Apoyado en parte por R01NS064593 y R21ES016636 (KV). Microscopía se realizó en la UCV - Departamento de Servicio de Microscopía Neurobiología y Anatomía, apoyada, en parte, con fondos del NIH NINDS subvención 5P30NS047463 Center núcleo. El microscopio confocal de disco giratorio se compró con un premio NIH-CNRR (1S10RR027957).

A. Preparación de la célula <ol><li> Fibroblastos humanos normales primarios (GM02270) se obtuvieron de Coriell Cell Repository, Camden, Nueva Jersey, y se inmortalizan con hTERT 6. Las células se hicieron crecer y se expandieron en CellStar 6 cm de platos en los medios de comunicación (4 ml) que consiste en MEM suplementado con 20% fetal suero bovino (GIBCO), non-essential/essential aminoácidos, vitaminas, piruvato de sodio, y penicilina / estreptomicina (HyClone ). </li><li> De riñón embrionario humano 293 (HEK293) las células se obtuvieron a partir de American Type Culture Collection y se desarrollaron y se expandieron en CellStar 6-cm platos. Las células se mantuvieron en medios de comunicación (4 ml) que consiste en DMEM suplementado con fetales 10% de suero bovino, no aminoácidos esenciales, L-glutamina, y penicilina / estreptomicina. </li><li> 53BP1 mCherry-(N-Myc-53BP1 PESO pLPC-Puro; Addgene plásmido 19836) y H2B-GFP (pCLNR-H2BG; Addgene plásmido 17735) gen constructos de fusión también expresar puromicina o genes de resistencia a G418, respectivamente, fueron transducidas (fibroblapts) o transfectadas (HEK293) utilizando SuperFect (Qiagene) en las células y se mantiene en la selección de medicamentos. Mantenimiento de la fluorescencia se comprobó periódicamente. </li><li> 24-48 h antes de la adquisición de imágenes, las células se trataron con tripsina en una única suspensión de células y se sembraron a una densidad baja en placas de 3,5 cm de FluroDish fondo de cristal. </li></ol> B. Configuración del microscopio y de adquisición de imágenes Este protocolo fue desarrollado utilizando la Célula Zeiss Observador SD hilado disco microscopio confocal equipado con un AxioObserver Z1 stand, un dual-channel Yokagawa CSU-5000 X1A girar la unidad de disco, 2 Fotometría QuantEM 512SC cámaras EMCCD, un HXP 120C a base de fibra de iluminación, 4 láseres (un Lasos 100mW de varias líneas de argón [458, 488, 514 nm], 50 mW diodo 405 nm, 40 mW diodo 561 nm y 30 mW diodo 635 nm), AOTF, un Pecon XL etapa multiS1 sistema de incubación, incubación Zeiss módulos (Módulo de O 2 S, CO 2 Módulo S, S TempModule, Calefacción Unidad XL S) y un Prior motorized XY etapa con un inserto NanoScanZ piezo Z. Para reducir al mínimo las aberraciones esféricas, mientras que las células de formación de imágenes en vivo apoyado en un medio acuoso, un Agua C-Apochromat 63x/1.20 / Corr objetivo y lente Zeiss Immersol fluido de inmersión W (con un índice de refracción n = 1,334) fueron utilizados. Para canal 2 confocal de imágenes, un RQFT 405/488/568/647 espejo dicroico y BP525/50 (verde) y BP629/62 (rojo) se utilizaron filtros de emisión. El software del sistema utilizado fue Zeiss Axiovision (ver. 4.8.2.0) con AV4 Multi-channel/Z/T, Fast Imaging, Fisiología, Mosaix, Mark &amp; ​​Find, de doble cámara, Interior 4D, enfoque automático y 3-D módulos de deconvolución. <ol><li> Asegúrese de que el CO 2 gas se está ejecutando para el CO 2 Módulo del sistema de incubación. Si el microscopio se apoya en una mesa de aire anti-vibración, abra el suministro de aire (o gas N2) para la tabla del aire. </li><li> Encienda la alimentación del trípode del microscopio, la unidad de disco giratorio, las cámaras, los módulos de incubación, iluminación HXP, platina motorizada, Argonláser, y el ordenador. </li><li> Después de 1 minuto de tiempo de calentamiento, gire la llave de contacto para que el láser de argón a &quot;On&quot;. </li><li> En el panel de control del láser Zeiss, encienda los interruptores de las líneas de láser que se utilizarán. </li><li> Apague el interruptor de palanca para el controlador Lasos láser de argón de &quot;espera&quot; a &quot;run láser&quot; y ajustar el regulador de luz para el nivel óptimo (es decir, justo por debajo del punto en que el indicador verde se vuelve roja). </li><li> Inicie el software AxioVision Nota:. La interfaz de usuario para AxioVision pueden ser personalizados con menús de las ventanas y tirar hacia abajo que sean específicos para el microscopio especial y los componentes que lo controla. Como tal, cada sistema tiene una interfaz potencialmente única. Por lo tanto, las instrucciones generales para la manipulación de software se proporcionan en los siguientes pasos, en lugar de direcciones para las ventanas de software específicos, fichas y / o menús desplegables. </li><li> Aproximadamente 1 h antes de la formación de imágenes, en el software, localizar los controles de la incubadora yencender la calefacción de la cámara superior y la placa de la platina. Ajustar la temperatura a 37 ° C. Encienda el CO 2 Control y ajuste el nivel del 5%. </li><li> Seleccione la lente objetivo para formación de imágenes. En este estudio, un 63x/1.20 NA C-Apochromat Agua / Corr lente objetivo se utilizó Nota:. Para este objetivo, un medio de inmersión con un índice de refracción similar al del agua (Zeiss Immersol fluido de inmersión W) es necesario. </li><li> Si múltiples posiciones separadas son objeto de muestreo durante un largo período de tiempo, de aplicar una cantidad suficiente de medio de inmersión para asegurar que es transportada desde una posición a otra. </li><li> Colocar el plato de la etapa y llevar la lente del objetivo arriba en contacto con el fondo. </li><li> Usando los controles del microscopio o del software, dirigir la luz emitida a los oculares y seleccione el filtro de campo amplio establecido para la señal fluorescente de interés (para este estudio, &quot;Red&quot; filtro para 53BP1 y un &quot;buenas prácticas agrarias&quot; filtro para H2B ). &lt;/ Li&gt; <li> Ver a través de las lentes oculares, enfocar la imagen, y localizar un campo adecuado de células. </li><li> Utilizando el software o los controles del microscopio, dirigir la luz emitida fuera de los oculares al puerto con la unidad de disco giratorio confocal. </li><li> En el software, encienda el láser adecuado (para este estudio, el láser nm 561 por 53BP1 y la línea de 488 nm del láser de argón para H2B). </li><li> Para cada canal, ajustar la intensidad del láser mediante el ajuste del filtro acústico-óptico sintonizable (AOTF) de control a un nivel apropiado. </li><li> Seleccione el espejo dicroico apropiado (RQFT 405/488/568/647) y filtros de emisión (BP 629/62 para 53BP1 y BP 525/50 para H2B). Abrir el obturador a la unidad de disco giratorio. </li><li> Seleccione la opción &quot;Live&quot; ventana para mostrar el actual campo de visión. </li><li> En el software, abra el &quot;cámara&quot; de control, seleccione la cámara que desea utilizar (si es un sistema de cámara dual) y establecer el tiempo de exposición a aproximadamente 100 ms. Ajuste el% y ganar EM como necsario Nota:. La construcción 53BP1-mCherry parece un tanto débil. Nos pareció que es útil para aumentar la ganancia EM. </li><li> En el software, abra el control de la unidad de disco giratorio confocal y ajustar la velocidad de giro del disco introduciendo el tiempo de exposición de la cámara que se configuró para capturar una imagen adecuada (por ejemplo, ~ 100 ms). Haga clic en &quot;Set&quot; para guardar los cambios. </li><li> Abra &quot;multi-dimensional de adquisición&quot;. Seleccione la pestaña de canales y cargar / seleccionar los canales apropiados. Para este estudio, estamos utilizando canales definidos para dsRed (561 nm láser de excitación y BP 629/62 filtro de emisión) y las buenas prácticas agrarias (488 nm láser de línea para la excitación y BP525/50 filtro de emisión). </li><li> Para asegurar el registro de imagen, un espejo dicroico común (RQFT 405/488/568/647) se utilizó para ambos canales. Configure el software de &quot;Autofoco&quot; Nota:. Vaya a Herramientas → Configuración de editor para ajustar los valores de MDA. Asegúrese de que la potencia del láser adecuado se establece (&quot;láser de potencia adecuada&quot; se refiere a una opción que le permitepara excitar el fluoróforo apropiado mientras se minimiza foto-blanqueamiento). </li><li> En la ventana MDA, seleccione la pestaña z-stack. Seleccione &quot;Z-stack en la posición de foco actual&quot;. Ajuste el rango de ~ 10 m z-pila y elija &quot;óptimo&quot; para el número de pasos para asegurar un muestreo de Nyquist a través de Z. Nota: El tamaño exacto de la z-stack dependerá de la altura de sus células. Ajuste en consecuencia. </li><li> 23. Haga clic en &quot;Inicio&quot; y analizar el resultado z-stack en la imagen para asegurar la configuración es apropiada para lo que se está investigando (por ejemplo, en este estudio, es importante para la imagen del núcleo entero). </li><li> Seleccione la opción &quot;T&quot; (tiempo) ficha. Para nuestro experimento con camptotecina, se establece el intervalo entre los puntos de tiempo de formación de imágenes a 5 min y la duración total de la sesión de 1 hora para un control (células no tratadas) video Nota:. Para minimizar foto-blanqueamiento de las células, el experimento debe ser configurado de tal manera que el AOTF espacios en blanco el láser entre los puntos de tiempo de formación de imágenes. </li><li> Fo múltiples puntos de imagen de varias células en el plato, en la ventana MDA, seleccione la ficha posición. Asegúrese de &quot;Aplicar&quot; ajuste antes / después de punto en el tiempo &quot;posición por&quot; está marcada. Seleccione &quot;Mark_Find&quot;. Usando el &quot;Live&quot; vista, mueva el plato alrededor y seleccionar los campos apropiados de vista. </li><li> Haga clic en &quot;Inicio&quot; en el menú multi-dimensional de adquisición para iniciar el experimento y grabar un vídeo de control (de las células no tratadas). </li><li> Después de que el control de vídeo, añadir el tratamiento apropiado (en este caso, 10 camptotecina mM). Se registró el experimental (droga células tratadas) de vídeo a intervalos de 5-10 min 2-4 h Nota:. Una cuestión importante a tener en cuenta es la velocidad con que se produce un efecto determinado después del tratamiento. Como se ve en el video, 53BP1 focos comienzan a partir de ~ 5 min después de la adición de CPT. Aunque es un proceso relativamente fácil, y agregó droga para el plato manualmente y volver a calibrar el microscopio toma tiempo. Hay que prestar atención a esto cuando el diseño de experimentos. </li><li> Para el seguimiento de mitosis, fijamos el intervalo de 7,5 minutos y grabado durante 4-5 horas (la configuración específica dependerá de la línea celular utilizada y la duración de su ciclo celular). Los ajustes que tenga que hacer para evitar que la foto-blanqueamiento durante grabaciones más largas. </li></ol> C. Procesamiento de imágenes y análisis Este protocolo fue desarrollado usando software Volocity (PerkinElmer). El software utilizado para adquirir la información (AxioVision) también tiene la capacidad para procesar y analizar imágenes. Los usuarios están invitados a utilizar el software a su disposición, y consulte la bibliografía adecuada en cuanto a su aplicación. <ol><li> Abra el software Volocity. Crear y nombrar una nueva biblioteca, e importar los archivos de vídeo. </li><li> Para ver los archivos, por lo general les resulta más útil usar el &quot;Focus extendido&quot; de ajuste. Esta superpone las rebanadas z-stack y, para este protocolo, nos permite visualizar los focos 53BP1 en las diferentes áreas del núcleo. </li><li> Ajuste vídeos como sea necesario. Volocity está equipado con una gama de herramientas para mejorar la calidad de las imágenes adquiridas. Al asegurarse de que los ajustes del microscopio eran apropiadas, mucho tiempo se pueden guardar en la edición más adelante. A menudo, es útil para deconvolucionar sus imágenes y ajustar el brillo / contraste. Sus necesidades de edición específicas pueden variar basado en el experimento. </li><li> Añadir una marca de tiempo relativo y la barra de escala. </li><li> Para ver las células en 3-D, cambie a la &quot;3-D opacidad&quot; de ajuste. Esto permite la rotación de las células en 3-D prestados en el espacio, proporcionando así múltiples perspectivas de estructuras de interés dentro de las células Nota:. Es útil para visualizar las células en diferentes planos para determinar donde las estructuras de los viajes interés. Por ejemplo, en el &quot;Focus extendida&quot; ajuste es difícil discernir que el 53BP1 es, de hecho, se disocian de ADN durante la mitosis. Sin embargo, esto es fácilmente evidente en 3-D. </li><li> Las películas y las imágenes fijas pueden ser exportados a una variedad de tipos de archivos basado en la preferencia del usuario. </l<html> i&gt; </ol> D. Representante Resultados Un ejemplo de 53BP1 formación de focos en respuesta a la CPT se muestra en la figura 1. Las células expuestas a forma CPT focos dentro de 5-10 minutos, y mantener estos focos durante toda la duración de la grabación. Como se muestra en la Figura 2, 53BP1 disocia de la cromatina en el inicio de la mitosis, formando una fina neblina alrededor de los cromosomas de condensación. Como telofase se produce la mitosis y llega a su fin, 53BP1 una vez más agregados en distintos focos. Mientras que las células HEK293 no fueron expuestos a CPT, que sin embargo forman focos abundante, reparación espontánea 53BP1 generado por el daño del ADN endógeno. Esta observación nos permitió concluir que 53BP1 no formar focos durante la mitosis temprana, de acuerdo con un informe anterior que muestra un efecto similar después de la exposición de las células a la radiación ionizante y las drogas radiomiméticos 5. ure 1 &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/4251/4251fig1.jpg &quot;/&gt; Figura 1. Camptotecina (10 mM) y provoca DSBs 53BP1 formación de focos en el ciclismo fibroblastos dentro de 30 min de la adición del fármaco al medio. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4251/4251fig2.jpg" /> Figura 2. 53BP1 no formar focos durante la mitosis hasta telophase/G1 en células HEK293.

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No hay conflictos de interés declarado.

Mantenimiento de la integridad genómica es crucial para la supervivencia celular. El incumplimiento de preservar los resultados del genoma en el envejecimiento prematuro, la carcinogénesis, o la muerte 8. Hay un gran interés en discernir cómo funciona el DDR, derivadas de su importancia para la investigación básica y clínica. Muchas técnicas se han desarrollado a lo largo de los años para ayudar en el estudio de cómo las células detectar y reparar el daño del ADN. Los métodos tradicionales como la inmunocitoquímica y Western Blot han sido pilares fundamentales de la materia, aunque los recientes avances en la tecnología han permitido a métodos cada vez más sofisticados para evolucionar. Vivo de imágenes de células, como se detalla en este protocolo, nos permite estudiar las características de la DDR pasados ​​por alto por las técnicas más tradicionales. Central para el uso de imágenes de células vivas es la creación de proteínas marcadas fluorescentemente. Aquí se describe el uso de una proteína marcada con mCherry involucrados en el DDR, 53BP1, así como una histona H2B-GFP producto de fusión. Proteínas marcadas fluorescentemente se utilizan ampliamente en la biología molecular y celular, sin embargo, no son sin sus limitaciones. Colocación de una nueva estructura de una proteína endógena crea el riesgo evidente de alteración de la función natural. Adicionalmente, ciertas construcciones pueden y serán expresadas en diferentes niveles en diferentes líneas celulares, en diversas condiciones. Hemos observado niveles divergentes de intensidad de fluorescencia en todas las células de ingeniería genética utilizadas en este estudio. El 53BP1 construir utilizada en este protocolo carece de dominios más funcionales, sin embargo, retiene la capacidad de unirse a los sitios de daño de ADN que no parece afectar negativamente a la celda 2. Además, es importante tener en cuenta el método de entrega de genes. En este protocolo, se utilizaron dos métodos: la transducción lentiviral y transfección estable. Nuestros lentivirus de las células infectadas de forma estable transducidas con el constructo fluorescente;por lo tanto, continuarán para expresar estas proteínas indefinidamente. Sin embargo, este método es algo más mano de obra en comparación con la transfección y es dictada por qué tipo de células son el blanco; algunas células no son susceptibles de transfección eficiente. Por otro lado, los lentivirus son capaces de entrar en la mayoría de las células, incluyendo humanos. Los investigadores se les anima a sopesar los pros y los contras de cada método cuando se trata de sus propios experimentos. Como un posible medio de eludir los problemas inherentes a las proteínas marcadas con fluorescencia, el uso de células permeables a sondas marcadas fluorescentemente se informó recientemente de experimentos de células vivas 10. Sin embargo, esta técnica todavía no se ha desarrollado completamente. Una ventaja principal de imágenes de células vivas es la posibilidad de estudiar las relaciones espacio-temporales de la RDA y la reparación de DSB. En efecto, Dimitrova et al. (2008) fueron capaces de observar la etiqueta fluorescente células vivas y en revelar novelaformación con respecto a la unión a los telómeros 53BP1 y cómo afecta a la dinámica de la cromatina. Este análisis sería mucho más difícil, aunque no imposible, con otros métodos. Tener la capacidad de monitorear el DDR en el espacio y el tiempo nos permite discernir las funciones y relaciones que de otro modo podrían pasar por alto. En resumen, utilizando imágenes de células vivas permite a los investigadores para controlar la cinética de formación de DSB y resolución en tiempo real, y permite el análisis cuantitativo en una única célula. Además de la técnica utilizada en este estudio, otras aplicaciones de imágenes de células vivas pueden ser utilizados, tales como FRET y FRAP 3. La tecnología de la observación de las células en tiempo real continuará a ser mejorado y utilizado para estudiar una variedad de procesos celulares.

<table border="1"><tbody><tr><td> Producto </td><td> Empresa </td></tr><tr><td> Cellstar placas de cultivo </td><td> Greiner Bio-One </td></tr><tr><td> FluroDish platos con fondo de cristal </td><td> World Precision Instruments, Inc. </td></tr><tr><td> Medio MEM </td><td> GIBCO </td></tr><tr><td> No esenciales de aminoácidos </td><td> GIBCO </td></tr><tr><td> Los aminoácidos </td><td> GIBCO </td></tr><tr><td> Vitaminas </td><td> GIBCO </td></tr><tr><td> Piruvato de sodio </td><td> Invitrogen </td></tr><tr><td> Penicilina / Estreptomicina </td><td> HyClone </td></tr><tr><td> Suero Bovino Fetal </td><td> GIBCO </td></tr><tr><td> N-Myc-53BP1 PESO pLPC-Puro; plásmido 19836 </td><td> Addgene </td></tr><tr><td> pCLNR-H2BG; plásmido 17735 </td><td> Addgene </td></tr><tr><td> SuperFect </td><td> Qiagen </td></tr><tr><td> Zeiss celular Observador SD Imaging System </td><td> Zeiss </td></tr><tr><td> AxioVision (versión 4.8.2) </td><td> Zeiss </td></tr><tr><td> Zeiss Immersol W Petróleo </td><td> Zeiss </td></tr><tr><td> Volocity software (versión 6,0) </td><td> PerkinElmer </td></tr></tbody></table>

two- and three-dimensional live cell imaging of dna damage response proteins

Doble filamento se rompe (DSBs) son el ADN más perjudicial lesiones que una célula pueda encontrar. Si se deja sin reparar, DSBs gran puerto potencial para generar mutaciones y aberraciones cromosómicas 1. Para evitar este trauma de catalizar la inestabilidad genómica, que es crucial para las células para detectar DSBs, activan la respuesta al daño del ADN (DDR), y reparar el ADN. Cuando se estimula, el DDR trabaja para preservar la integridad genómica mediante la activación de detención del ciclo celular para permitir la reparación a tener lugar o forzar la célula a la apoptosis. Los mecanismos predominantes de reparación de DSB ocurrir a través de nonhomologous fin de unirse (NHEJ) y reparación de recombinación homóloga (HRR) (revisado en 2). Hay muchas proteínas cuyas actividades deben estar precisamente orquestada por la RDA para funcionar correctamente. En este documento, se describe un método para 2 - y 3-dimensional (D) la visualización de una de estas proteínas, 53BP1. La proteína p53 de unión 1 (53BP1) se localiza en áreas deDSBs por la unión a las histonas modificadas 3,4, formando focos dentro de 5-15 minutos 5. Las modificaciones de las histonas y el reclutamiento de proteínas DDR 53BP1 y otro a sitios de DSB se cree que facilita la reorganización estructural de la cromatina alrededor de las áreas de daño y contribuir a la reparación del ADN 6. Más allá de la participación directa en la reparación, funciones adicionales han sido descritos para 53BP1 en el DDR, tales como la regulación de un puesto de control intra-S, un punto de control G2 / M, y la activación de proteínas aguas abajo de DDR 7-9. Recientemente, se descubrió que 53BP1 no formar focos en respuesta al daño del ADN inducido durante la mitosis, en vez de espera para entrar en las células G1 antes de localizar a la vecindad de DSBs 6. Proteínas tales como DDR 53BP1 han encontrado asociación con estructuras mitóticas (tal como cinetocoros) durante la progresión a través de mitosis 10. En este protocolo se describe el uso de 2 - y 3-D imágenes de células vivas para visualizarla formación de focos 53BP1 en respuesta al agente que daña el ADN camptotecina (CPT), así como el comportamiento de 53BP1 durante la mitosis. La camptotecina es un inhibidor de topoisomerasa I que causa principalmente DSBs durante la replicación del ADN. Para lograr esto, se utilizó una anteriormente descrita 53BP1-mCherry proteína de fusión fluorescente construir consta de un dominio de proteína 53BP1 capaz de unirse DSBs 11. Además, se utilizó una histona H2B-GFP proteína de fusión fluorescente construir capaz de monitorear dinámica de la cromatina a través del ciclo celular, pero en particular durante la mitosis 12. Imágenes de células vivas en múltiples dimensiones es una excelente herramienta para profundizar en nuestra comprensión de la función de las proteínas de DDR en las células eucariotas.

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Two- and Three-Dimensional Live Cell Imaging of DNA Damage Response Proteins

Este protocolo describe un método para visualizar un ADN de doble hebra proteína rotura de señalización activada en respuesta al daño del ADN, así como su localización durante la mitosis.

De dos y tres dimensiones imágenes de células vivas de las proteínas de respuesta al daño del ADN

Double-strand breaks (DSBs) are the most deleterious DNA lesions a cell can encounter. If left unrepaired, DSBs harbor great potential to generate ...

two-three-dimensional-live-cell-imaging-dna-damage-response

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

14.0K vistas.  Virginia Commonwealth University. Este protocolo describe un método para visualizar un ADN de doble hebra proteína rotura de señalización activada en respuesta al daño del ADN, así como su localización durante la mitosis.

Video: Two- and Three-Dimensional Live Cell Imaging of DNA Damage Response Proteins

Microfabrication of Chip-sized Scaffolds for Three-dimensional Cell cultivation

Using microfabrication technologies is a prerequisite to create scaffolds of reproducible geometry and constant quality for three-dimensional cell cultivation. These technologies offer a wide spectrum of advantages not only for manufacturing but also for different applications. The size and shape of formed cell clusters can be influenced by the exact and reproducible architecture of the microfabricated scaffold and, therefore, the diffusion path length of nutrients and gases can be controlled.1 This is unquestionably a useful tool to prevent apoptosis and necrosis of cells due to an insufficient nutrient and gas supply or removal of cellular metabolites.
Our polymer chip, called CellChip, has the outer dimensions of 2 x 2 cm with a central microstructured area. This area is subdivided into an array of up to 1156 microcontainers with a typical dimension of 300 m edge length for the cubic design (cp- or cf-chip) or of 300 m diameter and depth for the round design (r-chip).2
So far, hot embossing or micro injection moulding (in combination with subsequent laborious machining of the parts) was used for the fabrication of the microstructured chips. Basically, micro injection moulding is one of the only polymer based replication techniques that, up to now, is capable for mass production of polymer microstructures.3 However, both techniques have certain unwanted limitations due to the processing of a viscous polymer melt with the generation of very thin walls or integrated through holes. In case of the CellChip, thin bottom layers are necessary to perforate the polymer and provide small pores of defined size to supply cells with culture medium e.g. by microfluidic perfusion of the containers.
In order to overcome these limitations and to reduce the manufacturing costs we have developed a new microtechnical approach on the basis of a down-scaled thermoforming process. For the manufacturing of highly porous and thin walled polymer chips, we use a combination of heavy ion irradiation, microthermoforming and track etching. In this so called "SMART" process (Substrate Modification And Replication by Thermoforming) thin polymer films are irradiated with energetic heavy projectiles of several hundred MeV introducing so-called "latent tracks" Subsequently, the film in a rubber elastic state is formed into three dimensional parts without modifying or annealing the tracks. After the forming process, selective chemical etching finally converts the tracks into cylindrical pores of adjustable diameter.

We present two processes for the microfabrication of porous polymer chips for three-dimensional cell cultivation. The first one is hot embossing combined with a solvent vapour welding process. The second one uses a recently developed microthermoforming process combined with ion track technology leading to a significant simplification of manufacture.

Microfabricación de chip del tamaño de andamios para el cultivo de células en tres dimensiones

Using microfabrication technologies is a prerequisite to create scaffolds of reproducible geometry and constant quality for three-dimensional cell ...

Investigación

Biología

Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo. Here we describe a method to mount zebrafish embryos for long-term imaging and demonstrate how to automate the capture of time-lapse images using a confocal microscope. We also describe a method to create controlled, precise damage to individual branches of peripheral sensory axons in zebrafish using the focused power of a femtosecond laser mounted on a two-photon microscope. The parameters for successful two-photon axotomy must be optimized for each microscope. We will demonstrate two-photon axotomy on both a custom built two-photon microscope and a Zeiss 510 confocal/two-photon to provide two examples.

Zebrafish trigeminal sensory neurons can be visualized in a transgenic line expressing GFP driven by a sensory neuron specific promoter 1. We have adapted this zebrafish trigeminal model to directly observe sensory axon regeneration in living zebrafish embryos. Embryos are anesthetized with tricaine and positioned within a drop of agarose as it solidifies. Immobilized embryos are sealed within an imaging chamber filled with phenylthiourea (PTU) Ringers. We have found that embryos can be continuously imaged in these chambers for 12-48 hours. A single confocal image is then captured to determine the desired site of axotomy. The region of interest is located on the two-photon microscope by imaging the sensory axons under low, non-damaging power. After zooming in on the desired site of axotomy, the power is increased and a single scan of that defined region is sufficient to sever the axon. Multiple location time-lapse imaging is then set up on a confocal microscope to directly observe axonal recovery from injury.

Here we describe a method for mounting zebrafish embryos for long-term imaging, two-photon imaging and tissue-damage techniques, and time-lapse confocal imaging.

De dos fotones axotomía y de lapso de tiempo de imagen confocal en embriones de pez cebra en vivo

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo.  ...

Imaging Mismatch Repair and Cellular Responses to DNA Damage in Bacillus subtilis

Both prokaryotes and eukaryotes respond to DNA damage through a complex set of physiological changes. Alterations in gene expression, the redistribution of existing proteins, and the assembly of new protein complexes can be stimulated by a variety of DNA lesions and mismatched DNA base pairs. Fluorescence microscopy has been used as a powerful experimental tool for visualizing and quantifying these and other responses to DNA lesions and to monitor DNA replication status within the complex subcellular architecture of a living cell. Translational fusions between fluorescent reporter proteins and components of the DNA replication and repair machinery have been used to determine the cues that target DNA repair proteins to their cognate lesions in vivo and to understand how these proteins are organized within bacterial cells. In addition, transcriptional and translational fusions linked to DNA damage inducible promoters have revealed which cells within a population have activated genotoxic stress responses. In this review, we provide a detailed protocol for using fluorescence microscopy to image the assembly of DNA repair and DNA replication complexes in single bacterial cells. In particular, this work focuses on imaging mismatch repair proteins, homologous recombination, DNA replication and an SOS-inducible protein in Bacillus subtilis. All of the procedures described here are easily amenable for imaging protein complexes in a variety of bacterial species.

Imaging Mismatch Repair and Cellular Responses to DNA Damage in Bacillus subtilis

A detailed protocol is described for imaging the real time formation of DNA repair complexes in Bacillus subtilis cells.

Imágenes de reparación del ADN y la respuesta celular al daño del ADN en Bacillus subtilis</em

Both prokaryotes and eukaryotes respond to DNA damage through a complex set of physiological changes. Alterations in gene expression, the redistribution ...

Fluorescent Labeling of COS-7 Expressing SNAP-tag Fusion Proteins for Live Cell Imaging

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest in live cells. These systems offer a broad selection of fluorescent substrates optimized for a range of imaging instrumentation. Once cloned and expressed, the tagged protein can be used with a variety of substrates for numerous downstream applications without having to clone again. There are two steps to using this system: cloning and expression of the protein of interest as a SNAP-tag fusion, and labeling of the fusion with the SNAP-tag substrate of choice. The SNAP-tag is a small protein based on human O6-alkylguanine-DNA-alkyltransferase (hAGT), a DNA repair protein. SNAP-tag labels are dyes conjugated to guanine or chloropyrimidine leaving groups via a benzyl linker. In the labeling reaction, the substituted benzyl group of the substrate is covalently attached to the SNAP-tag. CLIP-tag is a modified version of SNAP-tag, engineered to react with benzylcytosine rather than benzylguanine derivatives. When used in conjunction with SNAP-tag, CLIP-tag enables the orthogonal and complementary labeling of two proteins simultaneously in the same cells.

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest in live cells. Once cloned and expressed, the tagged protein can be used with a variety of substrates for numerous downstream applications without having to clone again.

Marcaje fluorescente de COS-7 Expresando etiqueta SNAP-proteínas de fusión de imágenes de células vivas

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest ...

Two-Photon-Based Photoactivation in Live Zebrafish Embryos

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic development, cellular signaling and adult physiology. In this respect, the use of multi-photon microscopy enables quantitative photoactivation of a given light responsive agent in deep tissues at a single cell resolution. As zebrafish embryos are optically transparent, their development can be monitored in vivo. These traits make the zebrafish a perfect model organism for controlling the activity of a variety of chemical agents and proteins by focused light. Here we describe the use of two-photon microscopy to induce the activation of chemically caged fluorescein, which in turn allows us to follow cell's destiny in live zebrafish embryos. We use embryos expressing a live genetic landmark (GFP) to locate and precisely target any cells of interest. This procedure can be similarly used for precise light induced activation of proteins, hormones, small molecules and other caged compounds.

Multiphoton microscopy allows control of low energy photons with deep optical penetration and reduced phototoxicity. We describe the use of this technology for live cell labeling in zebrafish embryos. This protocol can be readily adapted for photo-induction of various light-responsive molecules.

De dos fotones basado en fotoactivación en vivo embriones de pez cebra

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic ...

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

The Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating fundamental questions such as cytoskeletal function, cell organization, and organelle structure and function. The availability of various GFP-tagged proteins means that many cellular processes can be monitored in living cells over the course of minutes or hours, and using this technique, processes such as RNP transport, epithelial morphogenesis, and tissue remodeling have been described in great detail in Drosophila oocytes1,2.
The ability to perform video imaging combined with a rich repertoire of mutants allows an enormous variety of genes and processes to be examined in incredible detail. One such example is the process of ooplasmic streaming, which initiates at mid-oogenesis3,4. This vigorous movement of cytoplasmic vesicles is microtubule and kinesin-dependent5 and provides a useful system for investigating cytoskeleton function at these stages.
Here I present a protocol for time lapse imaging of living oocytes using virtually any confocal microscopy setup.

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

A protocol for live imaging of GFP-tagged proteins or autofluorescent structures in individual Drosophila oocytes is described.

Imágenes en directo de las proteínas GFP-etiquetados en<em&gt; Drosophila</em&gt; Los ovocitos

The  Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating  fundamental questions such as cytoskeletal function, cell ...

4D Imaging of Protein Aggregation in Live Cells

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental conditions and an intracellular environment that is tightly packed, sticky, and hazardous to protein stability1. The ability to dynamically balance protein production, folding and degradation demands highly-specialized quality control machinery, whose absolute necessity is observed best when it malfunctions. Diseases such as ALS, Alzheimer's, Parkinson's, and certain forms of Cystic Fibrosis have a direct link to protein folding quality control components2, and therefore future therapeutic development requires a basic understanding of underlying processes. Our experimental challenge is to understand how cells integrate damage signals and mount responses that are tailored to diverse circumstances.
The primary reason why protein misfolding represents an existential threat to the cell is the propensity of incorrectly folded proteins to aggregate, thus causing a global perturbation of the crowded and delicate intracellular folding environment1. The folding health, or "proteostasis," of the cellular proteome is maintained, even under the duress of aging, stress and oxidative damage, by the coordinated action of different mechanistic units in an elaborate quality control system3,4. A specialized machinery of molecular chaperones can bind non-native polypeptides and promote their folding into the native state1, target them for degradation by the ubiquitin-proteasome system5, or direct them to protective aggregation inclusions6-9.
In eukaryotes, the cytosolic aggregation quality control load is partitioned between two compartments8-10: the juxtanuclear quality control compartment (JUNQ) and the insoluble protein deposit (IPOD) (Figure 1 - model). Proteins that are ubiquitinated by the protein folding quality control machinery are delivered to the JUNQ, where they are processed for degradation by the proteasome. Misfolded proteins that are not ubiquitinated are diverted to the IPOD, where they are actively aggregated in a protective compartment.
Up until this point, the methodological paradigm of live-cell fluorescence microscopy has largely been to label proteins and track their locations in the cell at specific time-points and usually in two dimensions. As new technologies have begun to grant experimenters unprecedented access to the submicron scale in living cells, the dynamic architecture of the cytosol has come into view as a challenging new frontier for experimental characterization. We present a method for rapidly monitoring the 3D spatial distributions of multiple fluorescently labeled proteins in the yeast cytosol over time. 3D timelapse (4D imaging) is not merely a technical challenge; rather, it also facilitates a dramatic shift in the conceptual framework used to analyze cellular structure.
We utilize a cytosolic folding sensor protein in live yeast to visualize distinct fates for misfolded proteins in cellular aggregation quality control, using rapid 4D fluorescent imaging. The temperature sensitive mutant of the Ubc9 protein10-12 (Ubc9ts) is extremely effective both as a sensor of cellular proteostasis, and a physiological model for tracking aggregation quality control. As with most ts proteins, Ubc9ts is fully folded and functional at permissive temperatures due to active cellular chaperones. Above 30 &deg;C, or when the cell faces misfolding stress, Ubc9ts misfolds and follows the fate of a native globular protein that has been misfolded due to mutation, heat denaturation, or oxidative damage. By fusing it to GFP or other fluorophores, it can be tracked in 3D as it forms Stress Foci, or is directed to JUNQ or IPOD.

Cellular viability depends on timely and efficient management of protein misfolding. Here we describe a method for visualizing the different potential fates of a misfolded protein: refolding, degradation, or sequestration in inclusions. We demonstrate the use of a folding sensor, Ubc9ts, for monitoring proteostasis and aggregation quality control in live cells using 4D microscopy.

4D de imágenes de la agregación de proteínas en células vivas

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental ...

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Most morphogenetic processes in the fetal intestine have been inferred from thin sections of fixed tissues, providing snapshots of changes over developmental stages. Three-dimensional information from thin serial sections can be challenging to interpret because of the difficulty of reconstructing serial sections perfectly and maintaining proper orientation of the tissue over serial sections. Recent findings by Grosse et al., 2011 highlight the importance of three- dimensional information in understanding morphogenesis of the developing villi of the intestine1. Three-dimensional reconstruction of singly labeled intestinal cells demonstrated that the majority of the intestinal epithelial cells contact both the apical and basal surfaces. Furthermore, three-dimensional reconstruction of the actin cytoskeleton at the apical surface of the epithelium demonstrated that the intestinal lumen is continuous and that secondary lumens are an artifact of sectioning. Those two points, along with the demonstration of interkinetic nuclear migration in the intestinal epithelium, defined the developing intestinal epithelium as a pseudostratified epithelium and not stratified as previously thought1. The ability to observe the epithelium three-dimensionally was seminal to demonstrating this point and redefining epithelial morphogenesis in the fetal intestine. With the evolution of multi-photon imaging technology and three-dimensional reconstruction software, the ability to visualize intact, developing organs is rapidly improving. Two-photon excitation allows less damaging penetration deeper into tissues with high resolution. Two-photon imaging and 3D reconstruction of the whole fetal mouse intestines in Walton et al., 2012 helped to define the pattern of villus outgrowth2. Here we describe a whole organ culture system that allows ex vivo development of villi and extensions of that culture system to allow the intestines to be three-dimensionally imaged during their development.

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Improved imaging technology is allowing three-dimensional imaging of organs during development. Here we describe a whole organ culture system that allows live imaging of the developing villi in the fetal mouse intestine.

Sistema de Cultura ratón fetal Whole Intestino para<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Manipulación de vías de señalización y tridimensional de imágenes en vivo del desarrollo de vellosidades

Most morphogenetic processes in the fetal intestine have been inferred from thin sections of fixed tissues, providing snapshots of changes over ...

FRET Imaging in Three-dimensional Hydrogels

Imaging of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET)&#160;is a powerful tool for examining cell biology in real-time. Studies utilizing FRET commonly employ two-dimensional (2D) culture, which does not mimic the three-dimensional (3D) cellular microenvironment. A method to perform quenched emission FRET imaging using conventional widefield epifluorescence microscopy of cells within a 3D hydrogel environment is presented. Here an analysis method for ratiometric FRET probes that yields linear ratios over the probe activation range is described. Measurement of intracellular cyclic adenosine monophosphate (cAMP) levels is demonstrated in chondrocytes under forskolin stimulation using a probe for EPAC1 activation (ICUE1) and the ability to detect differences in cAMP signaling dependent on hydrogel material type, herein a photocrosslinking hydrogel (PC-gel, polyethylene glycol dimethacrylate) and a thermoresponsive hydrogel (TR-gel). Compared with 2D FRET methods, this method requires little additional work. Laboratories already utilizing FRET imaging in 2D can easily adopt this method to perform cellular studies in a 3D microenvironment. It can further be applied to high throughput drug screening in engineered 3D microtissues. Additionally, it is compatible with other forms of FRET imaging, such as anisotropy measurement and fluorescence lifetime imaging (FLIM), and with advanced microscopy platforms using confocal, pulsed, or modulated illumination.

F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) imaging is a powerful tool for real-time cell biology studies. Here a method for FRET imaging cells in physiologic three-dimensional (3D) hydrogel microenvironments using conventional epifluorescence microscopy is presented. An analysis for ratiometric FRET probes that yields linear ratios over the activation range is described.

FRET Imaging en hidrogeles tridimensionales

Imaging of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET)&#160;is a powerful tool for examining cell biology in real-time. Studies utilizing FRET commonly ...

Single-Cell Resolution Three-Dimensional Imaging of Intact Organoids

Organoid technology, in vitro 3D culturing of miniature tissue, has opened a new experimental window for cellular processes that govern organ development and function as well as disease. Fluorescence microscopy has played a major role in characterizing their cellular composition in detail and demonstrating their similarity to the tissue they originate from. In this article, we present a comprehensive protocol for high-resolution 3D imaging of whole organoids upon immunofluorescent labeling. This method is widely applicable for imaging of organoids differing in origin, size and shape. Thus far we have applied the method to airway, colon, kidney, and liver organoids derived from healthy human tissue, as well as human breast tumor organoids and mouse mammary gland organoids. We use an optical clearing agent, FUnGI, which enables the acquisition of whole 3D organoids with the opportunity for single-cell quantification of markers. This three-day protocol from organoid harvesting to image analysis is optimized for 3D imaging using confocal microscopy.

The entire 3D structure and cellular content of organoids, as well as their phenotypic resemblance to the original tissue can be captured using the single-cell resolution 3D imaging protocol described here. This protocol can be applied to a wide range of organoids varying in origin, size and shape.

Imagen tridimensional de resolución de una sola célula de organoides intactos

Organoid technology, in vitro 3D culturing of miniature tissue, has opened a new experimental window for cellular processes that govern organ development ...