Nos gustaría dar las gracias a nuestros colaboradores, Francois Delori, Tomas Burke, y Tobias Duncker. Apoyo a la Investigación: NIH / NEI R01 EY015520 (RTS, JPG), y los fondos de libre disposición de Investigación para prevenir la ceguera (RTB).

Ética Declaración: Todos los pacientes incluidos en estos estudios fueron realizados de acuerdo con lo que de revisión institucional aprobado supervisión de la junta de la Facultad de Medicina de la Universidad de Nueva York. 1. Selección de pacientes y preparación inicial de la Imagen Nota: Se requieren los siguientes materiales: 0,5% solución oftálmica de tropicamida, 2,5% solución oftálmica fenilefrina, CSLO equipado con dominio espectral tomografía óptica de coherencia (SD-OCT) y la fluorescencia de referencia interna. <ol><li> Antes de la proyección de imagen, configurado de forma adecuada CSLO para la adquisición de datos de acuerdo con las instrucciones del fabricante. </li><li> Montar una referencia fluorescente interna en el CSLO. Nota: La referencia fluorescente interna, tal como se adquirió desde el fabricante, se encuentra en un anillo de metal y se coloca directamente detrás de la lente de la cámara. Si se utiliza un CSLO de otro fabricante, puede haber una configuración diferente que la que se describe eneste protocolo. <ol><li> Con el fin de insertar la referencia en el CSLO, girar la lente para eliminarlo, desenroscar el anillo del metal de la máquina, y sustituirlo por el nuevo anillo de metal que contiene la referencia. Nota: la referencia fluorescente interna es esencial para la técnica qaf, ya que permite la corrección de la variación en la potencia del láser y el detector de sensibilidad / ganancia. </li></ol></li><li> Tienen los pacientes reclutados para la imagen se someten a un examen del ojo con dilatación de rutina y obtener información básica relativa a la historia ocular pasado y condiciones médicas subyacentes que pueden manifestarse con los hallazgos oculares. </li><li> Dilatar los alumnos con 0,5% de tropicamida y fenilefrina al 2,5%. Paso crítico: Dilatar alumnos de al menos 6 mm. Nota: Esto es esencial para el paso ininterrumpido de la luz, y por lo tanto para la visualización óptima y la medición del fondo de ojo. </li><li> Antes de las imágenes, la posición del paciente correctamente en el CSLO, con la barbilla apoyada en el soporte de la barbilla, la frente coloca contra la forehead resto, y cantos lateral correctamente alineados con los indicadores. </li></ol> 2. El nivel básico de imágenes de fondo de ojo <ol><li> En primer lugar, la imagen del fondo de ojo con la luz de reflectancia en el infrarrojo (IR) próximo (longitud de onda de 820 nm) con el fin de centralizar la cámara sobre la mácula y obtener el enfoque áspera. <ol><li> Con el paciente en la posición correcta, cambiar el ajuste de hardware en el panel de control para el modo de formación de imágenes de infrarrojos, cámara de posición manualmente hasta que el fondo está en el foco completo, y saque una foto </li><li> Ajustar las configuraciones en el panel de control en &quot;IR-OCT&quot;, que utiliza el dominio espectral tomografía de coherencia óptica (SD-OCT), en relación con las imágenes de infrarrojos para evaluar la mácula de la enfermedad subyacente. </li><li> Utilice las guías presentes en la ventana de imagen para orientar correctamente la OCT para la imagen IR del fondo de ojo. Para lograr una óptima calidad SD-OCT, coloque la cámara de tal manera que la imagen de OCT se encuentra en el tercio superior de la ventana de imagen. Adquirir por lo menos una línea horizontal scuna a través de la fóvea y que abarca todo el campo de la imagen. </li></ol></li></ol> 3. La creación de QAF Imaging <ol><li> Utilice la adquisición de imágenes &quot;alta velocidad&quot;. Nota: Esta configuración permite la adquisición de imágenes más rápido, lo que disminuye el riesgo de pérdida de señal debido al movimiento del paciente y la consiguiente obstrucción de la luz por el iris o los párpados. </li><li> Use &quot;La media de 9&quot; marcos. Nota: Esta configuración permite la captura rápida y secuencial de 9 cuadros de imagen, que pueden ser posteriormente &quot;promedio&quot; para reducir el ruido y los artefactos (véase más adelante). </li><li> Utilizar el campo &quot;30 x 30 grados&quot;. Nota: Esto se refiere a los grados de área de la retina capturado en la adquisición de imágenes. </li><li> Antes de las imágenes, que advertir al paciente acerca de la luz azul, ya que esto puede ser alarmante al principio. </li><li> Activar el modo AF y alinear eje de la cámara de tal manera que la pantalla es como máximo de &quot;lleno&quot; con FA fondo de ojo (oscurecimiento mínima de los lados y las esquinas de la imagen). <ol><li> Si los pacientes hAve dificultad para tolerar la luz azul brillante, comienzo de imágenes con la cámara más lejos del ojo y luego llevar la cámara lentamente hacia el paciente hasta que el fondo está a la vista. Paso crítico: si la luz que entra y sale del ojo está obstruido, disminución de la señal dará como resultado. disminución localizada es visible como el oscurecimiento asimétrica de un lado de la imagen o de la esquina. pérdida generalizada de la señal se ve cuando los movimientos oculares solo obstruyen el paso de la luz. </li></ol></li><li> Alinear la cámara de tal manera que la señal de AF está en su nivel más alto en todo el campo. Objetivo de señal máxima en vez de imagen más nítida, sin embargo, que más o menos se correlacionan. Ajuste el enfoque de la cámara moviendo el CSLO para volver a colocar la cámara de forma manual o con la palanca de mando oftalmoscopio. </li><li> Ajustar la sensibilidad / ganancia de tal manera que la FA fondo de ojo es fácilmente visible, pero evitar la sobre-saturación. Durante la adquisición de imágenes, los píxeles de colores visibles tanto en la referencia interna (situado en la parte superior de laimagen) o el fondo de ojo indican sobre-saturación y por lo tanto la pérdida de señal. </li></ol> 4. Adquisición de imágenes Nota: Paso crítico: El objetivo de la adquisición de imágenes debe ser de calidad para obtener 2 pilas de imágenes altas de 9 fotogramas por sesión para controlar la variabilidad entre las imágenes dentro de una sesión. Después de cambiar la posición del paciente y la cámara, obtener una segunda sesión de dos imágenes para la evaluación y el control de la variabilidad. Todas las imágenes en última instancia ser calibradas para la referencia interna (descrito a continuación). <ol><li> Adquirir imágenes sólo después de al menos 20 segundos de &quot;blanqueo&quot; (exposición total de la retina a la luz AF) para minimizar la absorción de la luz por la rodopsina en la retina sensorial 9. <ol><li> Usar este período para optimizar la alineación de la cámara, el enfoque y la sensibilidad. </li></ol></li><li> Tienen los sujetos parpadear antes de cada adquisición de imágenes como una película lagrimal fresca mejora la calidad de la señal. </li><li> Evitar los párpados en el plano de la adquisición. Nota: Puede ser útil manualmente los párpados abiertos para los pacientes más difíciles. Los autores recomiendan que un ayudante realiza esta tarea. </li><li> Optimizar la alineación antes de cada adquisición de imágenes para asegurarse de que la luz no es obstruida por el iris que resulta en una disminución de la señal. Nota: Como mínimo menor movimiento es muy común, los autores recomiendan fina reajuste según sea necesario antes de cada adquisición de imágenes. Orientar y animar al paciente mientras que las imágenes ayuda a movimiento de descenso. Los autores también recomiendan el uso de un pedal de la máquina como el botón &quot;adquisición&quot; con el fin de minimizar la distracción del operador. </li><li> Realizar el procesamiento posterior de las imágenes mediante el cálculo de la &quot;media&quot; de la pila 9-marco para aumentar la relación señal-ruido. Calcular la media de una pila utilizando el software CSLO mediante la selección de la opción para calcular la media. Nota: es posible que las pilas donde algunos cuadros no son de calidad óptima (es decir, han localizada o generalizada disminución de la ISgnal en relación con los marcos óptimas), por lo tanto, inspeccionar cuidadosamente cada pila y anular la selección de marcos subóptimas antes de cálculo de la media. Nota: Las imágenes de medias con proporciones aceptables de señal a ruido se pueden procesar de al menos 3 cuadros. Es normal que los lados y las esquinas de cada imagen tenga la señal más baja que los 20 grados centrales debido a las limitaciones dentro de la propia CSLO. <ol><li> Si el software pregunta si el operador quiere normalizar los niveles de gris (es decir, estirar el histograma) entre 0 y 255, seleccione &quot;No&quot;. Esto mantiene los niveles de gris inalterados para el análisis. </li></ol></li></ol> Análisis 5. Imagen <ol><li> Analizar las imágenes AF como se describió anteriormente usando el software de análisis de imagen desarrollado para la técnica de QAF (IGOR; 9). Una breve descripción de un análisis de imagen típico que utiliza este software se incluye a continuación. <ol><li> Cargar el programa en QAF IGOR e importar imágenes (en formato .bmp) exportados de lasoftware CSLO con relación de aspecto de píxeles de 768 x 768 (parámetro de salida por defecto). </li><li> Seleccione la imagen en el menú desplegable e iniciar el análisis. </li><li> Cambiar la posición de los indicadores de calibración en la imagen de tal manera que las &quot;punto de mira&quot; se superponen a la fóvea y el &quot;soporte&quot; se apoya en el disco óptico (estos indicadores se utilizan para escalar y posicionar las ROI). Cuando se coloca correctamente, el software utilizan peticiones a continuación, rellenar la imagen con regiones de interés circunferenciales en torno a la fóvea (véanse las figuras 1, 2). </li><li> Seleccionar la opción de IGOR para calibrar los niveles de gris globales de cada imagen para esos niveles presentes en la referencia fluorescente interna. Nota: Este paso permite la calibración de los factores relacionados con la máquina, incluyendo el nivel cero electrónico de cada imagen y el factor de calibración de referencia interna de cada máquina, así como los factores relacionados con el paciente, incluyendo la edad, la refracción y la curvatura corneal. Nota: El software de análisis a continuación, muestra el r fijoEGIONES en la imagen resultante y un valor qaf se demuestra dentro de cada región. qaf valores también se introducen automáticamente en un formato de hoja de cálculo en una ventana separada &quot;. </li><li> Generar qaf &quot;mapas de calor&quot; seleccionando la opción dentro de los símbolos del sistema. Todas las imágenes y los datos se pueden exportar desde el software IGOR en una hoja de cálculo de Excel mediante la selección de las opciones apropiadas. </li></ol></li></ol>

<ol>
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R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+fundus+autofluorescence+in+mice:+correlation+with+HPLC+quantitation+of+RPE+lipofuscin+and+measurement+of+retina+outer+nuclear+layer+thickness.">Quantitative fundus autofluorescence in mice: correlation with HPLC quantitation of RPE lipofuscin and measurement of retina outer nuclear layer thickness.</a> Investigative ophthalmology &amp; visual science. 54, 2812-2820 (2013).</li><li>Delori, F. C., Webb, R. H., Sliney, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maximum+permissible+exposures+for+ocular+safety+(ANSI+2000),+with+emphasis+on+ophthalmic+devices.">Maximum permissible exposures for ocular safety (ANSI 2000), with emphasis on ophthalmic devices.</a> Journal of the Optical Society of America. A, Optics, image science, and vision. 24, 1250-1265 (2007).</li></ol>

STA: no disclosures, JPG: no disclosures, RTS: consultant, Ocata Therapeutics.

distribución lipofuscina RPE anormal, si aumenta o disminuye, es un marcador sensible de la enfermedad de la retina y, en general se asocia con la pérdida de función de la retina sensorial. A continuación, describimos la aplicación de qaf para la evaluación de la lipofuscina RPE. La incorporación de una referencia interna fluorescente para corregir la sensibilidad variable la potencia del láser y el detector 9 junto con nuestra técnica de imagen estandarizada permite la cuantificación fiable de los niveles de AF. Nuestro objetivo es que este método ayuda en el diagnóstico y seguimiento de enfermedades de la retina, y, finalmente, en la evaluación de la eficacia de las intervenciones terapéuticas, como la terapia de drogas o gen. qaf también puede ayudar en la estratificación de las personas en situación de riesgo de enfermedades tales como AMD. Hemos generado una gran base de datos normativa de los datos QAF para ser utilizado como una herramienta de referencia para la interpretación de la patología de la retina 13, y también hemos descrito qaf en varios sta enfermedadtes, incluyendo la enfermedad de Stargardt 10, maculopatía en ojo de buey 12 y 11 La enfermedad de Best. En retina sana, hay diferentes niveles qaf entre los grupos étnicos, con significativamente mayor en QAF blancos que negros y los asiáticos, y ha demostrado que las mujeres tienen mayores niveles qaf que los hombres. Tal vez lo más sorprendente es que qaf aumenta a medida que la edad del paciente, que se corresponde con los niveles de lipofuscina RPE, medido previamente por espectrofluorometría 14. Aunque los datos normativa actual sólo se extiende hasta los 60 años, parece que los pacientes tienen una disminución medida en lipofuscina RPE después de los 70 los 14 años. Curiosamente, no parece que los cambios en el número de células RPE producen como pacientes de 2 años y por lo que las disminuciones observadas en AF puede ser debido a una redistribución o reducción de lipofuscina RPE 3. Será interesante determinar si estas disminuciones en la AF en la vejez se correlacionan con deterioro de la función RPE y mayor riesgo de AMD. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Este protocolo permite obtener resultados cuantitativos fiables que se pueden comparar longitudinalmente, entre los pacientes, y entre máquinas CSLO. Una limitación es que QAF no puede medir con precisión de AF en pacientes de edad avanzada con la opacidad del cristalino, lo que limita la técnica en un subgrupo de esta población de alto riesgo. Una posible solución es usar un método de reflectometría para estimar individualmente pérdidas de luz en los medios. Afortunadamente, los pacientes mayores que son pseudofáquica con cápsulas posteriores claras y características de transmisión de la lente intraocular conocidos son buenos candidatos para QAF. Sin embargo, las pupilas de los pacientes ancianos y las personas con cirugía de cataratas previa a menudo no se dilatan para más de 6 mm, lo que limita el paso de luz y evita que la recopilación de datos precisos. Con el fin de la imagen tales pacientes, una abertura puede ser insertada en el CSLO por el fabricante a fin de disminuir el diámetro del láser. Esta modificación ha sido utilizado con éxito para realizar las imágenes QAF 1 en ratones5. Otra limitación es que la técnica es difícil de realizar y es altamente dependiente del operador. Es esencial para obtener imágenes de alta calidad consistentemente para asegurar mediciones precisas de los niveles de AF. Para lograr esto, los autores recomiendan estricta adherencia al protocolo de imagen, así como la práctica adecuada. Aunque algunos pacientes toleran mal los brillantes destellos de luz requerida para obtener imágenes de la FA pacientes, asegurando que los niveles de exposición son bien dentro de los límites de seguridad es útil 1. Para permitir la proyección de imagen óptima, es fundamental para dilatar los alumnos de al menos 6 mm y obtener múltiples imágenes con la transmisión de luz sin obstrucciones (véase más arriba). El logro de un enfoque óptimo y evitar la sobresaturación de los píxeles son también esenciales. prácticas útiles incluyen comunicación con el paciente mientras que las imágenes, el uso de un asistente si el párpado tiene que ser levantado y utilizar el pedal de pie para la activación de la cámara, como se describió anteriormente. En resumen, la ONUcomprensión de la fisiopatología de la RPE en degeneraciones de la retina sigue siendo un área de investigación activa, y del impacto terapéutico potencialmente importante. Como qaf permite la comparación directa de los niveles de AF en las imágenes obtenidas en sentido longitudinal, entre pacientes y entre los centros, es una herramienta valiosa que puede contribuir a esta comprensión, así como proporcionar información clínica útil. El protocolo detallado se describe aquí ayudará a otros en la adquisición de datos qaf fiables, y que las aplicaciones clínicas importantes de QAF animará a los centros de investigación y especialistas en retina clínicos para hacer uso de la técnica de QAF.

El epitelio pigmentario de la retina (RPE) es compatible con la función de la retina sensorial a través de numerosos procesos 1. La degeneración macular asociada a la edad (DMAE) es la causa más importante de ceguera intratable en los países industrializados y se caracteriza por los cambios en el EPR, incluyendo la pérdida de pigmento, pérdida de la función y la atrofia. En AMD y en el envejecimiento normal, el RPE se acumula orgánulos fluorescentes, lisosomas derivados que contienen fragmentos fotorreceptoras fagocitados, se hace referencia como gránulos de lipofuscina. La acumulación de lipofuscina RPE ha sido pensado para indicar la disfunción oxidativa 1, pero estudios recientes han demostrado que la morfología del EPR se mantiene normal en los ojos de edad con altos niveles de lipofuscina 2. Marcadores Sin embargo, los patrones anormales de distribución de lipofuscina, en particular, la pérdida de la lipofuscina, se documentan para AMD y progresión de la DMAE, tanto histológicamente y clínicamente 3,4 proces defectuososcante de la lipofuscina RPE también se ha demostrado que se producen en ciertas degeneraciones retinianas hereditarias. Los pacientes que sufren de la enfermedad de Stargardt (STGD) acumulan lipofuscina en el EPR a una edad temprana, con el tiempo el desarrollo de la pérdida de visión similar a la observada en la DMAE 5. Estos resultados sugirieron que la acumulación de lipofuscina puede ser en sí mismo tóxico y conducir RPE disfunción 6,7. Sin embargo, un estudio de imagen detallada de los sujetos con STGD con el tiempo no confirmó que la acumulación de lipofuscina focal condujo a la pérdida de RPE posterior 8. Por lo tanto, aunque las anomalías de lipofuscina son marcadores de degeneraciones de la retina, un papel para la toxicidad directa de lipofuscina no ha sido demostrado. El RPE es la capa más posterior de la célula de retina, pero genera la mayor parte de la señal fluorescente desde el fondo de ojo. Generación y detección de la autofluorescencia (AF) derivado de la RPE se pueden realizar usando la oftalmoscopia láser confocal de barrido (CSLO), que permite la visualization de la distribución espacial de AF fondo de ojo. Ciertas degeneraciones retinianas demuestran patrones distintivos de fondo de ojo AF, AF y ayudas de formación de imágenes en el diagnóstico y seguimiento de estas condiciones. Aunque las imágenes estándar de la FA es clínicamente importante, AF cuantitativa (QAF) se ha convertido en un medio importante para evaluar la salud del EPR. Nosotros y otros han desarrollado un método estándar que se pueden determinar de forma fiable los niveles qaf en lugares específicos de la retina 9. qaf tiene aplicaciones potenciales en el diagnóstico y seguimiento de las condiciones de la retina, y también puede tener utilidad en el pronóstico y estratificación del riesgo. Además, las capacidades de diagnóstico de qaf También se han descrito para ciertos trastornos de la retina 10-12. Aquí, proporcionamos datos por etapas para llevar a cabo nuestra técnica acompañada de una demostración visual de su aplicación en la evaluación de los ojos sanos y enfermos.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="671">
	<tbody>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:243px;">Spectralis HRA + OCT</td>
			<td style="width:143px;">Heidelberg Engineering</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">0.5% tropicamide ophthalmic solution</td>
			<td style="width:143px;">n/a</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td>Any brand can be used</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">2.5% phenylephrine ophthalmic solution</td>
			<td style="width:143px;">n/a</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td>Any brand can be used</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:243px;">Internal fluorescent reference</td>
			<td style="width:143px;">Heidelberg Engineering</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">IGOR Pro software</td>
			<td style="width:143px;">WaveMetrics</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative fundus autofluorescence for the evaluation of retinal diseases

The retinal pigment epithelium (RPE) is juxtaposed to the overlying sensory retina, and supports the function of the visual system. Among the tasks performed by the RPE are phagocytosis and processing of outer photoreceptor segments through lysosome-derived organelles. These degradation products, stored and referred to as lipofuscin granules, are composed partially of bisretinoids, which have broad fluorescence absorption and emission spectra that can be detected clinically as fundus autofluorescence with confocal scanning laser ophthalmoscopy (cSLO). Lipofuscin accumulation is associated with increasing age, but is also found in various patterns in both acquired and inherited degenerative diseases of the retina. Thus, studying its pattern of accumulation and correlating such patterns with changes in the overlying sensory retina are essential to understanding the pathophysiology and progression of retinal disease. Here, we describe a technique employed by our lab and others that uses cSLO in order to quantify the level of RPE lipofuscin in both healthy and diseased eyes.

Esta técnica se utilizó para estudiar qaf en ambos sanos 13 y estados de enfermedad 10-12. En ojos sanos (Figura 1), AF emitida desde el RPE se distribuye de forma relativamente uniforme a lo largo del fondo de ojo (Figura 1A). intensidad reducida se ve en la región macular central debido al bloqueo de la luz por el pigmento macular, y en los lados y las esquinas de la imagen debido a la óptica del ojo y la cámara. Los vasos se ven oscuras y deben estar en foco claro en las imágenes así adquiridos. La Figura 1B muestra una representación correspondiente mapa de calor de los niveles qaf de la figura 1A. los colores más fríos corresponden a áreas de menor intensidad mientras que los colores más cálidos corresponden a las áreas de mayor intensidad. Intensidad máxima se ve generalmente en el segundo anillo de 8 segmentos concéntricos (indicado en la Figura 1B). Esta región también está menos sujeto a variabil relacionados con imágenesdad que las regiones más cercanas a los bordes de la imagen, y se encuentra fuera de la región central donde el pigmento mácula tiene un gran impacto en los niveles QAF. Por lo tanto, las intensidades medias de este anillo se utilizan para la mayoría de los análisis de datos 13. La Figura 2 presenta un análisis representativo en un ojo con AMD demuestra atrofia geográfica (GA), una forma avanzada de AMD. Esta forma de AMD en áreas localizadas de pérdida de RPE, evidenciado por marcadamente reducida o ausente AF, y provoca la pérdida progresiva de la visión central. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53577/53577fig1.jpg" /> Figura 1. autofluorescencia en el ojo sano. Imagen (A) autofluorescencia (AF) del ojo derecho de un paciente normal. OD: disco óptico, Fo: fóvea, Ma: mácula, Ref: referencia interna. (B) El post-procesado mapa qaf imagen de AF a partir de (A). colores más cálidos corresponden a la intensidad de AF superior. reg fijoLos iones se muestran, y los valores qaf de cada región se indican. Perifoveal anillo de 8 segmentos utilizados en el análisis de datos se indica mediante la línea discontinua. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53577/53577fig1large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53577/53577fig2.jpg" /> Figura 2. autofluorescencia en el ojo se presentan atrofia geográfica debido a la AMD. (A) autofluorescencia (AF) imagen del ojo izquierdo de un paciente con degeneración macular avanzada que muestra atrofia geográfica (GA) del RPE (región representativa circunscrita por línea de trazos). OD: disco óptico, Fo: fóvea, Ma: mácula, Ref: referencia interna. Nota marcadamente reducida y ausente de AF en las regiones correspondientes a GA en la mácula. (B) El post-procesado mapa qaf imagen de AF a partir de (A). regiones fijas se muestran, y los valores de cada región qaf unare indicado. Perifoveal anillo de 8 segmentos utilizados en el análisis de datos se indica mediante la línea discontinua. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53577/53577fig2large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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Quantitative Fundus Autofluorescence for the Evaluation of Retinal Diseases

Cuantitativa del fondo de ojo autofluorescencia para la Evaluación de Enfermedades de la Retina

The retinal pigment epithelium (RPE) supports the sensory retina through recycling visual cycle byproducts, which accumulate as lipofuscin. These products are autofluorescent and can be qualitatively imaged in vivo. Here, we describe a method to quantitatively image RPE lipofuscin using confocal scanning laser ophthalmoscopy.

The retinal pigment epithelium (RPE) is juxtaposed to the overlying sensory retina, and supports the function of the visual system. Among the tasks ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

11.3K vistas.  NYU School of Medicine. The retinal pigment epithelium (RPE) supports the sensory retina through recycling visual cycle byproducts, which accumulate as lipofuscin. These products are autofluorescent and can be qualitatively imaged in vivo. Here, we describe a method to quantitatively image RPE lipofuscin using confocal scanning laser ophthalmoscopy. 

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The Use of Primary Human Fibroblasts for Monitoring Mitochondrial Phenotypes in the Field of Parkinson's Disease

Parkinson's disease (PD) is the second most common movement disorder and affects 1% of people over the age of 60 1. Because ageing is the most important risk factor, cases of PD will increase during the next decades 2. Next to pathological protein folding and impaired protein degradation pathways, alterations of mitochondrial function and morphology were pointed out as further hallmark of neurodegeneration in PD 3-11.
After years of research in murine and human cancer cells as in vitro models to dissect molecular pathways of Parkinsonism, the use of human fibroblasts from patients and appropriate controls as ex vivo models has become a valuable research tool, if potential caveats are considered. Other than immortalized, rather artificial cell models, primary fibroblasts from patients carrying disease-associated mutations apparently reflect important pathological features of the human disease.
Here we delineate the procedure of taking skin biopsies, culturing human fibroblasts and using detailed protocols for essential microscopic techniques to define mitochondrial phenotypes. These were used to investigate different features associated with PD that are relevant to mitochondrial function and dynamics. Ex vivo, mitochondria can be analyzed in terms of their function, morphology, colocalization with lysosomes (the organelles degrading dysfunctional mitochondria) and degradation via the lysosomal pathway. These phenotypes are highly relevant for the identification of early signs of PD and may precede clinical motor symptoms in human disease-gene carriers. Hence, the assays presented here can be utilized as valuable tools to identify pathological features of neurodegeneration and help to define new therapeutic strategies in PD.

Fibroblasts from patients carrying mutations in Parkinson's disease-causing genes represent an easily accessible ex vivo model to study disease-associated phenotypes. Live cell imaging gives the opportunity to study morphological and functional parameters in living cells. Here we describe the preparation of human fibroblasts and subsequent monitoring of mitochondrial phenotypes.

El uso de fibroblastos humanos primarios para la Supervisión de fenotipos mitocondriales en el campo de la enfermedad de Parkinson

Parkinson's disease (PD) is the second most  common movement disorder and affects 1% of people over the age of 60 1. Because ageing is  the most important ...

Investigación

Medicina

Techniques for Processing Eyes Implanted with a Retinal Prosthesis for Localized Histopathological Analysis: Part 2 Epiretinal Implants with Retinal Tacks

Retinal prostheses for the treatment of certain forms of blindness are gaining traction in clinical trials around the world with commercial devices currently entering the market. In order to evaluate the safety of these devices, in preclinical studies, reliable techniques are needed. However, the hard metal components utilised in some retinal implants are not compatible with traditional histological processes, particularly in consideration for the delicate nature of the surrounding tissue. Here we describe techniques for assessing the health of the eye directly adjacent to a retinal implant secured epiretinally with a metal tack.
Retinal prostheses feature electrode arrays in contact with eye tissue. The most commonly used location for implantation is the epiretinal location (posterior chamber of the eye), where the implant is secured to the retina with a metal tack that penetrates all the layers of the eye. Previous methods have not been able to assess the proximal ocular tissue with the tack in situ, due to the inability of traditional histological techniques to cut metal objects. Consequently, it has been difficult to assess localized damage, if present, caused by tack insertion.
Therefore, we developed a technique for visualizing the tissue around a retinal tack and implant. We have modified an established technique, used for processing and visualizing hard bony tissue around a cochlear implant, for the soft delicate tissues of the eye. We orientated and embedded the fixed eye tissue, including the implant and retinal tack, in epoxy resin, to stabilise and protect the structure of the sample. Embedded samples were then ground, polished, stained, and imaged under various magnifications at incremental depths through the sample. This technique allowed the reliable assessment of eye tissue integrity and cytoarchitecture adjacent to the metal tack.

Here we describe histological techniques for visualising ocular tissue directly adjacent to a metal epiretinal tack and retinal prosthesis.

Las técnicas para Ojos Procesamiento implantados con una retina Prótesis para análisis histopatológico localizado: Parte 2 Epirretinal Implantes de retina con tachuelas

Retinal prostheses for the treatment of certain forms of blindness are gaining traction in clinical trials around the world with commercial devices ...

Automated Radiochemical Synthesis of [18F]3F4AP: A Novel PET Tracer for Imaging Demyelinating Diseases

3-[18F]fluoro-4-aminopyridine, [18F]3F4AP, is a radiofluorinated analog of the FDA-approved drug for multiple sclerosis 4-aminopyridine (4AP). This compound is currently under investigation as a PET tracer for demyelination. We recently described a novel chemical reaction to produce metafluorinated pyridines consisting of direct fluorination of a pyridine N-oxide and the utilization of this reaction for the radiochemical synthesis of [18F]3F4AP. In this article, we demonstrate how to produce this tracer using an automated synthesizer and an in-house made flow hydrogenation reactor. We also show the standard quality control procedures performed before releasing the radiotracer for preclinical animal imaging studies. This semi-automated procedure may serve as the basis for future production of [18F]3F4AP for clinical studies.

Automated Radiochemical Synthesis of [18F]3F4AP: A Novel PET Tracer for Imaging Demyelinating Diseases

We demonstrate the semi-automated radiochemical synthesis of [18F]3F4AP and quality control procedures.

Síntesis radioquímica automatizada de [<sup&gt; 18</sup&gt; F] 3F4AP: un nuevo trazador de PET para imágenes de enfermedades desmielinizantes

3-[18F]fluoro-4-aminopyridine, [18F]3F4AP, is a radiofluorinated analog of the FDA-approved drug for multiple sclerosis 4-aminopyridine (4AP). This ...

Smartphone Fundus Photography

Smartphone fundus photography is a simple technique to obtain ocular fundus pictures using a smartphone camera and a conventional handheld indirect ophthalmoscopy lens. This technique is indispensable when picture documentation of optic nerve, retina, and retinal vessels is necessary but a fundus camera is not available. The main advantage of this technique is the widespread&#160;availability of smartphones that allows documentation of macula and optic nerve changes in many settings that was not previously possible. Following the well-defined steps detailed here, such as proper alignment of the phone camera, handheld lens, and the patient&#39;s pupil, is the key for obtaining a clear retina picture with no interfering light reflections and aberrations. In this paper, the optical principles of indirect ophthalmoscopy and fundus photography will be reviewed first. Then, the step-by-step method to record a good quality retinal image using a smartphone will be explained.

Fundus photography normally requires specialized fundus cameras that are not always available in all clinical settings.&#160;Here, a simple method to record ocular fundus images using a smartphone camera and a conventional high-plus handheld indirect ophthalmoscopy lens is described.

Smartphone Fundus Fotografía

Smartphone fundus photography is a simple technique to obtain ocular fundus pictures using a smartphone camera and a conventional handheld indirect ...

Using Retinal Imaging to Study Dementia

The retina offers a unique &#8220;window&#8221; to study pathophysiological processes of dementia in the brain, as it is an extension of the central nervous system (CNS) and shares prominent similarities with the brain in terms of embryological origin, anatomical features and physiological properties.&#160; The vascular and neuronal structure in the retina can now be visualized easily and non-invasively using retinal imaging techniques, including fundus photography and optical coherence tomography (OCT), and quantified semi-automatically using computer-assisted analysis programs. Studying the associations between vascular and neuronal changes in the retina and dementia could improve our understanding of dementia and, potentially, aid in diagnosis and risk assessment.&#160; This protocol aims to describe a method of quantifying and analyzing retinal vasculature and neuronal structure, which are potentially associated with dementia. This protocol also provides examples of retinal changes in subjects with dementia, and discusses technical issues and current limitations of retinal imaging.

The retina shares prominent similarities with the brain and thus represents a unique window to study vasculature and neuronal structure in the brain non-invasively. This protocol describes a method to study dementia using retinal imaging techniques. This method can potentially aid in diagnosis and risk assessment of dementia.

Usando proyección de imagen retiniana para el estudio de la demencia

The retina offers a unique &#8220;window&#8221; to study pathophysiological processes of dementia in the brain, as it is an extension of the central ...

Invasive Hemodynamic Assessment for the Right Ventricular System and Hypoxia-Induced Pulmonary Arterial Hypertension in Mice

Pulmonary arterial hypertension (PAH) is a chronic and severe cardiopulmonary disorder. Mice are a popular animal model used to mimic this disease. However, the evaluation of right ventricular pressure (RVP) and pulmonary artery pressure (PAP) remains technically challenging in mice. RVP and PAP are more difficult to measure than left ventricular pressure because of the anatomical differences between the left and right heart systems. In this paper, we describe a stable right heart hemodynamic measurement method and its validation using healthy and PAH mice. This method is based on open-chest surgery and mechanical ventilation support. It is a complicated procedure compared to closed chest procedures. While a well-trained surgeon is required for this surgery, the advantage of this procedure is that it can generate both RVP and PAP parameters at the same time, so it is a preferable procedure for the evaluation of PAH models.

Here, we present a protocol to perform an invasive hemodynamic assessment of the right ventricle and pulmonary artery in mice using an open-chest surgery approach.

Evaluación hemodinámica invasiva para el sistema ventricular derecho y hipertensión arterial pulmonar inducida por hipoxia en ratones

Pulmonary arterial hypertension (PAH) is a chronic and severe cardiopulmonary disorder. Mice are a popular animal model used to mimic this disease. ...

Oxygen-Induced Retinopathy Model for Ischemic Retinal Diseases in Rodents

One of the commonly used models for ischemic retinopathies is the oxygen-induced retinopathy (OIR) model. Here we describe detailed protocols for the OIR model induction and its readouts in both mice and rats. Retinal neovascularization is induced in OIR by exposing rodent pups either to hyperoxia (mice) or alternating levels of hyperoxia and hypoxia (rats). The primary readouts of these models are the size of neovascular (NV) and avascular (AVA) areas in the retina. This preclinical in vivo model can be used to evaluate the efficacy of potential anti-angiogenic drugs or to address the role of specific genes in the retinal angiogenesis by using genetically manipulated animals. The model has some strain and vendor specific variation in the OIR induction which should be taken into consideration when designing the experiments.

Oxygen-induced retinopathy (OIR) can be used to model ischemic retinal diseases such as retinopathy of prematurity and proliferative diabetic retinopathy and to serve as a model for proof-of-concept studies in evaluating antiangiogenic drugs for neovascular diseases. OIR induces robust and reproducible neovascularization in the retina that can be quantified.

Modelo de retinopatía inducida por oxígeno para enfermedades retinianas isquémicas en roedores

One of the commonly used models for ischemic retinopathies is the oxygen-induced retinopathy (OIR) model. Here we describe detailed protocols for the OIR ...

Retinal Pigment Epithelium Transplantation in a Non-human Primate Model for Degenerative Retinal Diseases

Retinal pigment epithelial (RPE) transplantation holds great promise for the treatment of inherited and acquired retinal degenerative diseases. These conditions include retinitis pigmentosa (RP) and advanced forms of age-related macular degeneration (AMD), such as geographic atrophy (GA). Together, these disorders represent a significant proportion of currently untreatable blindness globally. These unmet medical needs have generated heightened academic interest in developing methods of RPE replacement. Among the animal models commonly utilized for preclinical testing of therapeutics, the non-human primate (NHP) is the only animal model that has a macula. As it shares this anatomical similarity with the human eye, the NHP eye is an important and appropriate preclinical animal model for the development of advanced therapy medicinal products (ATMPs) such as RPE cell therapy.
This manuscript describes a method for the submacular transplantation of an RPE monolayer, cultured on a polyethylene terephthalate (PET) cell carrier, underneath the macula onto a surgically created RPE wound in immunosuppressed NHPs. The fovea-the central avascular portion of the macula-is the site of the greatest mechanical weakness during the transplantation. Foveal trauma will occur if the initial subretinal fluid injection generates an excessive force on the retina. Hence, slow injection under perfluorocarbon liquid (PFCL) vitreous tamponade is recommended with a dual-bore subretinal injection cannula at low intraocular pressure (IOP) settings to create a retinal bleb. 
Pretreatment with an intravitreal plasminogen injection to release parafoveal RPE-photoreceptor adhesions is also advised. These combined strategies can reduce the likelihood of foveal tears when compared to conventional techniques. The NHP is a key animal model in the preclinical phase of RPE cell therapy development. This protocol addresses the technical challenges associated with the delivery of RPE cellular therapy in the NHP eye.

The non-human primate (NHP) is an ideal model for studying human retinal cellular therapeutics due to the anatomical and genetic similarities. This manuscript describes a method for submacular transplantation of retinal pigment epithelial cells in the NHP eye and strategies to prevent intraoperative complications associated with macular manipulation.

Trasplante de epitelio pigmentario retiniano en un modelo de primate no humano para enfermedades degenerativas de la retina

Retinal pigment epithelial (RPE) transplantation holds great promise for the treatment of inherited and acquired retinal degenerative diseases. These ...

Retinal Pathophysiological Evaluation in a Rat Model

A posterior segment eye disease like diabetic retinopathy alters the physiology of the retina. Diabetic retinopathy is characterized by a retinal detachment, breakdown of the blood-retinal barrier (BRB), and retinal angiogenesis. An in vivo rat model is a valuable experimental tool to examine the changes in the structure and function of the retina. We propose three different experimental techniques in the rat model to identify morphological changes of retinal cells, retinal vasculature, and compromised BRB. Retinal histology is used to study the morphology of various retinal cells. Also, quantitative measurement is performed by retinal cell count and thickness measurement of different retinal layers. A BRB breakdown assay is used to determine the leakage of extraocular proteins from the plasma to vitreous tissue due to the breakdown of BRB. Fluorescence angiography is used to study angiogenesis and leakage of blood vessels by visualizing retinal vasculature using FITC-dextran dye.

Diabetic retinopathy is one of the leading causes of blindness. Histology, blood-retinal barrier breakdown assay, and fluorescence angiography are valuable techniques to understand the pathophysiology of the retina, which could further enhance the efficient drug screening against diabetic retinopathy.

Evaluación fisiopatológica de la retina en un modelo de rata

A posterior segment eye disease like diabetic retinopathy alters the physiology of the retina. Diabetic retinopathy is characterized by a retinal ...

Repetitive Blood Sampling from the Subclavian Vein of Conscious Rat

Rats are widely used in pharmacokinetics (PK) and toxicokinetic (TK) studies that need to collect a certain amount of blood at specific time points to detect drug exposure. The rat blood sampling method determines the quality of the plasma and further affects the precision of the test results. The subclavian vein blood collection method described in this protocol collects blood samples repeatedly in the conscious state of animals to meet the needs of PK and TK tests. The skills of restraint handling and appropriate procedure of needle incision ensure the success rate of blood collection. It is easy to operate while ensuring the quality of plasma and at the same time catering to animal welfare. However, this method requires skilled operation, and an improper one may cause animal weakness, pain, lameness, and even mortality. The current method has been used in the testing facility for a 4-week oral toxicity study in Sprague Dawley (SD) rats with TK. The maximum amount of blood collected within 24 h did not exceed 20% of the animal's total blood. The animals' body weight was more than 200 g for males and females. The data showed that the animals' bodyweight increased steadily every week, and the clinical observation was normal after repetitive sample collection.

The present protocol describes a simple and efficient method for collecting blood from the subclavian vein in rats. It enables rapid, timely, and easily identifiable sampling without anesthesia and obtains high-quality blood through repetitive sample collection.

Muestreo repetitivo de sangre de la vena subclavia de rata consciente

Rats are widely used in pharmacokinetics (PK) and toxicokinetic (TK) studies that need to collect a certain amount of blood at specific time points to ...