Die Klarheitstechnik, die erstmals 2013 beschrieben wurde, ist eine Gewebereinigungstechnik, die die Probenahme größerer Mengen von Zellen, Blutgefäßen, also sogar Proteinen einer solchen Einzelzellauflösung in dicken Gehirnscheiben ermöglicht. Diese Technik ermöglicht die Untersuchung intakter mikroskopischer Strukturen, indem sie das gesamte Gehirn transparent macht. Dieses Protokoll ist ein einfacher Chip und eine unkomplizierte Pipeline für Tissue Clear.
Diese Technik kann zur Reinigung von Geweben in anderen Systemen zusätzlich zu Gehirngewebe verwendet werden. Um zu beginnen, verschließen Sie das Rohr und die Kappe mit Parafilm und durchstechen Sie zwei Löcher in die Kappe. Übertragen Sie dann Stickstoffgas aus dem Tank mit einem flexiblen Rohr mit einem Innendurchmesser von fünf Millimetern und einer 19-Gauge-Nadel, die an seinem Ende angeschlossen ist.
Beginnen Sie mit der Entgasung, indem Sie das Rohr am Rohr befestigen und den Gasaustausch für 30 Minuten bei Raumtemperatur ermöglichen. Lösen Sie das Rohr und schließen Sie die Löcher sofort mit Modelliermasse ab. Dann die entgasungsversiegelten Röhrchen für 3 1/2 Stunden in ein 37 Grad Celsius-Bad geben, um die Hydrogellösung zu polymerisieren.
Nimm das Gehirn aus der Röhre heraus. Entfernen Sie mit Labortüchern das polymerisierte Hydrogel um das Gehirn herum, um sicherzustellen, dass kein Restgel an der Oberfläche des Gehirns haftet. Teilen Sie das Gehirn in dicke Scheiben, die alle Bereiche von Interesse enthalten.
Legen Sie die Scheiben in die erste Räumlösung und inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius mit Rotation bei 70 U / min für 24 Stunden. Bereiten Sie in der Zwischenzeit einen perforierten Schlauch vor, um das Gehirn zu platzieren. Legen Sie das perforierte Rohr in ein mit zweiter Räumlösung gefülltes Becherglas auf eine Rührvorrichtung.
Legen Sie dann das Gehirn in das Becherglas und versiegeln Sie es mit Aluminiumfolie, um ein Bleichen zu verhindern. Nachdem das Gewebe transparent geworden ist, übertragen Sie das Gehirn in PBST und inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius mit einer Rotation bei 70 U / min für 24 Stunden. Ersetzen Sie die Lösung durch frisches PBST und setzen Sie die Inkubation für weitere 24 Stunden fort.
Übertragen Sie dann das Gehirn 24 Stunden lang bei Raumtemperatur auf PBS. Entfernen Sie nach 24 Stunden das Gehirn von PBS und übertragen Sie es auf die Brechungsindex-Matching-Lösung. Inkubieren Sie das Gehirn bei 37 Grad Celsius über Nacht.
Platzieren Sie die Probe zunächst in der Mitte des Objektträgers. Erstellen Sie mit Heißkleber Wände an den Rändern des Objektträgers, die fast so hoch sind wie das Gewebe. Achten Sie darauf, eine kleine Lücke an einer der Ecken zu lassen.
Wenn sich die Heißklebeschicht der Höhe der Gehirnscheibe nähert, tragen Sie ein bis zwei Tropfen der Brechungsindex-Matching-Lösung auf die Probe auf, um die obere Oberfläche zu befeuchten und die Bildung von Blasen zu verhindern. Während der Heißkleber noch flüssig ist, verschließen Sie die Oberseite mit einem Deckschlitten, legen Sie sie so gleichmäßig wie möglich und füllen Sie dann die Kammer mit der Brechungsindex-Matching-Lösung. Schließen Sie die Lücke mit Heißkleber.
Wenn die Heißklebewände über die Ränder des Objektträgers hinausragen, schneiden Sie die ausladenden Kanten ab. Wenn ein Öltauchobjektiv für die Bildgebung verwendet wird, fügen Sie weitere zwei bis drei Millimeter Kleber an die Wände über dem Deckglas hinzu, um die Tauchlösung zu erhalten. Nach diesem Protokoll wird das Hirngewebe gereinigt.
Mit diesem Protokoll wurden klare Gehirnschnitte hergestellt, um Populationen von Astrozyten und Neuronen in der CA1-Region des Hippocampus der Maus zu visualisieren. Alle Astrozyten exprimierten tdTomaten und exzitatorische Neuronen exprimierten H2B-GFP in ihren Kernen. Die für das geklärte Gewebe vorbereitete Kammer war optimal für die Bildgebung unter einem Zwei-Photonen- oder Konfokalmikroskop.
Mit einem Zwei-Photonen-Mikroskop wurden über 300 Astrozyten in einem geräumten Abschnitt der CA1-Region des Hippocampus der Maus beobachtet. Die Hippocampus-Astrozyten in roten und pyramidalen Zellen, Somata in Grün waren sichtbares und dickes, transparentes Gewebe, das die räumliche Nähe zwischen diesen beiden Zelltypen darstellte. Mit einem konfokalen Rasterlasermikroskop wurden axonale Bündel von exzitatorischen Neuronen über eine ganze Hemisphäre verfolgt.
Grüne Bündel wurden vom dorsalen Hippocampus in Richtung der Supermamillarkörper verfolgt. Die roten Bündel wurden von den Brustkörpern bis zu ihrem Ursprung am Hippocampus der Entlüftung verfolgt. Faktoren wie Temperatur, Konzentrationen und Inkubationszeit beeinflussten das Ergebnis des Klarheitsverfahrens.
Daher ist die Präzision in jedem Schritt des Protokolls entscheidend für den Erfolg, klares Gewebe zu erreichen. Mit dieser Technik messen wir die Abstände zwischen Neuronen und Astrozyten in mehreren Gehirnstrukturen. Dieses Protokoll ermöglichte die Analyse von zwei bis drei Größenordnungen mehr Zellen als in früheren Studien.
