Das Protokoll ist hochempfindlich und ermöglicht die Erfassung des Genexpressionsprofils mit hohem Durchsatz bei Einzelzellauflösung. Die Technik bietet sowohl anatomische räumliche als auch molekulare Spezifität bei Einzelzellauflösung. Nach der Ernte des Gehirns, der Auswahl der einzelnen Zellen und der Vorbereitung der mRNA injizieren Sie Kontrollleitungsflüssigkeit in den qPCR-Chip für das Priming.
Setzen Sie den qPCR-Chip in die mikrofluidische Mischvorrichtung ein. Wählen Sie das Prime-Skript aus und führen Sie das Programm aus. Entfernen Sie nach Abschluss des Programms den grundierten qPCR-Chip und pipettieren Sie sechs Mikroliter der Reaktion von der PCR-Probenplatte in die entsprechende Probenmulde im grundierten qPCR-Chip.
Pipettieren Sie nun sechs Mikroliter der Reaktion von der PCR-Assayplatte in die entsprechende Assay-Vertiefung im primierten qPCR-Chip. Stecken Sie dann den Chip in die mikrofluidische Mischvorrichtung. Wählen Sie das Load Mix-Skript aus und führen Sie das Programm aus.
Schalten Sie die mikrofluidische RT-qPCR-Plattform ein und wärmen Sie die Lampe auf. Entfernen Sie den qPCR-Chip von der mikrofluidischen Mischvorrichtung und ziehen Sie den Schutzaufkleber von der Unterseite des Chips. Öffnen Sie die mikrofluidische RT-qPCR-Plattform und laden Sie den qPCR-Chip in die Plattform.
Starten Sie die Datenerfassungssoftware, indem Sie auf Neue Ausführung starten klicken. Überprüfen Sie den Chip-Barcode und den Chip-Typ. Klicken Sie dann auf Weiter.
Wählen Sie die Chiplaufdatei aus und durchsuchen Sie den Dateispeicherort für den Datensammlungsspeicher. Klicken Sie dann auf Anwendungstyp und wählen Sie Genexpression. Wählen Sie ROX für eine passive Referenz, eine einzelne Sonde und EVAGreen für den Sondentyp.
Wählen Sie das Temperaturwechselprogramm und dann Biomark HD GE:Fast 96x96 PCR+Melt v2 aus. PCL-Datei. Laden Sie die Datenanalysesoftware herunter.
Starten Sie die Software, um das mikrofluidische RT-qPCR-Experiment zu analysieren. Klicken Sie auf Chip Run und öffnen Sie ChipRun. BML-Datei, die vom Experimentator erstellt wurde.
Ein Fenster mit den experimentellen Details, einschließlich der passiven Referenz, der Sonde und des PCR-Wärmeprogramms, wird angezeigt. Klicken Sie auf der Registerkarte Chip Explorer auf Sample Plate Setup (Probenplatten-Setup), und erstellen Sie eine neue Probenplattenvorlage. Kopieren Sie die Beispielbeschriftungen und fügen Sie sie gemäß dem experimentellen Design in die Softwaretabelle ein.
Geben Sie den Probennamen und die für die Standardproben verwendete RNA-Konzentration ein. Ordnen Sie nun das Setup des Beispiels zu, indem Sie im Taskmenü auf Zuordnung klicken und SBS96-Left.dsp auswählen. Wählen Sie als Nächstes Detailansichten aus, um diese Änderungen in der Datei zu aktualisieren, und klicken Sie auf Analysieren.
Wählen Sie Detector Plate Setup (Detektorplatten-Setup) und erstellen Sie eine neue Assay-Platte. Wählen Sie den entsprechenden Containertyp und das entsprechende Containerformat aus. Fügen Sie die Assay-Namen gemäß dem experimentellen Design ein und klicken Sie auf Analysieren.
Klicken Sie im Bereich der Analyseeinstellungen auf Benutzer, und legen Sie die Anpassung auf automatisch fest. Überprüfen Sie nun manuell jede Reaktion im 96x96-Chip. Visualisieren Sie die Amplifikations- und Schmelzkurven, um festzustellen, ob jede Reaktion dem erwarteten qPCR-Muster folgte.
Wenn die Verstärkungs- oder Schmelzkurve nicht mit dem übereinstimmt, was erwartet wird, schlägt diese Reaktion fehl. Exportieren Sie nach der Qualitätssicherung die Daten, indem Sie Datei auswählen, auf Exportieren klicken und den Datensatz als CSV-Datei speichern. Da die exportierte CSV-Datei sowohl eine Pass-Fail-Matrix als auch eine Matrix mit unformatierten CT-Werten enthält, verwenden Sie die Pass-Fail-Matrix, um alle fehlgeschlagenen Zellen im Dataset durch NA zu ersetzen. Laden Sie die aktuelle Version der Open Source R-Software herunter und laden Sie dann die R Studio-Anwendung herunter.
Verwenden Sie für die mediane Zentrierung die R-Software, um den mittleren CT-Wert zu berechnen, der aus allen CT-Werten für eine einzelne Probe berechnet wird, und subtrahieren Sie dann alle einzelnen CT-Werte von diesem Medianwert, um einen Minus-Delta-CT-Wert zu erhalten. Für die Normalisierung des Housekeeping-Gens berechnen Sie die durchschnittliche Expression der Housekeeping-Gene für jede Probe und subtrahieren Sie mit diesem Wert die einzelnen CT-Werte. Um einen Minus-Delta-Delta-CT-Wert zu generieren, führen Sie den Code in der R-Software aus.
Laden Sie das normalisierte Dataset in R hoch und analysieren Sie die Daten mithilfe der Skalierungsfunktion, generieren Sie die skalierten Daten, und verwenden Sie dann die R-Heatmap-Funktion oder eine separate Software, um eine Heatmap zu generieren. Um den Datensatz für andere Funktionen zu organisieren, berechnen Sie die Pearson-Korrelationen zwischen jedem Gen, gefolgt von der Schmelzfunktion. Exportieren Sie diese Daten und laden Sie sie in eine Genkorrelationsnetzwerk-Software hoch.
Neuronen zeigten eine erhöhte Expression von NeuN und Mikrogliaproben zeigten eine signifikante Expression der Mikrogliamarker Cd34 und Cx3xr1. Die Th+-neuronalen Proben zeigten eine signifikant erhöhte Expression von Th im Vergleich zu Th-neuronalen und Mikroglia-Proben. Die Th-Neuronen zeigten eine signifikante Expression von Gcg, was darauf hindeutet, dass Th-neuronale Proben mit Neuronen angereichert sind, die Glp1 als Neurotransmitter verwenden.
Die lineare Diskriminationsanalyse zeigte, dass diese drei Zelltypen unterschiedliche Genexpressionsprofile über alle 65 Gene hinweg aufwiesen. Zelluläre Subphänotypen von Glp1-angereicherten Neuronenproben durch eine Alkoholentzugszeitreihe wurden mittels Heatmaps dargestellt. Der Subphänotyp A, der den entzündlichen Gencluster eins stark exprimiert, nimmt am achtstündigen Entzugszeitpunkt im Verhältnis zu und erreicht bei 32 Stunden Entzug ein Maximum.
Der entzündliche Subphänotyp wird normalisiert, um den Entzug von 176 Stunden zu kontrollieren. Subphänotyp B, der den GABA-Rezeptor-Gencluster zwei stark exprimiert, zeigt eine allgemeine Unterdrückung der Expression dieses Genclusters durch die 176-stündige Entzugsbedingung. Die Genexpression einzelner Proben wurde zu Mittelwerten kombiniert, so dass die Expression von Genclustern und der Proteinort dieses Gentranskripts über die Zeitreihen hinweg visualisiert werden konnten.
Diese Technik kann auf jedes biologische System oder Gewebe angewendet werden, um die zelluläre Reaktion auf eine Krankheit oder eine Störung zu verstehen. Das heißt, die molekulare Antwort bei Einzelzellauflösung in Bezug auf die räumliche und die anatomische Architektur des Gewebes zu entschlüsseln.
