The authors thank Dr. Mark Borchardt, U.S. Department of Agriculture, Marshfield, WI, for supplying the Sabin poliovirus serotype 3 used in this study; Mary Jean See, Nancy Schable, and Jenifer Jones of Dynamac Corporation for preparation of BGM cultures; Nichole E. Brinkman, Shannon M. Griffin, Brian R. McMinn, Eric R. Rhodes, Eunice A. Varughese, Ann C. Grimm, Sandhya U. Parshionikar, and Larry Wymer for contributions in the overall evaluation of USEPA Method 1615; Gretchen Sullivan for technical assistance; and local private well owners and utilities for allowing us to collect water samples. Although this work was reviewed by USEPA and approved for publication, it may not necessarily reflect official Agency policy. Mention of trade names or commercial products does not constitute endorsement or recommendation for use.

NOTA: Por favor, véase la sección Materiales suplementarios S1 para obtener una lista de definiciones. Los procedimientos de control de calidad asociados con el método USEPA 1615 se describen en la sección S2 materiales suplementarios. 1. Filtro Procedimiento elución <ol><li> Primera elución <ol><li> Colocar 500 ml de extracto de carne 1,5% tamponada, pH 9,0, se calentó a temperatura ambiente en un cilindro graduado. Abra la carcasa del cartucho de filtro y añadir una cantidad suficiente de extracto de carne para cubrir el filtro electropositivo completamente. Vuelva a colocar la tapa de la carcasa del filtro y vierta el extracto de carne que queda en un vaso estéril. </li><li> Después de 1 minuto de tiempo de contacto, pasar la solución de extracto de carne de vacuno en la carcasa junto con la restante en el vaso de precipitados estéril lentamente a través del filtro utilizando un recipiente de presión o una bomba peristáltica. Recoger el eluido en un vaso de precipitados de vidrio de 2 L. </li></ol></li><li> En segundo lugar elución <ol><li> Repita los pasos 1.1 utilizando otros 500 ml adicionales de extracto de carne 1,5% tamponada, Pero aumentar el tiempo de contacto en el paso 1.1.2 a 15 min. </li><li> Añadir el extracto de carne de la segunda elución al vaso de precipitados que contiene 2 L que a partir de la primera elución. Añadir una barra de agitación estéril al vaso de precipitados. </li></ol></li></ol> Procedimiento 2. Concentración orgánica floculación <ol><li> Esterilizar un electrodo de pH de tipo combinado con hipoclorito de sodio 0,525% durante al menos 5 min. Enjuagar el electrodo con estéril dH 2 O y luego eliminar el cloro con tiosulfato de sodio 0,05 M. Calibrar el medidor de pH con pH 4 y 7 estándares. </li><li> Colocar el vaso que contiene el eluato en una placa de agitación. Encienda la placa y aumentar la velocidad de agitación hasta que se forma un vórtice. </li><li> Ajustar el pH del eluato a 3,5 ± 0,1 lentamente por adición gota a gota de HCl 1,2 M al eluido. Añadir el HCl gota a gota, porque además de la rápida será inactivar virus. Durante este tiempo el eluato se convertirá nublado como un precipitado comienza a formarse. </li><li> Reducir la mezcla speed a un revuelo lento y luego continuar a controlar y mantener el pH del eluato a 3,5 ± 0,1 a temperatura ambiente durante 30 min. </li><li> Se vierte la suspensión extracto de carne precipitado en una o más botellas de centrífuga y centrifugar durante 15 min a 2500 xg a 4 ° C. Retire las botellas de la centrífuga y, o bien aspirar o lentamente decantar el sobrenadante para evitar la pérdida del precipitado sedimentado. Descartar el sobrenadante. NOTA: No puede haber una considerable variación entre lotes de extracto de carne de vacuno en la cantidad y calidad del precipitado. El precipitado producido a partir de algunos lotes se disolverá rápidamente mientras que a partir de otros lotes se disuelve con dificultad. </li><li> Añadir 30 ml de fosfato de sodio 0,15 M a la botella de centrífuga que contiene el precipitado. <ol><li> Utilizar fosfato de sodio 0,15 M, pH 9,0, para precipita a partir de lotes extracto de carne que se disuelven en 5 minutos. Se agita durante 10 minutos después de que el precipitado se haya disuelto completamente, y luego ir inmediatamente al paso 2.7. </li><li> Utilice fosfato de sodio 0,15 M, pH 7,0 a 7,5 para todos los otros precipitados. Se agita durante 10 a 15 min para disolver, o por precipitados más difíciles, romper con una espátula estéril, mediante la elaboración de la solución varias veces arriba y abajo durante la agitación con una pipeta, agitando el precipitado a 160 rpm en un agitador orbital, o por una combinación de estos procedimientos. NOTA: Cuando se utiliza más de una botella de centrífuga, se combinan los precipitados utilizando menos de 30 ml de fosfato de sodio y luego utilizar la parte restante de los 30 ml para enjuagar las botellas después de combinar los precipitados en una botella o vaso de precipitados. </li><li> Si el precipitado combinado es en una botella de centrífuga de fondo plano, añadir una barra de agitación a la botella. Ir al paso 2.6.5. </li><li> Si el precipitado combinado está en una botella de centrífuga con un fondo cónico, la transfiere en una pequeña cubeta de vidrio y añadir una barra de agitación al vaso de precipitados. </li><li> Coloque la botella o vaso de precipitados sobre un agitador magnético, y se agita hasta que el precipitate se haya disuelto completamente. </li><li> Re-esterilizar un electrodo de pH tipo combinación con hipoclorito de sodio 0,525% y eliminar el cloro con tiosulfato de sodio 0,05 M como se describe en el paso 2.1. Calibrar el medidor de pH con un pH de 7 y 10 estándares. ajustar lentamente el pH del precipitado completamente disuelto a 9,0 con NaOH 1 M y luego se agita durante 10 min. </li></ol></li><li> Retire la barra de agitación y centrifugar el precipitado disuelto durante 10 minutos a 4,000-10,000 xgy 4 ° C. </li><li> Con cuidado, verter el sobrenadante en un vaso de vidrio sin perturbar el sedimento. Añadir una barra de agitación al vaso de precipitados y desechar el sedimento. </li><li> Colocar el vaso de precipitados sobre un agitador magnético, y se agita la solución. Añadir gota 1,2 M HCl aconsejable ajustar el pH a 7,0-7,5. </li><li> Filtro de esterilizar el sobrenadante mediante paso a través de un filtro esterilizante que contiene un filtro previo que se había pretratado con 15 ml de extracto de carne 1,5%, 0,05 M de glicina, pH 7,0 a 7,5. </li><li> Volum de la muestra de ensayoe (S) de los cálculos: <ol><li> Utilizar la ecuación 1 para calcular S para todas las muestras de prueba, excepto el Laboratorio fortificada en blanco y el reactivo de laboratorio en blanco, <img alt="Ecuación 1" src="/files/ftp_upload/52437/52437eq1.jpg" width="100" /> Ecuación 1 donde D (Volumen de la muestra original de agua ensayada) es de 500 l para las aguas subterráneas, TSV (volumen total de muestra) es el volumen de la muestra de campo pasa a través del filtro de cartucho electropositivo 5 pulgadas recibido en el laboratorio, y FCSV (Final Concentrado Volumen de la muestra) es el volumen después de la filtración en el Paso 2.10. Un ejemplo se muestra en la sección materiales suplementarios S4.1. </li><li> Calcular S para la fortificada laboratorio en blanco (LFB; es decir, un control positivo de la calidad del agua mediante sembrado de grado reactivo) y el reactivo de laboratorio en blanco (LRB, es decir, un control negativo calidad utilizando agua de grado reactivo) multiplicando el FCSV por 0,3. </li></ol></li><li> Divida la FCSV en three submuestras. <ol><li> Preparar submuestras 1 y 2 con un volumen igual a 1,04 veces el volumen de muestra de ensayo. Congelar estas submuestras en o por debajo de -70 ° C si no pueden ser analizados usando el ensayo de virus cultivables totales (Submuestra 1, Paso 4) o tratados a los ensayos moleculares (no mostrados) dentro de las 24 horas; de lo contrario, mantener a 4 ° C. </li><li> Congelar el volumen restante (submuestra 3) en o por debajo de -70 ° C. </li></ol></li><li> Calcular el volumen del inóculo dividiendo el S por 10. </li></ol> 3. Virus Total Culturable quantal Ensayo NOTA: Para todas las medidas siempre se agregan soluciones con cuidado para no perturbar la monocapa de células. <ol><li> Decantar o aspirar el contenido de los medios recipientes de ensayo que contenían una monocapa de células BGM a los 3-6 días después de la división y luego añadir un volumen de solución salina equilibrada igual a los medios de comunicación eliminado. </li><li> Decantar o aspirar la solución salina equilibrada de la te de cultivo celularvasos st usadas, y se inoculan los recipientes de ensayo de cultivo de células <ol><li> Inocular 10 recipientes de ensayo para cada muestra de ensayo con un volumen de submuestra 1 igual al volumen del inóculo junto con el total de los controles de ensayo cuánticos de virus cultivables (materiales suplementarios sección S2.4). </li><li> Para la LFB y el Laboratorio fortificada matriz de la muestra (LFSM, es decir, cabeza de serie de la muestra de matriz de agua), preparar 5-, 25-, y diluciones de 125 veces utilizando submuestra 3 y fosfato de sodio 0,15 M, pH 7,0 a 7,5 como diluyente. Un ejemplo de un procedimiento para hacer las diluciones se da en la sección de materiales suplementario S3. Inocular 10 recipientes de ensayo de cultivo de células lavadas para cada serie de dilución utilizando un volumen de inóculo en cada recipiente de ensayo además de los vasos inoculados con Submuestra no diluido 1 en el paso 3.2.1. </li><li> Para cualquier muestra de prueba de la etapa 3.2.1 (excepto los inoculado en el paso 3.2.2) que tiene CPE en las 10 repeticiones después de 14 días de incubación (véase el paso 3.3), prepare diluciones 5-, 25- y 125-, y 625 veces de submuestra 3. Inocular 10 lava recipientes de ensayo de cultivo de células para cada serie de dilución utilizando un volumen de inóculo en cada recipiente de ensayo junto con un nuevo conjunto de la quantal total de virus cultivables controles del ensayo (materiales suplementarios sección S2.4). </li><li> Distribuir el inóculo sobre la superficie de las monocapas de células por la inclinación de los vasos de ida y vuelta. Incubar los recipientes de ensayo a temperatura ambiente durante 80-120 min en una plataforma oscilante mecánica en 1-5 oscilaciones / min o con balanceo de los vasos cada 15-20 minutos para permitir que cualquier virus presente para adsorber a las células. </li><li> Añadir medio de mantenimiento precalentado, y luego se incuban los recipientes de ensayo a 36,5 ± 1 ° C. </li></ol></li><li> Buscar la aparición de CPE en cada recipiente de ensayo utilizando un microscopio al día durante los primeros 3 d y luego examinarlas cada 2-3 días hasta el día 14. Transferencia ningún recipientes de ensayo que muestran ≥75% de CPE a un congelador fijado en opor debajo de -70 ° C. Congelar todas las culturas restantes y el total de los controles de análisis de virus cultivables cuánticos igual o inferior a -70 ° C después de examinar los vasos en el último día. </li><li> Descongelar todas las culturas y filtrar ≥15% de la media de cada recipiente de ensayo CPE-positivo a través de un filtro de esterilización de 0,2 micras. Si el volumen especificado no se puede pasar a través del filtro debido a la obstrucción, se centrifuga el medio durante 10 minutos a 1,500-18,000 xg y 4 ° C antes de la filtración. </li><li> Realizar un segundo paso de los 1 st recipientes de ensayo pasaje utilizando recipientes de ensayo BGM lavadas. <ol><li> Inocular los nuevos recipientes de ensayo con un volumen de inoculación que representa el 10% del medio descongelado de todos los recipientes de ensayo y negativos del medio filtrado de los vasos positivos. </li><li> Repita los pasos 3.2.4-3.4.3, pero congelar cualquier recipiente de ensayo que fue negativo en el paso 1 st y positivo en el 2º como se describe en el paso 3.3. Realizar un pase 3ªedad tal como se describe para el paso 2 nd utilizando sólo los controles de ensayo negativos y cultivos celulares que fueron negativos durante el paso 1 st y positivo en el paso 2 nd. </li></ol></li><li> Identificar los recipientes de ensayo individuales como el virus positivo cuando muestran CPE tanto en el 1 ° y 2 pasajes nd o, en el caso en que el CPE no se produce hasta el paso 2º, tanto en los pasajes 2 ª y 3 ª. </li><li> Utilice la calculadora de número más probable de la EPA con los ajustes por defecto del programa establecidos como se muestra en la Tabla S2 para calcular los títulos de virus de todas las muestras de ensayo. <ol><li> Introducir el número de virus positivos vasos de ensayo en paralelo desde el paso 3.6 para cada muestra de ensayo en la calculadora para determinar el valor NMP / ml (M ml) y la superior (CL UML) y el 95% límites de confianza / valores ml más bajos (CL LML) . </li><li> Obtain el valor NMP / L (M L) de la muestra de ensayo correspondiente usando la ecuación 2. <img alt="Ecuación 2" src="/files/ftp_upload/52437/52437eq2.jpg" width="100" /> Ecuación 2 M ml es el valor / ml NMP en el paso 3.7, S es el volumen de la muestra de ensayo, y D es el volumen de la muestra original de agua ensayada. </li><li> Calcular el límite de confianza superior / L sustituyendo el valor CL UML para el valor M ml. Calcular la menor confianza límite / L sustituyendo el valor CL LML para el valor M mL. Un ejemplo de cálculo se muestra en la sección materiales suplementarios S4.2. </li><li> Informe valores M mL de 0 como ≤ 1 / D. Por ejemplo, ≤ 0,002 NMP / L (≤ 1/500 L) para las muestras de agua subterránea. </li><li> Calcular los valores de límite de confianza del MPN y el 95% para cada laboratorio fortificada en blanco y Re Labagente en blanco multiplicando primero los valores / ml obtenidos en la calculadora S y dividiendo el resultado por 0,3. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Bradbury, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Source+and+transport+of+human+enteric+viruses+in+deep+municipal+water+supply+wells.">Source and transport of human enteric viruses in deep municipal water supply wells.</a> Environ. Sci. Technol. 47 (9), 4096-4103 (2013).</li><li>Aslan, A., Xagoraraki, I., Simmons, F. J., Rose, J. B., Dorevitch, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Occurrence+of+adenovirus+and+other+enteric+viruses+in+limited-contact+freshwater+recreational+areas+and+bathing+waters.">Occurrence of adenovirus and other enteric viruses in limited-contact freshwater recreational areas and bathing waters.</a> J. Appl. Microbiol. 111 (5), 1250-1261 (2011).</li><li>Begier, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+outbreak+of+concurrent+echovirus+30+and+coxsackievirus+A1+infections+associated+with+sea+swimming+among+a+group+of+travelers+to+Mexico.">An outbreak of concurrent echovirus 30 and coxsackievirus A1 infections associated with sea swimming among a group of travelers to Mexico.</a> Clin. Infect. Dis. 47 (5), 616-623 (2008).</li><li>Anderson, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+waterborne+outbreak+of+Norwalk-like+virus+among+snowmobilers-Wyoming,+2001.">A waterborne outbreak of Norwalk-like virus among snowmobilers-Wyoming, 2001.</a> J. Infect. Dis. 187 (2), 303-306 (2003).</li><li>Glass, R. I., Parashar, U. D., Estes, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Norovirus+gastroenteritis.">Norovirus gastroenteritis.</a> N.Engl.J. Med. 361 (18), 1776-1785 (2009).</li><li>Khetsuriani, N., Lamonte-Fowlkes, A., Oberst, S., Pallansch, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enterovirus+surveillance--United+States.">Enterovirus surveillance--United States.</a> MMWR Surveill. Summ. 55 (8), 1-20 (2006).</li><li>Sawyer, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enterovirus+infections:+diagnosis+and+treatment.">Enterovirus infections: diagnosis and treatment.</a> Semin. Pediatr. Infect. Dis. 13 (1), 40-47 (2002).</li><li>Abzug, M. J., Finn, A., Pollard, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+enteroviruses:+an+emerging+infectious+disease?+The+real,+the+speculative+and+the+really+speculative.">The enteroviruses: an emerging infectious disease? The real, the speculative and the really speculative.</a> Hot Topics in Infection and Immunity in Children. , (2008).</li><li>Harris, J. P., Edmunds, W. J., Pebody, R., Brown, D. W., Lopman, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deaths+from+norovirus+among+the+elderly,+England+and+Wales.">Deaths from norovirus among the elderly, England and Wales.</a> Emerg. Infect. Dis. 14 (10), 1546-1552 (2008).</li><li>Ho, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Epidemic+of+Enterovirus+71+Infection+in+Taiwan.">An Epidemic of Enterovirus 71 Infection in Taiwan.</a> New England J. Med. 341 (13), 929-935 (1999).</li><li>Bae, J., Schwab, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+murine+norovirus,+feline+calicivirus,+poliovirus,+and+MS2+as+surrogates+for+human+norovirus+in+a+model+of+viral+persistence+in+surface+water+and+groundwater.">Evaluation of murine norovirus, feline calicivirus, poliovirus, and MS2 as surrogates for human norovirus in a model of viral persistence in surface water and groundwater.</a> Appl. Environ. Microbiol. 74 (2), 477-484 (2008).</li><li>Ward, R. L., Knowlton, D. R., Winston, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+inactivation+of+enteric+viruses+in+fresh+water.">Mechanism of inactivation of enteric viruses in fresh water.</a> Appl. Environ. Microbiol. 52 (3), 450-459 (1986).</li><li>Kahler, A. M., Cromeans, T. L., Roberts, J. M., Hill, V. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Source+Water+Quality+on+Chlorine+Inactivation+of+Adenovirus,+Coxsackievirus,+Echovirus,+and+Murine+Norovirus.">Effects of Source Water Quality on Chlorine Inactivation of Adenovirus, Coxsackievirus, Echovirus, and Murine Norovirus.</a> Appl. Environ. Microbiol. 76 (15), 5159-5164 (2010).</li><li>Dahling, D. R., Wright, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+the+BGM+cell+line+culture+and+viral+assay+procedures+for+monitoring+viruses+in+the+environment.">Optimization of the BGM cell line culture and viral assay procedures for monitoring viruses in the environment.</a> Appl. Environ. Microbiol. 51 (4), 790-812 (1986).</li><li>Fout, G. S., Schaefer, F. W., Messer, J. W., Dahling, D. R., Stetler, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EPA/600/R-95/178.">EPA/600/R-95/178.</a> ICR Microbial Laboratory Manual. , (1996).</li><li>Cashdollar, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+Evaluation+of+EPA+Method+1615+for+Detection+of+Enterovirus+and+Norovirus+in+Water.">Development and Evaluation of EPA Method 1615 for Detection of Enterovirus and Norovirus in Water.</a> Appl. Environ. Microbiol. 79 (1), 215-223 (2013).</li><li>USEPA. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=40+CFR+Parts+141+and+142+Revisions+to+the+Unregulated+Contaminant+Monitoring+Regulation+(UCMR3)+for+Public+Water+Systems+Final+Rule.">40 CFR Parts 141 and 142 Revisions to the Unregulated Contaminant Monitoring Regulation (UCMR3) for Public Water Systems Final Rule.</a> Federal Register. 77 (85), 26072-26101 (2012).</li><li>USEPA. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=40+CFR+Part+141+National+Primary+Drinking+Water+Regulations:+Monitoring+Requirements+for+Public+Drinking+Water+Supplies;+Final+Rule.">40 CFR Part 141 National Primary Drinking Water Regulations: Monitoring Requirements for Public Drinking Water Supplies; Final Rule.</a> Federal Register. 61 (94), 24353-24388 (1996).</li><li>Shaw, S., Regli, S., Chen, J., McGuire, M. J., McLain, J. L., Obolensky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus+occurrence+and+health+risks+in+drinking+water+.">Virus occurrence and health risks in drinking water .</a> Information Collection Rule Data Analysis. , 437-462 (2002).</li><li>Lieberman, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Microbial monitoring of vulnerable public groundwater supplies. , (2002).</li><li>Lukasik, J., Scott, T. M., Andryshak, D., Farrah, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+salts+on+virus+adsorption+to+microporous+filters.">Influence of salts on virus adsorption to microporous filters.</a> Appl. Environ. Microbiol. 66 (7), 2914-2920 (2000).</li><li>Sedmak, G., Bina, D., MacDonald, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+an+enterovirus+sewage+surveillance+system+by+comparison+of+clinical+isolates+with+sewage+isolates+from+milwaukee,+wisconsin,+collected+august+1994.">Assessment of an enterovirus sewage surveillance system by comparison of clinical isolates with sewage isolates from milwaukee, wisconsin, collected august 1994.</a> Appl. Environ. Microbiol. 69 (12), 7181-7187 (2003).</li><li>Ikner, L. A., Soto-Beltran, M., Bright, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+method+using+a+positively+charged+microporous+filter+and+ultrafiltration+for+concentration+of+viruses+from+tap+water.">New method using a positively charged microporous filter and ultrafiltration for concentration of viruses from tap water.</a> Appl. Environ. Microbiol. 77 (10), 3500-3506 (2011).</li><li>Karim, M. R., Rhodes, E. R., Brinkman, N., Wymer, L., Fout, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+electropositive+filter+for+concentrating+enteroviruses+and+noroviruses+from+large+volumes+of+water.">New electropositive filter for concentrating enteroviruses and noroviruses from large volumes of water.</a> Appl. Environ. Microbiol. 75 (8), 2393-2399 (2009).</li><li>Cashdollar, J. L., Wymer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+primary+concentration+of+viruses+from+water+samples:+a+review+and+meta-analysis+of+recent+studies.">Methods for primary concentration of viruses from water samples: a review and meta-analysis of recent studies.</a> J Appl Microbiol. 115 (1), 1-11 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Método USEPA 1615 fue desarrollado para su uso durante el tercer ciclo de monitorización del Reglamento los contaminantes no regulados (UCMR3) 17 y diseñado fundamentalmente para medir la ocurrencia del virus en el agua subterránea. Se comparte una serie de pasos comunes con el método de información de regla de colección (ICR), 15,18 pero tiene dos diferencias menores. Tanto el uso de ensayos para medir cuánticos virus que producen CPE sobre monocapas de células BGM con cuantificación de ser en base a mayoría de los cálculos del número más probable (NMP). Método 1615 permite el uso de un filtro de electropositivo más reciente para la concentración de virus a partir de varias matrices de agua y reduce el número de recipiente de ensayo de cultivo de células réplicas por dilución de 20 a 10. Tanto los cambios de menor importancia reducir los costos generales del método. La reducción en el número de repeticiones reduce la mano de obra, pero da lugar a un límite de detección ligeramente inferior. Aunque se espera que las aguas subterráneas a tener menores concentraciones de virus que las aguas superficiales, 19,20 ºe cantidad de muestra ensayada es cinco veces mayor que la de las aguas superficiales, compensando en parte las diferencias. El uso de un menor número de repeticiones será adecuado para la mayoría de las aguas de superficie, pero algunos requieren dilución de la muestra. Método 1615 tiene varios pasos críticos y limitaciones. extractos de carne de res varían de lote a lote. Cada lote debe ser probado para la eficacia de la elución del virus y la capacidad de concentración del virus a través de las etapas de concentración secundaria es como se describe materiales suplementarios sección S2.3. El método utiliza fórmulas precisas para el cálculo de la cantidad de muestra para inocular en cultivos celulares de música ambiental y determinar los títulos de virus. Los resultados inexactos se generarán si estas fórmulas no se siguen rigurosamente. una técnica aséptica apropiada debe ser utilizado para el mantenimiento de cultivos de células. No infectadas control de cultivos celulares de música ambiental que muestran angustia durante el período de incubación de 14 días probable que indican problemas con el mantenimiento del cultivo celular. El gran cuidado debe ser también taken durante el pipeteo pasos a seguir para la inoculación del medio y adición a matraces de cultivo de células para evitar la contaminación cruzada. Los controles de calidad que se describen en la Sección S2 suplementaria materiales deben seguirse rigurosamente. Sección S2 también proporciona consejos para la solución de problemas problemas de calidad. El principal mecanismo de la adsorción del virus a electropositivo filtros es una interacción de carga relacionada con la fuerza de la carga positiva en el filtro y la fuerza de carga negativa del virus relacionado con su punto isoeléctrico y el pH del agua que se está probando 21. La elución de los filtros también se ve afectada por la fuerza de estas interacciones. Debido a que varían entre los tipos de virus, e incluso entre las cepas dentro del mismo tipo, la elución de los filtros no es uniforme. Esto significa que cualquier resultado puede subestimar el nivel real de virus presente en las aguas ambientales. El uso de la línea celular BGM única también subestima la aparición de virus. El rangode virus entérico que puede producir CPE en esta línea celular principalmente está limitada a los poliovirus y serotipos especies Enterovirus B, así como algunos reovirus 14,15,22. No se detectaron otros tipos de virus infeccioso. Recuperaciones de poliovirus de las aguas subterráneas y de grado reactivo cumplan las 1615 criterios de aceptación de rendimiento método USEPA tanto para la Evaluación del Desempeño (PE; es decir, las muestras de agua sin semillas de grado reactivo con títulos desconocidos a un analista que se utilizan para evaluar el desempeño del analista antes del inicio de un estudio) y muestras (LFB materiales suplementarios Tabla S1). La recuperación del 58% de las aguas subterráneas mediante el procedimiento de cultivo es similar a la reportada por otros que usan el agua del grifo 23,24. La recuperación media de las muestras de la LFB 111% con un coeficiente de variación (CV) de 100% también se reunió con los criterios de aceptación de rendimiento del método a pesar de ser mayor que la observada para las muestras de PE during del ICR. ICR recuperación media entre laboratorios era 56% con un coeficiente de variación (CV) de 92%, mientras que las recuperaciones medias intralaboratorio variaron desde 36 hasta 85% (CV 58 a 131%; datos no publicados de la base de datos ICR PE). Se observaron mayores recuperaciones en este estudio para la baja de semillas muestras LFB que para las muestras de semillas más altas (122 frente a 42%). En el momento en que el ICR se estaba planeando, se esperaba que las muestras de PE que reciben valores bajos de semillas tendrían la recuperación de un menor que aquellos que recibieron semillas de alto. Similar a la observada aquí por las muestras de la LFB, la recuperación de poliovirus para muestras ICR PE eran 71% (CV 100%), 54% (CV 69%), y el 44% (CV 71%) para los valores de semilla ≤300 MPN, 300- 1.500 RPM, y&gt; 1.500 RPM, respectivamente. Hay muchos métodos para la medición de virus infeccioso en muestras de agua 25. Este método es significativa con respecto a otros métodos en el grado de estandarización. La normalización no sólo incluye los controles de calidad y rendimiento,pero también utiliza volúmenes y fórmulas definidas para garantizar que todos los laboratorios analíticos realizar el método de forma idéntica. Sin la normalización, es difícil comparar los resultados entre laboratorios, y por lo tanto la normalización es esencial cuando se realizan estudios a gran escala en varios laboratorios de análisis. Con la estandarización incorporado en este método podría ampliarse en el futuro para incluir tipos adicionales del virus y líneas celulares. La investigación está en marcha para proporcionar datos para la inclusión de adenovirus en el método.

A correction was made to: <a href="www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/video/52437">EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. II. Total Culturable Virus Assay</a>. The values for Reagent Grade Water shown in Figure 2 were changed from a mean value of 111% with a standard error of 8% to a mean value of 82% with a standard error of 26%.
The penultimate sentence of the last paragraph of the Representative Results section was changed from:
 These controls performed similarly with a mean recovery of 111% and a coefficient of variation of 100% (Figure 2), 
 
 to: 
 
 These controls had a mean recovery of 82% and a coefficient of variation of 110% (Figure 2).
 
The third sentence of the fourth paragraph of the Discussion section was changed from:
 The mean recovery from the LFB samples of 111% with a coefficient of variation (CV) of 100% also met the method performance acceptance criteria even though they are higher than that observed for PE samples during the ICR, 
 
 to: 
 
 The mean recovery from the LFB samples of 82% with a coefficient of variation (CV) of 110% also met the method performance acceptance criteria even though they are higher than that observed for PE samples during the ICR.

A correction was made to: <a href="www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/video/52437">EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. II. Total Culturable Virus Assay</a>. The values for Reagent Grade Water shown in Figure 2 were changed from a mean value of 111% with a standard error of 8% to a mean value of 82% with a standard error of 26%.

Erratum: EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. II. Total Culturable Virus Assay

Los virus entéricos son un grupo diverso de virus que infectan el sistema intestinal humano y que se transmiten a través de la vía fecal-oral. Estos virus entran en las aguas superficiales y subterráneas a través de la planta de tratamiento de aguas residuales y efluentes de fosas sépticas, pozos sépticos incorrectamente diseñados o rotas, líneas de alcantarillado rotos, derrames de aguas negras combinadas, y otras fuentes puntuales y no puntuales 1-4. Las infecciones humanas y las enfermedades transmitidas por el agua de los virus se producen a través del consumo de agua contaminada o no adecuadamente desinfectada o por contacto de las aguas recreativas. síntomas de la enfermedad pueden implicar leve a severa; gastroenteritis conjuntivitis; fiebre; distrés respiratorio superior; la mano, la fiebre aftosa; miocarditis; meningitis aséptica; encefalitis; parálisis; sepsis 5-8, y la muerte 9,10. Método USEPA 1615 proporciona un procedimiento para medir partículas de virus entéricos infecciosas en aguas ambientales y de agua potable. Estas aguas pueden contener unamezcla de viriones infecciosos y no infecciosos, pero sólo las partículas infecciosas representan un peligro potencial para la salud. Partículas de virus infecciosas pierden infectividad con el tiempo en las aguas ambientales y beber de pérdida de la integridad de la cápside de proteínas, daños a los ácidos nucleicos debido a la radiación UV de la luz solar, y el daño debido a desinfectantes que pueden estar presentes 11 a 13. El procedimiento de virus cultivables total proporcionada en el método se basa en la producción de efectos citopáticos (CPE) en la línea celular de riñón de mono verde de Buffalo (BGM). Esta línea celular fue elegido debido a su amplio uso en el campo de la virología ambiental 14,15, a pesar de que la gama de tipos de virus infecciosos detectados se limita principalmente a ciertos enterovirus 15. El propósito de este trabajo es describir los procedimientos del Método 1615 para la elución de los filtros de cartucho electropositivo de cinco pulgadas, la concentración secundaria, y la medición de los virus cultivables totales. Una evaluación de lamétodo global se describe en Cashdollar et al. 16.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="624">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Name of the reagent</td>
			<td style="width:120px;">Company</td>
			<td style="width:143px;">Catalogue number</td>
			<td style="width:149px;">Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Beef extract, desiccated powder</td>
			<td style="width:120px;">BD Bacto</td>
			<td style="width:143px;">211520</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Cryogenic tubes</td>
			<td style="width:120px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:143px;">3775/945373</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Hank&#8217;s balanced salt solution</td>
			<td style="width:120px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:143px;">14170-112</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Mechanical rocking platform</td>
			<td style="width:120px;">Daigger</td>
			<td style="width:143px;">EF4907G</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Orbital shaker</td>
			<td style="width:120px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:143px;">14-285-729</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Sterilizing filter with prefilter</td>
			<td style="width:120px;">VWR</td>
			<td style="width:143px;">28143-295</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Sterilizing syringe filter</td>
			<td style="width:120px;">Corning</td>
			<td style="width:143px;">431219</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">pH Standards</td>
			<td style="width:120px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">33643, 33646, 33648</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">MEM</td>
			<td style="width:120px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">M1018 or M4642</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Leibovitz L-15</td>
			<td style="width:120px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">L4386</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Sodium bicarbonate, 7.5%</td>
			<td style="width:120px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">S8761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:120px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:143px;">10082-139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Antibiotic-Antimycotic</td>
			<td style="width:120px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:143px;">15240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Trypsin, EDTA</td>
			<td style="width:120px;">Invitrogen</td>
			<td>25200072</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

epa method 1615. measurement of enterovirus and norovirus occurrence in water by culture and rt-qpcr. ii. total culturable virus assay

A standardized method is required when national studies on virus occurrence in environmental and drinking waters utilize multiple analytical laboratories. The U.S Environmental Protection Agency&#8217;s (USEPA) Method 1615 was developed with the goal of providing such a standard for measuring Enterovirus and Norovirus in these waters. Virus is concentrated from water using an electropositive filter, eluted from the filter surface with beef extract, and then concentrated further using organic flocculation. Herein we present the protocol from Method 1615 for filter elution, secondary concentration, and measurement of total culturable viruses. A portion of the concentrated eluate from each sample is inoculated onto ten replicate flasks of Buffalo Green Monkey kidney cells. The number of flasks demonstrating cytopathic effects is used to quantify the most probable number (MPN) of infectious units per liter. The method uses a number of quality controls to increase data quality and to reduce interlaboratory and intralaboratory variation. Laboratories must meet defined performance standards. Method 1615 was evaluated by examining virus recovery from reagent-grade and ground waters seeded with Sabin poliovirus type 3. Mean poliovirus recoveries with the total culturable assay were 111% in reagent grade water and 58% in groundwaters.

El virus se concentra a partir de la fuente de agua subterránea tres plantas de tratamiento de agua potable y una privada, así que utilizan filtros electropositivos. Dos conjuntos de la muestra, que consta de una muestra de campo y control LFSM, se recogieron de las plantas de tratamiento en ocasiones separadas, y un conjunto de muestras se recogieron desde el pozo privado. La recuperación total del virus se determinó utilizando muestras LFSM de dos de las plantas y el pozo privado (dos muestras de una planta y una muestra de otro fueron excluidos del cálculo porque el valor de la MPN de la semilla utilizada con cada muestra no se pudo determinar con precisión debido a los resultados de CPE anormales entre matraces replicados). La media de recuperación de poliovirus a partir de muestras de aguas subterráneas promedio de 58% con un coeficiente de variación del 79% (Figura 2) 16. No virus cultivables se detectó en ninguna de las muestras de campo de aguas subterráneas cabeza de serie duplicados. el funcionamiento del método también se midió utilizando LFB sejemplos modificados mediante el uso de dos niveles de semillas diferentes. Se utilizó un título de &quot;baja&quot; de 300 NMP de poliovirus para evaluar el rendimiento en niveles inferiores al nivel 500 &quot;estándar&quot; NPF LFB utilizado en el método USEPA 1615. Un &quot;alto&quot; título de 1,000 NMP de poliovirus se utilizó para probar el rendimiento en el nivel del control LFSM. Estos controles a cabo de manera similar con una recuperación media del 111% y un coeficiente de variación de 100% (Figura 2). Todas las muestras fueron negativas LRB y todas las muestras LFB realizan dentro del rango de aceptación (material complementario el cuadro S1). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52437/52437fig1.jpg" /> Se muestra la Figura 1. La elución de filtro. Un esquema para el uso de un recipiente a presión para la elución filtro de cartucho. presión de aire positiva se utiliza para empujar solución de extracto de carne en el recipiente de presión a través del con alojamiento de cartuchocontiene el filtro de cartucho electropositivo. Una bomba peristáltica puede ser sustituido por el recipiente de presión, con la entrada de la bomba se coloca en el recipiente que contiene la solución de extracto de carne de vacuno. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52437/52437fig2.jpg" /> Figura 2. Media Poliovirus Recuperación (%) del suelo y el agua de grado reactivo. La recuperación media por ciento se muestra para el poliovirus de suelo ( <img alt="figura 3" src="/files/ftp_upload/52437/52437fig3.jpg" /> ; n = 4) y de grado reactivo agua ( <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52437/52437fig4.jpg" /> ; n = 12) muestras. Las doce muestras de agua de grado reactivo incluyen seis sembró con 300 MPN y se sembró con seis 1,000 NMP de poliovirus. Las barras de error representan el error estándar.

Watch this Scientific Journal Video about EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. II. Total Culturable Virus Assay at JoVE.com

EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. II. Total Culturable Virus Assay

Here we present a procedure to measure total culturable viruses using the Buffalo Green Monkey kidney cell line. The procedure provides a standardized tool for measuring the occurrence of infectious viruses in environmental and drinking waters.

Método EPA 1615. La medición de enterovirus y la aparición norovirus en agua por cultura y RT-qPCR. II. Ensayo Virus Culturable total

A standardized method is required when national studies on virus occurrence in environmental and drinking waters utilize multiple analytical laboratories. ...

epa-method-1615-measurement-enterovirus-norovirus-occurrence-water

Research

JoVE Journal

Environment

8.7K vistas.  U.S. Environmental Protection Agency. Here we present a procedure to measure total culturable viruses using the Buffalo Green Monkey kidney cell line. The procedure provides a standardized tool for measuring the occurrence of infectious viruses in environmental and drinking waters.

Video: EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. II. Total Culturable Virus Assay

A Small Volume Procedure for Viral Concentration from Water

Small-scale concentration of viruses (sample volumes 1-10 L, here simulated with spiked 100 ml water samples) is an efficient, cost-effective way to identify optimal parameters for virus concentration. Viruses can be concentrated from water using filtration (electropositive, electronegative, glass wool or size exclusion), followed by secondary concentration with beef extract to release viruses from filter surfaces, and finally tertiary concentration resulting in a 5-30 ml volume virus concentrate. In order to identify optimal concentration procedures, two different electropositive filters were evaluated (a glass/cellulose filter [1MDS] and a nano-alumina/glass filter [NanoCeram]), as well as different secondary concentration techniques; the celite technique where three different celite particle sizes were evaluated (fine, medium and large) followed by comparing this technique with that of the established organic flocculation method. Various elution additives were also evaluated for their ability to enhance the release of adenovirus (AdV) particles from filter surfaces. Fine particle celite recovered similar levels of AdV40 and 41 to that of the established organic flocculation method when viral spikes were added during secondary concentration. The glass/cellulose filter recovered higher levels of both, AdV40 and 41, compared to that of a nano-alumina/glass fiber filter. Although not statistically significant, the addition of 0.1% sodium polyphosphate amended beef extract eluant recovered 10% more AdV particles compared to unamended beef extract.

An approach was developed for identifying optimal viral concentration conditions for small volume water samples using spikes of human adenovirus. The techniques described here are used to identify concentration parameters for other viral targets, and applied to large-scale viral concentration experimentation.

Un procedimiento de volumen pequeño para la concentración viral del Agua

Small-scale concentration of viruses (sample volumes 1-10 L, here simulated with spiked 100 ml water samples) is an efficient, cost-effective way to ...

Investigación

Medio ambiente

EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. I. Collection of Virus Samples

EPA Method 1615 was developed with a goal of providing a standard method for measuring enteroviruses and noroviruses in environmental and drinking waters. The standardized sampling component of the method concentrates viruses that may be present in water by passage of a minimum specified volume of water through an electropositive cartridge filter. The minimum specified volumes for surface and finished/ground water are 300 L and 1,500 L, respectively. A major method limitation is the tendency for the filters to clog before meeting the sample volume requirement. Studies using two different, but equivalent, cartridge filter options showed that filter clogging was a problem with 10% of the samples with one of the filter types compared to 6% with the other filter type. Clogging tends to increase with turbidity, but cannot be predicted based on turbidity measurements only. From a cost standpoint one of the filter options is preferable over the other, but the water quality and experience with the water system to be sampled should be taken into consideration in making filter selections.

EPA Method 1615 uses an electropositive filter to concentrate enteroviruses and noroviruses in environmental and drinking waters. This manuscript describes the procedure for collecting samples for Method 1615 analyses.

Método EPA 1615. La medición de enterovirus y norovirus Ocurrencia en agua por cultura y RT-qPCR. I. Colección de ejemplos de virus

EPA Method 1615 was developed with a goal of providing a standard method for measuring enteroviruses and noroviruses in environmental and drinking waters. ...

EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. Part III. Virus Detection by RT-qPCR

EPA Method 1615 measures enteroviruses and noroviruses present in environmental and drinking waters. This method was developed with the goal of having a standardized method for use in multiple analytical laboratories during monitoring period 3 of the Unregulated Contaminant Monitoring Rule. Herein we present the protocol for extraction of viral ribonucleic acid (RNA) from water sample concentrates and for quantitatively measuring enterovirus and norovirus concentrations using reverse transcription-quantitative PCR (RT-qPCR). Virus concentrations for the molecular assay are calculated in terms of genomic copies of viral RNA per liter based upon a standard curve. The method uses a number of quality controls to increase data quality and to reduce interlaboratory and intralaboratory variation. The method has been evaluated by examining virus recovery from ground and reagent grade waters seeded with poliovirus type 3 and murine norovirus as a surrogate for human noroviruses. Mean poliovirus recoveries were 20% in groundwaters and 44% in reagent grade water. Mean murine norovirus recoveries with the RT-qPCR assay were 30% in groundwaters and 4% in reagent grade water.

Here we present a procedure to quantify enterovirus and norovirus in environmental and drinking waters using reverse transcription-quantitative PCR. Mean virus recovery from groundwater with this standardized procedure from EPA Method 1615 was 20% for poliovirus and 30% for murine norovirus.

Método EPA 1615. La medición de enterovirus y norovirus Ocurrencia en agua por cultura y RT-qPCR. Parte III. Detección de virus por RT-qPCR

EPA Method 1615 measures enteroviruses and noroviruses present in environmental and drinking waters. This method was developed with the goal of having a ...

A Duplex Digital PCR Assay for Simultaneous Quantification of the Enterococcus spp. and the Human Fecal-associated HF183 Marker in Waters

This manuscript describes a duplex digital PCR assay (EntHF183 dPCR) for simultaneous quantification of Enterococcus spp. and the human fecal-associated HF183 marker. The EntHF183 duplex dPCR (referred as EntHF183 dPCR hereon) assay uses the same primer and probe sequences as its published individual quantitative PCR (qPCR) counterparts. Likewise, the same water filtration and DNA extraction procedures as performed prior to qPCR are followed prior to running dPCR. However, the duplex dPCR assay has several advantages over the qPCR assays. Most important, the dPCR assay eliminates the need for running a standard curve and hence, the associated bias and variability, by direct quantification of its targets. In addition, while duplexing (i.e. simultaneous quantification) Enterococcus and HF183 in qPCR often leads to severe underestimation of the less abundant target in a sample, dPCR provides consistent quantification of both targets, whether quantified individually or simultaneously in the same reaction. The dPCR assay is also able to tolerate PCR inhibitor concentrations that are one to two orders of magnitude higher than those tolerated by qPCR. These advantages make the EntHF183 dPCR assay particularly attractive because it simultaneously provides accurate and repeatable information on both general and human-associated fecal contamination in environmental waters without the need to run two separate qPCR assays. Despite its advantages over qPCR, the upper quantification limit of the dPCR assay with currently available instrumentation is approximately four orders of magnitude lower than that achievable by qPCR. Consequently, dilution is needed for measurement of high concentrations of target organisms such as those typically observed following sewage spills.

A Duplex Digital PCR Assay for Simultaneous Quantification of the Enterococcus spp. and the Human Fecal-associated HF183 Marker in Waters

This manuscript describes a duplex digital PCR assay that can be used to simultaneously quantify Enterococcus spp. and the HF183 genetic markers as indicators of general and human-associated fecal contamination in recreational waters.

Un ensayo de PCR digital de dos vías para la cuantificación simultánea de la<em&gt; Enterococcus spp.</em&gt; Y el marcador asociado HF183-fecal humana en las aguas

This manuscript describes a duplex digital PCR assay (EntHF183 dPCR) for simultaneous quantification of Enterococcus spp. and the human fecal-associated ...

VacuSIP, an Improved InEx Method for In Situ Measurement of Particulate and Dissolved Compounds Processed by Active Suspension Feeders

Benthic suspension feeders play essential roles in the functioning of marine ecosystems. By filtering large volumes of water, removing plankton and detritus, and excreting particulate and dissolved compounds, they serve as important agents for benthic-pelagic coupling. Accurately measuring the compounds removed and excreted by suspension feeders (such as sponges, ascidians, polychaetes, bivalves) is crucial for the study of their physiology, metabolism, and feeding ecology, and is fundamental to determine the ecological relevance of the nutrient fluxes mediated by these organisms. However, the assessment of the rate by which suspension feeders process particulate and dissolved compounds in nature is restricted by the limitations of the currently available methodologies. Our goal was to develop a simple, reliable, and non-intrusive method that would allow clean and controlled water sampling from a specific point, such as the excurrent aperture of benthic suspension feeders, in situ. Our method allows simultaneous sampling of inhaled and exhaled water of the studied organism by using minute tubes installed on a custom-built manipulator device and carefully positioned inside the exhalant orifice of the sampled organism. Piercing a septum on the collecting vessel with a syringe needle attached to the distal end of each tube allows the external pressure to slowly force the sampled water into the vessel through the sampling tube. The slow and controlled sampling rate allows integrating the inherent patchiness in the water while ensuring contamination free sampling. We provide recommendations for the most suitable filtering devices, collection vessel, and storing procedures for the analyses of different particulate and dissolved compounds. The VacuSIP system offers a reliable method for the quantification of undisturbed suspension feeder metabolism in natural conditions that is cheap and easy to learn and apply to assess the physiology and functional role of filter feeders in different ecosystems.

VacuSIP, an Improved InEx Method for In Situ Measurement of Particulate and Dissolved Compounds Processed by Active Suspension Feeders

We introduce the VacuSIP, a simple, non-intrusive, and reliable method for clean and accurate point sampling of water. The system was developed and evaluated for the simultaneous collection of the water inhaled and exhaled by benthic suspension feeders in situ, to cleanly measure removal and excretion of particulate and dissolved compounds.

VacuSIP, un método mejorado para InEx<em&gt; In Situ</em&gt; Medición de las partículas y compuestos disueltos procesada por Alimentadores Active Suspension

Benthic suspension feeders play essential roles in the functioning of marine ecosystems. By filtering large volumes of water, removing plankton and ...

Optimized Procedure for Determining the Adsorption of Phosphonates onto Granular Ferric Hydroxide using a Miniaturized Phosphorus Determination Method

This paper introduces a procedure to investigate the adsorption of phosphonates onto iron-containing filter materials, particularly granular ferric hydroxide (GFH), with little effort and high reliability. The phosphonate, e.g., nitrilotrimethylphosphonic acid (NTMP), is brought into contact with the GFH in a rotator in a solution buffered by an organic acid (e.g., acetic acid) or Good buffer (e.g., 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid) [MES] and N-cyclohexyl-2-hydroxyl-3-aminopropanesulfonic acid [CAPSO]) in a concentration of 10 mM for a specific time in 50 mL centrifuge tubes. Subsequently, after membrane filtration (0.45 &#181;m pore size), the total phosphorus (total P) concentration is measured using a specifically developed determination method (ISOmini). This method is a modification and simplification of the ISO 6878 method: a 4 mL sample is mixed with H2SO4 and K2S2O8 in a screw cap vial, heated to 148-150 &#176;C for 1 h and then mixed with NaOH, ascorbic acid and acidified molybdate with antimony(III) (final volume of 10 mL) to produce a blue complex. The color intensity, which is linearly proportional to the phosphorus concentration, is measured spectrophotometrically (880 nm). It is demonstrated that the buffer concentration used has no significant effect on the adsorption of phosphonate between pH 4 and 12. The buffers, therefore, do not compete with the phosphonate for adsorption sites. Furthermore, the relatively high concentration of the buffer requires a higher dosage concentration of oxidizing agent (K2S2O8) for digestion than that specified in ISO 6878, which, together with the NaOH dosage, is matched to each buffer. Despite the simplification, the ISOmini method does not lose any of its accuracy compared to the standardized method.

This paper introduces a procedure to investigate the adsorption of phosphonates onto iron-containing filter materials, particularly granular ferric hydroxide, with little effort and high reliability. In a buffered solution, the phosphonate is brought into contact with the adsorbent using a rotator and then analyzed via a miniaturized phosphorus determination method.

Procedimiento optimizado para la determinación de la adsorción de los fosfonatos en hidróxido férrico Granular utilizando un método de determinación de fósforo miniaturizados

This paper introduces a procedure to investigate the adsorption of phosphonates onto iron-containing filter materials, particularly granular ferric ...

Detection of Tilapia Lake Virus Using Conventional RT-PCR and SYBR Green RT-qPCR

The aim of this method is to facilitate the fast, sensitive and specific detection of Tilapia Lake Virus (TiLV) in tilapia tissues. This protocol can be used as part of surveillance programs, biosecurity measures and in TiLV basic research laboratories. The gold standard of virus diagnostics typically involves virus isolation followed by complementary techniques such as reverse-transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) for further verification. This can be cumbersome, time-consuming and typically requires tissue samples heavily infected with virus. The use of RT-quantitative (q)PCR in the detection of viruses is advantageous because of its quantitative nature, high sensitivity, specificity, scalability and its rapid time to result. Here, the entire method of PCR based approaches for TiLV detection is described, from tilapia organ sectioning, total ribonucleic acid (RNA) extraction using a guanidium thiocyanate-phenol-chloroform solution, RNA quantification, followed by a two-step PCR protocol entailing, complementary deoxyribonucleic acid (cDNA) synthesis and detection of TiLV by either conventional PCR or quantitative identification via qPCR using SYBR green I dye. Conventional PCR requires post-PCR steps and will simply inform about the presence of the virus. The latter approach will allow for absolute quantification of TiLV down to as little as 2 copies and thus is exceptionally useful for TiLV diagnosis in sub-clinical cases. A detailed description of the two PCR approaches, representative results from two laboratories and a thorough discussion of the critical parameters of both have been included to ensure that researchers and diagnosticians find their most suitable and applicable method of TiLV detection.

This protocol diagnoses Tilapia Lake Virus (TiLV) in tilapia tissues using RT-PCR methodologies. The entire method is described from tissue dissection to total RNA extraction, followed by cDNA synthesis and detection of TiLV by either conventional PCR or quantitative PCR using dsDNA binding a fluorescent binding dye.

Detección de Tilapia lago Virus usando RT-PCR convencional y SYBR Green RT-qPCR

The aim of this method is to facilitate the fast, sensitive and specific detection of Tilapia Lake Virus (TiLV) in tilapia tissues. This protocol can be ...

Microplot Design and Plant and Soil Sample Preparation for 15Nitrogen Analysis

Many&#160;nitrogen fertilizer studies evaluate the overall effect of a treatment on end-of-season measurements such as grain yield or cumulative N losses. A stable isotope approach is necessary to follow and quantify the fate of fertilizer derived N (FDN) through the soil-crop system. The purpose of this paper is to describe a small-plot research&#160;design utilizing non-confined 15N enriched microplots for multiple soil and plant sampling events over two growing seasons and provide sample collection, handling, and processing protocols for total 15N analysis. The methods were demonstrated using a replicated study from south-central Minnesota planted to corn (Zea mays L.). Each treatment consisted of six corn rows (76 cm row-spacing) 15.2 m long with a microplot (2.4 m by 3.8 m) embedded at one end. Fertilizer-grade urea was applied at 135 kg N&#8729;ha-1 at planting, while the microplot received urea enriched to 5 atom % 15N. Soil and plant samples were taken several times throughout the growing season, taking care to minimize cross-contamination by using separate tools and physically separating unenriched and enriched samples during all procedures. Soil and plant samples were dried, ground to pass through a 2 mm screen, and then ground to a flour-like consistency using a roller jar mill. Tracer studies require additional planning, sample processing time and manual labor, and incur higher costs for 15N enriched materials and sample analysis than traditional N studies. However, using the mass balance approach, tracer studies with multiple in-season sampling events allow the researcher to estimate FDN distribution through the soil-crop system and estimate unaccounted-for FDN from the system.

Microplot Design and Plant and Soil Sample Preparation for 15Nitrogen Analysis

A microplot design for 15N tracer research is described to accommodate multiple in-season plant and soil sampling events. Soil and plant sample collection and processing procedures, including grinding and weighing protocols, for 15N analysis are put forth.

Diseño de microparplots y preparación de muestras de plantas y suelos para 15 análisisde nitrógeno

Many&#160;nitrogen fertilizer studies evaluate the overall effect of a treatment on end-of-season measurements such as grain yield or cumulative N losses. ...

Electrostatic Method to Remove Particulate Organic Matter from Soil

Estimations of soil organic carbon are dependent on soil processing methods including removal of undecomposed plant material. Inadequate separation of roots and plant material from soil can result in highly variable carbon measurements. Methods to remove the plant material are often limited to the largest, most visible plant materials. In this manuscript we describe how electrostatic attraction can be used to remove plant material from a soil sample. An electrostatically charged surface passed close to dry soil naturally attracts both undecomposed and partially decomposed plant particles, along with a small quantity of mineral and aggregated soil. The soil sample is spread in a thin layer on a flat surface or a soil sieve. A plastic or glass Petri dish is electrostatically charged by rubbing with polystyrene foam or nylon or cotton cloth. The charged dish is passed repeatedly over the soil. The dish is then brushed clean and recharged. Re-spreading the soil and repeating the procedure eventually results in a diminishing yield of particulates. The process removes about 1 to 5% of the soil sample, and about 2 to 3 times that proportion in organic carbon. Like other particulate removal methods, the endpoint is arbitrary and not all free particulates are removed. The process takes approximately 5 min and does not require a chemical process as do density flotation methods. Electrostatic attraction consistently removes material with higher than average C concentration and C:N ratio, and much of the material can be visually identified as plant or faunal material under a microscope.

Removing recently deposited and incompletely decomposed plant material from soil samples reduces the influence of temporary seasonal inputs on soil organic carbon measurements. Attraction to an electrostatically charged surface can be used to quickly remove a substantial amount of particulate organic matter.

Método electrostático para eliminar la materia orgánica particulada del suelo

Estimations of soil organic carbon are dependent on soil processing methods including removal of undecomposed plant material. Inadequate separation of ...

A Method to Preserve Wetland Roots and Rhizospheres for Elemental Imaging

Roots extensively interact with their soil environment but visualizing such interactions between roots and the surrounding rhizosphere is challenging. The rhizosphere chemistry of wetland plants is particularly challenging to capture because of steep oxygen gradients from the roots to the bulk soil. Here a protocol is described that effectively preserves root structure and rhizosphere chemistry of wetland plants through slam-freezing and freeze drying. Slam-freezing, where the sample is frozen between copper blocks pre-cooled with liquid nitrogen, minimizes root damage and sample distortion that can occur with flash-freezing while still minimizing chemical speciation changes. While sample distortion is still possible, the ability to obtain multiple samples quickly and with minimal cost increases the potential to obtain satisfactory samples and optimizes imaging time. The data show that this method is successful in preserving reduced arsenic species in rice roots and rhizospheres associated with iron plaques. This method can be adopted for studies of plant-soil relationships in a wide variety of wetland environments that span concentration ranges from trace-element cycling to phytoremediation applications.

We describe a protocol to sample, preserve, and section intact roots and the surrounding rhizosphere soil from wetland environments using rice (Oryza sativa L.) as a model species. Once preserved, the sample can be analyzed using elemental imaging techniques, such as synchrotron X-ray fluorescence (XRF) chemical speciation imaging.

Un método para preservar las raíces y rizosferas de los humedales para imágenes elementales

Roots extensively interact with their soil environment but visualizing such interactions between roots and the surrounding rhizosphere is challenging. The ...

Método EPA 1615. La medición de enterovirus y la aparición norovirus en agua por cultura y RT-qPCR. II. Ensayo Virus Culturable total

Resumen

Explorar más videos

Capítulos en este video