Dieses Protokoll ermöglicht es Forschern zu beobachten, wie C-Elgans auf den Acetylcholinrezeptoragonisten Levamisol reagieren. Eine veränderte Levamisol-Empfindlichkeit kann auf Signaldefekte an ihrer neuromuskulären Verbindung oder Muskelfunktion hinweisen. Ein großer Vorteil ist, dass das kräftige Schwimmen von C-Elgans in der Levamisole-Lösung es den Forschern ermöglicht, die zeitabhängige Lähmung von Hunderten von Würmern in nur einer Stunde zu quantifizieren.
Die Anzahl der Würmer in jedem Brunnen alle fünf Minuten zu zählen, kann überwältigend sein. Anzahl der untersuchten Bohrlöcher oder Zeitpunkte können bei Bedarf angepasst werden. Um mit der Herstellung von Nematoden-Wachstumsmedien zu beginnen, indem Sie drei Gramm Natriumchlorid, 2,5 Gramm Pep-Ton und 17 Gramm Agar mit einem Liter entionisiertem Wasser in einem Kolben mit einem Rührstab kombinieren.
Nach dem Autoklavieren legen Sie die Medien auf eine auf 70 Grad Celsius eingestellte Heizplatte und rühren Sie eine Stunde lang mit moderater Geschwindigkeit um. Fügen Sie einen Milliliter von fünf Milligramm pro Milliliter Cholesterin tropfenweise hinzu, um Niederschläge zu verhindern. Ein Milliliter eines molaren Calciumchlorids, ein Milliliter eines molaren Magnesiumsulfats und 25 Milliliter eines molaren pH 6,0 Kaliumphosphatpuffers zum Medium.
Mit einer sterilen serologischen Pipette werden zwei Milliliter Nematoden-Wachstumsmedien in jede Vertiefung einer 24-Well-Platte überführt. Lassen Sie die Teller zwei Tage lang auf der Tischplatte trocknen, bevor Sie mit Bakterien sitzen. Wählen Sie eine einzelne OP 50-Kolonie in B-Brühe und lassen Sie die Kultur über Nacht auf 37 Grad Celsius schütteln.
Mit einer sterilen Pipette 30 Mikroliter OP50-Suspension auf den Agar in der Mitte jedes Vertiefungs tropfen. Lassen Sie die Teller nach dem Sitzen mindestens zwei Tage bei Raumtemperatur stehen, damit sich ein Bakterienrasen bilden kann. Züchten Sie den Wildtyp unc-63 Lev10 und unc-49 C-elgan bis zum Erwachsenenalter auf sechs Zentimetern Platten und bereiten Sie mindestens acht Platten pro Stamm vor.
Bereiten Sie die Bleichlösung am Tag der Synchronisierung unter der Haube vor. Mischen Sie 10 Milliliter Bleichmittel, 2,5 Milliliter Natriumhydroxid und 37,5 Milliliter deionisiertes Wasser in einem 50-Milliliter-Chronikrohr. Mit einer Kunststoff-Transferpipette gravid adulte Würmer von mindestens vier Platten mit M9-Puffer waschen und in ein 15-Milliliter-Chronikröhrchen überführen.
Drehen Sie diese 716 G für eine Minute bei Raumtemperatur und entfernen Sie dann den Supernatant mit einer Transferpipette. Fügen Sie 10 Milliliter der Bleichlösung hinzu. Schütteln Sie das Röhrchen vorsichtig vier Minuten lang, bis sich die meisten, aber nicht alle Wurmkadaver aufgelöst haben.
Drehen Sie sich bei 716 G für eine Minute. Gießen Sie die Bleichlösung in einer Bewegung ab. Solange das Röhrchen an dieser Stelle nicht geschüttelt wird, kleben die Eier bei 15 Milliliter M9-Puffer an der Seite des Röhrchens und kehren um.
Drehen Sie sich eine Minute lang bei 716 G und gießen Sie den M9-Puffer in einer sanften Bewegung ab. Wiederholen Sie diese Wäsche mit Pufferlösung dreimal. Nach dem letzten Waschgang 10 Milliliter frisches M9 hinzufügen und über Nacht bei 15 Grad Celsius auf einen Rotator legen, um eine synchronisierte Population von verhungerten Tieren im ersten Larvenstadium zu isolieren.
Drucken Sie auf 24 Well-Platten aus und weisen Sie Stämme zufälligen Stellen zu. Etwa 24 Stunden nach der Bleichmittelvorbereitung schlüpfen Sie ausgeblütete L1-Würmer bei 716 G für eine Minute bei Raumtemperatur herunter. Entfernen Sie etwa neun Milliliter M9-Puffer mit einer Kunststofftransferpipette und mischen Sie dann vorsichtig die ausgehungerten Würmer im ersten Larvenstadium in den verbleibenden M9-Puffer.
Sofort drei Mikroliter der Würmer und M9-Puffer auf einen Objektträger pipettieren und die Anzahl der L1 bestimmen. Die gewünschte Anzahl beträgt 20 bis 30 L1 in drei Mikrolitern. Pipettieren Sie drei Mikroliter L1 in jede Vertiefung gemäß der vorgefertigten Plattenkarte, lassen Sie die Würmer drei Tage lang bei 20 Grad Celsius erwachsen werden.
Drucken Sie das leere Datenblatt aus, das verwendet wird, um die Anzahl der Würmer aufzuzeichnen, die sich alle fünf Minuten für eine Stunde in jedem Bohrloch bewegen. Überprüfen Sie die Würmer in den 24 Well-Platten. Machen Sie mit einem Marker ein X auf dem Plattendeckel über alle Brunnen, die kontaminiert sind, verhungert sind oder zu viele Würmer haben, was das Zählen erschwert.
Stellen Sie 0,4 Millimolar Levamisollösung her, indem Sie 200 Mikroliter 100 Millimolar Levamisol zu 50 Milliliter M9 hinzufügen. Starten Sie einen Timer und geben Sie dann mit einer Transferpipette einen Milliliter 0,4 Millimol Levamisol in die ersten beiden Vertiefungen, so dass die Tiere frei schwimmen können. Fügen Sie Levamisol weiterhin zu den benachbarten Bohrlöchern hinzu und staffeln Sie die Zeit entsprechend der Anzahl der zu untersuchenden Bohrlöcher. Beginnen Sie nach fünf Minuten damit, manuell nur die Anzahl der sich bewegenden Würmer in jedem Bohrloch zu zählen, beginnend mit dem ersten Bohrloch, und notieren Sie diese Zahl auf dem Datenblatt.
Zählen Sie die Anzahl der sich bewegenden Würmer in jedem Bohrloch alle fünf Minuten für eine Stunde. Am Ende des Tests oder wenn es die Zeit erlaubt, notieren Sie die Gesamtzahl der Würmer in jedem Bohrloch. Besorgen Sie sich die Platte, kartieren Sie und notieren Sie, welche Dehnung jeder Vertiefung entspricht.
Geben Sie die Daten in eine Tabelle ein, beginnend mit der Gesamtzahl der Würmer in jedem Bohrloch und organisieren Sie sie nach Genotyp. Kombinieren Sie Daten aus den Brunnen, um die Anzahl der Würmer zu bestimmen, die sich zu jedem Zeitpunkt bewegen. Verwenden Sie dies, um die Anzahl zu berechnen, die zu jedem Zeitpunkt lähmen.
Erstellen Sie eine Datentabelle so, dass die linke Spalte die Zeit angibt und nachfolgende Spalten die Daten für jede Dehnung enthalten. Erstellen Sie für jedes Tier, das innerhalb der ersten fünf Minuten gelähmt ist, eine Reihe und geben Sie eine für fünf Minuten ein. Wiederholen Sie dies für jeden Zeitpunkt.
Für alle Tiere, die am Ende des Tests nicht gelähmt sind, geben Sie für 60 Minuten eine Null ein. Verwenden Sie diese Daten, um eine Überlebenskurve in der hier verwendeten spezifischen Statistiksoftware zu erstellen, um die zeitabhängige Lähmung der Bevölkerung visuell darzustellen. Die Daten für alle untersuchten Stämme müssen in dieselbe Datentabelle eingegeben werden, wobei bei Bedarf Leerzeichen zu lassen sind.
Mutationen in Untereinheiten des Levamisol-Acetylcholinrezeptors sowie in Genen, die für die Clusterbildung postsynaptischer Levamisol-sensitiver Acetylcholinrezeptoren erforderlich sind, verursachen eine Resistenz gegen Levamisol-induzierte Lähmung, wie sie bei den unc-63- bzw. Lev-10-Mutanten beobachtet wurde. Der Verlust des GABA-gesteuerten Ionenkanals unc-49 verursachte Levamisol-Überempfindlichkeit aufgrund einer Störung des richtigen Gleichgewichts von cholinergen und GABAergen Signalen. Die richtige Vorbereitung von 24 Well-Platten ist unerlässlich.
Wenn Bakterienrasen vor dem Erkennen von L1 nicht trocken sind, kann die Levamisollösung während des Assays trüb werden, was die Beobachtung hemmt. Durch Modifizierung der 24 Well-Platten kann dieses Protokoll mit RNAi-niedergeschlagenen Tieren durchgeführt werden. Dies ermöglicht es den Forschern, die Gene von C-elgan zu untersuchen, für die keine Mutanten verfügbar sind.
