Visualisierung von Proteinen zur Reparatur von DNA-Schäden in patienteneigenen Ovarialkarzinom-Organoiden mittels Immunfluoreszenz-Assays

Die Untersuchung der DNA-Schadensantwort ist notwendig, um die Pathophysiologie potenzieller Biomarker für Eierstockkrebs in einer neuartigen zielgerichteten Therapie zu verstehen. Diese Technik ermöglicht es, dass die Probe intakt bleibt und die Antigene an ihrem Wirkort untersucht werden können. Dieses Protokoll ist schnell und kann an jedes Antigen angepasst werden, das für die Immunfluoreszenz geeignet ist.

Diese Methode gibt Aufschluss über Eierstockkrebs und Reparaturprozesse von DNA-Schäden, die an der Resistenz gegen Chemotherapeutika und PARP-Inhibitoren beteiligt sind. Diese Methoden können auf andere Studienbereiche angewendet werden, in denen 3D-Kulturen und Organoide verwendet werden. Saugen Sie zunächst die Medien aus den bestrahlten und inkubierten Organoiden ab, ohne die 3D-Matrix zu stören.

Anschließend mit 300 Mikrolitern PBS waschen. Fixieren Sie die Organoide in 300 Mikrolitern 2% Paraformaldehyd für 10 Minuten. Waschen Sie die Organoide nach dem Fixieren mit 300 Mikrolitern Färbepuffer und legen Sie sie fünf Minuten lang auf einen Shaker.

Dann permeabilisieren Sie das Organoid durch vorsichtige Zugabe von 300 Mikrolitern Permeabilisierungspuffer. Entfernen Sie nach 20 Minuten Inkubation den Puffer und waschen Sie ihn mit 300 Mikrolitern Färbepuffer. Legen Sie die Organoide für fünf Minuten auf einen Shaker.

Als nächstes fügen Sie 300 Mikroliter Färbepuffer hinzu, um den Permeabilisierungsschritt zu blockieren. 30 Minuten auf den Shaker legen und den Färbepuffer mit einer Pipette absaugen. Fügen Sie dann 300 Mikroliter Primärantikörper hinzu, die in Färbepuffer verdünnt sind.

16 Stunden bei vier Grad Celsius inkubieren. Entfernen Sie nach der Inkubation die primäre Antikörperlösung. Führen Sie drei Wäschen mit 300 Mikrolitern Färbepuffer für jeweils fünf Minuten auf dem Shaker durch.

Fügen Sie 300 Mikroliter sekundäre Antikörperlösung hinzu, die in Färbepuffer verdünnt ist, und inkubieren Sie eine Stunde lang im Dunkeln. Nach einer Stunde saugen Sie die sekundäre Antikörperlösung ab und fügen Sie 300 Mikroliter verdünntes DAPI hinzu. Fünf Minuten auf den Shaker legen.

Führen Sie drei Wäschen mit 300 Mikrolitern Färbepuffer für jeweils fünf Minuten auf dem Shaker durch. Entfernen Sie den Färbepuffer und lösen Sie die Kammern mit dem Entnahmeset, das den Objektträgern beiliegt. Schneiden Sie die Spitze einer P200-Pipettenspitze ab und fügen Sie damit Montagemedium hinzu, um jede Vertiefung mit einer Organoidlasche abzudecken.

Legen Sie ein Deckglas über die Probe und vermeiden Sie dabei Blasen. Nehmen Sie durchsichtigen Nagellack und malen Sie ihn auf die Seiten des Deckglases, um den Objektträger zu versiegeln. Lassen Sie es eine Stunde aushärten und legen Sie es dann auf 20 Grad Celsius.

Nehmen Sie Bilder mit einem konfokalen Mikroskop mit einem 63X-Objektiv mit Immersionsöl auf. Unter Verwendung dieses Protokolls wurden von Patientinnen stammende Ovarialkarzinom-Organoide vor und nach der Bestrahlung auf Proteine zur Reparatur von DNA-Schäden gefärbt und auf Biomarker wie Gamma-H2AX, einen Marker für DNA-Schäden, und RAD51, einen Marker für die homologe Rekombinationsreparatur, untersucht. RPA, ein Marker für Replikationsstress, 53BP1, ein Marker für nicht-homologes Enstranging, und Geminin, ein GS2-Phasen-Zellzyklusmarker, wurden ebenfalls mit dieser Technik bewertet.

Die BME-Tabs neigen zum Depolymerisieren, daher ist es wichtig, nach dem Fixieren und Absaugen genau aufzupassen. Die Analyse der Antigene zur Bestimmung der Organoidschädigung und die Fähigkeit, eine DNA-Schadensreaktion aufzubauen, könnten bei der Bewertung der chemotherapeutischen Resistenz helfen.