study of how cells in the brain mediate various functions. Measuring protein expression in neurons and glia is critical for the study ...

Delivery of Antibodies into the Brain Using Focused Scanning Ultrasound

Only a small fraction of therapeutic antibodies targeting brain diseases are taken up by the brain. Focused ultrasound offers a possibility to increase uptake of antibodies and engagement through transient opening of the blood-brain barrier (BBB). In our laboratory, we are developing therapeutic approaches for neurodegenerative diseases in which an antibody in various formats is delivered across the BBB using microbubbles, concomitant with focused ultrasound application through the skull targeting multiple spots, an approach we refer to as scanning ultrasound (SUS). The mechanical effects of microbubbles and ultrasound on blood vessels increases paracellular transport across the BBB by transiently separating tight junctions and enhances vesicle- mediated transcytosis, allowing antibodies and therapeutic agents to effectively cross. Moreover, ultrasound also facilitates the uptake of antibodies from the interstitial brain into brain cells such as neurons where the antibody distributes throughout the cell body and even into neuritic processes. In our studies, fluorescently labeled antibodies are prepared, mixed with in-house prepared lipid-based microbubbles and injected into mice immediately before SUS is applied to the brain. The increased antibody concentration in the brain is then quantified. To account for alterations in normal brain homeostasis, microglial phagocytosis can be used as a cellular marker. The generated data suggest that ultrasound delivery of antibodies is an attractive approach to treat neurodegenerative diseases.

Presented here is a protocol to transiently open the blood-brain barrier (BBB) either focally or throughout a mouse brain to deliver fluorescently-labeled antibodies and activate microglia. Also presented is a method to detect the delivery of antibodies and microglia activation by histology.

Administración de anticuerpos en el cerebro mediante ultrasonido de barrido enfocado

Only a small fraction of therapeutic antibodies targeting brain diseases are taken up by the brain. Focused ultrasound offers a possibility to increase ...

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy (SBEM) for the Study of Dendritic Spines

Three-dimensional electron microscopy (3D EM) gives a possibility to analyze morphological parameters of dendritic spines with nanoscale resolution. In addition, some features of dendritic spines, such as volume of the spine and post-synaptic density (PSD) (representing post-synaptic part of the synapse), presence of presynaptic terminal, and smooth endoplasmic reticulum or atypical form of PSD (e.g., multi-innervated spines), can be observed only with 3D EM. By employing serial block-face scanning electron microscopy (SBEM) it is possible to obtain 3D EM data easier and in a more reproducible manner than when performing traditional serial sectioning. Here we show how to prepare mouse hippocampal samples for SBEM analysis and how this protocol can be combined with immunofluorescence study of dendritic spines. Mild fixation perfusion allows us to perform immunofluorescence studies with light microscopy on one half of the brain, while the other half was prepared for SBEM. This approach reduces the number of animals to be used for the study.

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy SBEM for the Study of Dendritic Spines

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy (SBEM) is applied to image and analyze dendritic spines in the murine hippocampus.

Microscopía electrónica de barrido serial de cara de bloque (SBEM) para el estudio de espinas dendríticas

Three-dimensional electron microscopy (3D EM) gives a possibility to analyze morphological parameters of dendritic spines with nanoscale resolution. In ...