Dieses Protokoll zeigt, wie wir das JBNm Schicht für Schicht auf molekularer Ebene zusammengesetzt und charakterisiert haben. JBNm kapselt TGF-B1 ein und verhindert seine Freisetzung im umgebenden Gewebe, wodurch die lokalisierte Chondrogenese gefördert wird. Die Bildung des JBNm ist standardisiert, so dass verschiedene JBNms für zukünftige Anwendungen gebildet werden können.
Die einzigartige Schicht-für-Schicht-Struktur ermöglicht eine Wachstumsfaktorverkapselung, wodurch eine stetige lokalisierte Freisetzung entsteht, die Hypertrophie vermeidet und das Wachstum aufrechterhält. JBNm bietet aufgrund seiner Injektionsfähigkeit eine homöostatische Mikroumgebung für die Regeneration von Knorpelgewebe an einem begrenzten Ort, die für verschiedene Szenarien wie unregelmäßig geformte Frakturen oder Hohlräume verwendet werden kann. Um zu beginnen, fügen Sie acht Mikroliter von einem Milligramm pro Milliliter TGF-B1, suspendiert in Wasser zu 32 Mikrolitern von einem Milligramm pro Milliliter Matrilin-3 in Wasser suspendiert.
Pipetten, um das richtige Mischen dieser Proteine zu gewährleisten. Fügen Sie 80 Mikroliter von einem Milligramm pro Milliliter hinzu. Janus Base Nanotubes, oder JBNts suspendiert in Wasser, zur TGF-B1, Matrilin-3 Lösung.
Pipetten Sie wiederholt, um eine ordnungsgemäße Mischung zu gewährleisten. Für die JBNt-Gruppe fügen Sie fünf Mikroliter von einem Milligramm pro Milliliter, JBNts zu 50 Mikrolitern Wasser hinzu, um eine 90,9 Mikrogramm pro Milliliter Lösung zu erhalten. Für die Matrilin-3-Gruppe fügen Sie 40 Mikroliter von 10 Mikrogramm pro Milliliter Matrilin-3 zu 15 Mikrolitern Wasser hinzu, um eine Lösung von 7,3 Mikrogramm pro Milliliter herzustellen.
Für die TGF-B1-Gruppe fügen Sie 10 Mikroliter von 10 Mikrogramm pro Milliliter TGF-B1 zu 45 Mikrolitern Wasser hinzu, um eine Lösung von 1,8 Mikrogramm pro Milliliter herzustellen. Für die Janus Base Nano-Matrix oder JBNm-Gruppe fügen Sie 40 Mikroliter von 10 Mikrogramm pro Milliliter, Matrilin-3 bis 10 Mikroliter von 10 Mikrogramm pro Milliliter TGF-B1 hinzu. Rühren, um eine ordnungsgemäße Mischung zu gewährleisten.
Dann fügen Sie der Lösung fünf Mikroliter von einem Milligramm pro Milliliter JBNts hinzu und pipettieren Sie wiederholt, um die Probe zu mischen. Messen Sie mit einem Spektralphotometer das Absorptionsspektrum jeder Gruppe. Kennzeichnen Sie den TGF-B1 mit einem Proteinmarkierungskit gemäß den Anweisungen des Herstellers.
Fügen Sie 20 Mikroliter von 20 Mikrogramm pro Milliliter, gekennzeichnet mit TGF-B1, zu 25 Mikrolitern Wasser hinzu, um eine 8,9 Mikrogramm pro Milliliter Testlösung zu erhalten. Beschriften Sie den Matrilin-3 mit einem separaten Beschriftungskit. Fügen Sie 20 Mikroliter von 80 Mikrogramm pro Milliliter markiertem Matrilin-3 zu 25 Mikrolitern Wasser hinzu, um eine Testlösung von 36 Mikrogramm pro Milliliter herzustellen.
Mischen Sie 20 Mikroliter von 80 Mikrogramm pro Milliliter markiertem Matrilin-3 mit 20 Mikrolitern von 20 Mikrogramm pro Milliliter markiertem TGF-B1 und fünf Mikrolitern Wasser, was zu einer markierten TGF-B1, Matrilin-3-Verbindung führt. Pipetten Sie die Mischung mehrmals, um sie zu mischen. Fügen Sie fünf Mikroliter von einem Milligramm pro Milliliter JBNts zu 40 Mikrolitern Wasser hinzu, was zu einer Lösung von 111 Mikrogramm pro Milliliter führt.
Dann fügen Sie fünf Mikroliter von einem Milligramm pro Milliliter JBNts zu der markierten TGF-B1, Matrilin-3-Lösung hinzu und pipetten Sie wiederholt, um die Verbindung zu mischen. Übertragen Sie jede Probengruppe in die Vertiefung einer schwarzen 384-Well-Platte. Laden Sie die Platte in einen Multimode-Mikroplattenleser und messen Sie bei Anregungswellenlängen von 488 und 555 Nanometern gemäß den Protokollen des Herstellers.
Unter physiologischen Bedingungen war das Zetapotentialspektrum von Matrilin-3 aufgrund seines isoelektrischen Punktes negativ geladen. Nach der Zugabe des TGF-B1 zum Matrilin-3 stieg das Zetapotential der TGF-B1 Matrilin-3-Verbindung auf einen nahezu neutralen Wert. Das Zetapotential von JBNm war das höchste unter den drei Gruppen.
Die UV-sichtbaren Absorptionsspektren bestätigten die Bildung der hierarchischen Schicht-für-Schicht-Innenstruktur des JBNm, der aromatischen Ringe der Lysinseitenketten und der JBNts trugen mit 220 bzw. 280 Nanometern zu den Absorptionsspitzen bei. TEM wurde verwendet, um die Morphologie der JBNts und JBNm zu charakterisieren. Nach der Kombination mit Proteinen wurden dicke Bündel von JBNm beobachtet, die eine Gerüststruktur bildeten.
Die Fluoreszenzmikroskopie bestätigte das Vorhandensein der Schichtstruktur und demonstrierte den Querschnitt des JBNm. Nach der Markierung umhüllte das rot fluoreszierende Matrilin-3 die JBNt-Bündel und bildete die äußere Schicht des JBNm, während das grün fluoreszierende TGF-B1 eine innere Schicht bildete. Der Fluoreszenzresonanzenergietransfer zeigte Emissionsspitzen bei 520 Nanometern für markierte TGF-B1-Gruppen und 570 Nanometer für Matrilin-3-Gruppen.
Die Wirkung von JBNm auf die Adhäsion und Zellproliferation von HMSC wurde untersucht. Der JBNm zeigte, dass HMSCs zusammen mit sich selbst gruppiert waren, während weniger Zellen an JBNts hafteten. Die Ausrichtung der Zellen und die Größe der Zellen auf dem JBNm zeigten, dass JBNts eine Rolle bei der Zelladhäsion spielten, während die Proteine die Affinität der Zelladhäsion erhöhten.
Nach dem ersten Tag der Zellkultur zeigten die JBNm- und TGF-B1-Gruppen im Vergleich zu den anderen Gruppen eine signifikante Zellproliferation. Wenn die Zellstrukturdauer auf drei und fünf Tage erhöht wurde, zeigten die JBNm- und TGF-B1-Gruppen eine noch erhöhte Zellproliferation. Bei der fluoreszierenden Markierung des JBNm ist es wichtig, dass TGF-B1 und Matrilin-3 vor dem Hinzufügen der JBNts einzeln markiert und gemischt werden, um eine korrekte Bildung der Schichtstruktur zu ermöglichen.
Eine weitere Beurteilung des Gerüsts kann ein Verständnis dafür liefern, wie sie bei therapeutischen Behandlungen wirksam sind. Genauer gesagt kann ein Hochdurchsatz-Proliferationstest die optimale Dosierung in vitro und später in vivo bestimmen. Diese neuartige NanoMatriX-Kreation ermöglicht es Forschern, ein injizierbares Gerüst auf Nanomaterialbasis zur Regeneration von Knorpel zu verwenden.
Dieser Poly-Nachahmungsansatz ermöglicht eine verbesserte Androgenese und die Verbreitung von Gegenstellen.
