Name: Video: Low-Cost Cryo-Light Microscopy Stage Fabrication for Correlated Light/Electron Microscopy
Uploaded: 2011-06-05T17:00:00.000+00:00
Duration: 10 min
Description: 15.4K vistas. University of California Davis. Se demuestra la fabricación de una etapa criogénica de bajo costo diseñado para adaptarse a la mayoría de los microscopios de luz reflejada. Esta etapa criogénica de laboratorio permite construir imágenes correlativas eficiente y confiable entre la luz y la crio-crio-microscopía electrónica.

Los autores desean agradecer a Brandon J. Zipp y Ken B. Kaplan para facilitar el acceso a la cepa de levadura utilizada en este estudio. Los autores también agradecen Julio Lenin Domínguez Ramírez de asistencia con grabación en vídeo. JEE NIH reconoce el apoyo financiero de la subvención número 5RC1GM91755.

1. Fabricación y Montaje <ol><li> Coloque el disipador de calor de aluminio en el interior del 22,96 cm (9 &quot;) molde de aproximadamente 2 cm por el lado de la olla, como se muestra en la Figura 1c El uso de un rotulador negro, marque los agujeros para el disipador de calor de aluminio Nota:.. Si el aluminio bloque (comprado en una tienda de chatarra local o en línea en <a href="http://www.onlinemetals.com">http://www.onlinemetals.com</a> ) no viene con los agujeros previamente perforados, tendrá que hacer arreglos para que los agujeros perforados y avellanados antes del paso 1 para obtener el aluminio bloque para el molde. Utilizamos cinco agujeros para fijar el bloque a la plataforma y cuatro agujeros extra para permitir que las burbujas de gas nitrógeno para escapar de debajo de la de aluminio. </li><li> Coloque la caja de la crio-red cerca de la ubicación del disipador de calor de aluminio y marcar la primera categoría y de cada lado. </li><li> Perforar agujeros piloto para cada posición marcada con una broca # 17 para perforar los agujeros de lavabo de calor de aluminio y una broca # 35 para perforar los agujeros de caja de la crio-red. </li><li> Montar el disipador de calor de aluminio con 5 - N º 10, de 1,9 cm (3 / 4 &quot;) de cabeza plana tornillos y tuercas con ranuras correspondientes, así como 15 - # 10 arandelas Coloque dos arandelas debajo del bloque de aluminio y la tercera en la parte posterior de la. molde para cada agujero Nota:. voladizos sin garantía del bloque de aluminio, cerca del área de visualización puede dar lugar a vibraciones que limitan las capacidades de imágenes de la etapa de verificación para asegurarse de que todos los tornillos de montaje están bien apretados.. </li><li> Inserte 3 - # 4, 0,95 cm (3 / 8 &quot;) alrededor de los tornillos y las tuercas con ranuras correspondientes de la parte trasera del molde para que actúe como caja de montaje en la crio-red. </li><li> Cinta 4 palillos de dos en dos con un palillo encima del otro. Cinta de cada par de extremos opuestos de la torta de pan de actuar como separadores. </li><li> Humedecer la superficie superior e inferior de la tarta y la tarta de las cacerolas, respectivamente, con ddH 2 O. </li><li> Llenar el molde con dos capas de aislante de espuma aerosol. Mojar cada capa antes de ir al siguiente paso. </li><li> Presione el molde en la espuma. </li><li> Da la vuelta al revés y las cacerolas de prensa en el molde hasta que los separadores en contacto con el molde. Coloque ningún objeto pesado encima de la torta de pan y dejar reposar toda la noche para curar. </li><li> Con un cuchillo de sierra, cortar el exceso de secado spray de espuma aislante del borde de los moldes y retire los palillos. </li><li> Retire el molde de la tarta de pan. El molde de aluminio con disipador de calor está aislado y se conoce como la &quot;etapa criogénica&quot; (Fig. 1a). </li><li> Coloque un tablero de plástico transparente (de cualquier color y mayor de 3 mm de espesor) en la parte superior de la etapa criogénica. Marca con un marcador negro la ubicación de la Caja de montaje en la crio-rejilla dibujando un círculo alrededor de 1,5 veces el diámetro de una sola ronda de crio-grid caja. Cortar el orificio con un 1,9 cm (3 / 4 &quot;) sierra de perforación. Este portapapeles se conoce como la&quot; pantalla de carga &quot;(Fig 1b). </li><li> Ponga un tablero transparente nuevo en la cima de la etapa criogénica y el lugar en el microscopio con el disipador de calor directamente en las lentes del objetivo. Con un marcador negro, marca el camino de los objetivos a medida que rotan. </li><li> Corte a lo largo de la línea marcada la eliminación de un semicírculo desde el borde del portapapeles. Esto se puede lograr con una sierra o con un 7.62 cm (3 &quot;) el agujero vio varias veces, como se muestra en el video. </li><li> Finalmente hizo un agujero de 1,9 cm (3 / 4 &quot;) de distancia del semicírculo, pero aún dentro de la zona del plato. Este será el puerto para la recarga de nitrógeno líquido (LN 2) si al mismo tiempo que bajan los niveles de imagen. Esta portapapeles se refiere como la &quot;pantalla de visión&quot; (Fig. 1c). </li></ol> 2. Preparación de la muestra <ol><li> Diluir registro de las células de levadura cultivada en fase sintético completo (SC) los medios de comunicación a una concentración adecuada de 1x10 6 células / ml en agua. </li><li> 2 ml de la levadura diluida con pipeta a un R2 / 1 400 mallas perforadas de carbono recubiertos de cobre crio-ME red (SPI Supplies, West Chester, PA) y se deja absorber durante 15 segundos. </li><li> Borrar lejos el exceso de líquido de la superficie de la rejilla al tocar el fondo de la parrilla a un trozo de tejido de celulosa blanda (Kimwipe) durante 2 segundos. </li><li> Si es necesario, la red se pueden lavar con 3 gotas l de agua (1-3 veces), y el malo de distancia como en el paso 3 por transferencia de la parte posterior. </li><li> Antes del último lavado, la muestra se carga en el congelador caída neumáticos y la red colgando se lava como en el paso 2.4. Después de borrar la parrilla con un pañuelo de papel rasgado (Kimwipe) para eliminar la mayor parte del agua de la superficie, la red se hunde en la LN 2 etano líquido refrigerado y trasladado a una caja de crio-red para el almacenamiento Nota 1:. Es importante dejar una capa de líquido lo más fina posible sobre la superficie para mantener hidratada la muestra. Inadecuado secante o se seca la muestra o dejar de hielo que es opaco a los electrones. </li></ol> 3. Cryo-microscopio de luz <ol><li> Llene la etapa criogénica conln 2 y cubrir rápidamente con la pantalla de carga (portapapeles de plástico con solo 1,9 cm (3 / 4 &quot;) el agujero). </li><li> Una vez que el metal alcance la temperatura ln 2, la transferencia de la caja de la crio-a través de la red de 1,9 cm (3 / 4 &quot;) el agujero de la pantalla de carga y en la transferencia de montaje creado por los 3 tornillos que se describe en el A5 parte. Desenrosque la caja de la crio-red de su soporte y quitar el soporte para mejorar el acceso. Mantenga el titular de la caja de la crio-red con arreglo a ln 2 por separado en un termo hasta el paso 3.10. El cuadro de la crio-red también debe ser objeto de ln 2 para evitar el calentamiento de la muestra la cuadrícula. </li><li> . Rellenar ln 2 en la etapa criogénica hasta justo debajo de la parte superior del disipador de calor de aluminio Nota: en dos niveles deben ser controlados periódicamente y rellenados durante el proceso de formación de imágenes para asegurarse de ln 2 está continuamente en contacto con el disipador de calor. En general, la recarga se produce cada 10 minutos a través del puerto de llenado en la pantalla de visualización. </li><li> Pre-enfriar la punta de la pinza en la NL 2, entonces la transferencia de la cuadrícula (s) en la superficie de visión plana del disipador de calor de aluminio con pinzas, con el 1,9 cm (3 / 4 &quot;) el agujero de la pantalla de carga. </li><li> Cuidadosamente mueva el crio-etapa de debajo de las aberturas objetivo del microscopio de luz reflejada. </li><li> Coloque la pantalla de visualización transparente sobre la pantalla de carga. Luego, lentamente, quitar la pantalla de carga, deslizándola por debajo de la pantalla de visualización. Nota: En este punto, la muestra es más vulnerable. Todas las corrientes de aire alrededor del microscopio debe ser minimizado, incluyendo la respiración, una puerta cercana, gente caminando pasas, etc Le sugerimos usar una mascarilla o colgar una careta transparente debajo del microscopio oculares como medida de precaución. </li><li> Gire la lente objetivo en el medio ambiente de nitrógeno gas frío de la crio-escenario y análisis de la muestra en el área de visualización plana calor fregadero. Los métodos habituales de la luz brillante microscopía de campo técnicas se centran en la red con un objetivo de bajo aumento para encontrar el centro y tener una imagen general. Especificaciones relativas a las lentes de microscopio de luz utilizada para este experimento se muestran en la sección de materiales experimentales. Nota: ln 2 no entran en contacto con las lentes del objetivo y todavía tenemos que ver la degradación de las imágenes o los daños a las lentes de los efectos de enfriamiento . </li><li> Enfoque en el gran aumento en un área de interés y adquirir datos de campo claro, campo oscuro, la luz polarizada o imágenes de fluorescencia. Asegúrese de registrar la ubicación del área de interés en la imagen de campo de bajo aumento de la correlación brillante futuro. Si todas las precauciones mencionadas anteriormente para rellenar el ln 2 se siguen, entonces la presión positiva de la evaporación de nitrógeno es suficiente para mantener un ambiente libre de contaminación (independiente de la humedad del ambiente) para la duración de la imagen. </li><li> Una vez terminado, vuelva a colocar la pantalla de carga de deslizamiento sobre la parte superior de la pantalla de visualización. Quitar la pantalla de visualización de la desaceleración deslizándola por debajo de la pantalla de carga. </li><li> Retire la etapa criogénica del microscopio y con pre-enfriado pinzas, la transferencia de la red a la caja de la crio-red. Atornille el soporte de caja de la crio-red en la crio-grid caja para sellar contra el medio ambiente y la transferencia a su titular un dewar LN2 para el almacenamiento y las imágenes en el futuro. </li></ol> 4. Crio-microscopía electrónica <ol><li> Siguiendo las técnicas estándar y estableció, la carga de la red de la muestra en un soporte de transferencia de la crio-ME, manteniendo la muestra a la temperatura del nitrógeno líquido en todo momento. </li><li> Inserte el titular de la crio-con la red de la muestra en un microscopio electrónico de transmisión. </li><li> En una vista de la ampliación adecuada de baja (50-500x aumentos nominales), encontrar el centro de la rejilla de la muestra. </li><li> Utilice la recogida previamente bajo magnificación LM crio-los datos de paso de 3,7 a determinar la orientación relativa de las fichas de la cuadrícula central de cobre (como se describe en la figura 2) e identificar las áreas exactas de interés para la correlación. </li><li> Proceder a la alineación microscopio, dosis bajas de imágenes crio-ME y la recolección de datos. </li></ol> 5. Resultados representante La etapa criogénica (Fig. 1a) es una manera efectiva para reunir datos de la crio-LM para la crio-microscopía de fluorescencia y análisis cryo-LM/cryo-EM correlativa. La figura 2 muestra cómo la combinación de bajo y alto aumento de la crio-LM imágenes le permite crear mapas de referencia que le llevan a las áreas específicas de la crio-ME. El resultado de la crio-LM referencia en el mapa (figura 2b) se utilizó durante la crio-ME de adquisición de datos para localizar las regiones exacto que se muestra en la Figura 3. <img src="/files/ftp_upload/2909/2909fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Etapa criogénica. A) El diseño de la etapa criogénica consiste en una caja de transferencia crio de la red de montaje indicado won una flecha blanca y un disipador de calor de aluminio. Las rejillas son transferidos bajo ln 2 de la caja de la crio-red y se colocan directamente en el área de visualización del disipador de calor como indica la flecha negro. B) de la imagen que representa la etapa criogénica con la pantalla de carga. El agujero en la pantalla de carga se coloca directamente sobre la caja de montaje en la crio-red y actúa como un puerto de transferencia de muestras y para mover las muestras de la caja de la crio-red para el área de la muestra la visualización en el disipador de calor con unas pinzas. C) La criogénica etapa en la posición en las lentes del objetivo con la pantalla de visualización en su lugar. La corte especial en la pantalla de visualización permite a las lentes del objetivo a oscilar con facilidad en la posición sin mover la etapa criogénica. El agujero en la pantalla de visualización de la zona de la muestra actúa como un puerto de llenado ln 2 ln 2 para reponer los niveles si es necesario. <img src="/files/ftp_upload/2909/2909fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Navegación en la crio-LM de estudios que los relacionan. A) bajo aumento de la crio-LM vista de las células de levadura se adhirió a una red de muestreo. B) La misma imagen en (a) cubierta con una imagen de gran aumento de fluorescencia de un área de interés y con un polígono relleno de color naranja que marca el centro de la rejilla de la muestra. El centro consiste de un grupo de cuatro plazas, tres tienen una lengüeta metálica adicional y al aire libre etc. Para las tres plazas con una lengüeta de metal extra, dos pares de compartir la ficha de alrededor de los ejes largo y corto formando un centro asimétrico. Este centro asimétrico se puede ver en la esquina superior izquierda y se utiliza para indicar el ángulo de rotación y la imparcialidad de la red entre la crio-LM y la crio-EM. Desde una de las áreas de baja magnificación de la imagen de interés turístico se pueden marcar y se utiliza como un mapa de referencia para localizar áreas idénticas en la crio-ME. C) Una magnifica fluorescencia crio-LM imagen de la zona de interés en (b). HTA1-PPC, un marcador de c-terminal de la histona PPC, puede ser visto como una estructura verde punteada de etiquetado de la ubicación del núcleo. D) Una imagen de la crio-ME de la zona correspondiente (c). Las barras de escala representan el 50 micrones. <img src="/files/ftp_upload/2909/2909fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Correlación de la crio-LM y la crio-EM. Dos campos de visión que representan las células de levadura idéntica correlación con la crio-campo claro (a, d), la crio-fluorescencia (b, e), y la crio-EM (c, f ). Las barras de escala representan el 5 micrones.

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	<li>Dubochet, J., Adrian, M., Lepault, J., McDowall, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-electron+microscopy+of+vitrified+biological+speciments.">Cryo-electron microscopy of vitrified biological speciments.</a> Trends Biochem. Sci. 10, 143-146 (1985).</li><li>Plitzko, J. M., Rigort, A., Leis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+cryo-light+microscopy+and+cryo-electron+tomography:+from+cellular+territories+to+molecular+landscapes.">Correlative cryo-light microscopy and cryo-electron tomography: from cellular territories to molecular landscapes.</a> Curr Opin Biotechnol. 20, 83-89 (2009).</li><li>Schwartz, C. L., Sarbash, V. I., Ataullakhanov, F. I., McIntosh, J. R., Nicastro, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-fluorescence+microscopy+facilitates+correlations+between+light+and+cryo-electron+microscopy+and+reduces+the+rate+of+photobleaching.">Cryo-fluorescence microscopy facilitates correlations between light and cryo-electron microscopy and reduces the rate of photobleaching.</a> J Microsc. 227, 98-109 (2007).</li><li>Lepper, S., Merkel, M., Sartori, A., Cyrklaff, M., Frischknecht, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+quantification+of+the+effects+of+blotting+for+correlation+of+light+and+cryo-light+microscopy+images.">Rapid quantification of the effects of blotting for correlation of light and cryo-light microscopy images.</a> J Microsc. 238, 21-26 (2010).</li><li>Sartori, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+microscopy:+bridging+the+gap+between+fluorescence+light+microscopy+and+cryo-electron+tomography.">Correlative microscopy: bridging the gap between fluorescence light microscopy and cryo-electron tomography.</a> J Struct Biol. 160, 135-145 (2007).</li><li>McDonald, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+high-pressure+freezing+preparation+techniques+for+correlative+light+and+electron+microscopy+of+the+same+cells+and+tissues.">A review of high-pressure freezing preparation techniques for correlative light and electron microscopy of the same cells and tissues.</a> J Microsc. 235, 273-281 (2009).</li><li>van Driel, L. F., Valentijn, J. A., Valentijn, K. M., Koning, R. I., Koster, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+for+correlative+cryo-fluorescence+microscopy+and+cryo-electron+tomography+applied+to+whole+mitochondria+in+human+endothelial+cells.">Tools for correlative cryo-fluorescence microscopy and cryo-electron tomography applied to whole mitochondria in human endothelial cells.</a> Eur J Cell Biol. 88, 669-684 (2009).</li><li>Gaietta, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolor+and+electron+microscopic+imaging+of+connexin+trafficking.">Multicolor and electron microscopic imaging of connexin trafficking.</a> Science. 296, 503-507 (2002).</li><li>Sosinsky, G. E., Giepmans, B. N., Deerinck, T. J., Gaietta, G. M., Ellisman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Markers+for+correlated+light+and+electron+microscopy.">Markers for correlated light and electron microscopy.</a> Methods Cell Biol. 79, 575-591 (2007).</li></ol>

Los autores declaran no tener intereses financieros.

<p class="jove_content"&gt; Uso de nuestra etapa criogénica y técnicas de preparación de muestras, estudios que los relacionan entre crio-LM y la crio-EM presentan varias ventajas sobre los enfoques tradicionales de la temperatura ambiente, incluyendo pero no limitado a: fijación rápida<sup&gt; 1,2</sup&gt;, La reducción de photobleaching<sup&gt; 3</sup&gt;, Y el escaneo de la integridad de la muestra antes de la crio-ME<sup&gt; 4,5</sup&gt; O químicos fijación / incorporación de<sup&gt; 6</sup&gt;. Uno de los cuellos de botella para la crio-ME de recopilación de datos es el tiempo necesario para que tanto la transferencia de la muestra en un TEM y el escaneo de la red para encontrar las regiones aptas para la imagen. Con la rápida adquisición de la crio-LM de datos<sup&gt; 5</sup&gt;, El tiempo para encontrar las células buenas se pueden reducir considerablemente. Por lo tanto, se puede ahorrar tiempo y dinero y reducir este cuello de botella por el pre-escaneo y cartografía de zonas de interés en la crio-LM.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Criogénico Las etapas más costosas o complejas pueden permitir una mayor resolución de imagen crio-LM. Sin embargo, el escenario fabricado aquí es más que suficiente para muchas aplicaciones. Si la crio-LM muestra de imágenes y transferencia de la red se realizan con cautela como se describe en el texto y video, imagen totalmente libre de contaminación se puede lograr. Este método permite la relación directa de los datos de microscopía de fluorescencia y electrónica de la misma célula, orgánulo o complejo macromolecular dispersos en el soporte de carbono o contenidos dentro de una sección de tejido fino<sup&gt; 7</sup&gt;. Cabe señalar que el valor de esta etapa criogénica se extiende más allá cryo-LM/cryo-EM estudios que los relacionan con el campo de la microscopía de luz en su conjunto. Esta etapa criogénica es muy adecuado tanto para muestras delicadas y tintes fluoróforo / manchas<sup&gt; 8</sup&gt; Puntos Cuánticos, o proteínas marcado con fluorescencia<sup&gt; 9</sup&gt; Que puede ser inestable durante la fijación química a temperatura ambiente y la inclusión con glutaraldehído y paraformaldehído. Como resultado, esperamos que esta etapa criogénica ofrecerá mayor acceso a los interesados ​​en la crio-LM, que previamente han sido disuadidos por los costos de acceso e insuficiente.</p&gt;<p class="jove_content"<em&gt; Solución de problemas Cryo-microscopio de luz</em</p&gt;<p class="jove_content"<em&gt; 1. Muestra de adsorción:</em&gt; Las diferentes muestras pueden presentar variables características de adsorción para el apoyo de carbono. Puede que le resulte necesario utilizar otros tipos de redes de apoyo, tales como carbono continua, llena de agujeros de carbono, o formvar rejillas recubiertas de apoyo de la muestra. Además, si la muestra es vinculante para las barras de cobre de la red y no la superficie del carbón, puede ser necesario ajustar la química de la superficie de carbono mediante la incubación de la red con un agente humectante o por el desempeño de brillo antes de la adición de la muestra.</p&gt;<p class="jove_content"<em&gt; 2. Etapa de estabilidad:</em&gt; Si usted nota la vibración, es muy probable debido a la etapa de la muestra está sobrecargado de peso en lugar de las burbujas de LN2. El peso añadido de la etapa criogénica, a veces puede causar vibraciones de baja frecuencia para transmitir a lo largo de la norma de 3 ejes platina del microscopio de viaje, y afectar negativamente la imagen a través de imágenes borrosas. Esto puede ser fácilmente corregido mediante el apoyo a la etapa del microscopio de viaje desde la parte inferior, ya sea con un mini-ajustable de elevación o de un adaptador ajustable con doble tornillo de armas, como se muestra en el video. Estos dos mecanismos de soporte ajustable interactuar con una parte no móvil de la etapa de los viajes y por lo tanto, sigue permitiendo X y la traducción del eje Y como se requiere para obtener imágenes.</p

Tabla de reactivos y equipos específicos: <table border="1"><tbody><tr><th> Nombre </th><th> Empresa </th><th> Catálogo # </th><th> Comentarios </th><th> Costo </th></tr><tr><td> 1 a 22,86 cm (9 &quot;) molde con el borde de una pendiente </td><td> Buen cocinero </td><td></td><td> Tienda de comestibles </td><td> $ 4.39 </td></tr><tr><td> 1 a 22,86 cm (9 &quot;) torta de pan </td><td> Buen cocinero </td><td></td><td> Tienda de comestibles </td><td> $ 4.93 </td></tr><tr><td> 4 pares de palillos </td><td></td><td></td><td> Tienda de comestibles </td><td> $ 0.50 </td></tr><tr><td> 1 - Gran spray de espuma cosas </td><td> Great Stuff </td><td></td><td> Ferretería local </td><td> $ 5.98 </td></tr><tr><td> 1 - 4 cm x8cm x1cm bloque de aluminio </td><td></td><td></td><td> Ferretería local o en el patio de chatarra </td><td> $ 10.00 </td></tr><tr><td> 5 - # 10 1,91 cm (3 / 4 &quot;) de cabeza plana con ranura tornillos w / tuercas </td><td></td><td></td><td> Ferretería local </td><td> $ 0,98 </td></tr><tr><td> 3 - # 4 0,95 cm (3 / 8 &quot;) alrededor de los tornillos ranurados w / tuercas </td><td></td><td></td><td> Ferretería local </td><td> $ 0,98 </td></tr><tr><td> 15 - # 10 arandelas </td><td></td><td></td><td> Ferretería local </td><td> $ 0,98 </td></tr><tr><td> 2 - tablillas de plástico transparente </td><td></td><td></td><td> Tienda de la oficina local </td><td> $ 6.84 </td></tr><tr><td> 1 - Cryo-EM red cuadro titular </td><td> Ted Pella </td><td> 160-41 </td><td></td><td> N / A </td></tr><tr><td> 1 - Cryo-EM celda de la malla barra de manejo </td><td> Ted Pella </td><td> 160-46 </td><td></td><td> N / A </td></tr><tr><td> 1 - R2 / 1 película de carbón perforado, de 400 mallas de cobre crio-ME red de apoyo </td><td> SPI Supplies </td><td> 4340C-XA </td><td></td><td> N / A </td></tr></tbody></table> Materiales experimentales <ol><li> Cepa de levadura: Hta1-PPC:: Kan (KSC-3382: Mata, ura3-52, LYS2-801, ade2-101, trp1-Δ63, his3-Δ200, leu2-Δ1, Hta1-PPC:: KanMX6 del laboratorio de Kaplan Universidad de California en Davis). </li><li> Cryo-microscopio de luz: Cryo-imágenes de microscopía de luz fueron tomadas con un microscopio Leica DM4000M que refleja con una Leica DFC310 FX CCD de la cámara. Campo claro, campo oscuro y las imágenes de fluorescencia fueron adquiridos utilizando un HCX PL Fluotar 5x 0.15 NA objetivo de aire, un HCX PL Fluotar 10x 0.30 NA objetivo de aire, un PL Fluotar 50x 0.55 NA objetivo de aire o un 0,75 NPLAN 100x objetivo NA aire. Campo brillantes e imágenes de campo oscuro utiliza una lámpara de tungsteno de 100W 12V como fuente de luz. De fluorescencia, una fuente de UV EL6000 lámpara se utiliza en conjunción con una Leica JC1 (Ex.F.: BP 480/30, DM: LP 505, SF BP 535/40 y LP 580) Cubo de filtro. </li><li> Cryo-Microscopía Electrónica de Transmisión: Cryo-EM imágenes fueron adquiridas en un microscopio de transmisión JEM-2100-FEG electrónica (JEOL, Japón) que opera a 200 keV utilizando un Gatan 626 crio-la transferencia de titular (Gatan, EE.UU.). Micrografías se registraron aumentos en el nominal de los X 50, 200, 1.200 y 4.000 en 4096 x 4096 píxeles Tietz cámara CCD (TVIPS, Gauting, Alemania). </li></ol>

low-cost cryo-light microscopy stage fabrication for correlated light/electron microscopy

El acoplamiento de la crio-microscopía de luz (crio-LM) y la crio-microscopía electrónica (crio-ME) plantea una serie de ventajas para la comprensión de la dinámica celular y ultraestructura. En primer lugar, las células se pueden leer en un ambiente casi nativo para ambas técnicas. En segundo lugar, debido al proceso de vitrificación, las muestras se conservan por la inmovilización rápida física en lugar de fijación química lenta. En tercer lugar, la imagen de la misma muestra con tanto crio-LM y la crio-ME ofrece la correlación de los datos de una sola célula, en vez de una comparación de &quot;muestras representativas&quot;. Aunque estos beneficios son bien conocidos a partir de estudios previos, el uso generalizado de la correlativa crio-LM y la crio-EM sigue siendo limitada debido al costo y la complejidad de la compra o la construcción de una adecuada etapa criogénica microscopía de luz. Aquí se demuestra la asamblea, y el uso de una etapa criogénica barato que se puede fabricar en cualquier laboratorio de menos de $ 40 con piezas encontradas en las ferreterías y tiendas de comestibles. Esta etapa de la crio-LM está diseñado para su uso con microscopios de luz reflejada que están equipados con mucho trabajo los objetivos de distancia aérea. Por correlativas crio-LM y los estudios de la crio-ME, que adaptar el uso de carbono con recubrimiento estándar de 3 mm de la crio-ME redes como soporte de la muestra. Después de adsorción de la muestra a la red, los protocolos previamente establecidos para vitrificar la muestra y transferir / manejo de la red se siguen para permitir múltiples técnicas de imagen. Como resultado, esta configuración permite que cualquier laboratorio con un microscopio de luz reflejada para tener acceso a imágenes directas correlativo de muestras congeladas de hidratación.

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Low-Cost Cryo-Light Microscopy Stage Fabrication for Correlated Light/Electron Microscopy

Se demuestra la fabricación de una etapa criogénica de bajo costo diseñado para adaptarse a la mayoría de los microscopios de luz reflejada. Esta etapa criogénica de laboratorio permite construir imágenes correlativas eficiente y confiable entre la luz y la crio-crio-microscopía electrónica.

Bajo Costo Cryo-microscopio de luz para la luz de la etapa de fabricación correlacionadas / Microscopía Electrónica

The coupling of cryo-light microscopy (cryo-LM) and cryo-electron microscopy (cryo-EM) poses a number of advantages for understanding cellular 
dynamics ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

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Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As the mainstays of in vivo three-dimensional (3-D) optical microscopy, single-/multi-photon fluorescence microscopy and optical coherence tomography (OCT) have demonstrated their extraordinary sensitivities to fluorescence and optical scattering contrasts, respectively. However, the optical absorption contrast of biological tissues, which encodes essential physiological/pathological information, has not yet been assessable. 
The emergence of biomedical photoacoustics has led to a new branch of optical microscopy optical-resolution photoacoustic microscopy (OR-PAM)1, where the optical irradiation is focused to the diffraction limit to achieve cellular1 or even subcellular2 level lateral resolution. As a valuable complement to existing optical microscopy technologies, OR-PAM brings in at least two novelties. First and most importantly, OR-PAM detects optical absorption contrasts with extraordinary sensitivity (i.e., 100%). Combining OR-PAM with fluorescence microscopy3 or with optical-scattering-based OCT4 (or with both) provides comprehensive optical properties of biological tissues. Second, OR-PAM encodes optical absorption into acoustic waves, in contrast to the pure optical processes in fluorescence microscopy and OCT, and provides background-free detection. The acoustic detection in OR-PAM mitigates the impacts of optical scattering on signal degradation and naturally eliminates possible interferences (i.e., crosstalks) between excitation and detection, which is a common problem in fluorescence microscopy due to the overlap between the excitation and fluorescence spectra. 
Unique for optical absorption imaging, OR-PAM has demonstrated broad biomedical applications since its invention, including, but not limited to, neurology5, 6, ophthalmology7, 8, vascular biology9, and dermatology10. In this video, we teach the system configuration and alignment of OR-PAM as well as the experimental procedures for in vivo functional microvascular imaging.

Optical-resolution photoacoustic microscopy (OR-PAM) is an emerging technology capable of imaging optical absorption contrasts in vivo with cellular resolution and sensitivity. Here, we provide a visualized instruction on the experimental protocols of OR-PAM, including system configuration, system alignment, typical in vivo experimental procedures, and functional imaging schemes.

Tridimensional óptico resolución microscopía fotoacústica

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

Investigación

Bioingeniería

Bacterial Immobilization for Imaging by Atomic Force Microscopy

AFM is a high-resolution (nm scale) imaging tool that mechanically probes a surface. It has the ability to image cells and biomolecules, in a liquid environment, without the need to chemically treat the sample. In order to accomplish this goal, the sample must sufficiently adhere to the mounting surface to prevent removal by forces exerted by the scanning AFM cantilever tip. In many instances, successful imaging depends on immobilization of the sample to the mounting surface. Optimally, immobilization should be minimally invasive to the sample such that metabolic processes and functional attributes are not compromised. By coating freshly cleaved mica surfaces with porcine (pig) gelatin, negatively charged bacteria can be immobilized on the surface and imaged in liquid by AFM. Immobilization of bacterial cells on gelatin-coated mica is most likely due to electrostatic interaction between the negatively charged bacteria and the positively charged gelatin. Several factors can interfere with bacterial immobilization, including chemical constituents of the liquid in which the bacteria are suspended, the incubation time of the bacteria on the gelatin coated mica, surface characteristics of the bacterial strain and the medium in which the bacteria are imaged. Overall, the use of gelatin-coated mica is found to be generally applicable for imaging microbial cells.

Live Gram-negative and Gram-positive bacteria can be immobilized on gelatin-coated mica and imaged in liquid using Atomic Force Microscopy (AFM).

Inmovilización de bacterias para tratamiento de imágenes de microscopía de fuerza atómica

AFM is a high-resolution (nm scale) imaging tool that mechanically probes a surface.  It has the ability to image cells and biomolecules, in a liquid ...

Video-rate Scanning Confocal Microscopy and Microendoscopy

Confocal microscopy has become an invaluable tool in biology and the biomedical sciences, enabling rapid, high-sensitivity, and high-resolution optical sectioning of complex systems. Confocal microscopy is routinely used, for example, to study specific cellular targets1, monitor dynamics in living cells2-4, and visualize the three dimensional evolution of entire organisms5,6. Extensions of confocal imaging systems, such as confocal microendoscopes, allow for high-resolution imaging in vivo7 and are currently being applied to disease imaging and diagnosis in clinical settings8,9.
Confocal microscopy provides three-dimensional resolution by creating so-called "optical sections" using straightforward geometrical optics. In a standard wide-field microscope, fluorescence generated from a sample is collected by an objective lens and relayed directly to a detector. While acceptable for imaging thin samples, thick samples become blurred by fluorescence generated above and below the objective focal plane. In contrast, confocal microscopy enables virtual, optical sectioning of samples, rejecting out-of-focus light to build high resolution three-dimensional representations of samples.
Confocal microscopes achieve this feat by using a confocal aperture in the detection beam path. The fluorescence collected from a sample by the objective is relayed back through the scanning mirrors and through the primary dichroic mirror, a mirror carefully selected to reflect shorter wavelengths such as the laser excitation beam while passing the longer, Stokes-shifted fluorescence emission. This long-wavelength fluorescence signal is then passed to a pair of lenses on either side of a pinhole that is positioned at a plane exactly conjugate with the focal plane of the objective lens. Photons collected from the focal volume of the object are collimated by the objective lens and are focused by the confocal lenses through the pinhole. Fluorescence generated above or below the focal plane will therefore not be collimated properly, and will not pass through the confocal pinhole1, creating an optical section in which only light from the microscope focus is visible. (Fig 1). Thus the pinhole effectively acts as a virtual aperture in the focal plane, confining the detected emission to only one limited spatial location.
Modern commercial confocal microscopes offer users fully automated operation, making formerly complex imaging procedures relatively straightforward and accessible. Despite the flexibility and power of these systems, commercial confocal microscopes are not well suited for all confocal imaging tasks, such as many in vivo imaging applications. Without the ability to create customized imaging systems to meet their needs, important experiments can remain out of reach to many scientists.
In this article, we provide a step-by-step method for the complete construction of a custom, video-rate confocal imaging system from basic components. The upright microscope will be constructed using a resonant galvanometric mirror to provide the fast scanning axis, while a standard speed resonant galvanometric mirror will scan the slow axis. To create a precise scanned beam in the objective lens focus, these mirrors will be positioned at the so-called telecentric planes using four relay lenses. Confocal detection will be accomplished using a standard, off-the-shelf photomultiplier tube (PMT), and the images will be captured and displayed using a Matrox framegrabber card and the included software.

The complete construction of a custom, real-time confocal scanning imaging system is described. This system, which can be readily used for video-rate microscopy and microendoscopy, allows for an array of imaging geometries and applications not accessible using standard commercial confocal systems, at a fraction of the cost.

Video-velocidad de barrido y microscopía confocal Microendoscopy

Confocal microscopy has become an invaluable tool in biology and the biomedical sciences, enabling rapid, high-sensitivity, and high-resolution optical ...

High Throughput Microfluidic Rapid and Low Cost Prototyping Packaging Methods

In this work, 3 different packaging and assembly techniques are presented. They can be classified into two categories: one-time use and reusable packaging techniques.
The one-time use packaging technique employs UV-based and temperature curing epoxies to connect microtubes to access holes, wire-bonding for integrated circuit connections, and silver epoxy for electrical connections. This method is based on a robust assembly technique that can support relatively high pressure close to 1 psi and does not need any support to strengthen the microfluidic architecture.
Reusable packaging techniques consist of PDMS-based microtube interconnectors and anisotropic adhesive films for electrical connections. These devices are more sensitive and fragile. Consequently, Plexiglas support is added to the microfluidic structure to improve the electrical contact when anisotropic adhesive films are used, and also to strengthen the microfluidic architecture. In addition, a micromanipulator is needed to maintain tubes while using a thin PDMS layer to connect them to the access holes. Different PDMS layer thicknesses, ranging from 0.45-3 mm, are tested to compare the best adherence versus injection rates. Applied injection rates are varied from 50-300 &#956;l/hr for 0.45-3 mm PDMS layers, respectively. These techniques are mainly applicable for low-pressure applications. However, they can be extended for high-pressure ones through plasma-oxygen process to permanently seal the PDMS to glass substrates. The main advantage of this technique, besides the fact that it is reusable, consists of keeping the device observable when the microchannel length is very short (in the range of 3 mm or lower).

In this article we describe different techniques for microfluidic rapid prototyping platforms. The proposed techniques are based on ultraviolet (UV) sensitive and temperature curing epoxies, polydimethylsiloxane (PDMS) based tubing, wire-bonding, and anisotropic adhesive films. The assembling procedures presented are developed for both one-time use devices as well as reusable microfluidic systems.

In this work, 3 different packaging and assembly techniques are presented. They can be classified into two categories: one-time use and reusable packaging ...

Rapid and Low-cost Prototyping of Medical Devices Using 3D Printed Molds for Liquid Injection Molding

Biologically inert elastomers such as silicone are favorable materials for medical device fabrication, but forming and curing these elastomers using traditional liquid injection molding processes can be an expensive process due to tooling and equipment costs. As a result, it has traditionally been impractical to use liquid injection molding for low-cost, rapid prototyping applications. We have devised a method for rapid and low-cost production of liquid elastomer injection molded devices that utilizes fused deposition modeling 3D printers for mold design and a modified desiccator as an injection system. Low costs and rapid turnaround time in this technique lower the barrier to iteratively designing and prototyping complex elastomer devices. Furthermore, CAD models developed in this process can be later adapted for metal mold tooling design, enabling an easy transition to a traditional injection molding process. We have used this technique to manufacture intravaginal probes involving complex geometries, as well as overmolding over metal parts, using tools commonly available within an academic research laboratory. However, this technique can be easily adapted to create liquid injection molded devices for many other applications.

We have devised a method for low-cost and rapid prototyping of liquid elastomer rubber injection molded devices by using fused deposition modeling 3D printers for mold design and a modified desiccator as a liquid injection system.

Prototipado rápido y de bajo costo de los dispositivos médicos Utilizando 3D Impreso Moldes para moldeo por inyección de líquido

Biologically inert elastomers such as silicone are favorable materials for medical device fabrication, but forming and curing these elastomers using ...

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous number of imaging techniques currently available and the progress in instrumentation, there is still a need for highly sensitive probes that are suitable for in vivo imaging. One typical problem of available preclinical fluorescent probes is their rapid clearance in vivo, which reduces their imaging sensitivity. To circumvent rapid clearance, increase number of dye molecules at the target site, and thereby reduce background autofluorescence, encapsulation of the near-infrared fluorescent dye, DY-676-COOH in liposomes and verification of its potential for in vivo imaging of inflammation was done. DY-676 is known for its ability to self-quench at high concentrations. We first determined the concentration suitable for self-quenching, and then encapsulated this quenching concentration into the aqueous interior of PEGylated liposomes. To substantiate the quenching and activation potential of the liposomes we use a harsh freezing method which leads to damage of liposomal membranes without affecting the encapsulated dye. The liposomes characterized by a high level of fluorescence quenching were termed Lip-Q. We show by experiments with different cell lines that uptake of Lip-Q is predominantly by phagocytosis which in turn enabled the characterization of its potential as a tool for in vivo imaging of inflammation in mice models. Furthermore, we use a zymosan-induced edema model in mice to substantiate the potential of Lip-Q in optical imaging of inflammation in vivo. Considering possible uptake due to inflammation-induced enhanced permeability and retention (EPR) effect, an always-on liposome formulation with low, non-quenched concentration of DY-676-COOH (termed Lip-dQ) and the free DY-676-COOH were compared with Lip-Q in animal trials.

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

The use of fluorophores for in vivo imaging can be greatly limited by opsonization, rapid clearance, low detection sensitivity and cytotoxic effects on the host. Encapsulation of fluorophores in liposomes by film hydration and extrusion leads to fluorescence quenching and protection which enables in vivo imaging with high detection sensitivity.

Fluorescencia de extinción de un fluoróforo encapsulada en liposomas en infrarrojo cercano como herramienta para<em&gt; En Vivo</em&gt; Imagen Óptico

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous ...

Single Molecule Fluorescence Microscopy on Planar Supported Bilayers

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background in optics and laser physics to a discipline that is now enjoying vivid attention by life-scientists of all venues 1. This is because single molecule imaging has the unique potential to reveal protein behavior in situ in living cells and uncover cellular organization with unprecedented resolution below the diffraction limit of visible light 2. Glass-supported planar lipid bilayers (SLBs) are a powerful tool to bring cells otherwise growing in suspension in close enough proximity to the glass slide so that they can be readily imaged in noise-reduced Total Internal Reflection illumination mode 3,4. They are very useful to study the protein dynamics in plasma membrane-associated events as diverse as cell-cell contact formation, endocytosis, exocytosis and immune recognition. Simple procedures are presented how to generate highly mobile protein-functionalized SLBs in a reproducible manner, how to determine protein mobility within and how to measure protein densities with the use of single molecule detection. It is shown how to construct a cost-efficient single molecule microscopy system with TIRF illumination capabilities and how to operate it in the experiment.

Preparation of protein-functionalized planar glass-supported lipid bilayers, determination of protein mobility within and measurement of protein densities is shown here. A roadmap to building a noise-reduced Total Internal Reflection microscope is outlined, which allows visualizing single bilayer-resident fluorochromes with high spatiotemporal resolution.

Bilayers Individual Molécula microscopía de fluorescencia en planar compatibles

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background ...

Correlative Light- and Electron Microscopy Using Quantum Dot Nanoparticles

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of human pathology tissue using widefield fluorescence light microscopy and transmission electron microscopy (TEM). To demonstrate the protocol we have immunolabeled ultrathin epoxy sections of human somatostatinoma tumor using a primary antibody to somatostatin, followed by a biotinylated secondary antibody and visualization with streptavidin conjugated 585 nm cadmium-selenium (CdSe) quantum dots (QDs). The sections are mounted on a TEM specimen grid then placed on a glass slide for observation by widefield fluorescence light microscopy. Light microscopy reveals 585 nm QD labeling as bright orange fluorescence forming a granular pattern within the tumor cell cytoplasm. At low to mid-range magnification by light microscopy the labeling pattern can be easily recognized and the level of non-specific or background labeling assessed. This is a critical step for subsequent interpretation of the immunolabeling pattern by TEM and evaluation of the morphological context. The same section is then blotted dry and viewed by TEM. QD probes are seen to be attached to amorphous material contained in individual secretory granules. Images are acquired from the same region of interest (ROI) seen by light microscopy for correlative analysis. Corresponding images from each modality may then be blended to overlay fluorescence data on TEM ultrastructure of the corresponding region.

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of epoxy embedded human pathology tissue. We employ commercial antibody fragment conjugated QDs that are visualized by widefield fluorescence light microscopy and transmission electron microscopy.

Correlativa a la luz y microscopía electrónica de Uso de Quantum Dot nanopartículas

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of human pathology tissue using ...

Correlative Light Electron Microscopy (CLEM) for Tracking and Imaging Viral Protein Associated Structures in Cryo-immobilized Cells

Due to its high resolution, electron microscopy (EM) is an indispensable tool for virologists. However, one of the main difficulties when analyzing virus-infected or transfected cells via EM are the low efficiencies of infection or transfection, hindering the examination of these cells. In order to overcome this difficulty, light microscopy (LM) can be performed first to allocate the subpopulation of infected or transfected cells. Thus, taking advantage of the use of fluorescent proteins (FPs) fused to viral proteins, LM is used here to record the positions of the "positive-transfected" cells, expressing a FP and growing on a support with an alphanumeric pattern. Subsequently, cells are further processed for EM via high pressure freezing (HPF), freeze substitution (FS) and resin embedding. The ultra-rapid freezing step ensures excellent membrane preservation of the selected cells that can then be analyzed at the ultrastructural level by transmission electron microscopy (TEM). Here, a step-by-step correlative light electron microscopy (CLEM) workflow is provided, describing sample preparation, imaging and correlation in detail. The experimental design can be also applied to address many cell biology questions.

Correlative Light Electron Microscopy CLEM for Tracking and Imaging Viral Protein Associated Structures in Cryo-immobilized Cells

A correlative light electron microscopy (CLEM) method is applied to image virus-induced intracellular structures via electron microscopy (EM) in cells that are previously selected by light microscopy (LM). LM and EM are combined as a hybrid imaging approach to achieve an integrated view of virus-host interactions.

Correlativos luz microscopia electrónica (CLEM) para el seguimiento y proyección de imagen proteína Viral asociada a estructuras en las células inmovilizadas de Cryo

Due to its high resolution, electron microscopy (EM) is an indispensable tool for virologists. However, one of the main difficulties when analyzing ...

Visualizing Adhesion Formation in Cells by Means of Advanced Spinning Disk-Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to visualize these highly dynamic events, two complementary light microscopy techniques that allow fast imaging of live samples were combined: spinning disk microscopy (SD) for fast and high-resolution volume recording and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy for precise localization and visualization of the plasma membrane. A comprehensive and complete imaging protocol will be shown for guiding through sample preparation, microscope calibration, image formation and acquisition, resulting in multi-color SD-TIRF live imaging series with high spatio-temporal resolution. All necessary image post-processing steps to generate multi-dimensional live imaging datasets, i.e. registration and combination of the individual channels, are provided in a self-written macro for the open source software ImageJ. The imaging of fluorescent proteins during initiation and maturation of adhesion complexes, as well as the formation of the actin cytoskeletal network, was used as a proof of principle for this novel approach. The combination of high resolution 3D microscopy and TIRF provided a detailed description of these complex processes within the cellular environment and, at the same time, precise localization of the membrane-associated molecules detected with a high signal-to-background ratio.

An advanced microscope that permit fast and high-resolution imaging of both, the isolated plasma membrane and the surrounding intracellular volume, will be presented. The integration of spinning disk and total internal reflection fluorescence microscopy in one setup allows live imaging experiments at high acquisition rates up to 3.5 s per image stack.

Visualizar la formación de adherencias en las células por medio de avanzados Spinning microscopía de fluorescencia de reflexión interna Total de disco

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to ...