Nos gustaría dar las gracias a Ying Yu para APC Min / + ratones genotipado. Este estudio fue apoyado por fondos del INSERM y donaciones (CA057621 y AI053194) de los Institutos Nacionales de Salud.

NOTA: Todos los experimentos con animales se realizaron de conformidad con los procedimientos aprobados por el Cuidado de Animales y el empleo Comisión Institucional (IACUC), UCSF. Todos los experimentos de imagen eran procedimientos no de supervivencia y los animales fueron sacrificados inmediatamente después del final de la adquisición de imágenes. 1. generación de ratones NOTA: APC Min / + ratones, portadores de una mutación en el gen Apc, desarrollan espontáneamente 50-100 adenomas en el intestino delgado. <ol><li> Cruz APC Min / + ratones con la línea de ACTB-ECFP, que expresa ECFP bajo el promotor de la actina, y además con la línea c-fms-EGFP, que expresa EGFP bajo el promotor c-fms para detectar las células mieloides. Los animales heterocigotos para ACTB-ECFP y c-fms-EGFP se utilizan para detectar la fluorescencia. </li><li> Utilice ratones a los 3-4 meses de edad para imagen adenomas claramente detectables. </li></ol> 2 Preparación de Materiales antes de la cirugía NOTA: Los detalles de la configuración de microscopio han sido previamente descrito 6,7. <ol><li> Microscopio <ol><li> Encienda la manta calefactora. Encienda el láser de argón para 488 nm de excitación y el de estado sólido de 405 nm, 561 nm y 640 nm láseres. Encienda el microscopio, la unidad de control de disco giratorio, el AOTF, la unidad de control de láser, y el controlador de la cámara. </li><li> Abra el obturador microscopio, lo que convierte el LED rojo. Encienda el ordenador y el software de la cámara. </li></ol></li><li> Plataforma de Imagen <ol><li> Asegúrese de que el inserto etapa es limpio. De lo contrario, limpia con agua y jabón y luego secar. </li><li> Tome dos cubreobjetos y utilice cinta de laboratorio para fijarlos en el inserto. Coloque el inserto en el escenario y limpiar con toallitas con alcohol. </li><li> Con la cinta de laboratorio, adjuntar la manta de calentamiento a la parte derecha de la etapa. </li><li> Verificar la integridad de la membrana de goma en el cono de la nariz y cambiarlo si necessary. Posición y fijar el cono de la nariz para la administración de anestesia con isoflurano al animal mediante el uso de una gasa y cinta de laboratorio. </li></ol></li><li> El isoflurano Sistema de Anestesia <ol><li> Vuelva a llenar el tanque de isoflurano. </li><li> Encienda el vacío y ajustar a 1,2 l / min. </li><li> Añadir agua destilada hasta el nebulizador y conectar el nebulizador para el sistema de isoflurano. </li><li> Encienda el analizador de oxígeno y conectarlo al sistema de isoflurano. A su vez en el tanque de oxígeno y asegurar que el analizador de oxígeno muestra 100%. Ajuste el flujo de O 2 a 0,2 L / min. </li><li> Encienda el tanque de nitrógeno y ajustar el flujo a 0,8 L / min. Asegúrese de que el analizador de oxígeno muestra un 21%. </li></ol></li><li> Preparación de Herramientas de la cirugía y la Plataforma <ol><li> Limpie 2 pares de pinzas de disección y tijeras con agua y jabón. </li><li> Encienda el esterilizador de cuentas en caliente y se deja alcanzar 250 ° C. Esterilice los instrumentos de cirugía durante 30 segundos. Dejarlas enfriar. </li><li> Coloque un remojo de laboratorio en el banco de la cirugía. </li><li> Use una tapa de espuma de poliestireno como plataforma quirúrgica. Cubra con un pedazo de remojo laboratorio. Preparar una segunda pieza de remojo laboratorio a cambiar después de afeitar el ratón. </li><li> Coloque el cono de la nariz con la línea de la anestesia en la tapa de espuma de poliestireno cubierta, y adjuntarlo a la tapa de espuma de poliestireno (no en el laboratorio de remojo) con un poco de cinta y utilizar dos agujas a ambos lados del cono de la nariz para mantenerla en su lugar. </li><li> Ensamble betadine, toallitas de alcohol, gasas estériles, super pegamento, portaobjetos, máquina de afeitar eléctrica, y 4 unidades de cinta de laboratorio. </li></ol></li></ol> 3 Preparación de las inyecciones <ol><li> Bajo el capó, preparar una jeringa de insulina (28 G x ½ in) con 7 l de conjugado de stock AF647 Ly-6G (Gr1) de anticuerpos (1 mg / ml) en 100 l de 2000 kDa-rodamina dextrano (4 mg / ml ) para inyección retro-orbital. Inyección retro-orbital se recomienda en APC Min / + ratones ya que la anemia que se desarrolla en estos animales hace que la difficu venas de la colaLT para detectar a través de la piel. </li><li> Preparar una segunda jeringa de insulina con 1 mg / kg de atropina diluido en 150 l de PBS por vía subcutánea (sc) antes de la inyección de imágenes para amortiguar los movimientos peristálticos del intestino. </li></ol> 4 Preparación del intestino for Imaging <ol><li> Verifique que la línea de la anestesia a la cámara de inducción está abierto, y las líneas a la mesa de operaciones y el microscopio están cerrados. </li><li> Transferir el animal a la cámara de anestesia. Cierre la cámara de anestesia y encienda el isoflurano y el 4% (con 21% O 2). </li><li> Cuando el ratón se respira profunda y lentamente (después de 5-6 min), la transferencia a la fase quirúrgica en su flanco e inyectar la solución de anticuerpos Gr1 y / o solución de dextrano retro-orbital. </li><li> Abra la línea de la anestesia vinculado a la plataforma quirúrgica. Cierre de la línea a la cámara de anestesia y poner el ratón sobre su espalda con su nariz en el cono de la anestesia. </li><li> Reducir el isofluranoconcentración de 4% a 2,5%. </li><li> Verifique que el ratón está bien anestesiado pellizcando su almohadilla plantar y probar el reflejo corneal. </li><li> Añadir ungüento oftálmico lubricante en los ojos para evitar la sequedad, mientras que bajo anestesia. </li><li> Asegure las extremidades del ratón a la etapa quirúrgica mediante la adición de cinta de laboratorio. </li><li> Quite el pelo de la superficie ventral utilizando una máquina de afeitar eléctrica. También quite el pelo de la extremidad posterior izquierda para colocar el oxímetro antes de la adquisición. Retire el remojo de laboratorio de la etapa quirúrgica y reemplazar por uno limpio para evitar la contaminación del cabello. </li><li> Desinfectar la superficie ventral con toallitas con alcohol y betadine. </li><li> Se inyecta la solución de atropina (de 3.2) sc en un flanco del ratón. </li><li> Hacer un 1 cm incisión de línea media ventral a través de la piel y el peritoneo mediante el uso de tijeras y un par de fórceps. Tire con cuidado de 3-4 cm de intestino e identificar uno o varios tumores a la imagen. </li><li> Tome un vaso micrdiapositiva oscope y la posición de un bucle del intestino en él con un tumor en la parte superior. </li><li> Añadir un poco de pegamento súper a unos pocos lugares a lo largo del intestino para adjuntarlo a la diapositiva. Espere un minuto para que el pegamento se seque. Use un marcador para dibujar una línea en la diapositiva que apunta al tumor con el fin de facilitar su localización con el confocal. </li></ol> 5. Posicionamiento del ratón en el escenario y Preparación para la Adquisición de imágenes <ol><li> Retire la cinta de laboratorio a partir de las extremidades. </li><li> Abra la línea de anestesia para la platina del microscopio y cerrar la una a la plataforma quirúrgica. </li><li> Transferir el ratón con cuidado a la platina del microscopio con su lado ventral hacia abajo y la nariz en el cono de la nariz. Asegure la línea de la anestesia con un poco de cinta de laboratorio. </li><li> Vuelva a colocar el ratón y / o la diapositiva con el fin de tener el intestino en el centro de una de las ventanas de cubierta con engobe. Cinta suavemente por el tobogán con cinta laboratorio. </li><li> Conecte la sonda del oxímetro a la extremidad izquierda del ratón parasiga su corazón y los niveles de tasas y saturación arterial de oxígeno respiratorias. </li><li> Cubra el ratón en la manta eléctrica para evitar la hipotermia. </li><li> Disminuir la concentración de isoflurano del 2,5% al ​​1-1,5% para formación de imágenes. </li></ol> 6. Adquisición de Imágenes mediante μManager Software <ol><li> Aumentar la velocidad CSUX a 2.500 rpm para mejorar la calidad de la imagen en los ajustes de configuración. </li><li> Utilice el menú desplegable para elegir Objetivo 10X 0,5 NA o 20X 0,75 lente objetivo NA Fluar. </li><li> Elija el láser 405 nm en el menú desplegable en color. </li><li> Haga clic en en vivo y ajustar el enfoque con el microscopio. </li><li> Haga clic en Automático para ajustar automáticamente la intensidad máxima y mínima de píxeles de la imagen de la pantalla sobre la base de los valores de los píxeles extremos en la imagen. Un histograma de intensidad de imagen de visualización de píxeles se presenta en el gráfico en la parte inferior de la ventana principal. </li><li> Ajuste la exposición de la cámara en la ventana Panel de control Piper porcambiando el número de relojes (Un reloj es 33,333 ms). </li><li> Si la señal es demasiado brillante con la exposición más bajo, disminuir la intensidad del láser utilizando la unidad de control del microscopio. </li><li> Compruebe la intensidad de la señal de 488 nm, 561 nm y 640 nm láser de líneas. Ajusta la intensidad del láser con propia unidad de control del láser (488 nm y 561 nm) o la unidad de control microscopio. </li><li> En la ventana Multi D Adquisición, marque la casilla de puntos de tiempo y escriba el número de puntos de tiempo y el intervalo de tiempo deseado. </li><li> Marque la casilla Z-pilas, elija &quot;Z relativa&quot; y definir Z-inicio y Z-final relativa a la posición actual. NOTA: Para 10X o 20X objetivo, empezar con 3 aviones Z, 8 micras o 4 micras aparte respectivamente. </li><li> Marque la casilla de posiciones múltiples (XY) para obtener imágenes de varios lugares, a continuación, haga clic en Editar lista de posiciones, marque 4 a 6 posiciones diferentes. </li><li> Marque la casilla de Canales y añadir canales de Nueva y seleccione láseres líneas desde el menú desplegable y tipe en la exposición para cada canal (en múltiplos de 33.333 mseg). </li><li> A consultar Guardar imágenes en la ventana de &quot;adquisición Multi D&quot;. </li><li> Seleccione una carpeta y todas las imágenes obtenidas se guardarán automáticamente en esta carpeta con el nombre de prefijo dado. NOTA: Cada adquisición continua se guardará en una subcarpeta separada como archivos TIFF individuales para cada rebanada Z en cada color en cada punto de tiempo. </li><li> Guarde todos los ajustes, haga clic en Guardar configuración en la ventana Multi D Adquisición. </li><li> Haga clic en Adquirir en la ventana de adquisición multi-dimensional para iniciar la adquisición. </li><li> Si la sonda de oxímetro no se usa o deja de funcionar bien (cuando el pulso no es estable o difícil de detectar), comprobar la eficacia de la anestesia cada 15 minutos durante el procedimiento de imagen pellizcando la almohadilla plantar y comprobando el reflejo corneal. Ajuste la anestesia si el ratón es sensible a estos estímulos. </li><li> Después de la adquisición, la eutanasia el ratón por el aumento de la concent isofluranoración a 5%. Cuando no hay movimientos respiratorios son detectables, quite el ratón desde el escenario y realizar una dislocación cervical. </li></ol> 7. Análisis de Imágenes mediante Imaris Software <ol><li> La conversión a .ims de Archivos (Figura 1A) <ol><li> Abra el software de la cámara, haga clic en Archivo y luego Batch Converter. </li><li> Haga clic en Agregar archivos y seleccione el primer archivo de la primera posición. Repita el procedimiento para cada posición. </li><li> Para cada archivo cargado, haga clic en Configuración y compruebe que la configuración &quot;T&quot; para Time, &quot;c&quot; para los canales y &quot;z&quot; de Z-pilas aparecen en ese orden. </li><li> Guardar en la carpeta deseada. Explorar y crear un nuevo archivo como convertir. </li><li> Haga clic en Set para todos y de inicio. </li></ol></li><li> Ajustes (que complementa la figura 1B) <ol><li> Ir a la carpeta Construcción específica y abrir el primer archivo. </li><li> En la ventana de ajuste de la pantalla, ajustar el fondoseñal de corte modificando el número mínima para cada canal si es necesario. </li><li> Si es necesario, ajustar la intensidad de la señal modificando el número Max (cuanto menor es el número máximo, mayor es la intensidad de la señal). NOTA: Los ajustes de la señal de intensidad / contraste permiten el punto culminante de un comportamiento de la célula o de un compartimento con el fin de tener una visualización más agradable. No cambia el resultado en sí. </li><li> Haga clic en Editar e imagen en Propiedades. </li><li> Cambie las x, y, y los valores z (para un objetivo de 10X, x e y = 0,712, z = 8 m; para un objetivo de 20X: x e y = 0,36, z = 4 micras). </li><li> Haga clic en Todos Equidistante para ajustar los puntos de tiempo. Añade la fecha de inicio y la hora de inicio de la adquisición. Añade la fecha de finalización y la hora de finalización de la adquisición (que complementa la figura 1C). </li><li> Haga clic en el botón Reproducir para ver la película. </li><li> Haga clic en Editar y Eliminar los puntos de tiempo para eliminar las imágenes borrosas. </li><li> Para unir dos adquisiciones separadas Together en una película, ir al último punto de la primera película de hora y haga clic en Editar&gt; Añadir puntos de tiempo para añadir el segundo archivo. </li></ol></li><li> Guardar como película (Figura 1D Complementario) <ol><li> Haga clic en Registro, seleccione la extensión mov y un factor de compresión de 0. </li><li> Haga clic en Guardar. </li></ol></li></ol>

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	<li>Hanahan, D., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hallmarks+of+cancer:+the+next+generation.">Hallmarks of cancer: the next generation.</a> Cell. 144 (5), 646-674 (2011).</li><li>Hanahan, D., Coussens, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accessories+to+the+crime:+functions+of+cells+recruited+to+the+tumor+microenvironment.">Accessories to the crime: functions of cells recruited to the tumor microenvironment.</a> Cancer Cell. 21 (3), 309-322 (2012).</li><li>Schouppe, E., De Baetselier, P., Van Ginderachter, J. A., Sarukhan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Instruction+of+myeloid+cells+by+the+tumor+microenvironment:+Open+questions+on+the+dynamics+and+plasticity+of+different+tumor-associated+myeloid+cell+populations.">Instruction of myeloid cells by the tumor microenvironment: Open questions on the dynamics and plasticity of different tumor-associated myeloid cell populations.</a> Oncoimmunology. 1 (7), 1135-1145 (2012).</li><li>Egeblad, M., Nakasone, E. S., Werb, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumors+as+organs:+complex+tissues+that+interface+with+the+entire+organism.">Tumors as organs: complex tissues that interface with the entire organism.</a> Dev Cell. 18 (6), 884-901 (2010).</li><li>Lohela, M., Werb, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+imaging+of+stromal+cell+dynamics+in+tumors.">Intravital imaging of stromal cell dynamics in tumors.</a> Curr Opin Genet Dev. 20 (1), 72-78 (2010).</li><li>Egeblad, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+stromal+cell+dynamics+in+different+tumor+microenvironments+by+spinning+disk+confocal+microscopy.">Visualizing stromal cell dynamics in different tumor microenvironments by spinning disk confocal microscopy.</a> Dis Model Mech. 1 (2-3), 155-167 (2008).</li><li>Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+long-term+in+vivo+imaging+of+tumor-stroma+interactions+in+mouse+models+of+breast+cancer+using+spinning-disk+confocal+microscopy.">Dynamic long-term in vivo imaging of tumor-stroma interactions in mouse models of breast cancer using spinning-disk confocal microscopy.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2011 (2), (2011).</li><li>Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+of+vital+signs+for+long-term+survival+of+mice+under+anesthesia.">Monitoring of vital signs for long-term survival of mice under anesthesia.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2011 (2), (2011).</li><li>Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+mice+for+long-term+intravital+imaging+of+the+mammary+gland.">Preparation of mice for long-term intravital imaging of the mammary gland.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2011 (2), (2011).</li><li>Nakasone, E. S., Askautrud, H. A., Egeblad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+drug+responses+in+the+tumor+microenvironment+in+mouse+models+of+breast+cancer.">Live imaging of drug responses in the tumor microenvironment in mouse models of breast cancer.</a> J Vis Exp. (73), e50088 (2013).</li><li>Nakasone, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+tumor-stroma+interactions+during+chemotherapy+reveals+contributions+of+the+microenvironment+to+resistance.">Imaging tumor-stroma interactions during chemotherapy reveals contributions of the microenvironment to resistance.</a> Cancer Cell. 21 (4), 488-503 (2012).</li><li>Walther, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+prognostic+and+predictive+markers+in+colorectal+cancer.">Genetic prognostic and predictive markers in colorectal cancer.</a> Nat Rev Cancer. 9 (7), 489-499 (2009).</li><li>Fearon, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+genetics+of+colorectal+cancer.">Molecular genetics of colorectal cancer.</a> Annu Rev Pathol. 6, 479-507 (2011).</li><li>Moser, A. R., Pitot, H. C., Dove, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dominant+mutation+that+predisposes+to+multiple+intestinal+neoplasia+in+the+mouse.">A dominant mutation that predisposes to multiple intestinal neoplasia in the mouse.</a> Science. 247 (4940), 322-324 (1990).</li><li>Su, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+intestinal+neoplasia+caused+by+a+mutation+in+the+murine+homolog+of+the+APC+gene.">Multiple intestinal neoplasia caused by a mutation in the murine homolog of the APC gene.</a> Science. 256 (5057), 668-670 (1992).</li><li>Watson, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+barrier+function+in+vivo+is+sustained+despite+gaps+in+epithelial+layers.">Epithelial barrier function in vivo is sustained despite gaps in epithelial layers.</a> Gastroenterology. 129 (3), 902-912 (2005).</li><li>McDole, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Goblet+cells+deliver+luminal+antigen+to+CD103++dendritic+cells+in+the+small+intestine.">Goblet cells deliver luminal antigen to CD103+ dendritic cells in the small intestine.</a> Nature. 483 (7389), 345-349 (2012).</li><li>Xu, C., Shen, Y., Littman, D. R., Dustin, M. L., Velazquez, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+mucosal+homeostasis+via+single-+and+multiphoton+intravital+fluorescence+microscopy.">Visualization of mucosal homeostasis via single- and multiphoton intravital fluorescence microscopy.</a> J Leukoc Biol. 92 (3), 413-419 (2012).</li><li>Haigis, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+effects+of+oncogenic+K-Ras+and+N-Ras+on+proliferation,+differentiation+and+tumor+progression+in+the+colon.">Differential effects of oncogenic K-Ras and N-Ras on proliferation, differentiation and tumor progression in the colon.</a> Nat Genet. 40 (5), 600-608 (2008).</li><li>Sansom, O. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+Apc+allows+phenotypic+manifestation+of+the+transforming+properties+of+an+endogenous+K-ras+oncogene+in+vivo.">Loss of Apc allows phenotypic manifestation of the transforming properties of an endogenous K-ras oncogene in vivo.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (38), 14122-14127 (2006).</li><li>Janssen, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=APC+and+oncogenic+KRAS+are+synergistic+in+enhancing+Wnt+signaling+in+intestinal+tumor+formation+and+progression.">APC and oncogenic KRAS are synergistic in enhancing Wnt signaling in intestinal tumor formation and progression.</a> Gastroenterology. 131 (4), 1096-1109 (2006).</li><li>Takaku, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+tumorigenesis+in+compound+mutant+mice+of+both+Dpc4+(Smad4)+and+Apc+genes.">Intestinal tumorigenesis in compound mutant mice of both Dpc4 (Smad4) and Apc genes.</a> Cell. 92 (5), 645-656 (1998).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

En este trabajo, un protocolo detallado se describe para la hilatura disco de imagen confocal de las dinámicas celulares mieloides en tumores intestinales durante varias horas en un animal vivo, fotografiados desde la parte serosa del intestino. Para evitar la inflamación y para tener condiciones fisiológicas óptimas, formación de imágenes del intestino tiene que ser hecho en el órgano intacto. Sin embargo, las imágenes desde el lado de la serosa del intestino es un reto, ya que la luz tiene que ir a través de diferentes capas de tejido, tales como el músculo liso antes de alcanzar el epitelio. Centrándose en el epitelio puede ser difícil en algunas áreas, particularmente en el reportero ratones actina-ECFP desde actina es altamente expresado por las células musculares lisas. Aunque la microscopía de dos fotones tiene el beneficio de una mayor penetración en el tejido, en comparación con los microscopios confocal, hemos encontrado que el microscopio confocal de disco giratorio es lo suficientemente potente como para obtener una buena visualización de la estructura del epitelio intestinal. Las ventajas omicroscopía de disco f hilatura incluyen la capacidad para la adquisición muy rápida y sensibilidad única sin sacrificar la resolución confocal. Estas cualidades permiten la observación de los procesos dinámicos, incluso si algunos momentos de la hora tienen que ser eliminado debido a artefactos de movimiento, a minimizar el daño solar, y permitir la obtención de imágenes de moléculas relativamente débilmente fluorescentes. Imaging delgado desde el lado seroso también puede ser un reto debido a los movimientos peristálticos endógenos de este órgano. En este protocolo, una inyección sc de atropina se da antes de exponer, y disminuye de manera eficiente el movimiento. Sin embargo, es importante señalar que el movimiento peristáltico es más extensa en el intestino grueso, pero no está bien inhibida por el tratamiento atropina, representación de imágenes bastante difícil en esta parte del intestino. La capa de músculo liso en el colon es algo más prominente c ompared al intestino delgado y parece ser más contráctil. Por lo tanto,es casi imposible para centrarse en el epitelio en los ratones reportero actina-ECFP. Por otra parte, además de estos movimientos endógenos, se puede producir la deriva de órganos, pero en este caso corrección de la deriva posterior puede llevarse a cabo utilizando el software de la cámara. Otro reto importante en los experimentos de imagen invasivas es mantener vivo y saludable el mayor tiempo posible bajo anestesia el ratón. El intestino se alcanza mediante la apertura de la cavidad peritoneal. Así, el procedimiento es más invasiva que la utilizada para formación de imágenes de tumor mamario, que se puede hacer para hasta 40 horas debido a la integridad del peritoneo. La adquisición máxima hecho con la cavidad peritoneal abierto fue de 6 horas, pero el ratón seguía con vida, sin signos evidentes de angustia, por lo que incluso la adquisición ya puede ser factible. En este estudio mieloide comportamiento de la célula puede ser seguido y analizado dentro del tumor intestinal mediante el uso de reportero ratones fluorescentes y también fluorocromo conjugado tcorredores o anticuerpos. Este enfoque también se puede utilizar para la observación de otros tipos de células tales como células T reguladoras, células dendríticas o fibroblastos mediante el uso de Foxp3-EGFP o CD11c-DTR-EGFP, o reportero ratones FSP1-EGFP, respectivamente, como se ha utilizado en el estudio de tumor mamario de 6 . También, los anticuerpos fluorescentes contra otras poblaciones de células que los neutrófilos pueden ser inyectados iv Además, el comportamiento celular también se puede analizar en diferentes condiciones, tales como la hipoxia. Tales experimentos pueden dar nuevas pistas sobre el comportamiento de las células del estroma después del tratamiento con quimioterapia o terapia dirigida. Por último, este protocolo puede ser utilizado en otros modelos de ratón de cáncer intestinal y en diferentes etapas de la progresión del tumor. APC Min / + ratones desarrollan sólo pólipos adenomatosos intestinales, que no progresan a la malignidad ya que los ratones tienen una menor esperanza de vida. Será interesante para estudiar la dinámica de las células mieloides en otros modelos de cáncer intestinal con más aggtumores ataquen e invasivos tales como ratones portadores de mutaciones en K-ras 19-21 o Smad4 22 genes además de la mutación de APC.

Evidencia abrumadora ahora demuestra que el microambiente tumoral, que consiste en poblaciones de células heterogéneas, incluyendo fibroblastos, células endoteliales, células inmunes e inflamatorias, matriz extracelular, y factores solubles, juega un papel crucial en la iniciación y progresión de tumores sólidos mediante la contribución a casi todos características del cáncer 1. De hecho, durante la progresión tumoral, hay constantes interacciones dinámicas entre las células cancerosas transformadas y las células del estroma que evolucionan para generar un microambiente favorable a la malignidad 2. Entre las células inmunes que infiltran el microambiente tumoral, las células mieloides son los más abundantes 3. Compuesto de macrófagos asociados al tumor (TAM), células supresoras de origen mieloide (MDSCs), células dendríticas (DC) y los neutrófilos (PMNs), células mieloides son reclutados desde la médula ósea y se infiltran en los tumores progresivamente, liberando citoquinas, factores de crecimiento y proteasas que puede promoverel crecimiento del tumor y se extendió 4. La diafonía entre las células cancerosas y las células mieloides es compleja, pero dinámico. Por lo tanto la comprensión de la naturaleza de sus interacciones es crucial para determinar por qué estas células promueven la progresión del cáncer en lugar de participar en una respuesta inmune anti-tumor, y puede ayudar a encontrar nuevas dianas para controlarla. La observación directa por microscopía intravital proporciona información sobre la dinámica de células dentro de los tejidos de ratones vivos 5. Un niño de cuatro-color, multi-región, el sistema confocal de disco giratorio micro-lensed fue diseñado para estudiar las células del estroma en los tumores mamarios 6. Este enfoque permite formación de imágenes continuo a largo plazo e incluye varias ventajas, tales como (a) adquisición de imágenes rápidas para minimizar los artefactos de movimiento, (b) la anestesia a largo plazo, (c) adquisición de cuatro colores para seguir diferentes tipos de células, (d) el marcaje fluorescente de diferentes componentes tumorales, y (e) observación de diferentes microambientes tumorales ingeniohin el mismo ratón evitar ratón para 7-9 variabilidad ratón. Con esta tecnología, diferentes comportamientos celulares han sido reportados en el modelo de virus de tumor mamario (MMTV) polioma medio promotor impulsado T oncogén (PYMT) que muestra etapas progresivas de la tumorigénesis. Linfocitos T reguladores (Treg, visualizado por el transgén EGFP Foxp3) migran preferentemente en la proximidad de los vasos sanguíneos que el DCS (CD11c-DTR-EGFP), fibroblastos de carcinoma asociado (FSP1 + / + EGFP) y las células mieloides (c-fms EGFP) exhiben mayor motilidad en la periferia del tumor que dentro de la masa tumoral. En la condición de hipoxia sistémica aguda, las células migraron de manera diferente: Tregs detener la migración en contraste con las células mieloides que continúan mover 6. Además, en el mismo modelo de ratón, se ha demostrado que los cambios de sensibilidad doxorrubicina con el estadio del tumor, la distribución de drogas está relacionada con la respuesta al fármaco, y doxorrubicinatratamiento conduce a la contratación CCR2-dependiente de las células mieloides a los tumores. Por lo tanto, las imágenes en directo también se puede utilizar para obtener información sobre las respuestas de drogas in situ y la biología de la quimio-resistencia 10,11. Poliposis coli (APC) mutaciones genéticas adenomatosos ocurren comúnmente en los adenomas colorrectales y carcinomas humanos 12 y la mutación de una sola copia de los resultados Apc genes en la poliposis adenomatosa familiar (PAF), que confiere un riesgo extremadamente alto de cáncer de colon 13. La cepa de ratón APC Min / + lleva una mutación en el codón 850 truncamiento del gen APC y se desarrolla de forma espontánea múltiples adenomas intestinales en todo el intestino delgado de 14 16. Intravital de imágenes a largo plazo del intestino es difícil debido a la invasividad del procedimiento, desde la apertura de la cavidad peritoneal es necesaria para el acceso al intestino. Corto plazo de imágenes en vivo studies han sido publicados anteriormente en intestino sano 17,18, pero la observación directa a largo plazo de los tumores intestinales no se ha reportado. Un procedimiento quirúrgico ha sido diseñado y perfeccionado para visualizar tumores a través de la superficie serosa del intestino, usando el sistema de microscopía intravital disco giratorio utilizado anteriormente para los tumores de mama 6,10 imagen. En este trabajo, un protocolo se describe que permite seguir el comportamiento de las células mieloides dentro de los tumores en el intestino delgado mediante el uso de APC Min / + ratones.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="691">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;"><a name="RANGE!A1:D30">Name of Material/ Equipment</a></td>
			<td style="width:107px;">Company</td>
			<td style="width:141px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:227px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">ApcMin/+ mice</td>
			<td style="width:107px;">Jackson Laboratory</td>
			<td>2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">ACTB-ECFP mice</td>
			<td style="width:107px;">Jackson Laboratory</td>
			<td style="width:141px;">3773</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">cfms-EGFP mice</td>
			<td style="width:107px;">Jackson Laboratory</td>
			<td align="right">18549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">2,000 kDa Dextran, rhodamine-conjugated</td>
			<td style="width:107px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:141px;">D7139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:107px;">Butler Animal Health Supply</td>
			<td style="width:141px;">29450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Nitrogen</td>
			<td style="width:107px;">UCSF</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Oxygen</td>
			<td style="width:107px;">UCSF</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">1X PBS</td>
			<td style="width:107px;">UCSF cell culture facility</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Saline Buffer</td>
			<td style="width:107px;">UCSF cell culture facility</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Anti-mouse Ly-6G (GR1) antibody AF647</td>
			<td style="width:107px;">UCSF Monoclonal antibody core</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td>Stock 1mg/ml. Use at 7ug/mouse</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Atropine</td>
			<td style="width:107px;">LARC UCSF</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td>Use at 1mg/Kg mouse</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Alcohol wipes</td>
			<td style="width:107px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:141px;">326895</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">28G1/2 insulin syringe</td>
			<td style="width:107px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:141px;">329465</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Remium cover glass</td>
			<td style="width:107px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:141px;">12-548-5M</td>
			<td>24x50-1</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Superfrost plus microscope slides</td>
			<td style="width:107px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:141px;">12-550-15</td>
			<td>25x75x1mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Krazy glue</td>
			<td style="width:107px;">Office Max</td>
			<td align="right">7111555</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Betadine</td>
			<td style="width:107px;">LARC UCSF</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Heat blanket</td>
			<td style="width:107px;">Gaymar Industries</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Hot bead sterilizer</td>
			<td style="width:107px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:141px;">18000-45</td>
			<td>Turn ON 30min before use</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Cotton tipped apllicators 6-inch</td>
			<td style="width:107px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:141px;">72310-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Anesthesia system</td>
			<td style="width:107px;">Summit Anesthesia Support</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Inverted microscope</td>
			<td style="width:107px;">Carl Zeiss Inc</td>
			<td style="width:141px;">Zeiss Axiovert 200M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">stage insert</td>
			<td style="width:107px;">Applied Sientific Instrumentation</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Mouse Ox oximeter, software and sensors</td>
			<td style="width:107px;">Starr Life Sciences</td>
			<td style="width:141px;">MouseOx</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Nebulizer</td>
			<td style="width:107px;">Summit Anesthesia Support</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Imaris</td>
			<td style="width:107px;">Bitplane</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">mManager</td>
			<td style="width:107px;">Vale lab, UCSF</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td>Open-source software</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">ICCD camera</td>
			<td style="width:107px;">Stanford Photonics</td>
			<td style="width:141px;">XR-Mega-10EX S-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Spinning disk confocal sacan-head</td>
			<td style="width:107px;">Yokogawa Corporation</td>
			<td style="width:141px;">CSU-10b</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real-time imaging of myeloid cells dynamics in apcmin/+ intestinal tumors by spinning disk confocal microscopy

Células mieloides son las células inmunes más abundantes dentro de los tumores y se ha demostrado para promover la progresión tumoral. Técnicas de imagen intravital modernos permiten la observación del comportamiento celular en vivo en el interior del órgano, pero puede ser un reto en algunos tipos de cáncer debido a la accesibilidad de órganos y el tumor tales como intestino. La observación directa de los tumores intestinales no ha sido descrito previamente. Un procedimiento quirúrgico aquí descrito permite la observación directa de la dinámica celular mieloides dentro de los tumores intestinales en ratones vivos mediante el uso de ratones transgénicos reportero fluorescente y trazadores inyectables o anticuerpos. Para este propósito, una de cuatro colores, multi-región, disco giratorio microscopio confocal micro-lensed que permite formación de imágenes continua a largo plazo con una rápida adquisición de la imagen se ha utilizado. APC Min / + ratones que desarrollan múltiples adenomas en el intestino delgado se cruzan con los ratones c-FMS-EGFP para visualizar las células mieloides y con ratones ACTB-ECFPpara visualizar las células epiteliales intestinales de las criptas. También se describen procedimientos para el etiquetado de diferentes componentes tumorales, tales como vasos sanguíneos y neutrófilos, y el procedimiento para el posicionamiento del tumor para formación de imágenes a través de la superficie serosa. Time-lapse películas recopilados de varias horas de proyección de imagen permiten el análisis del comportamiento de las células mieloides in situ en el microambiente intestinal.

Mediante el uso de microscopía confocal de disco giratorio, los tejidos no tumorales y tumorales en el intestino delgado de APC Min / +; ACTB-ECFP; ratones c-fms-ECFP se pueden visualizar desde la superficie serosa. Después de formación de imágenes, software de la cámara se utiliza para analizar y ajustar la adquisición (Figura 1). Después intravenosa (iv) la inyección de 2000 kDa de dextrano fluorescente rodamina y un anticuerpo conjugado Ly-6G 647, los vasos sanguíneos y PMNs pueden ser detectados respectivamente (Figura 1). Las placas de Peyer que son agregados de tejido linfoide y lleno de células mieloides se puede ver fácilmente (Figura 1A). Las criptas del intestino delgado están rodeados por los vasos sanguíneos y las células mieloides (Figura 1A y 1B). Tejido tumoral es a menudo más vascularizada y más infiltrado por células mieloides, y la estructura de las criptas w es menosell organizada (Figura 1A y 1B) dependiendo del tamaño del tumor. Adquisición se puede hacer mediante el uso de un 10X 0,5 NA (Figura 1A) y 20X 0,75 lentes NA Fluar (Figura 1B), pero obtiene el mejor rendimiento con la lente de 10X 0,5 NA Fluar que era brillante, permitirá la adquisición de una gran región (676 x 676 m) y podría proporcionar imágenes de hasta 70 micras en el tejido. La capa muscular que expresa actina-ECFP suave a veces puede hacer que el foco en el epitelio intestinal difícil (Figura 1B, panel derecho). Dinámica de las células mieloides en los tumores se pueden seguir en tiempo real durante unas horas como se muestra en la animada / Video Figura 2. Considerando que circulan neutrófilos (Gr1 + células) en los vasos sanguíneos y patrullan los tejidos, otras células mieloides, en su mayoría macrófagos, rodear las criptas y son menos móviles (Animated / Video Figura 2). Figura 1. Representante imágenes obtenidas con el confocal de disco giratorio de tejido no tumoral y tumoral de APC Min / + ratones. (A) las imágenes a cuatro colores (10X Fluar, 0,5 lente NA) del epitelio del intestino delgado de la superficie serosa del APC Min / +; ACTB-ECFP; cfms-EGFP ratón que recibió fluorescente iv 2.000 kDa dextrano-rodamina (rojo) y Ly-6G 647 anticuerpo conjugado (blanco). El panel izquierdo muestra el epitelio no tumoral y el panel derecho muestra un tumor de la misma APC Min / +; ACTB-ECFP; ratón cfms-EGFP. Células mieloides son verdes y las células epiteliales son de color azul. Un grupo de c-fms + células se ve en el tejido intestinal no tumoral en una placa de Peyer (flecha blanca), barra de escala = 100 m. (B) de cuatro imágenes en color (20X Fluar, 0,5 NAlente) del epitelio del intestino delgado de la superficie serosa de un APC Min / +; ACTB-ECFP; tumor cfms-EGFP. En el panel de la izquierda, varios c-fms doble positivas Gr1 + + células se detectaron en el tejido tumoral. El panel derecho muestra una imagen de la capa de músculo liso que expresan actina-ECFP que pueden hacer que el enfoque en el epitelio intestinal difícil, barra de escala = 50 micras. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51916/Animated-Video_Figure_2.mov" target="_blank">Animados / Figura Video 2</a> . dinámica de células mieloides en un adenoma 3 mm de un APC Min / + ratón. cuatro colores de lapso de tiempo del epitelio del intestino delgado (10X Fluar, 0,5 lente NA) de la superficie serosa de un APC Min / + ; ACTB-ECFP; cfms-EGFP co-inyectados ratón con fluorescente 2000 kDa de dextrano-rodamina (rojo) y un Ly-6G anticuerpo conjugado 647 (blanco). Células mieloides son verdes yLas células epiteliales son de color azul. Células mieloides alrededor de las criptas no se están moviendo. Algunos neutrófilos (células Gr1 + en blanco) están patrullando en los tejidos. Esta es una adquisición de 2 horas y la película se ha acelerado 295 veces. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51916/Supplementary Figure 1.tif" target="_blank">Suplementaria Figura 1</a> . Capturas de pantalla de software de la cámara para el análisis de la adquisición. (A) En primer lugar, los archivos deben ser convertidos en extensión .ims de. (B) A continuación, imágenes de la pantalla se puede ajustar, por ejemplo, señales específicas se puede aumentar y el fondo disminuyó . (C) Fecha y necesitan tiempo para ajustarse con el fin de conseguir una película en tiempo real. (D) La adquisición se pueden guardar como una película.

Watch this Scientific Journal Video about Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy at JoVE.com

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

By using transgenic reporter mice and injectable fluorescent labels, long-term intravital spinning disk confocal microscopy enables direct visualization of myeloid cell behavior into intestinal adenoma in the ApcMin/+ colorectal cancer model.

Imágenes en tiempo real de las células mieloides en Dinámica<em&gt; Apc<sup&gt; Min / +</sup</em&gt; Intestinal Tumores de Spinning disco microscopía confocal

Myeloid cells are the most abundant immune cells within tumors and have been shown to promote tumor progression. Modern intravital imaging techniques ...

real-time-imaging-myeloid-cells-dynamics-apcmin-intestinal-tumors

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

9.6K vistas.  INSERM U661, Functional Genomic Institute. By using transgenic reporter mice and injectable fluorescent labels, long-term intravital spinning disk confocal microscopy enables direct visualization of myeloid cell behavior into intestinal adenoma in the ApcMin/+ colorectal cancer model. 

Video: Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

Intravital Microscopy of the Spleen: Quantitative Analysis of Parasite Mobility and Blood Flow

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. Thus, in vivo imaging of malaria parasites during pre-erythrocytic stages have revealed the active entrance of parasites into skin lymph nodes 3, the complete development of the parasite in the skin 4, and the formation of a hepatocyte-derived merosome to assure migration and release of merozoites into the blood stream 5. Moreover, the development of individual parasites in erythrocytes has been recently documented using 4D imaging and challenged our current view on protein export in malaria 6. Thus, intravital imaging has radically changed our view on key events in Plasmodium development. Unfortunately, studies of the dynamic passage of malaria parasites through the spleen, a major lymphoid organ exquisitely adapted to clear infected red blood cells are lacking due to technical constraints.
Using the murine model of malaria Plasmodium yoelii in Balb/c mice, we have implemented intravital imaging of the spleen and reported a differential remodeling of it and adherence of parasitized red blood cells (pRBCs) to barrier cells of fibroblastic origin in the red pulp during infection with the non-lethal parasite line P.yoelii 17X as opposed to infections with the P.yoelii 17XL lethal parasite line 7. To reach these conclusions, a specific methodology using ImageJ free software was developed to enable characterization of the fast three-dimensional movement of single-pRBCs. Results obtained with this protocol allow determining velocity, directionality and residence time of parasites in the spleen, all parameters addressing adherence in vivo. In addition, we report the methodology for blood flow quantification using intravital microscopy and the use of different colouring agents to gain insight into the complex microcirculatory structure of the spleen. 
Ethics statement
All the animal studies were performed at the animal facilities of University of Barcelona in accordance with guidelines and protocols approved by the Ethics Committee for Animal Experimentation of the University of Barcelona CEEA-UB (Protocol No DMAH: 5429). Female Balb/c mice of 6-8 weeks of age were obtained from Charles River Laboratories.

We show the method for performing intravital microscopy of the spleen using GFP transgenic malaria parasites and the quantification of parasite mobility and blood flow within this organ.

Microscopia intravital del bazo: Análisis cuantitativo de la movilidad del parásito y el flujo sanguíneo

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. ...

Investigación

Inmunología e Infección

A TIRF Microscopy Technique for Real-time, Simultaneous Imaging of the TCR and its Associated Signaling Proteins

Signaling is initiated through the T Cell Receptor (TCR) when it is engaged by antigenic peptide fragments bound by Major Histocompatibility Complex (pMHC) proteins expressed on the surface of antigen presenting cells (APCs). The TCR complex is composed of the ligand binding TCR&alpha;&beta; heterodimer that associates non-covalently with CD3 dimers (the &#949;&delta; and &#949;&gamma; heterodimers and the &zeta;&zeta; homodimer)1. Upon engagement of the receptor, the CD3 &zeta; chains are phosphorylated by the Src family kinase, Lck. This leads to the recruitment of the Syk family kinase, Zap70, which is then phosphorylated and activated by Lck. After that, Zap70 phosphorylates the adapter proteins LAT and SLP76, initiating the formation of the proximal signaling complex containing a large number of different signaling molecules2. 
The formation of this complex eventually results in calcium and Ras-dependent transcription factor activation and the consequent initiation of a complex series of gene expression programs that give rise to T cell differentiation2. TCR signals (and the resulting state of differentiation) are modulated by many other factors, including antigen potency and crosstalk with co-stimulatory/co-inhibitory, chemokine, and cytokine receptors 3-4. Studying the spatial and temporal organization of the proximal signaling complex under various stimulation conditions is, therefore, key to understanding the TCR signaling pathway as well as its regulation by other signaling pathways.
One very useful model system to study signaling initiated by the TCR at the plasma membrane in T cells is glass-supported lipid bilayers, as described previously5-6. They can be utilized to present antigenic pMHC complexes, adhesion, and co-stimulatory molecules to T cells-serving as artificial APCs. By imaging the T cells interacting with the lipid bilayer using total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM), we can restrict the excitation to within 100 nm of the space between the glass and the cell surface 7-8. This allows us to image primarily the signaling events occurring at the plasma membrane. As we are interested in imaging the recruitment of signaling proteins to the TCR complex, we describe a two-camera TIRF imaging system wherein the TCR, labeled with fluorescent Fab (fragment antigen binding) fragments of the H57 antibody (purified from hybridoma H57-597, ATCC, ATCC Number:HB-218) which is specific for TCR&beta;, and signaling proteins, tagged with GFP, may be imaged simultaneously and in real time. This strategy is necessary due to the highly dynamic nature of both the T cells and of the signaling events that are occurring at the TCR. This imaging modality has allowed researchers to image single ligands 9-11 as well as recruitment of signaling molecules to activated receptors and is an excellent system to study biochemistry in-situ12-16.

The compartmentalization of proteins either within the plasma membrane or into intracellular locations is one regulatory mechanism that can greatly influence signaling outcomes; hence, to understand signaling it is important to study the spatial and temporal behavior of the proteins involved. We describe here a TIRF microscopy based system to study signal transduction in T cells, but is broadly applicable.

Una técnica de microscopía TIRF en tiempo real, imágenes simultáneas de la TCR y sus proteínas asociadas de señalización

Signaling is initiated through the T Cell Receptor (TCR) when it is engaged by antigenic peptide fragments bound by Major Histocompatibility Complex ...

Detection of MicroRNAs in Microglia by Real-time PCR in Normal CNS and During Neuroinflammation

Microglia are cells of the myeloid lineage that reside in the central nervous system (CNS)1. These cells play an important role in pathologies of many diseases associated with neuroinflammation such as multiple sclerosis (MS)2. Microglia in a normal CNS express macrophage marker CD11b and exhibit a resting phenotype by expressing low levels of activation markers such as CD45. During pathological events in the CNS, microglia become activated as determined by upregulation of CD45 and other markers3. The factors that affect microglia phenotype and functions in the CNS are not well studied. MicroRNAs (miRNAs) are a growing family of conserved molecules (~22 nucleotides long) that are involved in many normal physiological processes such as cell growth and differentiation4 and pathologies such as inflammation5. MiRNAs downregulate the expression of certain target genes by binding complementary sequences of their mRNAs and play an important role in the activation of innate immune cells including macrophages6 and microglia7. In order to investigate miRNA-mediated pathways that define the microglial phenotype, biological function, and to distinguish microglia from other types of macrophages, it is important to quantitatively assess the expression of particular microRNAs in distinct subsets of CNS-resident microglia. Common methods for measuring the expression of miRNAs in the CNS include quantitative PCR from whole neuronal tissue and in situ hybridization. However, quantitative PCR from whole tissue homogenate does not allow the assessment of the expression of miRNA in microglia, which represent only 5-15% of the cells of neuronal tissue. Hybridization in situ allows the assessment of the expression of microRNA in specific cell types in the tissue sections, but this method is not entirely quantitative. In this report we describe a quantitative and sensitive method for the detection of miRNA by real-time PCR in microglia isolated from normal CNS or during neuroinflammation using experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), a mouse model for MS. The described method will be useful to measure the level of expression of microRNAs in microglia in normal CNS or during neuroinflammation associated with various pathologies including MS, stroke, traumatic injury, Alzheimer's disease and brain tumors.

Microglia are resident macrophages that provide the first line of defense and immune surveillance of the central nervous system. MicroRNAs are regulatory molecules that play an important role in many physiological processes including activation and differentiation of macrophages. In this article, we describe the method for measurement of microRNAs in microglia.

La detección de microARNs en la microglía por PCR en tiempo real en el SNC normal y durante la neuroinflamación

Microglia are cells of the myeloid lineage that reside in the central nervous system (CNS)1. These cells play an important role in pathologies of many ...

Real-time Live Imaging of T-cell Signaling Complex Formation

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating the activation and responses of multiple immune cells 3,4. T-cell activation is dependent on the recognition of specific antigens displayed by antigen presenting cells (APCs). The T-cell antigen receptor (TCR) is specific to each T-cell clone and determines antigen specificity 5. The binding of the TCR to the antigen induces the phosphorylation of components of the TCR complex. In order to promote T-cell activation, this signal must be transduced from the membrane to the cytoplasm and the nucleus, initiating various crucial responses such as recruitment of signaling proteins to the TCR;APC site (the immune synapse), their molecular activation, cytoskeletal rearrangement, elevation of intracellular calcium concentration, and changes in gene expression 6,7. The correct initiation and termination of activating signals is crucial for appropriate T-cell responses. The activity of signaling proteins is dependent on the formation and termination of protein-protein interactions, post translational modifications such as protein phosphorylation, formation of protein complexes, protein ubiquitylation and the recruitment of proteins to various cellular sites 8. Understanding the inner workings of the T-cell activation process is crucial for both immunological research and clinical applications.
Various assays have been developed in order to investigate protein-protein interactions; however, biochemical assays, such as the widely used co-immunoprecipitation method, do not allow protein location to be discerned, thus precluding the observation of valuable insights into the dynamics of cellular mechanisms. Additionally, these bulk assays usually combine proteins from many different cells that might be at different stages of the investigated cellular process. This can have a detrimental effect on temporal resolution. The use of real-time imaging of live cells allows both the spatial tracking of proteins and the ability to temporally distinguish between signaling events, thus shedding light on the dynamics of the process 9,10. We present a method of real-time imaging of signaling-complex formation during T-cell activation. Primary T-cells or T-cell lines, such as Jurkat, are transfected with plasmids encoding for proteins of interest fused to monomeric fluorescent proteins, preventing non-physiological oligomerization 11. Live T cells are dropped over a coverslip pre-coated with T-cell activating antibody 8,9, which binds to the CD3/TCR complex, inducing T-cell activation while overcoming the need for specific activating antigens. Activated cells are constantly imaged with the use of confocal microscopy. Imaging data are analyzed to yield quantitative results, such as the colocalization coefficient of the signaling proteins.

We describe a live-cell imaging method that provides insight into protein dynamics during the T-cell activation process. We demonstrate the combined usage of the T-cell spreading assay, confocal microscopy and imaging analysis to yield quantitative results to follow signaling complex formation throughout T-cell activation.

En tiempo real de imágenes en vivo de las células T de señalización Formación de complejos

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating ...

Assessing Anti-fungal Activity of Isolated Alveolar Macrophages by Confocal Microscopy

The lung is an interface where host cells are routinely exposed to microbes and microbial products. Alveolar macrophages are the first-line phagocytic cells that encounter inhaled fungi and other microbes. Macrophages and other immune cells recognize Aspergillus motifs by pathogen recognition receptors and initiate downstream inflammatory responses. The phagocyte NADPH oxidase generates reactive oxygen intermediates (ROIs) and is critical for host defense. Although NADPH oxidase is critical for neutrophil-mediated host defense1-3, the importance of NADPH oxidase in macrophages is not well defined. The goal of this study was to delineate the specific role of NADPH oxidase in macrophages in mediating host defense against A. fumigatus. We found that NADPH oxidase in alveolar macrophages controls the growth of phagocytosed A. fumigatus spores4. Here, we describe a method for assessing the ability of mouse alveolar macrophages (AMs) to control the growth of phagocytosed Aspergillus spores (conidia). Alveolar macrophages are stained in vivo and ten days later isolated from mice by bronchoalveolar lavage (BAL). Macrophages are plated onto glass coverslips, then seeded with green fluorescent protein (GFP)-expressing A. fumigatus spores. At specified times, cells are fixed and the number of intact macrophages with phagocytosed spores is assessed by confocal microscopy.

A method to evaluate the ability of isolated mouse alveolar macrophages to control the growth of phagocytosed Aspergillus spores by confocal microscopy.

La evaluación de la actividad anti-fúngica de aislados macrófagos alveolares por microscopía confocal

The lung is an interface where host cells are routinely exposed to microbes and microbial products. Alveolar macrophages are the first-line phagocytic ...

The Mesenteric Lymph Duct Cannulated Rat Model: Application to the Assessment of Intestinal Lymphatic Drug Transport

The intestinal lymphatic system plays key roles in fluid transport, lipid absorption and immune function. Lymph flows directly from the small intestine via a series of lymphatic vessels and nodes that converge at the superior mesenteric lymph duct. Cannulation of the mesenteric lymph duct thus enables the collection of mesenteric lymph flowing from the intestine. Mesenteric lymph consists of a cellular fraction of immune cells (99% lymphocytes), aqueous fraction (fluid, peptides and proteins such as cytokines and gut hormones) and lipoprotein fraction (lipids, lipophilic molecules and apo-proteins). The mesenteric lymph duct cannulation model can therefore be used to measure the concentration and rate of transport of a range of factors from the intestine via the lymphatic system. Changes to these factors in response to different challenges (e.g., diets, antigens, drugs) and in disease (e.g., inflammatory bowel disease, HIV, diabetes) can also be determined. An area of expanding interest is the role of lymphatic transport in the absorption of orally administered lipophilic drugs and prodrugs that associate with intestinal lipid absorption pathways. Here we describe, in detail, a mesenteric lymph duct cannulated rat model which enables evaluation of the rate and extent of lipid and drug transport via the lymphatic system for several hours following intestinal delivery. The method is easily adaptable to the measurement of other parameters in lymph. We provide detailed descriptions of the difficulties that may be encountered when establishing this complex surgical method, as well as representative data from failed and successful experiments to provide instruction on how to confirm experimental success and interpret the data obtained.

Here we describe a technique to cannulate the mesenteric lymph duct in rats which enables quantification of lipid and drug transport via the lymphatic system following intestinal delivery. The technique can be adapted to assess mesenteric lymph concentrations and/or transport of fluid, immune cells, peptides, proteins and lipophilic molecules.

La linfa mesentérica Conducto canulado Rata Modelo: Aplicación de la Evaluación de Intestinal Linfático Transporte de Drogas

The intestinal lymphatic system plays key roles in fluid transport, lipid absorption and immune function. Lymph flows directly from the small intestine ...

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages and disadvantages. We describe here an experimental colitis model that is initiated by adoptive transfer of syngeneic splenic CD4+CD45RBhigh T cells into T and B cell deficient recipient mice. The CD4+CD45RBhigh T cell population that largely consists of na&#239;ve effector cells is capable of inducing chronic intestinal inflammation, closely resembling key aspects of human IBD. This method can be manipulated to study aspects of disease onset and progression. Additionally it can be used to study the function of innate, adaptive, and regulatory immune cell populations, and the role of environmental exposures, i.e., the microbiota, in intestinal inflammation. In this article we illustrate the methodology for inducing colitis with a step-by-step protocol. This includes a video demonstration of key technical aspects required to successfully develop this murine model of experimental colitis for research purposes.

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Here, we present a protocol to induce colonic inflammation in mice by adoptive transfer of syngeneic CD4+CD45RBhigh T cells into T and B cell deficient recipients. Clinical and histopathological features mimic human inflammatory bowel diseases. This method allows the study of the initiation of colonic inflammation and progression of disease.

La inducción de la inflamación intestinal murino por transferencia adoptiva de Efector CD4<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; Alta</sup&gt; T células en ratones inmunodeficientes

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages ...

Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

Many gram-negative bacteria including pathogenic Yersinia spp. employ type III secretion systems to translocate effector proteins into eukaryotic target cells. Inside the host cell the effector proteins manipulate cellular functions to the benefit of the bacteria. To better understand the control of type III secretion during host cell interaction, sensitive and accurate assays to measure translocation are required. We here describe the application of an assay based on the fusion of a Yersinia enterocolitica effector protein fragment (Yersinia outer protein; YopE) with TEM-1 beta-lactamase for quantitative analysis of translocation. The assay relies on cleavage of a cell permeant FRET dye (CCF4/AM) by translocated beta-lactamase fusion. After cleavage of the cephalosporin core of CCF4 by the beta-lactamase, FRET from coumarin to fluorescein is disrupted and excitation of the coumarin moiety leads to blue fluorescence emission. Different applications of this method have been described in the literature highlighting its versatility. The method allows for analysis of translocation in vitro and also in in vivo, e.g., in a mouse model. Detection of the fluorescence signals can be performed using plate readers, FACS analysis or fluorescence microscopy. In the setup described here, in vitro translocation of effector fusions into HeLa cells by different Yersinia mutants is monitored by laser scanning microscopy. Recording intracellular conversion of the FRET reporter by the beta-lactamase effector fusion in real-time provides robust quantitative results. We here show exemplary data, demonstrating increased translocation by a Y. enterocolitica YopE mutant compared to the wild type strain.

Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

Effector translocation into host cells via a type III secretion system is a common virulence strategy among gram-negative bacteria. A beta-lactamase effector fusion based assay for quantitative analysis of translocation was applied. In Yersinia infected cells, conversion of a FRET reporter by the beta-lactamase is monitored using laser scanning microscopy.

Análisis de<em&gt; Yersinia enterocolitica</em&gt; Efector translocación en las células huésped Usando beta-lactamasa Efector fusiones

Many gram-negative bacteria including pathogenic Yersinia spp. employ type III secretion systems to translocate effector proteins into eukaryotic target ...

Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in vivo is crucial for understanding the molecular basis of leukocyte transendothelial migration and interaction with vascular endothelium. One powerful approach involves intravital microscopy on transgenic mice expressing fluorescent proteins in cells of interest.
Here we present a protocol for imaging monocytes and neutrophils in the CX3CR1gfp/wt mouse i.v. injected with orange dye-labeled neutrophils with an inverted confocal microscope. Time-lapse movies gathered from 30 min&#160;to several hours of imaging allow the analysis of leukocyte behavior in mesenteric veins under both steady state and inflammatory conditions. We also describe the steps to locally induce blood vessel inflammation with TLR2/TLR1 agonist Pam3SK4 and monitor the subsequent recruitment of neutrophils and monocytes.
The presented technique can also be used to monitor other populations of leukocytes and investigate molecules implicated in leukocyte recruitment or trafficking using other stimuli or transgenic mice.

We detail a protocol to monitor the behavior of neutrophils and monocytes in mesenteric veins under steady state and inflammatory conditions using intravital confocal microscopy on anaesthetized mice.

Imaging neutrófilos y monocitos en mesentérica venas por Microscopia intravital en ratones anestesiados en Tiempo Real

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in ...

Cortical Actin Flow in T Cells Quantified by Spatio-temporal Image Correlation Spectroscopy of Structured Illumination Microscopy Data

Filamentous-actin plays a crucial role in a majority of cell processes including motility and, in immune cells, the formation of a key cell-cell interaction known as the immunological synapse. F-actin is also speculated to play a role in regulating molecular distributions at the membrane of cells including sub-membranous vesicle dynamics and protein clustering. While standard light microscope techniques allow generalized and diffraction-limited observations to be made, many cellular and molecular events including clustering and molecular flow occur in populations at length-scales far below the resolving power of standard light microscopy. By combining total internal reflection fluorescence with the super resolution imaging method structured illumination microscopy, the two-dimensional molecular flow of F-actin at the immune synapse of T cells was recorded. Spatio-temporal image correlation spectroscopy (STICS) was then applied, which generates quantifiable results in the form of velocity histograms and vector maps representing flow directionality and magnitude. This protocol describes the combination of super-resolution imaging and STICS techniques to generate flow vectors at sub-diffraction levels of detail. This technique was used to confirm an actin flow that is symmetrically retrograde and centripetal throughout the periphery of T cells upon synapse formation.

To investigate flow velocities and directionality of filamentous-actin at the T cell immunological synapse, live-cell super-resolution imaging is combined with total internal reflection fluorescence and quantified with spatio-temporal image correlation spectroscopy.

Cortical de actina de flujo en células T cuantificados por espacio-temporal de correlación Imagen Espectroscopia de Estructurado Iluminación Microscopía de datos