Diese Forschung zielt darauf ab, ein effizientes Protokoll für die Konservierung des Atemwegsinhalts von Mäusen in Lungeninfektionsmodellen zu etablieren. Wir entwickeln die Fähigkeit, die Frage zu beantworten, wo eingeatmete Pilzsporen in der Lunge landen. In jüngster Zeit haben viele Gruppen die Rolle verschiedener Epithelzellen der Atemwege bei der Wahrnehmung von Infektionen und der Initiierung schützender Immunantworten identifiziert.
Diese Epithelzellen reichen von Keulenzellen in den Bronchialen bis hin zu Typ-II-Epithelzellen in den terminalen Lungenbläschen. Die übliche Lungenvorbereitungstechnik besteht darin, die Lunge mit dem flüssigen Fixiermittel aufzublasen, um das Lungengewebe für nachfolgende histologische Analysen zu erhalten. Bei dieser Technik werden jedoch Inhalte der Atemwege, wie z. B. eingeatmete Pilzsporen, verdrängt.
Unser Protokoll bewahrt die natürliche Position der eingeatmeten Pilzsporen in der Lunge und behält gleichzeitig die richtige Lungenmorphologie durch Luftaufblasen und die richtige Lungenfixierung durch Gefäßperfusion bei. Wir hoffen, dieses Protokoll verwenden zu können, um die bronchoalveolären Verbindungen zu charakterisieren, an denen die Sporen in unserem Modell zu landen scheinen, aber wir werden die Positionen der Sporen in der Nähe verschiedener Epithelzellen verwenden und die daraus resultierenden Immunantworten untersuchen. Färben Sie zunächst eins mal 10 hoch sechs Coccidioides posadasii-Sporen mit fünf mikromolaren CFSE-Konzentrationen für 30 Minuten bei 30 Grad Celsius.
Waschen Sie die Sporen nach dem Färben mit PBS. Zentrifugieren Sie die Sporen bei 12.000 g und resuspendieren Sie das Pellet in 25 Mikrolitern PBS für das Sporeninokulum in der entsprechenden Konzentration. Bereiten Sie eine Pipette mit 25 Mikrolitern des Sporeninokulums vor.
Nachdem Sie die Maus in einem Nalgene-Glas betäubt haben, positionieren Sie die Maus in Rückenlage in einer Hand und lassen Sie sie drei bis fünf regelmäßige Atemzüge machen. Platzieren Sie die Pipettenspitze am hinteren Rand des Oropharynx der Maus und lösen Sie das Inokulum während der Inhalation. Spüren Sie mit Hand und Daumen ein Knistern an den hinteren und vorderen Aspekten des Brustkorbs der Maus, um die Inhalation des Inokulums zu bestätigen.
Besprühen Sie die tief betäubte Maus mit 70%igem Ethanol. Schneiden Sie mit einer Schere vorsichtig die Haut der Maus ab und ziehen Sie sie dann auseinander, um das Bauchfell freizulegen. Ziehen Sie dann die Haut von der oberen Hälfte über den Kopf der Maus und befreien Sie so die Arme.
Schneiden Sie nun die Peritonealmembran am Brustbein und entlang der unteren Seite des Brustkorbs und legen Sie das Peritoneum frei. Verlagern Sie die Leber nach unten, um das Zwerchfell freizulegen. Stechen Sie das Zwerchfell vorsichtig mit einer Schere vom Lungenparenchym weg.
Schneiden Sie als Nächstes den Brustkorb auf der linken Seite auf, um das Herz freizulegen. Injizieren Sie mit einer 30-Gauge-Nadel fünf bis 10 Milliliter PBS in den rechten Ventrikel. Nachdem Sie die Nadel entfernt haben, injizieren Sie mit einer neuen Nadel fünf Milliliter 10% neutrales gepuffertes Formalin in den rechten Ventrikel.
Entfernen Sie mit einer Schere die vordere Hälfte des Brustkorbs. Um die Luftröhre freizulegen, schneiden Sie die oberen Rippen und Schlüsselbeine rechts und links des Halses ab und vermeiden Sie dabei die Mittellinie, wo die Luftröhre liegt. Fassen Sie mit einer Pinzette die verbleibenden oberen Rippen und Schlüsselbeine in der Nähe der Mittellinie des Halses an und ziehen Sie überlegen, bis die Luftröhre freiliegt.
Bereiten Sie einen 10 Zentimeter langen Nahtfaden vor und ziehen Sie ihn unter die Luftröhre. Binden Sie einen losen Knoten am unteren Ende der freiliegenden Luftröhre. Bereiten Sie dann eine Ein-Milliliter-Spritze Luft mit einem 18-Gauge-Katheter vor.
Bohren Sie mit einer 18-Gauge-Nadel ein Loch in die Luftröhre am oberen Ende des freiliegenden Bereichs. Führen Sie nun den Katheter in das Loch ein und achten Sie dabei auf einen festen Sitz, um zu verhindern, dass Luft entweicht. Injizieren Sie dann langsam über 10 Sekunden einen Milliliter Luft in die Lunge und achten Sie auf das Aufblasen aller Lungenlappen.
Das vollständige Aufblasen führt dazu, dass sich die Lunge leicht um das Herz wickelt und das Volumen des unpunktierten Zwerchfells ausfüllt. Nachdem Sie die Lunge von der Maus isoliert haben, legen Sie sie auf den oberen Rand eines konischen 50-Milliliter-Röhrchens, das mit 20 Millilitern 10 % neutralem gepuffertem Formalin gefüllt ist. Platzieren Sie die Nahtfäden außerhalb des Schlauchs und schrauben Sie dann die Kappe fest.
Spülen Sie zunächst die isolierten Mauslungen in PBS und legen Sie sie für 72 bis 96 Stunden bei vier Grad Celsius in eine 30%ige Saccharose-PBS-Lösung. Entfernen Sie anschließend überschüssiges Gewebe und legen Sie die Lunge in einen Cryomold mit OCT-Medium. Frieren Sie die Probe bei minus 80 Grad Celsius ein.
Die Probe wird eine Stunde lang in OCT-Kryoblöcken bei minus 20 Grad Celsius äquilibriert, bevor die Blöcke bei einer Dicke von 20 bis 100 Mikrometern geschnitten werden. Sammeln Sie die Abschnitte auf einem Objektträger und lassen Sie sie 30 Minuten bis eine Stunde trocknen. Legen Sie den Objektträger für 30 Minuten bei Raumtemperatur in ein PBS-Bad, um OCT aus dem Gewebe zu entfernen.
Verwenden Sie dann ein Tuch, um überschüssige Tröpfchen vom Umfang des Objektträgers um die Gewebeprobe herum zu entfernen. Zeichnen Sie mit einem hydrophoben PAP-Stift einen Umfang um die Probe auf dem Objektträger und lassen Sie sie fünf Minuten trocknen. Geben Sie anschließend 300 Mikroliter frisch zubereitete tierversuchsfreie Blockierungslösung auf den Objektträger und inkubieren Sie sie bei Raumtemperatur.
Inkubieren Sie nun den Objektträger über Nacht bei vier Grad Celsius in 300 Mikrolitern primärer Alexa Fluor 647 konjugierter Ratten-Anti-Maus-EpCAM-Antikörperlösung. Entfernen Sie am nächsten Tag die Antikörperlösung und waschen Sie den Objektträger zweimal fünf Minuten lang mit 300 Mikrolitern PBS. Geben Sie nach dem Trocknen einen Tropfen weich abbindendes SlowFade-Eindeckmedium bei Raumtemperatur auf jedes Gewebestück.
Legen Sie ein Deckglas über das Gewebe und stellen Sie sicher, dass es über die Probe und den hydrophoben Markerumfang hinausragt. Legen Sie zunächst den mit Pilzsporen beimpften, immungefärbten Lungenschnitt der Maus unter ein Mehrkanal-Fluoreszenzmikroskop und wählen Sie ein geeignetes Objektiv aus. Um den gesamten Lungenlappen zu erfassen, sammeln Sie ausreichend Bildkacheln und fügen Sie diese zusammen.
Exportieren Sie mit der Software des Mikroskops das Bild des gesamten Lungenlappens für die nachgelagerte Verarbeitung. Erstellen Sie in QuPath eine Projektdatei und fügen Sie der Datei die fluoreszierenden Bilder hinzu. Klassifizieren Sie die EpCAM-positiven Pixel als Epithel, indem Sie nacheinander Klassifizieren, Pixelklassifizierung und Schwellenwert erstellen auswählen.
Wählen Sie die Auflösung, den Kanal, das Glättungs-Sigma und den Schwellenwert aus, um den Zielbereich zu identifizieren. Speichern Sie den Klassifikator unter einem eindeutigen Namen, und wählen Sie Objekte erstellen aus. Wählen Sie im neuen Fenster Objekte erstellen die Option Neuer Objekttyp als Anmerkung aus.
Legen Sie für Lungenepithel die minimale Objektgröße und die minimale Lochgröße auf 100 Quadratmikrometer fest. Nachdem Sie OK ausgewählt haben, werden die Anmerkungen erstellt und können mit dem Pinselwerkzeug geändert werden. Um Sporen zu klassifizieren, wiederholen Sie die Schritte, wie für Lungenepithel-Annotationen gezeigt.
Wählen Sie dann im Fenster Objekte erstellen die Option Erkennung als neuen Objekttyp aus. Legen Sie die minimale Objektgröße und die minimale Bohrungsgröße auf null Quadratmikrometer fest, und wählen Sie Objekte teilen aus. Um als Nächstes eine räumliche Analyse der Sporen nacheinander durchzuführen, wählen Sie Analysieren, Räumliche Analyse aus, und berechnen Sie den vorzeichenbehafteten Abstand zu Annotationen zweidimensional.
Die Entfernungen zum EpCAM-positiven Epithel werden für jede nachgewiesene Spore berechnet. Klicken Sie abschließend auf Messen, gefolgt von Messungen exportieren, um die Ergebnisse zu exportieren. Sporen von Coccidioides posadasii reicherten sich hauptsächlich in den distalen Bronchialen und den nahe gelegenen Alveolarräumen in der luftaufgeblasenen Lunge an.
Die Sporen schienen in formalen und flüssigkeitsaufgeblasenen Lungen im Vergleich zu luftaufgeblasenen Lungen stärker von den Bronchien weg verteilt zu sein. Der Abstand zwischen Sporen und EpCAM-positivem bronchiolärem Epithel war in flüssigkeitsaufgeblähten Lungen größer als bei physiologischer Luftinflation, was auf stärker verteilte Sporen hinweist.
