Los autores desean agradecer al Dr. Steve Withers y Chen Hong-Ming para proporcionar DNP-Cellobioside sustrato.

Antes de iniciar este protocolo, tendrá que tener su biblioteca metagenómica almacenados en un formato de placa de 384 pocillos. En nuestro estudio, hemos utilizado el vector de control de copia PCC1 fosmid en combinación con el fago T1-resistentes TransforMax EPI300-T1 R E. células de E. coli como el anfitrión de la biblioteca y se almacenan nuestros platos a -80 ° C 11. 1. La replicación de las placas biblioteca metagenómica <ol><li> Descongelar las placas que contienen la biblioteca a 37 ° C durante aproximadamente 20 minutos, o hasta que todos los pozos se descongelan. </li><li> Utilice la función de la luz ultravioleta en la esterilización de qPix2 para esterilizar el robot durante 15 minutos. </li><li> Preparar el caldo LB con cloranfenicol a una concentración final de 12.5ug/mL y arabinosa en 100ug/mL en una botella de 500 ml de reactivo. Cada placa se utilizan aproximadamente 20 ml, además de hacer un adicional de 50 ml para permitir el volumen muerto. </li><li> Configurar el qFill3 como las instrucciones del fabricante con la botella de los medios de comunicación conectado al colector a través de la tubería estéril. Programa que por la cantidad apropiada de los medios de comunicación, y la puso para llenar un volumen 45uL en cada pozo. </li><li> Purgar el aire de la tubería y el colector con la característica de purga del robot hasta que los medios de comunicación se ve que proviene de cada pin del colector. </li><li> Rellene el número deseado de placas con medio LB con el qFill3. Cada placa tiene unos 20 segundos para completar. </li><li> La carga de las placas de la biblioteca y las placas nuevas en las áreas apropiadas del robot qPix2. Rellene los baños de limpieza con los reactivos adecuados, el 2% Micro90 en el baño trasero, autoclave agua destilada en el baño de media, el 80% de etanol en el baño principal. </li><li> Utilice la opción &quot;replicar&quot; el programa de la qPix2. En el software, seleccionar el número apropiado cabeza, y los tipos de platos de origen y destino de las placas. También estableció la cabeza para limpiar entre repeticiones, generalmente 6 ciclos en cada baño es suficiente. Capacidad de la máquina es de 10 platos a la vez, y se tarda aproximadamente 15 minutos para replicar a todos con una cabeza de alfiler 384 (o aproximadamente 50 minutos con una cabeza de alfiler 96). Nota: Hay una opción de &quot;Stir Fuente&quot; o &quot;Stir destino&quot;. Se recomienda no utilizar estas opciones como los problemas han ocurrido previamente con nuestro robot utilizando. </li><li> Una vez que las placas se replican, crecen las placas a 37 ° C durante 24 horas en una caja de humedad. Debido a que estamos induciendo un alto número de copias de fosmid con la adición de arabinosa, los clones tienden a crecer más lentamente que no inducida clones. Retorno de las placas de la biblioteca a -80 ° C. Nota: La incubación de un cuadro de la humedad garantiza la evaporación de los medios de comunicación no se produce en los pozos en el borde de las placas, manteniendo un entorno uniforme para todos los pozos. </li><li> Limpie el robot qFill3 por primera purga de agua (~ 50 ml) y 80% de etanol (~ 50 ml). Desmontar los componentes, y limpiar y esterilizar en autoclave de la botella, la tapa y el tubo envuelto en papel de aluminio. </li></ol> 2. La medición del crecimiento de E. Clones coli <ol><li> Quitar las placas de 37 ° C incubadora. Retirar y reservar las tapas, placas y colocarla sobre la plataforma de carga siempre con la revista RapidStak, hasta un máximo de 25 placas. Nota: La placa en la parte inferior de la pila será el primero en ser leído. Asegúrese de no perder de vista el orden de los platos, ya que el software no registra esto. </li><li> Quitar una revista de la Stak rápida, asegúrese de que está vacía, y pulsar en la pila de platos para ser leído. Datos por el mango, y las placas de todos debe ser cargado en la revista. Cargar el cargador en el RapidStak. Nota: La revista tiene un pequeño tornillo en la esquina que indica que los pozos A1 esquina de las placas debe ir. La revista sólo se montará en el RapidStak en una orientación. </li><li> Abra el programa RE SkanIt en el ordenador conectado a las máquinas. Seleccione &quot;Nueva sesión&quot; con un nombre adecuado. Seleccione la opción &quot;Corning fondo plano de 384 y placa&quot; como el tipo de plato. </li><li> En el &quot;Diseño de placa&quot;, seleccione el &quot;Mago&quot; botón, y quiero que añadir 384 incógnitas a su plato. </li><li> En el &quot;Protocolo&quot;, seleccione el &quot;Loop Bueno&quot; y, a entrar para 384 pozos. Un &quot;Loop Bueno&quot; aparece en el flujo de árbol en el lado izquierdo de la pantalla. Seleccione el icono y haga clic para añadir &quot;medición fotométrica&quot;. Lo puso a leer a 600 nm. </li><li> Guarde su protocolo con un nombre único, y cerrar el programa RE SkanIt. </li><li> En el equipo, abra el programa PolaraRS. </li><li> En la página principal habrá listado de los instrumentos conectados al dispositivo RapidStak. El VarioSkan debe estar en el lado izquierdo de la mesa. Bajo el título VarioSkan, habrá dos enlaces, &quot;RunSession&quot; y la &quot;incubación&quot;. Haga clic en el &quot;RunSession&quot; opción. </li><li> Aparecerá una nueva ventana, la ventana de análisis, aparecerá con un diagrama de flujo en el medio. Seleccione la opción &quot;RunSession&quot; tema (debe ser el presente artículo solamente). En la parte derecha de la pantalla un menú desplegableaparecerá. Busque el nombre de su RE SkanIt salvo correr en este menú. Nota: No parece haber ningún orden racional a este menú. No es por orden alfabético o por fecha de añadido, o en relación con que en la computadora el protocolo se guarda. Esto significa que debe mirar a través de todos los protocolos antes de encontrar su propio, que es un dolor. </li><li> Una vez que haya seleccionado el protocolo, en la esquina superior derecha, haga clic en &quot;Ejecutar este ensayo&quot;. </li><li> Una ventana pop-up, le pide que denotan que la revista va a utilizar como fuente, y que la revista está vacío. El cuadro inferior de la pantalla se corresponde con la revista delante. [Opcional: Se le pedirá que introduzca el número de placas de carga para determinar una estimación de la cantidad de tiempo que tomará. Esta estimación es normalmente muy lejos.] </li><li> Asegurar tanto la RapidStak VarioSkan y se encienden, y presiona &quot;Aceptar&quot;. </li><li> El RapidStak se cargará automáticamente en sus placas en el lector de placas, lo que permite realizar mediciones continuas de las placas. Para leer 25 placas de aproximadamente 50 minutos. Nota: Se recomienda observar la carga en la primera placa VarioSkan para asegurar una alineación correcta de las máquinas. Si el RapidStak no se carga correctamente el lector de placas, el uso de la &quot;pausa este ensayo&quot; en la esquina superior derecha de la ventana PolaraRS. </li><li> Una vez que el VarioSkan se hace la lectura de todos los platos, quitar el cargador lleno y lo coloca en la plataforma de carga revista. Levante el rectángulo exterior de la plataforma, y ​​la revista debe deslizarse, dejando las placas de pie en una pila en el centro. Vuelva a colocar las tapas de las placas adecuadas. </li></ol> 3. Además de la mezcla de ensayo a cada plato <ol><li> Prepare la mezcla de ensayo utilizando acciones premade 10x de la mezcla de lisis (10% Triton X-100, 100mm ris, 10 mM EDTA) en tampón 50 mM de acetato de potasio a pH 5,5. Prepare un inventario de hasta 75mg/mL DNP-cellobioside sustrato en DMSO, asegurándose de que el sustrato esté completamente disuelta. Añadir DNP-cellobioside solución de reserva de mezcla de ensayo a una concentración final de 0.1mg/mL. Cada placa se utilizan aproximadamente 20 ml de la solución, además de hacer un adicional de 50 ml para permitir el volumen muerto. Nota: DNP-Cellobioside no es fácilmente soluble en agua, por lo que se disuelve en DMSO aumenta la solubilidad. La presencia de DMSO en la solución final del ensayo no tiene efectos observables. </li><li> Configurar el qFill3 como las instrucciones del fabricante con la botella de los medios de comunicación conectado al colector a través de la tubería estéril. Programa que por la cantidad apropiada de los medios de comunicación, y la puso para llenar un volumen 45uL en cada pozo. </li><li> Purgar el aire de la tubería y el colector con la característica de purga del robot hasta que los medios de comunicación se ve que proviene de cada pin del colector. </li><li> Agregue la mezcla de ensayo para cada plato con el qFill3. Cada placa tiene unos 20 segundos para completar. </li><li> Una vez que la mezcla de ensayo, se añade, se incuban las placas a 37 ° C en una caja de humedad durante 12-16 horas. Nota: El exceso de incubación de las placas una vez que la mezcla de ensayo se añade hará que la evaporación en los pozos exterior de la placa, lo cual generará mayores lecturas de absorbancia a la observada para los pozos en el interior. Esto se puede compensar mediante la incubación de las placas en una cámara húmeda. </li></ol> 4. Absorción de la lectura de los clones ensayados <ol><li> Quitar las placas de 37 ° C incubadora. Retirar y reservar las tapas, placas y colocarla sobre la plataforma de carga siempre con la revista RapidStak, hasta un máximo de 25 placas. Nota: La placa en la parte inferior de la pila será el primero en ser leído. Asegúrese de no perder de vista el orden de los platos, ya que el software no registra esto. </li><li> Quitar una revista de la Stak rápida, asegúrese de que está vacía, y pulsar en la pila de platos para ser leído. Datos por el mango, y las placas de todos debe ser cargado en la revista. Cargar el cargador en el RapidStak. Nota: La revista tiene un pequeño tornillo en la esquina que indica que los pozos A1 esquina de las placas debe ir. La revista sólo se montará en el RapidStak en una orientación. </li><li> Abra el programa RE SkanIt en el ordenador conectado a las máquinas. Seleccione &quot;Nueva sesión&quot; con un nombre adecuado. Seleccione la opción &quot;Corning fondo plano de 384 y placa&quot; como el tipo de plato. </li><li> En el &quot;Diseño de placa&quot;, seleccione el &quot;Mago&quot; botón, y quiero que añadir 384 incógnitas a su plato. </li><li> En el &quot;Protocolo&quot;, seleccione el &quot;Loop Bueno&quot; y, a entrar para 384 pozos. Un &quot;Loop Bueno&quot; aparece en el flujo de árbol en el lado izquierdo de la pantalla. Seleccione el icono y haga clic para añadir &quot;medición fotométrica&quot;. Lo puso a leer a 400 nm. </li><li> Guarde su protocolo con un nombre único, y cerrar el programa RE SkanIt. </li><li> En el equipo, abra el programa PolaraRS. </li><li> En la página principal habrá listado de los instrumentos conectados al dispositivo RapidStak. El VarioSkan debe estar en el lado izquierdo de la mesa. Bajo el título VarioSkan, habrá dos enlaces, &quot;RunSession&quot; y Incubat &quot;e &quot;. Haga clic en el&quot; RunSession &quot;opción. </li><li> Aparecerá una nueva ventana, la ventana de análisis, aparecerá con un diagrama de flujo en el medio. Seleccione la opción &quot;RunSession&quot; tema (debe ser el presente artículo solamente). En la parte derecha de la pantalla un menú desplegable que aparece. Busque el nombre de su RE SkanIt salvo correr en este menú. </li><li> Una vez que haya seleccionado el protocolo, en la esquina superior derecha, haga clic en &quot;Ejecutar este ensayo&quot;. </li><li> Una ventana pop-up, le pide que denotan que la revista va a utilizar como fuente, y que la revista está vacío. El cuadro inferior de la pantalla se corresponde con la revista delante. [Opcional: Se le pedirá que introduzca el número de placas de carga para determinar una estimación de la cantidad de tiempo que tomará. Esta estimación es normalmente muy lejos.] </li><li> Asegurar tanto la RapidStak VarioSkan y se encienden, y presiona &quot;Aceptar&quot; </li><li> El RapidStak se cargará automáticamente en sus placas en el lector de placas, lo que permite realizar mediciones continuas de las placas. Nota: Se recomienda observar la carga en la primera placa VarioSkan para asegurar una alineación correcta de las máquinas. Si el RapidStak no se carga correctamente el lector de placas, el uso de la &quot;pausa este ensayo&quot; en la esquina superior derecha de la ventana PolaraRS. </li><li> Una vez que el VarioSkan se hace la lectura de todos los platos, quitar el cargador lleno y lo coloca en la plataforma de carga revista. Levante el rectángulo exterior de la plataforma, y ​​la revista debe deslizarse, dejando las placas de pie en una pila en el centro. Las placas pueden ser eliminados de acuerdo a sus procedimientos de laboratorio. </li><li> Para exportar las lecturas de absorbancia, software de código abierto RE SkanIt, y elegir la opción &quot;Abrir un archivo existente&quot;. </li><li> Seleccionar el directorio donde ha guardado la sesión, pulse el icono &quot;+&quot; para expandir la lista y bajo el título de la partida serán las opciones de la etiqueta &quot;Contenedor de 1&quot; a &quot;Container N&quot;, dependiendo del número de placas. Seleccione la primera placa para ser analizados. </li><li> En la barra de menú en la parte superior de la página, seleccione &quot;Procesamiento de Datos&gt; Informe / Exportar&quot; </li><li> Elija las opciones deseadas para la exportación. Nota: yo normalmente seleccione &quot;Diseño de placas&quot; y &quot;fotométrica&quot; ​​datos para la exportación. </li><li> Haga clic en &quot;Ver informe&quot; y luego &quot;Archivo&gt; Guardar&quot;. Seleccione el directorio deseado. El formato de salida es una hoja de cálculo Microsoft Excel </li></ol> 5. Resultados representante Un ejemplo de las lecturas de absorbancia a partir de una sola placa de 384 y que contiene un clon positivo se muestra en la Figura 2. Los clones positivos muestran un marcado aumento de la absorción por los que no expresan actividad de celulasa. Las diferencias en el tiempo del ensayo, la ubicación y en la placa, o la concentración de DNP (puede ser introducido mediante el filtrado sin disolver DNP) pueden afectar las lecturas absolutas de absorbancia. Lecturas de absorbancia relativa, como la diferencia de absorbancia por encima del promedio o media de la placa de columna, son un método más robusto de la identificación de clones positivos celulasa. Tras la identificación de clones positivos de las placas de la biblioteca, se recomienda para replicar todos los clones positivos en una nueva placa para la detección de secundaria. Esto elimina los efectos derivados de la ubicación y la variación o la placa y permite una comparación más directa entre los clones positivos. <img src="/files/ftp_upload/2461/2461fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Diagrama de flujo del ensayo de alto rendimiento para una biblioteca metagenómica clonado en E. coli y se almacenan a -80 ° C. <img src="/files/ftp_upload/2461/2461fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Lecturas de absorbancia de una placa de 384 pocillos que contienen un clon positivo. Celulasa clones positivos se pueden identificar por absorción aumentado significativamente en los clones negativos.

<ol>
	<li>Rubin, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomics+of+cellulosic+biofuels.">Genomics of cellulosic biofuels.</a> Nature. 454, 841-845 (2008).</li><li>Voget, S., Steele, H. L., Streit, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+metagenome+derived+halotolerant+cellulase.">Characterization of a metagenome derived halotolerant cellulase.</a> J. Biotechnol. 126, 26-36 (2006).</li><li>Duan, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+partial+characterization+of+novel+genes+encoding+acidic+cellulases+from+metagenomes+of+buffalo+rumens.">Isolation and partial characterization of novel genes encoding acidic cellulases from metagenomes of buffalo rumens.</a> J. Appl. Microbiol. 107, 245-256 (2009).</li><li>Zhang, Y. H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outlook+for+cellulase+improvement:+Screening+and+selection+strategies.">Outlook for cellulase improvement: Screening and selection strategies.</a> Biotech. Advances. 24, 452-481 (2006).</li><li>Teather, R. M., Wood, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+congo+red-polysaccharide+interactions+in+enumeration+and+characterization+of+cellulolytic+bacteria+from+the+bovine+rumen.">Use of congo red-polysaccharide interactions in enumeration and characterization of cellulolytic bacteria from the bovine rumen.</a> Appl. And Environ. Microbiol. 43, 777-780 (1982).</li><li>Sharrock, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellulase+assay+methods:+a+review.">Cellulase assay methods: a review.</a> J. Biochem and Biophys Methods. 17, 81-106 (1988).</li><li>Kasana, R. C., Salwan, R., Dhar, H., Dutt, S., Gulati, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+easy+method+for+detection+of+microbial+cellulases+on+agar+plates+using+Gram's+Iodine.">A rapid and easy method for detection of microbial cellulases on agar plates using Gram's Iodine.</a> Curr. Microbiology. 57, 503-507 (2008).</li><li>Huang, J. S., Tang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitive+assay+for+cellulase+and+dextranase.">Sensitive assay for cellulase and dextranase.</a> Anal. Biochem. 73, 369-377 (1976).</li><li>Tull, D., Withers, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+cellulases+and+xylanases:+A+detailed+kinetic+study+of+the+exo-beta-1,4-glycanase+from+Cellulomonas+fimi.">Mechanisms of cellulases and xylanases: A detailed kinetic study of the exo-beta-1,4-glycanase from Cellulomonas fimi.</a> Biochemistry. 33, 6363-6370 (1994).</li><li>Martinez, A., Bradley, A. S., Waldbauer, J. R., Summons, R. E., DeLong, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteorhodopsin+photosystem+gene+expression+enables+photophosphorylation+in+a+heterologous+host.">Proteorhodopsin photosystem gene expression enables photophosphorylation in a heterologous host.</a> PNAS. 104, 5590-5595 (2007).</li><li>Taupp, M., Lee, S., Hawley, A., Yang, J., Hallam, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+Insert+Environmental+Genomic+Library+Production.">Large Insert Environmental Genomic Library Production.</a> J Vis Exp. , (2009).</li><li>Martinez, A., Tyson, G. W., DeLong, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+known+and+novel+phosphonate+utilization+pathways+in+marine+bacteria+revealed+by+functional+screening+and+metagenomic+analyses.">Widespread known and novel phosphonate utilization pathways in marine bacteria revealed by functional screening and metagenomic analyses.</a> Environ Microbiol. 12, 222-238 (2010).</li><li>Wild, J., Hradecna, Z., Szybalski, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditionally+amplifiable+BACs:+Switching+from+single-copy+to+high-copy+vectors+and+genomic+clones.">Conditionally amplifiable BACs: Switching from single-copy to high-copy vectors and genomic clones.</a> Genome Research. 12, 1434-1444 (2002).</li><li>Johnson, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sacchirification+of+complex+cellulosic+substrates+by+the+cellulase+system+from+Clostridium+thermocellum.">Sacchirification of complex cellulosic substrates by the cellulase system from Clostridium thermocellum.</a> Appl Environ Microbiology. 43, 1125-1132 (1982).</li><li>Stutzenberger, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellulase+Production+by+Thermomonospora+curvata+isolated+from+municipal+solid+waste+compost.">Cellulase Production by Thermomonospora curvata isolated from municipal solid waste compost.</a> Appl Environ Microbiol. 22, 147-152 (1971).</li></ol>

Una pantalla de alto rendimiento para la detección rápida de la actividad celulolítica de una biblioteca genómica de gran metagenómica insertar ADN expresado en E. coli se describe en este protocolo. Este método es una mejora con respecto a la prueba CMC / Rojo Congo de uso común en la literatura. Es una solución basada, y permite una olla de detección química en placas de 384 pocillos, con el resultado final de las lecturas de absorbancia de un lector de placas que permite el análisis cuantitativo. ...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>qPix2</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Genetix</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>With 384-pin gridding head</td>
</tr>
<tr>
<td>qFill3</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Genetix</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>With 384-well manifold</td>
</tr>
<tr>
<td>Varioskan</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo-Fisher</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RapidStak</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo-Fisher</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Connected to Varioskan</td>
</tr>
<tr>
<td>Micro90 Detergent</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cole-Parmer</td>
<td>18100-00</td>
<td>Diluted to 2% in water</td>
</tr>
<tr>
<td>Ethanol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Major Lab Supplier</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Diluted to 80% in water</td>
</tr>
<tr>
<td>Chloramphenicol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>C0378</td>
<td>12.5mg/mL in ethanol</td>
</tr>
<tr>
<td>LB broth, Miller</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>BP1426-2</td>
<td>25g/L, autoclaved</td>
</tr>
<tr>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>384-well flat bottom plates</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning</td>
<td>3680</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-(+)-Arabinose</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>A3256</td>
<td>100mg/mL in water</td>
</tr>
<tr>
<td>Potassium Acetate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>P171</td>
<td>50mM in water, autoclaved, adjusted to pH 5.5 with HCl</td>
</tr>
<tr>
<td>Triton X-100</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>BP151</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Trizma hydrochloride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>T3253</td>
<td>In TE buffer solution, 100mM</td>
</tr>
<tr>
<td>EDTA disodium salt</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>E5134</td>
<td>In TE buffer solution, 10mM</td>
</tr>
<tr>
<td>2,4-dinitrophenyl cellobioside</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Provided by Dr. Steve Withers, UBC</td>
</tr>
<tr>
<td>Dimethyl Sulfoxide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>D8418</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

a high throughput screen for biomining cellulase activity from metagenomic libraries

Celulosa, la fuente más abundante de carbono orgánico en el planeta, tiene una amplia gama de aplicaciones industriales con creciente énfasis en la producción de biocombustibles 1. Métodos químicos para modificar o degradar la celulosa por lo general requieren ácidos fuertes y altas temperaturas. Por lo tanto, los métodos enzimáticos se han convertido en prominente en el proceso de bioconversión. Mientras que la identificación de las celulasas activa de los aislamientos de bacterias y hongos ha sido algo eficaz, la gran mayoría de los microbios en la naturaleza resistir el cultivo de laboratorio. Genómica medioambiental, también conocido como enfoques metagenómica, la selección tiene una gran promesa en la reducción de la brecha de cultivo en la búsqueda de enzimas bioconversión novela. Métodos de detección metagenómica ha recuperado celulasas novela de entornos tan variados como los suelos 2, 3 y búfalos rumen de las termitas traseras-gut 4 utilizando carboximetilcelulosa (CMC) placas de agar se tiñeron con colorante rojo Congo (basado en el método de Teatro y Madera 5). Sin embargo, el método CMC está limitado en el rendimiento, no es cuantitativo y se manifiesta una señal de baja a ruido 6. Otros métodos se han reportado 7,8, pero cada uno utiliza una placa de agar-ensayo basado, que es indeseable para la selección de alto rendimiento de las grandes bibliotecas de insertar genómica. Aquí les presentamos una solución basada en la pantalla de actividad de celulasa usando un dinitrofenol cromogénico (DNP)-cellobioside sustrato 9. Nuestra biblioteca fue clonado en el control de copia PCC1 fosmid para aumentar la sensibilidad del ensayo a través de la inducción de copiar el número 10. El método utiliza una olla de la química en 384 pocillos con la lectura final, siempre como una medida de la absorbancia. Esta lectura es cuantitativo, sensible y automatizada con un rendimiento de hasta 100 veces las placas de 384 pocillos al día usando un manejador de líquidos y lector de placas con sistema conectado de apilamiento.

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A High Throughput Screen for Biomining Cellulase Activity from Metagenomic Libraries

Este protocolo describe una pantalla de alto rendimiento para la actividad celulolítica de una biblioteca metagenómica expresado en Escherichia coli. La pantalla es la solución de base y altamente automatizado, y utiliza una olla de la química en microplacas de 384 y con la lectura final como una medida de la absorbancia.

Una pantalla de alto rendimiento para Biominería actividad de celulasa de bibliotecas metagenómicas

Cellulose, the most abundant source of organic carbon on the planet, has wide-ranging industrial applications with increasing emphasis on biofuel ...

a-high-throughput-screen-for-biomining-cellulase-activity-from

Research

JoVE Journal

Biology

15.1K vistas.  University of British Columbia - UBC. Este protocolo describe una pantalla de alto rendimiento para la actividad celulolítica de una biblioteca metagenómica expresado en Escherichia coli. La pantalla es la solución de base y altamente automatizado, y utiliza una olla de la química en microplacas de 384 y con la lectura final como una medida de la absorbancia.

Video: A High Throughput Screen for Biomining Cellulase Activity from Metagenomic Libraries

Large-Scale Screens of Metagenomic Libraries

Metagenomic libraries archive large fragments of contiguous genomic sequences from microorganisms without requiring prior cultivation. Generating a streamlined procedure for creating and screening metagenomic libraries is therefore useful for efficient high-throughput investigations into the genetic and metabolic properties of uncultured microbial assemblages. Here, key protocols are presented on video, which we propose is the most useful format for accurately describing a long process that alternately depends on robotic instrumentation and (human) manual interventions. First, we employed robotics to spot library clones onto high-density macroarray membranes, each of which can contain duplicate colonies from twenty-four 384-well library plates. Automation is essential for this procedure not only for accuracy and speed, but also due to the miniaturization of scale required to fit the large number of library clones into highly dense spatial arrangements. Once generated, we next demonstrated how the macroarray membranes can be screened for genes of interest using modified versions of standard protocols for probe labeling, membrane hybridization, and signal detection. We complemented the visual demonstration of these procedures with detailed written descriptions of the steps involved and the materials required, all of which are available online alongside the video.

A gran escala de pantallas de bibliotecas metagenómicas

Metagenomic libraries archive large fragments of contiguous genomic sequences from microorganisms without requiring prior cultivation.  Generating a ...

Investigación

Biología

High-throughput Yeast Plasmid Overexpression Screen

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a powerful model system for defining fundamental mechanisms of many important cellular processes, including those with direct relevance to human disease. Because of its short generation time and well-characterized genome, a major experimental advantage of the yeast model system is the ability to perform genetic screens to identify genes and pathways that are involved in a given process. Over the last thirty years such genetic screens have been used to elucidate the cell cycle, secretory pathway, and many more highly conserved aspects of eukaryotic cell biology 1-5. In the last few years, several genomewide libraries of yeast strains and plasmids have been generated 6-10. These collections now allow for the systematic interrogation of gene function using gain- and loss-of-function approaches 11-16. Here we provide a detailed protocol for the use of a high-throughput yeast transformation protocol with a liquid handling robot to perform a plasmid overexpression screen, using an arrayed library of 5,500 yeast plasmids. We have been using these screens to identify genetic modifiers of toxicity associated with the accumulation of aggregation-prone human neurodegenerative disease proteins. The methods presented here are readily adaptable to the study of other cellular phenotypes of interest.

Here we describe a plasmid overexpression screen in Saccharomyces cerevisiae, using an arrayed plasmid library and a high-throughput yeast transformation protocol with a liquid handling robot.

La levadura de alto rendimiento de la pantalla sobreexpresión plásmido

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a powerful model system for defining fundamental mechanisms of many important cellular processes, ...

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted into fuel alcohols1. The potential for enzymatic hydrolysis of cellulosic biomass to provide renewable energy has intensified efforts to engineer cellulases for economical fuel production2. Of particular interest are fungal cellulases3-8, which are already being used industrially for foods and textiles processing.
Identifying active variants among a library of mutant cellulases is critical to the engineering process; active mutants can be further tested for improved properties and/or subjected to additional mutagenesis. Efficient engineering of fungal cellulases has been hampered by a lack of genetic tools for native organisms and by difficulties in expressing the enzymes in heterologous hosts. Recently, Morikawa and coworkers developed a method for expressing in E. coli the catalytic domains of endoglucanases from H. jecorina3,9, an important industrial fungus with the capacity to secrete cellulases in large quantities. Functional E. coli expression has also been reported for cellulases from other fungi, including Macrophomina phaseolina10 and Phanerochaete chrysosporium11-12. 
We present a method for high throughput screening of fungal endoglucanase activity in E. coli. (Fig 1) This method uses the common microbial dye Congo Red (CR) to visualize enzymatic degradation of carboxymethyl cellulose (CMC) by cells growing on solid medium. The activity assay requires inexpensive reagents, minimal manipulation, and gives unambiguous results as zones of degradation (&#x201C;halos&#x201D;) at the colony site. Although a quantitative measure of enzymatic activity cannot be determined by this method, we have found that halo size correlates with total enzymatic activity in the cell. Further characterization of individual positive clones will determine , relative protein fitness. 
Traditional bacterial whole cell CMC/CR activity assays13 involve pouring agar containing CMC onto colonies, which is subject to cross-contamination, or incubating cultures in CMC agar wells, which is less amenable to large-scale experimentation. Here we report an improved protocol that modifies existing wash methods14 for cellulase activity: cells grown on CMC agar plates are removed prior to CR staining. Our protocol significantly reduces cross-contamination and is highly scalable, allowing the rapid screening of thousands of clones. In addition to H. jecorina enzymes, we have expressed and screened endoglucanase variants from the Thermoascus aurantiacus and Penicillium decumbens (shown in Figure 2), suggesting that this protocol is applicable to enzymes from a range of organisms.

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

We describe a low cost, high throughput method to screen for fungal endoglucanase activity in E. coli. The method relies on a simple visual readout of substrate degradation, does not require enzyme purification, and is highly scalable. This allows for the rapid screening of large libraries of enzyme variants.

Cribado de alto rendimiento de la actividad endoglucanasa por hongos en Escherichia coli</em

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted ...

High-throughput Saccharification Assay for Lignocellulosic Materials

Polysaccharides that make up plant lignocellulosic biomass can be broken down to produce a range of sugars that subsequently can be 
used in establishing a biorefinery. These raw materials would constitute a new industrial platform, which is both sustainable and carbon neutral, to replace 
the current dependency on fossil fuel. The recalcitrance to deconstruction observed in lignocellulosic materials is produced by several intrinsic properties 
of plant cell walls. Crystalline cellulose is embedded in matrix polysaccharides such as xylans and arabinoxylans, and the whole structure is encased by the 
phenolic polymer lignin, that is also difficult to digest 1. In order to improve the digestibility of plant materials we need to discover the main bottlenecks 
for the saccharification of cell walls and also screen mutant and breeding populations to evaluate the variability in saccharification 2. These tasks require 
a high throughput approach and here we present an analytical platform that can perform saccharification analysis in a 96-well plate format. This platform has 
been developed to allow the screening of lignocellulose digestibility of large populations from varied plant species. We have scaled down the reaction volumes 
for gentle pretreatment, partial enzymatic hydrolysis and sugar determination, to allow large numbers to be assessed rapidly in an automated system.
This automated platform works with milligram amounts of biomass, performing ball milling under controlled conditions to reduce the plant 
materials to a standardised particle size in a reproducible manner. Once the samples are ground, the automated formatting robot dispenses specified and recorded 
amounts of material into the corresponding wells of 96 deep well plate (Figure 1). Normally, we dispense the same material into 4 wells to have 4 replicates for 
analysis. Once the plates are filled with the plant material in the desired layout, they are manually moved to a liquid handling station (Figure 2). In this 
station the samples are subjected to a mild pretreatment with either dilute acid or alkaline and incubated at temperatures of up to 90&deg;C. The pretreatment solution 
is subsequently removed and the samples are rinsed with buffer to return them to a suitable pH for hydrolysis. The samples are then incubated with an enzyme
mixture for a variable length of time at 50&deg;C. An aliquot is taken from the hydrolyzate and the reducing sugars are automatically determined by the MBTH 
colorimetric method.

A simple, rapid method for determining the saccharification potential of large numbers of plant biomass samples is described. The automated platform for this analysis involves the preparation of the plant biomass for analysis in 96 well plates and the subsequent performance of pretreatment, hydrolysis and quantification of the sugars released.

De alto rendimiento de sacarificación de ensayo para materiales lignocelulósicos

Polysaccharides that make up plant lignocellulosic biomass can be broken down to produce a range of sugars that subsequently can be 
used in establishing ...

Single Read and Paired End mRNA-Seq Illumina Libraries from 10 Nanograms Total RNA

Whole transcriptome sequencing by mRNA-Seq is now used extensively to perform global gene expression, mutation, allele-specific expression and other genome-wide analyses. mRNA-Seq even opens the gate for gene expression analysis of non-sequenced genomes. mRNA-Seq offers high sensitivity, a large dynamic range and allows measurement of transcript copy numbers in a sample. Illumina&#x2019;s genome analyzer performs sequencing of a large number (&gt; 107) of relatively short sequence reads (&lt; 150 bp).The &quot;paired end&quot; approach, wherein a single long read is sequenced at both its ends, allows for tracking alternate splice junctions, insertions and deletions, and is useful for de novo transcriptome assembly.
One of the major challenges faced by researchers is a limited amount of starting material. For example, in experiments where cells are harvested by laser micro-dissection, available starting total RNA may measure in nanograms. Preparation of mRNA-Seq libraries from such samples have been described1, 2 but involves significant PCR amplification that may introduce bias. Other RNA-Seq library construction procedures with minimal PCR amplification have been published3, 4 but require microgram amounts of starting total RNA.
Here we describe a protocol for the Illumina Genome Analyzer II platform for mRNA-Seq sequencing for library preparation that avoids significant PCR amplification and requires only 10 nanograms of total RNA. While this protocol has been described previously and validated for single-end sequencing5, where it was shown to produce directional libraries without introducing significant amplification bias, here we validate it further for use as a paired end protocol. We selectively amplify polyadenylated messenger RNAs from starting total RNA using the T7 based Eberwine linear amplification method, coined &quot;T7LA&quot; (T7 linear amplification). The amplified poly-A mRNAs are fragmented, reverse transcribed and adapter ligated to produce the final sequencing library. For both single read and paired end runs, sequences are mapped to the human transcriptome6 and normalized so that data from multiple runs can be compared. We report the gene expression measurement in units of transcripts per million (TPM), which is a superior measure to RPKM when comparing samples7.

Here we describe a method for preparation of both single read and paired end Illumina mRNA-Seq sequencing libraries for gene expression analysis based on T7 linear RNA amplification. This protocol requires only 10 nanograms of starting total RNA and generates highly consistent libraries representing whole transcripts.

Solo lectura y pareadas final Sec ARNm bibliotecas de Illumina de 10 nanogramos ARN total

Whole transcriptome sequencing by mRNA-Seq is now used extensively to perform global gene expression, mutation, allele-specific expression and other ...

Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans

The nematode C. elegans has emerged as an important model for the study of conserved genetic pathways regulating fat metabolism as it relates to human obesity and its associated pathologies. Several previous methodologies developed for the visualization of C. elegans triglyceride-rich fat stores have proven to be erroneous, highlighting cellular compartments other than lipid droplets. Other methods require specialized equipment, are time-consuming, or yield inconsistent results. We introduce a rapid, reproducible, fixative-based Nile red staining method for the accurate and rapid detection of neutral lipid droplets in C. elegans. A short fixation step in 40% isopropanol makes animals completely permeable to Nile red, which is then used to stain animals. Spectral properties of this lipophilic dye allow it to strongly and selectively fluoresce in the yellow-green spectrum only when in a lipid-rich environment, but not in more polar environments. Thus, lipid droplets can be visualized on a fluorescent microscope equipped with simple GFP imaging capability after only a brief Nile red staining step in isopropanol. The speed, affordability, and reproducibility of this protocol make it ideally suited for high throughput screens. We also demonstrate a paired method for the biochemical determination of triglycerides and phospholipids using gas chromatography mass-spectrometry. This more rigorous protocol should be used as confirmation of results obtained from the Nile red microscopic lipid determination. We anticipate that these techniques will become new standards in the field of C. elegans metabolic research.

Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans

We present robust biochemical and microscopic methods for studying Caenorhabditis elegans lipid stores. A rapid, simple, fixing-staining procedure for fluorescent lipid droplet imaging leverages the spectral properties of the lipophilic dye Nile red. We then present biochemical measurement of triglycerides and phospholipids using solid phase extraction and gas chromatography-mass spectrometry.

Bioquímica y de Evaluación de Rendimiento microscópica de masa grasa en<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

The nematode C. elegans has emerged as an important  model for the study of conserved genetic pathways regulating fat metabolism as  it relates to human ...

High Throughput Microinjections of Sea Urchin Zygotes

Microinjection into cells and embryos is a common technique that is used to study a wide range of biological processes. In this method a small amount of treatment solution is loaded into a microinjection needle that is used to physically inject individual immobilized cells or embryos. Despite the need for initial training to perform this procedure for high-throughput delivery, microinjection offers maximum efficiency and reproducible delivery of a wide variety of treatment solutions (including complex mixtures of samples) into cells, eggs or embryos. Applications to microinjections include delivery of DNA constructs, mRNAs, recombinant proteins, gain of function, and loss of function reagents. Fluorescent or colorimetric dye is added to the injected solution to enable instant visualization of efficient delivery as well as a tool for reliable normalization of the amount of the delivered solution. The described method enables microinjection of 100-400 sea urchin zygotes within 10-15 min.

Microinjection is a common technique used to deliver DNA constructs, mRNAs, morpholino antisense oligonucleotides or other treatments into eggs, embryos, and cells of various species.

High Throughput microinyecciones de Sea Urchin cigotos

Microinjection into cells and embryos is a common technique that is used to study a wide range of biological processes. In this method a small amount of ...

A Manual Small Molecule Screen Approaching High-throughput Using Zebrafish Embryos

Zebrafish have become a widely used model organism to investigate the mechanisms that underlie developmental biology and to study human disease pathology due to their considerable degree of genetic conservation with humans. Chemical genetics entails testing the effect that small molecules have on a biological process and is becoming a popular translational research method to identify therapeutic compounds. Zebrafish are specifically appealing to use for chemical genetics because of their ability to produce large clutches of transparent embryos, which are externally fertilized. Furthermore, zebrafish embryos can be easily drug treated by the simple addition of a compound to the embryo media. Using whole-mount in situ hybridization (WISH), mRNA expression can be clearly visualized within zebrafish embryos. Together, using chemical genetics and WISH, the zebrafish becomes a potent whole organism context in which to determine the cellular and physiological effects of small molecules. Innovative advances have been made in technologies that utilize machine-based screening procedures, however for many labs such options are not accessible or remain cost-prohibitive. The protocol described here explains how to execute a manual high-throughput chemical genetic screen that requires basic resources and can be accomplished by a single individual or small team in an efficient period of time. Thus, this protocol provides a feasible strategy that can be implemented by research groups to perform chemical genetics in zebrafish, which can be useful for gaining fundamental insights into developmental processes, disease mechanisms, and to identify novel compounds and signaling pathways that have medically relevant applications.

The zebrafish is an excellent experimental organism to study vertebrate developmental processes and model human disease. Here, we describe a protocol on how to perform a manual high-throughput chemical screen in zebrafish embryos with a whole-mount in situ hybridization (WISH) read-out.

Un manual de la pantalla pequeña molécula Acercarse De Alto Rendimiento Utilizando embriones de pez cebra

Zebrafish have become a widely used model organism to investigate the mechanisms that underlie developmental biology and to study human disease pathology ...

Recovery of Adult Zebrafish Hearts for High-throughput Applications

Use of the zebrafish model system for studying development, regeneration, and disease is expanding toward use of adult hearts for cell dissociation and purification of RNA, DNA, and proteins. All of these applications demand the rapid recovery of significant numbers of zebrafish hearts to avoid gene regulatory, metabolic, and other changes that begin after death. Adult zebrafish hearts are also required for studying heart structure for a variety of mutants and for studying heart regeneration. However, the traditional zebrafish heart dissection is slow and difficult and requires specialized tools, making large-scale dissection of adult zebrafish hearts tedious. Traditional methods also harbor the risk of damaging the heart during the dissection. Here, we describe a method for dissection of adult zebrafish hearts that is fast, reproducible, and preserves heart architecture. Furthermore, this method does not require specialized tools, is painless for the zebrafish, can be performed on fresh or fixed specimens, and can be performed on zebrafish as young as one month old. The approach described expands the use of adult zebrafish for cardiovascular research.

Use of zebrafish for cardiovascular research is expanding towards research on adult hearts. For these applications, quick and simple isolation of cardiac tissues is key to avoid post-mortem changes and to obtain an adequate number of samples. Here, we describe a fast and reproducible method for dissecting adult zebrafish hearts.

Recuperación de adultos de pez cebra Corazones para aplicaciones de alto rendimiento

Use of the zebrafish model system for studying development, regeneration, and disease is expanding toward use of adult hearts for cell dissociation and ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays focus on transcriptional regulation, being essentially aimed at the identification of promoter-targeting molecules. As a result, post-transcriptional mechanisms are largely uncovered by gene expression targeted drug development. Here we describe a cell-based assay aimed at investigating the role of the 3&#39; untranslated region (3&#8217; UTR) in the modulation of the fate of its mRNA, and at identifying compounds able to modify it. The assay is based on the use of a luciferase reporter construct containing the 3&#8217; UTR of a gene of interest stably integrated into a disease-relevant cell line. The protocol is divided into two parts, with the initial focus on the primary screening aimed at the identification of molecules affecting luciferase activity after 24 hr of treatment. The second part of the protocol describes the counter-screening necessary to discriminate compounds modulating luciferase activity specifically through the 3&#8217; UTR. In addition to the detailed protocol and representative results, we provide important considerations about the assay development and the validation of the hit(s) on the endogenous target. The described cell-based reporter gene assay will allow scientists to identify molecules modulating protein levels via post-transcriptional mechanisms dependent on a 3&#8217; UTR.

Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3&#8217; UTR.

Selección de alto rendimiento para moduladores químicos de genes post-transcripcionalmente regulados

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...