This study was supported by the Swiss National Foundation (n&#176; 3100AO-120327 and 31003A_140754/1)

Cuidado de los animales estaba en conformidad con las directrices aprobadas por las autoridades locales suizos (Amt für Landwirtschaft und Natur des Kantons Berna, Veterinärdienst, Sekretariat Tierversuche, rupias de aprobación. 52/11 y 35/14). Estas directrices están de acuerdo con la Directiva de la Comunidad Europea 2010/63 / UE. Nota: El trabajo en una campana de flujo laminar con instrumentos y soluciones estériles para todos los pasos 1 - 5 incluyendo sub-etapas. 1. Preparación de los AMUMA Nota: AAM están compuestos de un sustrato de vidrio, electrodos micro-fabricados de metal y una capa de aislamiento de polímero SU-8 (también ver Tscherter et al 3.). Para el propósito de este estudio, los AMA disponibles comercialmente fueron ordenados con un diseño de matriz de electrodos a medida (Figura 1 A &amp; B). Los electrodos 68 están dispuestos en una cuadrícula rectangular que se divide en dos zonas por una ranura ancha 300 micras libre de electrodos, electrcables y aislamientos iCal. Cada electrodo es 40 x 40 m de tamaño y están separados por 200 m de centro a centro. Cuatro grandes electrodos de tierra se colocan alrededor del lugar de grabación. Se diferencian de otros acuerdos ambientales multilaterales estándar disponibles en el mercado en su tamaño (21 mm x 21 mm) y no tienen cámara de registro fijo. <ol><li> Para la desinfección MEAs de enjuague en etanol al 100% (2x), etanol al 70% (1x) y agua destilada (2x) durante al menos 30 segundos cada uno. Deje que se seque. Ponga 10 - 12 AMUMA en una placa de Petri de vidrio limpio (150 mm x 25 mm) y cierre la tapa. </li><li> AAM autoclave durante 20 minutos a 120 ° C. Guarde a temperatura ambiente. </li><li> Preparar la solución de revestimiento (véase la lista de materiales) para los AMUMA y almacenar alícuotas a -20 ° C. </li><li> Ponga cada MEA en una placa de Petri estériles individuales (35 mm x 10 mm). </li><li> Utilizar una pipeta enfriada para poner 150 l solución de revestimiento refrigerado en la parte superior de los electrodos y cierre la tapa de la placa de Petri. Después de unos 10 minutos, compruebe si hay burbujas de aire en la parte superiorlos electrodos y retire suavemente con una espátula de goma cubierta si es necesario. Deje reposar durante 1 hora a temperatura ambiente. </li><li> Aspirar residuos de la solución de revestimiento, se lavan 1x con medio optimizado para prenatal y neuronas embrionarias y 2 veces con agua destilada estéril. Si AMUMA no se utilizan hasta el día siguiente, mantenerlos en agua destilada estéril a 37 ° C en la incubadora O / N. De lo contrario, vamos directamente seca a temperatura ambiente. </li></ol> 2. Los ingredientes necesarios para la preparación y el crecimiento de las Culturas organotípicos <ol><li> Prepare la solución de lavado libre de calcio (ver lista de materiales). </li><li> Reconstituir plasma pollo en solución de lavado (1: 1, agite suavemente, evitar la formación de burbujas), centrifugar a 3000 xg durante unos 20 minutos y decantar el contenido claro en un tubo estéril. Alícuota 200 l en criotubos y almacenar a -20 ° C. </li><li> Reconstituir trombina a partir de plasma bovino en consecuencia (200 U / ml) y-filtro estéril (filtro de 0,2 micras de poro). Alícuotas de 200 l en crytotubes y almacenar a -20 ° C. </li><li> Durante 30 culturas preparar 100 ml de medio nutritivo (véase la lista de materiales). </li></ol> 3. Médula Espinal Tissue Disección Nota: los rendimientos de procedimiento, en función del número de embriones, rebanadas de la médula espinal durante unos 25 - 35 co-cultivos y se prepara dentro de una campana de flujo laminar en condiciones estériles. <ol><li> Aplicar una dosis letal de pentobarbital (0,4 ml) al animal madre por inyección intramuscular. Confirme anestesia profunda comprobando el reflejo de retirada pedal. Entregar embriones de rata E14 por cesárea y el sacrificio por decapitación. </li><li> La transferencia de los cuerpos de los embriones en una placa de Petri llena de solución estéril, refrigerada, lavado. </li><li> Realizar un corte transversal completo con un bisturí por encima de las extremidades posteriores y otro por encima de las extremidades anteriores y quitar las extremidades del cuerpo. A continuación, hacer un corte en el plano frontal para separar las vísceras de la pieza de la espalda que contiene el co médulard. </li><li> Para el corte en lonchas, transferir las piezas de la espalda que contienen la médula espinal de una en una en un disco de montaje y cortar con un espesor de 225 - 250 micras con un cortador de tejidos. Ponga una gota de solución de lavado en el tejido picado y transferir las rebanadas con una espátula en x 10 mm placas de Petri llenas de solución estéril, refrigerada, lavado de 35 mm. </li><li> Para cada sector por separado, diseccionar la médula espinal lejos de tejido restante. Deja ganglios de la raíz dorsal adjunto. </li><li> Deje que las rodajas de descansar durante 1 hora a 4 ° C. </li></ol> 4. Montaje espinales Rebanadas tejido del cordón en los AMUMA <ol><li> Calentar medio nutritivo estéril en la incubadora (37 ° C, ligeramente desenroscar la tapa de oxigenación). </li><li> Posición MEA con pinzas estériles con puntas de goma cubierta a TA en la placa de Petri con un microscopio estéreo con la matriz de electrodos en el enfoque. Centrar una gotita de 6 l de plasma de pollo en la matriz de electrodos limpio, libre de polvo, y estéril. Usando una pequeña espátula, deslice cuidadosamentedos secciones de la médula espinal con los lados ventrales uno frente al otro en la gotita de plasma. No toque los electrodos con la espátula. </li><li> Añadir 8 l de trombina alrededor de la gotita de plasma de pollo. Con la punta de la pipeta de la trombina, mezclar y extender la mezcla de pollo de plasma / trombina en torno a las dos rebanadas cuidadosamente. Una vez más, no toque la matriz de electrodos quebradizos directamente. Justo antes de la coagulación, aspirar el exceso de pollo de plasma / trombina. </li><li> Tapar la placa de Petri para retener la humedad alta, mientras que el conjunto de MEA / cultura se sienta durante aproximadamente 1 hora en una cámara húmeda dentro de la incubadora a 37 ° C. </li><li> Añadir con cuidado 10 l de medio nutriente a la cámara de cultivo, tapar la placa de Petri y poner de nuevo en la incubadora durante aproximadamente 30 minutos. </li><li> Coloque cada conjunto MEA / cultura con puntas estériles, cubiertas de goma en un tubo de rodillo, añadir 3 ml de medio nutritivo y cerrar herméticamente la tapa. Colocar el tubo del rodillo en el tambor rodillo giratorio con un 1 - 2 rpm en la incubadora en un 5% CO <sub&gt; 2 ambiente -Con a 37 ° C. </li><li> Cambie la mitad del medio de nutrientes después de 7 días in vitro (DIV) y después de 1 - 2 veces por semana. </li></ol> 5. Las lesiones mecánicas <ol><li> Tome la asamblea MEA / cultura con puntas estériles, de goma cubierta fuera del tubo del rodillo y colocar en una placa de Petri sin medio nutritivo bajo un microscopio estereoscópico con el tejido en el enfoque. Verifique visualmente que las dos rebanadas se fusionan. </li><li> Sostenga el MEA / cultura ensamblaje constante mediante la colocación de las pinzas con puntas de goma cubierta de la MEA. </li><li> Colocar una hoja de bisturí en la ranura de la MEA cerca de los cortes de tejido. Mantenga el bisturí en lugar horizontalmente. </li><li> Levante el bisturí manejar hasta pero dejó que la hoja de bisturí permanecer en la ranura de la MEA de tal manera que la hoja &quot;rollos&quot; de base hasta la punta y con ello corta a través del tejido que cubre la ranura. </li><li> Severas cualquier conexión de tejidos residuales con una punta de 25 G aguja si necessary. Trabajar sólo en el área dentro de la ranura y no toque los bordes de licitación. </li><li> Coloque el ensamblaje MEA / cultura en el tubo del rodillo. Proporcionar 3 ml de medio nutritivo fresco a las culturas y colocarlos de nuevo en el tambor del rodillo en la incubadora. </li></ol> 6. Registros electrofisiológicos de la actividad espontánea <ol><li> Para investigar la regeneración funcional entre las dos rebanadas de la médula espinal después del número elegido de DIV, montar el conjunto MEA / cultura en una cámara de registro en un microscopio y aplicar unos 500 solución extracelular l (véase la lista de materiales). </li><li> Esperar 10 min antes de la primera grabación para permitir que el sistema se estabilice. </li><li> Grabar 2x básicos de actividad espontánea de unos 10 minutos de cada actividad de detección de electrodo de la MEA a RT. </li><li> Para asegurar condiciones extracelulares estables, intercambiar solución extracelular después de cada sesión de grabación. </li><li> Para desinhibir la red, aplique la solución extracelular containing estricnina (1 M) y gabazine (10 mM). Espere al menos 2 minutos antes de comenzar la grabación. </li></ol> Análisis 7. Datos Nota: Para la detección de los potenciales de acción extracelularmente grabadas utilizar para cada electrodo de un detector basado en las desviaciones estándar y un discriminador subsiguiente. Este procedimiento se describe en detalle en Tscherter et al. 3. <ol><li> Visualizar la actividad neuronal detectado de cada electrodo en una parcela de trama de acuerdo con procedimientos estándar 3 (Figura 1f). </li><li> Determinar y visualizar la actividad de la red total para cada rebanada sumando el número de eventos en los canales de acuerdo dentro de una ventana deslizante de 10 ms, desplazado por los pasos de 1 ms (Figura 1G y ver Tscherter et al. 3). </li><li> Detectar en cada rebanada ráfagas individuales (clusters de actividad que aparecen en varios electrodos). Por lo tanto, Establecer un umbral mínimo de actividad máxima en el correspondiente actividad total de la red y definir cada inicio de ráfaga y al final estallar. Por ejemplo, un umbral adecuado es 25% de la amplitud media de rotura y de inicio de ráfaga puede ser definido por ser el primer evento en una ventana de tiempo de al menos 5 mseg, un extremo estallar por ser el último evento en una ventana de tiempo de al menos de 25 ms (véase Heidemann et al. 10). </li><li> Para cuantificar la regeneración funcional calcular el porcentaje de explosiones sincronizadas entre las dos rebanadas. Para ello, el cálculo de la latencia entre una explosión en uno de los sectores y la siguiente explosión en la otra rebanada. Nota: Un par de ráfaga se denomina &quot;sincronizado&quot; cuando la latencia es menor que la longitud media de ráfaga. Especialmente en co-cultivos con mucha actividad, existe la posibilidad de que ambas partes inicien casualmente una explosión en la ventana de latencia elegido. Este hecho ha de tenerse en cuenta en la cuantificación del porcentaje de syexplosiones nchronized. Para una descripción detallada de los cálculos ver Heidemann et al. 10. </li></ol> 8. Fijación de las Culturas y la inmunohistoquímica <ol><li> Para todas las medidas que incluyen el lavado o la incubación asegúrese de poner las culturas en una mesa basculante para garantizar la difusión adecuada de la solución a través del tejido. </li><li> Inmediatamente después de la sesión de grabación se termina tome la asamblea MEA / cultura fuera de la instalación, lo puso en una placa de Petri (35 mm x 10 mm) y añadir unos 2 ml de solución extracelular. </li><li> Para separar las rodajas de las capas de células que rodean que se han formado durante el tiempo in vitro, tener una punta de pipeta 10 l y el círculo de las rebanadas. Preste atención a no dañar los cultivos. Es posible omitir este paso, pero la incorporación de más adelante es más fácil cuando se realiza. </li><li> Use una aguja delgada jeringa no metálico (ver materiales de lista) en combinación con una jeringa de 1 ml lleno de soluti extracelulara soplar suavemente la cultura de la MEA. </li><li> Retire la punta de una pipeta Pasteur y adaptarse a la pera de goma en el extremo slivered. Use la parte de atrás de transferir la cultura en fijador (4% de paraformaldehído con tampón fosfato salino (PBS, 0,1 M)). No utilice la punta estándar de la pipeta Pasteur para la transferencia, ya que es demasiado pequeño y las culturas se pliega y probablemente dañado. Arreglo para el 1 - 2 horas a 4 ° C. Enjuague el MEA con agua destilada y eliminar los residuos de tejido con los dedos, pero no rayar con la uña. AAM Tienda en agua destilada a 4 ° C. </li><li> Lávese las culturas 3x en PBS durante al menos 10 minutos cada uno. Almacenar en PBS a 4 ° C o iniciar directamente con el procedimiento de tinción. </li><li> Incubar los cultivos durante al menos 90 min en solución de bloqueo (5% de suero de cabra, 1% de albúmina de suero bovino, detergente 0,3% en PBS). </li><li> Añadir el primer anticuerpo diluido en solución de bloqueo y se incuba durante 3 noches en el 4 ° C. </li><li> Lave 3x en PBS durante al leste 30 min cada uno. </li><li> Añadir el segundo anticuerpo diluido en PBS durante 2 horas a RT. </li><li> Lavar 3x en PBS durante al menos 30 min cada uno. </li><li> Transfiera las rebanadas con una pipeta Pasteur con punta eliminado en un portaobjetos. Retire el exceso de PBS y embeber con medio de montaje. </li></ol>

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	<li>Avossa, D., Rosato&#8211;Siri, M., Mazzarol, F., Ballerini, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinal+circuits+formation:+a+study+of+developmentally+regulated+markers+in+organotypic+cultures+of+embryonic+mouse+spinal+cord.">Spinal circuits formation: a study of developmentally regulated markers in organotypic cultures of embryonic mouse spinal cord.</a> Neuroscience. 122 (2), 391-405 (2003).</li><li>Cifra, A., Mazzone, G. L., Nani, F., Nistri, A., Mladinic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postnatal+developmental+profile+of+neurons+and+glia+in+motor+nuclei+of+the+brainstem+and+spinal+cord,+and+its+comparison+with+organotypic+slice+cultures.">Postnatal developmental profile of neurons and glia in motor nuclei of the brainstem and spinal cord, and its comparison with organotypic slice cultures.</a> Dev Neurobiol. 72 (8), 1140-1160 (2012).</li><li>Tscherter, A., Heuschkel, M. O., Renaud, P., Streit, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+characterization+of+rhythmic+activity+in+rat+spinal+cord+slice+cultures.">Spatiotemporal characterization of rhythmic activity in rat spinal cord slice cultures.</a> Eur. J. Neurosci. 14 (2), 179-190 (2001).</li><li>Czarnecki, A., Magloire, V., Streit, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+oscillations+of+spiking+activity+in+organotypic+spinal+cord+slice+cultures.">Local oscillations of spiking activity in organotypic spinal cord slice cultures.</a> Eur. J. Neurosci. 27 (8), 2076-2088 (2008).</li><li>Kirkby, L. A., Sack, G. S., Firl, A., Feller, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+correlated+spontaneous+activity+in+the+assembly+of+neural+circuits.">A role for correlated spontaneous activity in the assembly of neural circuits.</a> Neuron. 80 (5), 1129-1144 (2013).</li><li>Ballerini, L., Galante, M., Grandolfo, M., Nistri, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+rhythmic+patterns+of+activity+by+ventral+interneurones+in+rat+organotypic+spinal+slice+culture.">Generation of rhythmic patterns of activity by ventral interneurones in rat organotypic spinal slice culture.</a> J. Physiol. (Lond.). 517 ((Pt 2)), 459-475 (1999).</li><li>Hanson, M. G., Landmesser, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normal+patterns+of+spontaneous+activity+are+required+for+correct+motor+axon+guidance+and+the+expression+of+specific+guidance+molecules).">Normal patterns of spontaneous activity are required for correct motor axon guidance and the expression of specific guidance molecules).</a> Neuron. 43 (5), 687-701 (2004).</li><li>Courtine, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recovery+of+supraspinal+control+of+stepping+via+indirect+propriospinal+relay+connections+after+spinal+cord+injury.">Recovery of supraspinal control of stepping via indirect propriospinal relay connections after spinal cord injury.</a> Nat. Med. 14 (1), 69-74 (2008).</li><li>Bonnici, B., Kapfhammer, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+regeneration+of+intrinsic+spinal+cord+axons+in+a+novel+spinal+cord+slice+culture+model.">Spontaneous regeneration of intrinsic spinal cord axons in a novel spinal cord slice culture model.</a> Eur. J. Neurosci. 27 (10), 2483-2492 (2008).</li><li>Heidemann, M., Streit, J., Tscherter, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+regeneration+of+intraspinal+connections+in+a+new+in+vitro+model.">Functional regeneration of intraspinal connections in a new in vitro model.</a> Neuroscience. 262, 40-52 (2014).</li><li>Nishimaru, H., Restrepo, C. E., Ryge, J., Yanagawa, Y., Kiehn, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+motor+neurons+corelease+glutamate+and+acetylcholine+at+central+synapses.">Mammalian motor neurons corelease glutamate and acetylcholine at central synapses.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102 (14), 5245-5249 (2005).</li><li>Tsuji, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteasome+inhibition+induces+selective+motor+neuron+death+in+organotypic+slice+cultures.">Proteasome inhibition induces selective motor neuron death in organotypic slice cultures.</a> J. Neurosci. Res. 82 (4), 443-451 (2005).</li><li>Magloire, V., Streit, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+activity+and+positive+feedback+in+motor+circuits+in+organotypic+spinal+cord+slice+cultures.">Intrinsic activity and positive feedback in motor circuits in organotypic spinal cord slice cultures.</a> Eur. J. Neurosci. 30 (8), 1487-1497 (2009).</li><li>Bahrami, F., Janahmadi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibiotic+supplements+affect+electrophysiological+properties+and+excitability+of+rat+hippocampal+pyramidal+neurons+in+primary+culture.">Antibiotic supplements affect electrophysiological properties and excitability of rat hippocampal pyramidal neurons in primary culture.</a> Iran. Biomed J. 17 (2), 101-106 (2013).</li><li>Mentis, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noncholinergic+excitatory+actions+of+motoneurons+in+the+neonatal+mammalian+spinal+cord.">Noncholinergic excitatory actions of motoneurons in the neonatal mammalian spinal cord.</a> Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A.. 20 (102), 7344-7349 (2005).</li><li>Tsang, Y. M., Chiong, F., Kuznetsov, D., Kasarskis, E., Geula, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motor+neurons+are+rich+in+non&#8211;phosphorylated+neurofilaments:+Cross&#8211;+species+comparison+and+alterations+in+ALS.">Motor neurons are rich in non&#8211;phosphorylated neurofilaments: Cross&#8211; species comparison and alterations in ALS.</a> Brain Res. 861 (45&#8211;58), (2000).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Varios elementos en el procedimiento presentado son fundamentales para la realización de experimentos precisos y reproducibles. Todas las etapas durante la preparación de los AMMA, soluciones y la producción de los cultivos de cortes se realizan bajo condiciones estériles en una campana de flujo laminar. Los antibióticos no se aplican al medio nutriente, ya que pueden afectar a la actividad espontánea 14. Durante el recubrimiento MEA, la parte más importante es asegurarse de que la solución de gel de matriz extracelular se mantiene fría en todo momento. Descongelar en la nevera y mantenerlo en hielo durante todo el procedimiento para asegurar una temperatura máxima cercana a 0 ° C. Durante la preparación de la rebanadas aislamiento rápido y seccionamiento, así como prestar atención a una baja temperatura mediante el uso de hielo buffers de disección en frío aumenta el porcentaje de cultivos sanos. Por otra parte, el plasma / trombina coagulación es uno de los pasos más críticos. En primer lugar, asegúrese de que el plasma es propiamente mixed con la trombina. En segundo lugar, prestar especial atención a la eliminación de la mayor cantidad de residuos posible para asegurar la fijación correcta de los cortes a los acuerdos ambientales multilaterales. Este paso es muy sensible al tiempo; si el plazo es demasiado corto, demasiado de la mezcla de plasma / trombina se retira. Si el marco de tiempo es demasiado largo, la coagulación ya ha ocurrido, aumentando el riesgo de la eliminación de las rodajas junto con el plasma residual / trombina. Si se han previsto las lesiones mecánicas, es importante utilizar MEAs con un diseño preciso. La zona donde se pretende la lesión tiene que estar libre de electrodos, cables y aislamiento. De lo contrario, el sistema eléctrico de la MEA van a ser dañado y por lo tanto, no hay grabaciones se pueden realizar más. Otro paso crucial se refiere el tamaño de la lesión. Se ha demostrado previamente que volver a conectar dos rebanadas jóvenes después de la lesión toma alrededor de dos día 10. Para todos los experimentos, se utilizó la regla de oro que el betwe espacioen las rodajas después de la lesión no debe ser más grande que la anchura de la ranura MEA (300 micras). Un tamaño de la lesión más grande podría dar lugar a un plazo más largo para la reconexión o, si la lesión es demasiado grande, sin reconexión en absoluto. Para anotar, ex experimentos revelaron que una colocación inicial de las dos rebanadas más lejos que los resultados de 1 mm en una velocidad de conexión muy bajo. Antes del inicio de las grabaciones, un tiempo de ajuste de al menos 10 min a RT, en lugar de 37 ° C de la incubadora, y a la solución extracelular, en lugar del medio de nutrición se recomienda. Cerrar la observación del patrón de actividad durante estos minutos iniciales se asegura de que los datos medidos representan el patrón de estallido de la cultura apropiadamente después de que se inició la grabación. Para la detección de la actividad, adquisición de datos y procesamiento adicional, hardware casera (cámara de grabación, las conexiones a los amplificadores y amplificadores), los programas en LabVISTA, se utilizan C ++ y IgorPro. Configuraciones MEA comerciales y otros paquetes de software son adecuados también para estas operaciones. Aquí, las señales vistas por los electrodos se amplifican 1001 veces y, a continuación, digitalizaron a una velocidad de 6 kHz. El modelo presentado puede ser una herramienta útil para examinar las conexiones propioespinal porque in vivo, que son difíciles de estudiar sin la interferencia de ascenso y descenso tractos de fibras. El co-cultivo de dos rebanadas de la médula espinal puede eludir elegantemente este problema. Los cultivos proporcionan un microambiente que puede ser estrechamente controlada y manipulada fácilmente. Por otro lado, la entrada sensorial y supraespinal es, por supuesto faltante. Además, el proceso de la preparación de cultivo representa una situación de daño en el SNC. Las células gliales como astrocitos y microglia son conocidos para responder a lesiones con aumento de la proliferación y, por tanto, el tejido es hasta cierto punto reorganizado. En relación con el modo presentadol la formación de una cicatriz glial después de realizar las lesiones mecánicas no se observó. Una explicación podría ser que los mecanismos de adaptación de los astrocitos que ya se activaron durante el proceso de preparación y que las lesiones de las culturas no dio lugar a una respuesta aún más. Además, no hay pruebas de la participación de los inhibidores de mielina asociados, por ejemplo., Nogo-A, en el bajo potencial de regeneración de las culturas lesionadas a una edad avanzada. Sin embargo, se demostró que el tratamiento con el inhibidor de la fosfodiesterasa 4 Rolipram, empezando directamente después de la realización de las lesiones a los 23 DIV aumenta la regeneración funcional entre las lonchas 10. Estos resultados demuestran que la recuperación funcional se puede aumentar en las culturas antiguas. Notablemente, al contar el número de axones que cruzan el sitio de la lesión, se descubrió ninguna diferencia entre las culturas lesionadas a una edad temprana y culturas lesionadas a una edad avanzada. Estos hallazgos sugieren que la falta de regeneración axonal no es la razón principal fo la pérdida de la recuperación después de las lesiones tardías en la cultura y, por tanto, hacen hincapié en la necesidad de un modelo que permite el análisis funcional de la regeneración. Formación sináptica y la plasticidad sináptica podrían desempeñar un papel importante en el proceso de recuperación 10. Estos mecanismos ganaron mucha atención durante los últimos años y hoy en día es ampliamente aceptado que tienen un impacto importante en el resultado después de la lesión de la médula espinal. Por lo tanto, un modelo que proporciona condiciones estables para investigar estos procesos en aislamiento y en gran detalle sin duda puede ayudar a obtener una visión acerca de la regeneración funcional en la médula espinal.

Cultivos de cortes organotípicos del sistema nervioso central (SNC) se han utilizado ampliamente para estudiar diversos fenómenos fisiológicos y patológicos que llegan desde el desarrollo neuronal a la neurodegeneración. En comparación con los cultivos de células disociadas, rebanadas organotípicos ofrecen la ventaja de una mayor complejidad con una citoarquitectura intacto y circuitos sinápticos local. Al mismo tiempo, el tejido puede ser analizada de forma aislada sin la necesidad de implicar a la complejidad de la totalidad en contexto vivo. Por otra parte, el acceso fácil y repetida a las células de elección se justifica, el medio extracelular se puede controlar con precisión y por lo general, los modelos in vitro son menos costosos que sus homólogos en vivo. En los últimos años, diversos estudios presentan similitudes sorprendentes entre los perfiles de desarrollo de los cultivos a largo plazo en comparación con los animales correspondientes viven 1,2. Se ha demostrado que los circuitos neuronales del CNS diferentes regions expresan actividad de la red espontánea durante el desarrollo y que las rebanadas organotípicos mantienen parcialmente este fenómeno 3 -7. Preparaciones aisladas de la médula espinal se han utilizado particularmente para investigar la generación de ritmo 6 y la formación de circuitos neuronales 1. Una manera de registrar la actividad espontánea de las rebanadas organotípicos es a la cultura en la parte superior de las matrices multi-electrodo (MEA). Estos dispositivos contienen múltiples electrodos que pueden monitorear los potenciales extracelulares generados por potenciales de acción de numerosas células de forma simultánea (grabación multi-unidad). La alta resolución temporal de las grabaciones de MEA se puede utilizar para reconstruir la dinámica de actividad precisas dentro de un circuito neuronal dado. Además, en contraste con parche de sujeción de la técnica es no invasiva, que permite mediciones y resultados a largo plazo en el hecho de que las neuronas no se ven afectados en su comportamiento. Fo el propósito de este estudio, se utilizó la combinación de la médula espinal co-cultivos organotípicos y grabaciones de múltiples sitios para investigar la regeneración funcional dentro de la médula espinal. Desde adultos vertebrados superiores han potencial para recuperarse del daño de la médula espinal limitado, diferentes estrategias han sido estudiados para promover la regeneración después de lesión de la médula espinal. Hasta el momento, el tracto corticoespinal ha sido por lo general el modelo de sistema de elección para este tipo de investigaciones. Estos experimentos son típicamente mucho tiempo, costoso y requieren grandes cohortes de animales debido a la alta variabilidad dentro de los grupos individuales. Por otra parte, la evidencia sugiere que las conexiones propioespinal (neuronas que están limitados en su totalidad dentro de la médula espinal) pueden jugar un papel fundamental en el proceso de recuperación después de las lesiones de la médula espinal 8. Estas fibras son difíciles de estudiar in vivo sin la interferencia de ascenso y descenso tractos de fibras. Bonnici y Kapfhammer 9 utilizan longitudinal de la médula espinalcultivos de cortes de ratones postnatales como un enfoque alternativo. Después de realizar las lesiones mecánicas analizaron semi-cuantitativamente la regeneración de los axones morfológica entre los segmentos de la médula espinal. Observaron menos pero no axones ninguno que cruzan el sitio de la lesión en las culturas de corte a una edad madura. En contraste, las culturas que fueron lesionadas en una etapa más joven muestran una alta cantidad de regeneración axonal 5 - 7 días después de los daños. Sin embargo, no se presentó prueba para las conexiones funcionales. Por lo tanto, el desarrollo de un representante en el modelo in vitro de fibras propioespinal que permite la investigación de la regeneración funcional puede ser una herramienta valiosa para ampliar nuestros conocimientos acerca de los procesos regenerativos en la médula espinal.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Planar multielectrode array</td>
			<td>Qwane Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>custom-made according to the design of our lab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nutrient medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For 100 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbeccos modified Eagle&#39;s medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31966-021</td>
			<td>80 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>26050-070</td>
			<td>10 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>distilled, sterile water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10 ml&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nerve growth factor-7S [5ng/mL]</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N0513</td>
			<td>200 &#181;l</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>reconstituted in wash solution with 1% BSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coating solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extracellular matrix gel</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>356230</td>
			<td>Must stay cold at all times; dilute 1:50 with medium optimized for prenatal and embryonic neurons</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>medium optimized for prenatal and embryonic neurons</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>[mg/L]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2-6H2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td align="right">100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4-7H2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td align="right">100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td align="right">400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td align="right">60</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td align="right">8000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4 anhydrous</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td align="right">48</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose (Dextrose)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td align="right">1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>According to the protocol on http://www.lifetechnologies.com/ch/en/home/technical-resources/media-formulation.152.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extracellular solution (pH 7.4)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>[mM]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>145</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na-pyruvate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking Solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Detergent: Triton X-100</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.3%, harmful if swallowed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9418</td>
			<td>1%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16210-064</td>
			<td align="right">5%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken Plasma</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2366</td>
			<td>Lyophilized, reconstitute with wash solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gabazine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SR-95531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mecamylamine hydrochloride</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>2843</td>
			<td>toxic if swallowed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette</td>
			<td>World Precision Instruments, Inc.</td>
			<td>MF28G-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>harmful, 4%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMI-31</td>
			<td>Covance</td>
			<td>SMI-31P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMI-32</td>
			<td>Covance</td>
			<td>SMI-32R-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strychnine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0532</td>
			<td>toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thrombin</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>1123740001</td>
			<td>irritant, sensitizing, reconstitute with wash solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture flat tube 10 (= roller tube)</td>
			<td>Techno Plastic Products AG</td>
			<td>91243</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

investigating functional regeneration in organotypic spinal cord co-cultures grown on multi-electrode arrays

Adult higher vertebrates have a limited potential to recover from spinal cord injury. Recently, evidence emerged that propriospinal connections are a promising target for intervention to improve functional regeneration. So far, no in vitro model exists that grants the possibility to examine functional recovery of propriospinal fibers. Therefore, a representative model that is based on two organotypic spinal cord sections of embryonic rat, cultured next to each other on multi-electrode arrays (MEAs) was developed. These slices grow and, within a few days in vitro, fuse along the sides facing each other. The design of the used MEAs permits the performance of lesions with a scalpel blade through this fusion site without inflicting damage on the MEAs. The slices show spontaneous activity, usually organized in network activity bursts, and spatial and temporal activity parameters such as the location of burst origins, speed and direction of their propagation and latencies between bursts can be characterized. Using these features, it is also possible to assess functional connection of the slices by calculating the amount of synchronized bursts between the two sides. Furthermore, the slices can be morphologically analyzed by performing immunohistochemical stainings after the recordings. 
Several advantages of the used techniques are combined in this model: the slices largely preserve the original tissue architecture with intact local synaptic circuitry, the tissue is easily and repeatedly accessible and neuronal activity can be detected simultaneously and non-invasively in a large number of spots at high temporal resolution. These features allow the investigation of functional regeneration of intraspinal connections in isolation in vitro in a sophisticated and efficient way.

Para investigar el potencial de la recuperación funcional de los co-cultivos derivados de la médula espinal de embriones de rata E14, las lesiones se realizaron en una ventana de tiempo de 8 a 28 DIV. 2 a 3 semanas más tarde, la actividad neuronal espontánea fue grabado con los acuerdos ambientales multilaterales (Figura 1 C y D). Los potenciales de acción extracelular registrados fueron identificados sin conexión para cada electrodo individual (Figura 1E). A partir de estos datos se generaron parcelas de trama (Figura 1F), seguido por parcelas actividad de la red para visualizar la actividad total por separado por cada lado (Figura 1G). En cada sector de la actividad espontánea se organiza generalmente en ráfagas. Si las rodajas están conectados funcionalmente, estas ráfagas se pueden propagar a partir de una rebanada a la otra. Por lo tanto, se calculó la cantidad de ráfagas sincronizadas entre las dos rebanadas para medir cuantitativamente la regeneración funcional. Para una descripción detallada de cómo el int transformacióno las diferentes parcelas se realiza y cómo se deriva la fórmula para calcular el porcentaje de actividad sincronizada, consulte Heidemann et al. 10. En todos los experimentos, la actividad se registró primero bajo condiciones estándar. En un segundo paso, la inhibición sináptica se bloqueó mediante la adición de estricnina (1 M) y gabazine (10 mM) a la solución del baño extracelular. Esta desinhibición conduce por lo general a un patrón de actividad más regular con ráfagas prolongados y los intervalos de ráfaga, lo cual facilita la definición de ráfagas y por lo tanto la determinación de la sincronización de la ráfaga entre las rebanadas. Culturas lesionadas a una edad temprana (7-9 DIV) muestran una alta cantidad de actividad sincronizada 2-3 semanas después de la lesión mientras que los cultivos lesionaron en etapas posteriores (&gt; 19 DIV) mostraron una clara reducción en la capacidad de regenerarse (Figura 2 A - F). Estos hallazgos indican que la capacidad de regeneraciónde conexiones funcionales en cultivos de corte de la médula espinal disminuye desde un nivel alto, que representa el estado embrionario in vivo, a un nivel bajo, que representa el estado más desarrollado in vivo, dentro de tres semanas en la cultura. ¿Qué tipos de conexiones son en realidad participan en la sincronización de estallar entre las dos rebanadas? Además de las conexiones propioespinal, las fibras también podrían surgir de las motoneuronas o dorsal neuronas ganglionares de la raíz. Se ha demostrado previamente que las neuronas del ganglio de la raíz dorsal no son relevantes para la conectividad funcional entre la médula espinal 10 rebanadas. Sin embargo, la implicación de las neuronas motoras se mantuvo una posibilidad. Desde motoneuronas son conocidos para formar conexiones colinérgicas a las neuronas de la médula espinal a través de los receptores nicotínicos de 13, la actividad de la médula co-cultivos espinales se registró a 8 DIV, un momento en que los cultivos muestran una actividad de 10 altamente sincronizados, y el antagonista nicotínico Mecamilamina (MEC, 100 mM) se añadió a la solución del baño extracelular. A la participación de las motoneuronas en la conexión entre las dos rebanadas daría lugar a una disminución en el porcentaje de la actividad sincronizada. Sin embargo, este no fue el caso (MEC: 91,0 ± 4,5%, n = 7; de control: 93,6 ± 4,6%, n = 7, p&gt; 0,05, Wilcoxon prueba de pares). Estos resultados sugieren que las sinapsis colinérgicas no contribuyen a la conexión funcional entre las rebanadas. Sin embargo, ya que también se ha demostrado que las neuronas motoras a la liberación de glutamato en las sinapsis en el SNC 11, 15, estos experimentos no excluyen por completo su participación. Para identificar las motoneuronas coloraciones de inmunohistoquímica contra el neurofilamento no fosforilada H con se realizaron SMI-32. Revelaron varios cuerpos etiquetados grandes célula típica para las motoneuronas, distribuidos sobre las rebanadas (Figura 3A). El anticuerpo SMI-32 ha sido reportado para etiquetar los cuerpos celulares de motoneurons 12 y este hallazgo sostiene también cierto para los cultivos utilizados 13. También, tinciones de cuerpos celulares neuronales en general, por ejemplo, contra b-III-tubulina o NeuN, así como cuerpos de las células gliales, por ejemplo., Astrocitos con anticuerpos GFAP están en línea con otros informes y coinciden con las descripciones morfológicas de estos tipos de células ( Figura 3 B - D). Sin embargo, el etiquetado de los axones con el anticuerpo SMI-32 es preocupante (Figura 3E). Contra las expectativas, una enorme red de fibras aparece al utilizar este anticuerpo y parece similar a la tinción SMI-31 que etiqueta neurofilamento H fosforilada (Figura 3F). Una interpretación de este resultado podría ser que el reglamento de desarrollo de la fosforilación neurofilamento / desfosforilación no es tan fuerte en los cultivos utilizados en comparación con la situación in vivo. Una ocurrencia mixto de neurofilamentos fosforilados y no fosforilados en la misma axón podría Explain este hallazgo. Otra posibilidad es que los SMI-32 axones marcados surgen de las neuronas de proyección. Tsang y colegas 16 han demostrado que, por ejemplo, de columna y columna celular intermediolateral neuronas de Clark están manchadas por SMI-32, además de las motoneuronas. La proliferación de las neuritas pronunciada de tales neuronas también podría explicar la abundancia de SMI-32 fibras positivas. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53121/53121fig1.jpg" /> Figura 1. Visualización y Análisis de la actividad espontánea. (A) Diagrama de un MEA. Los electrodos de platino cubierta se representan en, los cables transparentes negros en rojo y la ranura en el centro de la MEA en amarillo. (B) Primer plano de la matriz de electrodos situados en el centro de la MEA. Los diagramas son amablemente proporcionados por el Dr. M. Heuschkel. Imagen brillante de campo de un viejo cultur 8 DIV (C)e. Las lonchas han crecido y se fusionan a lo largo de los lados uno frente al otro. La barra amarilla representa la ranura electrodo-y-aislamiento libre de la MEA. Barra de escala = 400 micras (D) Línea de tiempo de los experimentos. Dos rebanadas de la médula espinal de embriones de rata E14 se colocan uno al lado del otro sobre los acuerdos ambientales multilaterales. A los pocos días, los cortes crecen y se fusionan a lo largo de los lados enfrentados entre sí. En un plazo de 8-28 DIV, lesiones completas se realizan a través del sitio de fusión. Dos a tres semanas más tarde la actividad espontánea se registra y los cultivos son fijos para tinciones inmunohistoquímicas. (E) los rastros de actividad espontánea de cada electrodo individual de una vieja cultura 23 DIV. Para la visualización más clara, sólo cada segundo trazo se ilustra. Orange trazas representan la actividad que se ha grabado desde la rebanada en el lado derecho, trazas de color azul desde el lado izquierdo. La mayoría de las ráfagas están sincronizados entre los dos. La flecha señala una ráfaga que ocurren en el segmento de la izquierda que sólo partially propagado a la división derecha. La actividad en el segmento de la derecha sin embargo no alcanzó el umbral elegido de por lo menos 25% de la actividad pico máximo promediado del lado de acuerdo y por lo tanto, no se detecta como una ráfaga. Aumentos de la derecha representan el último par explosión sincronizada. (F) de la trama parcela de la actividad se muestra en (E). (G) la actividad de red parcela con ráfagas definidos (barras por debajo de línea de base) de la actividad se muestra en (E). Adaptado de Heidemann et al., 10. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53121/53121fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53121/53121fig2.jpg" /> Figura 2. Sincronizado frente Actividad No sincronizada. (A, B) parcelas de mapa de bits de las culturas lesioned a una edad temprana (en 7-9 DIV), que muestra la actividad sincronizada en condiciones estándar (A) y en virtud de desinhibición (B). (C, D) parcelas de mapa de bits de las culturas lesionadas a una edad avanzada (en&gt; 19 DIV), que muestran actividad no sincronizado en condiciones estándar (C) y bajo la desinhibición (D). (E, F) Porcentaje medio de la actividad sincronizada trazan para cada día lesión individual registrado bajo condiciones estándar (E) y en virtud de desinhibición (F). Grabaciones se tomaron 2 - 3 semanas después del día de la lesión. Adaptado de Heidemann et al., 10. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53121/53121fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53121/53121fig3.jpg" /> Figura 3. Caracterización inmunohistoquímica. (A) La tinción de cuerpos celulares motoneuronal con SMI-32. (B) el etiquetado tubulina β-III de cuerpos celulares neuronales maduras y sus procesos. (C) La identificación de los astrocitos con GFAP. (D) El etiquetado de madura cuerpo celular neuronal con NeuN. (E) SMI-32 tinción de no fosforilada H. neurofilamentos (F) neurofilamentos fosforilados H identificado por SMI-31. Adaptado de Heidemann et al., 10. Tenga en cuenta que con ambos, SMI-31 y SMI-32, una gran red de fibras es visible en los cultivos. Bares AD = 20 m, H &amp; F = 100 micras. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53121/53121fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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Investigating Functional Regeneration in Organotypic Spinal Cord Co-cultures Grown on Multi-electrode Arrays

Aquí se presenta un protocolo que se basa en rebanadas de la médula espinal cultivadas en matrices de electrodos múltiples para estudiar la regeneración funcional de conexiones propioespinal in vitro.

La investigación de la regeneración funcional en organotípicos médula espinal Co-culturas cultivadas en Arrays Multi-electrodos

Adult higher vertebrates have a limited potential to recover from spinal cord injury. Recently, evidence emerged that propriospinal connections are a ...

investigating-functional-regeneration-organotypic-spinal-cord-co

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

9.0K vistas.  University of Bern.  Aquí se presenta un protocolo que se basa en rebanadas de la médula espinal cultivadas en matrices de electrodos múltiples para estudiar la regeneración funcional de conexiones propioespinal in vitro. 

Video: Investigating Functional Regeneration in Organotypic Spinal Cord Co-cultures Grown on Multi-electrode Arrays

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies of these neurons are located in the dorsal spinal cord and their axons follow stereotyped trajectories during embryonic development. Commissural axons initially project ventrally towards the floorplate. After crossing the midline, these axons turn anteriorly and project towards the brain. Each of these steps is regulated by the action of several guidance cues. Cultures highly enriched in commissural neurons are ideally suited for many experiments addressing the mechanisms of axon pathfinding, including turning assays, immunochemistry and biochemistry. Here, we describe a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. First, the spinal cord is isolated and dorsal strips are dissected out. The dorsal tissue is then dissociated into a cell suspension by trypsinization and mechanical disruption. Neurons are plated onto poly-L-lysine-coated glass coverslips or tissue-culture dishes. After 30 hours in vitro, most neurons have extended an axon. The purity of the culture (Yam et al. 2009), typically over 90%, can be assessed by immunolabeling with the commissural neuron markers DCC, LH2 and TAG1 (Helms and Johnson, 1998). This neuronal preparation is a useful tool for in vitro studies of the cellular and molecular mechanisms of commissural axon growth and guidance during spinal cord development.

This video demonstrates a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. Dissociated commissural neurons are useful to study the cellular and molecular mechanisms of axon growth and guidance.

La disección y la Cultura de las neuronas comisurales de médula espinal embrionaria

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Investigación

Neurociencias

Multi-electrode Array Recordings of Neuronal Avalanches in Organotypic Cultures

The cortex is spontaneously active, even in the absence of any particular input or motor output. During development, this activity is important for the migration and differentiation of cortex cell types and the formation of neuronal connections1. In the mature animal, ongoing activity reflects the past and the present state of an animal into which sensory stimuli are seamlessly integrated to compute future actions. Thus, a clear understanding of the organization of ongoing i.e. spontaneous activity is a prerequisite to understand cortex function. 
Numerous recording techniques revealed that ongoing activity in cortex is comprised of many neurons whose individual activities transiently sum to larger events that can be detected in the local field potential (LFP) with extracellular microelectrodes, or in the electroencephalogram (EEG), the magnetoencephalogram (MEG), and the BOLD signal from functional magnetic resonance imaging (fMRI). The LFP is currently the method of choice when studying neuronal population activity with high temporal and spatial resolution at the mesoscopic scale (several thousands of neurons). At the extracellular microelectrode, locally synchronized activities of spatially neighbored neurons result in rapid deflections in the LFP up to several hundreds of microvolts. When using an array of microelectrodes, the organizations of such deflections can be conveniently monitored in space and time. 
Neuronal avalanches describe the scale-invariant spatiotemporal organization of ongoing neuronal activity in the brain2,3. They are specific to the superficial layers of cortex as established in vitro4,5, in vivo in the anesthetized rat 6, and in the awake monkey7. Importantly, both theoretical and empirical studies2,8-10 suggest that neuronal avalanches indicate an exquisitely balanced critical state dynamics of cortex that optimizes information transfer and information processing.
In order to study the mechanisms of neuronal avalanche development, maintenance, and regulation, in vitro preparations are highly beneficial, as they allow for stable recordings of avalanche activity under precisely controlled conditions. The current protocol describes how to study neuronal avalanches in vitro by taking advantage of superficial layer development in organotypic cortex cultures, i.e. slice cultures, grown on planar, integrated microelectrode arrays (MEA; see also 11-14).

A robust way to study neuronal avalanches, i.e. scale-invariant spatio-temporal activity bursts, indicative of critical state dynamics in cortex. Avalanches emerge spontaneously in developing superficial layers of cultured cortex which allows for long-term measurements of the activity with planar integrated multi-electrode arrays (MEA) under precisely controlled conditions.

Electrodos múltiples grabaciones matriz de avalanchas neuronal en cultivos organotípicos

The cortex is spontaneously active, even in the absence of any particular input or motor output.  During development, this activity is important for the ...

Spinal Cord Transection in the Larval Zebrafish

Mammals fail in sensory and motor recovery following spinal cord injury due to lack of axonal regrowth below the level of injury as well as an inability to reinitiate spinal neurogenesis. However, some anamniotes including the zebrafish Danio rerio exhibit both sensory and functional recovery even after complete transection of the spinal cord. The adult zebrafish is an established model organism for studying regeneration following spinal cord injury, with sensory and motor recovery by 6&#160;weeks post-injury. To take advantage of in vivo analysis of the regenerative process available in the transparent larval zebrafish as well as genetic tools not accessible in the adult, we use the larval zebrafish to study regeneration after spinal cord transection. Here we demonstrate a method for reproducibly and verifiably transecting the larval spinal cord. After transection, our data shows sensory recovery beginning at 2&#160;days post-injury (dpi), with the C-bend movement detectable by 3 dpi and resumption of free swimming by 5 dpi. Thus we propose the larval zebrafish as a companion tool to the adult zebrafish for the study of recovery after spinal cord injury.

After spinal transection, adult zebrafish have functional recovery by six weeks post-injury. To take advantage of larval transparency and faster recovery, we present a method for transecting the larval spinal cord. After transection, we observe sensory recovery beginning at 2&#160;days post-injury, and C-bend movement by 3 days post-injury.

La transección de la médula espinal en el pez cebra larval

Mammals fail in sensory and motor recovery following spinal cord injury due to lack of axonal regrowth below the level of injury as well as an inability ...

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

Injured CNS axons fail to regenerate and often retract away from the injury site. Axons spared from the initial injury may later undergo secondary axonal degeneration. Lack of growth cone formation, regeneration, and loss of additional myelinated axonal projections within the spinal cord greatly limits neurological recovery following injury. To assess how central myelinated axons of the spinal cord respond to injury, we developed an ex vivo living spinal cord model utilizing transgenic mice that express yellow fluorescent protein in axons and a focal and highly reproducible laser-induced spinal cord injury to document the fate of axons and myelin (lipophilic fluorescent dye Nile Red) over time using two-photon excitation time-lapse microscopy. Dynamic processes such as acute axonal injury, axonal retraction, and myelin degeneration are best studied in real-time. However, the non-focal nature of contusion-based injuries and movement artifacts encountered during in vivo spinal cord imaging make differentiating primary and secondary axonal injury responses using high resolution microscopy challenging. The ex vivo spinal cord model described here mimics several aspects of clinically relevant contusion/compression-induced axonal pathologies including axonal swelling, spheroid formation, axonal transection, and peri-axonal swelling providing a useful model to study these dynamic processes in real-time. Major advantages of this model are excellent spatiotemporal resolution that allows differentiation between the primary insult that directly injures axons and secondary injury mechanisms; controlled infusion of reagents directly to the perfusate bathing the cord; precise alterations of the environmental milieu (e.g., calcium, sodium ions, known contributors to axonal injury, but near impossible to manipulate in vivo); and murine models also offer an advantage as they provide an opportunity to visualize and manipulate genetically identified cell populations and subcellular structures. Here, we describe how to isolate and image the living spinal cord from mice to capture dynamics of acute axonal injury.

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

We present a protocol utilizing two-photon excitation time-lapse microscopy to simultaneously visualize the dynamics of axon and myelin injuries in real time. This proposed protocol permits studies of both intrinsic and extrinsic factors which can influence central myelinated axon fate after injury and contribute to permanent clinical disability.

Una<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Médula espinal inducida por láser Lesiones modelo para evaluar los mecanismos de degeneración axonal en tiempo real

Injured CNS axons fail to regenerate and often retract away from the injury site. Axons spared from the initial injury may later undergo secondary axonal ...

Spiral Ganglion Neuron Explant Culture and Electrophysiology on Multi Electrode Arrays

Spiral ganglion neurons (SGNs) participate in the physiological process of hearing by relaying signals from sensory hair cells to the cochlear nucleus in the brain stem. Loss of hair cells is a major cause of sensory hearing loss. Prosthetic devices such as cochlear implants function by bypassing lost hair cells and directly stimulating SGNs electrically, allowing for restoration of hearing in deaf patients. The performance of these devices depends on the functionality of SGNs, the implantation procedure and on the distance between the electrodes and the auditory neurons. 
We hypothesized, that reducing the distance between the SGNs and the electrode array of the implant would allow for improved stimulation and frequency resolution, with the best results in a gapless position. Currently we lack in vitro culture systems to study, modify and optimize the interaction between auditory neurons and electrode arrays and characterize their electrophysiological response. To address these issues, we developed an in vitro bioassay using SGN cultures on a planar multi electrode array (MEA). With this method we were able to perform extracellular recording of the basal and electrically induced activity of a population of spiral ganglion neurons. We were also able to optimize stimulation protocols and analyze the response to electrical stimuli as a function of the electrode distance. This platform could also be used to optimize electrode features such as surface coatings.

We present a protocol to culture primary murine spiral ganglion neuron explants on multi electrode arrays to study neuronal response profiles and optimize stimulation parameters. Such studies aim to improve the neuron-electrode interface of cochlear implants to benefit hearing in patients as well as the energy consumption of the device.

Ganglio espiral neurona explante cultura y Electrofisiología de multi electrodos matrices

Spiral ganglion neurons (SGNs) participate in the physiological process of hearing by relaying signals from sensory hair cells to the cochlear nucleus in ...

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in adult mammalian animals remains elusive. In this study, we describe an experimental procedure for measuring calcium dynamics through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy. This method enables recordings and quantifications of neural activity in bilateral mouse brain regions one at a time in the same experiment for a prolonged period in vivo. Key aspects of this method, which can be completed within an hour, include minimally invasive surgery procedures for creating dual optical windows, and the use of 2P imaging. Although we only demonstrate the technique in the S1 area, the method can be applied to other regions of the living brain facilitating the elucidation of structural and functional complexities of brain neural networks.

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

We describe an experimental procedure for measuring neuronal activity through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy in vivo.

Imágenes de la actividad neuronal en la corteza somatosensorial primaria usando Thy1-ratones transgénicos GCaMP6s

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in ...

Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing

Probing an individual cell&#39;s gene expression enables the identification of cell type and cell state. Single-cell RNA sequencing has emerged as a powerful tool for studying transcriptional profiles of cells, particularly in heterogeneous tissues such as the central nervous system. However, dissociation methods required for single cell sequencing can lead to experimental changes in the gene expression and cell death. Furthermore, these methods are generally restricted to fresh tissue, thus limiting studies on archival and bio-bank material. Single nucleus RNA sequencing (snRNA-Seq) is an appealing alternative for transcriptional studies, given that it accurately identifies cell types, permits the study of tissue that is frozen or difficult to dissociate, and reduces dissociation-induced transcription. Here, we present a high-throughput protocol for rapid isolation of nuclei for downstream snRNA-Seq. This method enables isolation of nuclei from fresh or frozen spinal cord samples and can be combined with two massively parallel droplet encapsulation platforms.

Here, we present a protocol to rapidly isolate high-quality nuclei from the fresh or frozen tissue for downstream massively parallel RNA sequencing. We include detergent-mechanical and hypotonic-mechanical tissue disruption and cell lysis options, both of which can be used for isolation of nuclei.

Aislamiento de núcleos de adultos de la médula espinal para secuenciación masivamente paralela solo núcleo ARN

Probing an individual cell&#39;s gene expression enables the identification of cell type and cell state. Single-cell RNA sequencing has emerged as a ...

Activity-based Training on a Treadmill with Spinal Cord Injured Wistar Rats

Spinal cord injury (SCI) results in lasting deficits that include both mobility and a multitude of autonomic-related dysfunctions. Locomotor training (LT) on a treadmill is widely used as a rehabilitation tool in the SCI population with many benefits and improvements to daily life. We utilize this method of activity-based task-specific training (ABT) in rodents after SCI to both elucidate the mechanisms behind such improvements and to enhance and improve upon existing clinical rehabilitation protocols. Our current goal is to determine the mechanisms underlying ABT-induced improvements in urinary, bowel, and sexual function in SCI rats after a moderate to severe level of contusion. After securing each individual animal in a custom-made adjustable vest, they are secured to a versatile body weight support mechanism, lowered to a modified three-lane treadmill and assisted in step-training for 58 minutes, once a day for 10 weeks. This setup allows for the training of both quadrupedal and forelimb-only animals, alongside two different non-trained groups. Quadrupedal-trained animals with body weight support are aided by a technician present to assist in stepping with proper hind limb placement as necessary, while forelimb-only trained animals are raised at the caudal end to ensure no hind limb contact with the treadmill and no weight-bearing. One non-trained SCI group of animals is placed in a harness and rests next to the treadmill, while the other control SCI group remains in its home cage in the training room nearby. This paradigm allows for the training of multiple SCI animals at once, thus making it more time-efficient in addition to ensuring that our pre-clinical animal model mimics the clinical representation as close as possible, particularly with respect to the body weight support with manual assistance.

This protocol demonstrates our model of activity-based locomotor treadmill training for rats with spinal cord injury (SCI). Included is both quadrupedal and forelimb-only groups, in addition to two distinct types of non-trained control groups. Investigators are able to assess training effects on SCI rats using this protocol.

Formación basada en una cinta rodante con la médula espinal lesionado ratas Wistar

Spinal cord injury (SCI) results in lasting deficits that include both mobility and a multitude of autonomic-related dysfunctions. Locomotor training (LT) ...

Intra-Arterial Delivery of Neural Stem Cells to the Rat and Mouse Brain: Application to Cerebral Ischemia

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to intracranial delivery, intra-arterial administration of NSCs is less invasive and produces a more diffuse distribution of NSCs within the brain parenchyma. Further, intra-arterial delivery allows the first-pass effect in the brain circulation, lessening the potential for trapping of cells in peripheral organs, such as liver and spleen, a complication associated with peripheral injections. Here, we detail the methodology, in both mice and rats, for delivery of NSCs through the common carotid artery (mouse) or external carotid artery (rat) to the ipsilateral hemisphere after an ischemic stroke. Using GFP-labeled NSCs, we illustrate the widespread distribution achieved throughout the rodent ipsilateral hemisphere at 1 d, 1 week and 4 weeks after postischemic delivery, with a higher density in or near the ischemic injury site. In addition to long-term survival, we show evidence of differentiation of GFP-labeled cells at 4 weeks. The intra-arterial delivery approach described here for NSCs can also be used for administration of therapeutic compounds, and thus has broad applicability to varied CNS injury and disease models across multiple species.

A method for delivering neural stem cells, adaptable for injecting solutions or suspensions, through the common carotid artery (mouse) or external carotid artery (rat) after ischemic stroke is reported. Injected cells are distributed broadly throughout the brain parenchyma and can be detected up to 30 d after delivery.

Entrega intra-arterial de células madre neuronales a la rata y el cerebro del ratón: aplicación a la isquemia cerebral

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to ...

Automated Gait Analysis to Assess Functional Recovery in Rodents with Peripheral Nerve or Spinal Cord Contusion Injury

Peripheral and central nerve injuries are mostly studied in rodents, especially rats, given the fact that these animal models are both cost-effective and a lot of comparative data has been published in the literature. This includes a multitude of assessment methods to study functional recovery following nerve injury and repair. Besides evaluation of nerve regeneration by means of histology, electrophysiology, and other in vivo and in vitro assessment techniques, functional recovery is the most important criterion to determine the degree of neural regeneration. Automated gait analysis allows recording of a vast quantity of gait-related parameters such as Paw Print Area and Paw Swing Speed as well as measures of inter-limb coordination. Additionally, the method provides digital data of the rats&#8217; paws after neuronal damage and during nerve regeneration, adding to our understanding of how peripheral and central nervous injuries affect their locomotor behavior. Besides the predominantly used sciatic nerve injury model, other models of peripheral nerve injury such as the femoral nerve can be studied by means of this method. In addition to injuries of the peripheral nervous systems, lesions of the central nervous system, e.g., spinal cord contusion can be evaluated. Valid and reproducible data assessment is strongly dependent on meticulous adjustment of the hard- and software settings prior to data acquisition. Additionally, proper training of the experimental animals is of crucial importance. This work aims to illustrate the use of computerized automated gait analysis to assess functional recovery in different animal models of peripheral nerve injury as well as spinal cord contusion injury. It also emphasizes the method&#8217;s limitations, e.g., evaluation of nerve regeneration in rats with sciatic nerve neurotmesis due to limited functional recovery. Therefore, this protocol is thought to help researchers interested in peripheral and central nervous injuries to assess functional recovery in rodent models.

Automated gait analysis is a feasible tool to evaluate functional recovery in rodent models of peripheral nerve injury and spinal cord contusion injury. While it requires only one setup to assess locomotor function in various experimental models, meticulous hard- and soft-ware adjustment and training of the animals is highly important.

Análisis automatizado de gaita para evaluar la recuperación funcional en roedores con daño de contusión de nervio periférico o médula espinal

Peripheral and central nerve injuries are mostly studied in rodents, especially rats, given the fact that these animal models are both cost-effective and ...