Dieses Protokoll kann verwendet werden, um die Integrität und Plastizität einer neuromuskulären Verbindung unter normalen und pathologischen Bedingungen zu bewerten. Diese Technik dient dazu, die Schwann-Zellen und die Tiere vor und nach dem Labor gleichzeitig auf einzelnen Muskelabschnitten zu markieren. Nachdem Sie die erwachsene männliche Ratte eingeschläfert haben, legen Sie die Ratte in die Kapuze und öffnen Sie die Brusthöhle, um mit einer Schere und einer Zange auf das Herz zuzugreifen.
Führen Sie einen intravenösen Katheter aus dem linken Herzventrikel in Richtung Aorta ein und schneiden Sie das rechte Orakel ab. Als nächstes beginnen Sie die Perfusion mit 100 Millilitern 0,9% normaler Kochsalzlösung, bis das Blut, das aus dem rechten Orakel austritt, klar ist. Dann perfusionieren Sie weiter mit 250 bis 300 Millilitern 4% Paraformaldehyd in 0,1 molaren Phosphatpuffer oder PB pH 7,4 für 10 Minuten.
Entfernen Sie nach der Durchblutung die Haut der bilateralen Hintergliedmaße mit einer chirurgischen Klinge und legen Sie den beidseitigen Ischiasnerv und den Musculus gastrocnemius medialis frei. Sezieren Sie den beidseitigen medialen Gastrocnemius-Muskel vorsichtig von der Hinterextremität mit einer Klinge ab und postfixieren Sie den gesamten Muskel in 10 Millilitern 4% Paraformaldehyd. Entfernen Sie nach zwei Stunden den Muskel aus der Lösung und kryoschützen Sie ihn in 10 Millilitern 25% Saccharose in 0,1 molaren PB für einen Tag bei vier Grad Celsius.
Sobald das Muskelgewebe in die Saccharoselösung eingetaucht ist, fixieren Sie es auf einem Gefriertisch eines gleitenden Mikrotomsystems mit einem gefrorenen Schnittmedium. Schneiden Sie den Muskel horizontal entlang der Längsachse des Muskels in der Dicke von 80 Mikron. Platzieren Sie mit einem Pinsel sieben Kryoabschnitte pro Bohrloch in geordneter Weise in einer Kulturplatte mit sechs Bohrlöchern und 10 Millilitern 0,1 molaren PB. Für die fluoreszierende Färbung inkubieren Sie vier Abschnitte pro Vertiefung mit 1,5 Millilitern 0,1 molaren PB, die 75 Mikroliter 10% Triton X 100 und 45 Mikroliter normales Eselserum auf einem Orbitalschüttler bei 20 U / min enthalten.
Nach 30 Minuten die Abschnitte in 1,5 Milliliter einer Mischlösung aus primären Antikörpern mit Kaninchen-Anti-Neuro-Filament 200, Ziegen-antivesikulärem Acetylcholin-Transporter in 0,1 molaren PB, in 1% normalem Eselserum und 0,5% Triton X 100 überführen und über Nacht bei vier Grad Celsius inkubieren. Waschen Sie die Abschnitte am nächsten Tag dreimal für jeweils fünf Minuten in 0,1 molaren PB on im Orbitalschüttler bei 20 U / min. Nach der letzten Wäsche den Abschnitt in einer Mischlösung aus sekundären Antikörpern, die Esels-Anti-Kaninchen-AF 488 und Esel-Anti-Ziegen-AF 546 enthalten, sowie die Biomarker von Alpha-Bungaro-Toxin AF 647 und Phalloidin 350, enthaltend in 0,1 M PB enthaltend 1%normales Eselserum und 0,5 Triton x 100 für eine Stunde, Schutz vor Licht.
Nach der Inkubation waschen Sie die Abschnitte in PB und montieren Sie sie auf einem Objektträger. Tragen Sie das Deckglas mit 50% Glycerin in destilliertem Wasser auf den Abschnitt auf. Beobachten und bebildern Sie die Probe mit einem konfokalen Bildgebungssystem, das mit einer 20-fachen subjektiven Linse mit einer numerischen Blende von 0,75 und einer 40-fachen Linse mit einer numerischen Blende von 0,95 ausgestattet ist.
Für die Mehrfachfluoreszenzbildgebung legen Sie die Anregungs- und Emissionswellenlängen jedes Biomarkers fest, wie im Textmanuskript beschrieben. Stellen Sie die Auflösung der Bilderfassung auf 640 x 640 Pixel ein. Legen Sie als Nächstes die Start- und Endfokalebene fest.
Stellen Sie die Schrittweite auf einen oder zwei Mikrometer ein. Wählen Sie dann Tiefenmuster, Bilderfassung und Z-Serie. Für die Bilder mit geringerer Vergrößerung bei 20 X erfassen Sie 40-Z-Stapelbilder in zwei Mikrometern Schrittgröße mit einem 105-Mikron-Loch.
Wählen Sie den Projektions- oder Topographiemodus und die Intensitätsprojektion über die Z-Achse, um alle Bilder in einem einzigen Fokus zu integrieren. Für die Bilder mit höherer Vergrößerung bei 40 X erfassen Sie 80-Z-Stapelbilder in einer Schrittgröße von einem Mikrometer, wobei der Zoom auf zwei und ein 105-Mikron-Loch eingestellt ist. Integrieren Sie alle Bilder in einem einzigen Fokus.
Rekonstruieren Sie die Bilder im dreidimensionalen Muster mit dem Bildverarbeitungssystem. Die repräsentative räumliche Korrelation des Musculus gastrocnemius medialis mit Neurofilament 200 positiven Nervenfasern, vesikulären Acetylcholintransporter-positiven präsynaptischen Terminalen, alpha-Bungarotoxin-positiven postsynaptischen Acetylcholinrezeptoren, S100-positiven perisynaptischen Schwann-Zellen, phalloidinpositiven Muskelfasern und DAPI-markierten Zellkernen wird hier gezeigt. Das Neurofilament 200 positive Nervenfasern liefen im Bündel.
Diese Nervenfasern verzweigten die vesikulären Acetylcholin-Transporter-positiven präsynaptischen Terminals, die eine Spiegelbeziehung mit den alpha-Bungaro-Toxin-positiven postsynaptischen Acetylcholinrezeptoren bildeten. Zusätzlich wurden die S100-positiven perisynaptischen Schwann-Zellen um das Neurofilament 200 positive Nervenfasern in der Nähe der präsynaptischen Terminals nachgewiesen. Die räumliche Korrelation wurde weiter in einem dreidimensionalen Muster gezeigt, das die detaillierten morphologischen Eigenschaften der neuromuskulären Verbindung aus verschiedenen Perspektiven zeigt.
Um mehr Bildgebung in Muskelpartien zu beobachten, ist es wichtig, den Muskel horizontal entlang der Längsachse mit einer Dicke von 80 Mikron zu schneiden.
