Wie unser Protokoll zeigt, können CRISPR CasRx-Technologien verwendet werden, um ubiquitäre und gewebespezifische Reduktionen von Gentranskripten bei Fruchtfliegen zu erreichen. Unsere Technik bietet ein Starterpaket für alle, die daran interessiert sind, CRISPR-basierte Gentranskriptreduktion in Fruchtfliegen zu verwenden und gleichzeitig mit weiterer Anpassung und Optimierung kompatibel zu sein. Um ein allgegenwärtiges In-vivo-RNA-Targeting mit einem Zwei-Komponenten-CasRx-System einzurichten, sammeln Sie 10 jungfräuliche erwachsene weibliche Fliegen aus der homozygoten gRNA-Linie von Interesse und fünf erwachsene männliche Fliegen aus dem ausgewogenen heterozygoten Ubiq CasRx CurlyO.
Legen Sie die Elternfliegen in eine Durchstechflasche, die mit 100 Mikrogramm Trockenhefepulver ergänzt wird, und ziehen Sie die Fläschchen 48 Stunden bei 26 Grad Celsius auf. Beobachten Sie die Fläschchen jeden Tag, um zu sehen, ob neue erwachsene Nachkommen aus dem Schamhaar der F1-Generation hervorgegangen sind, und betäuben Sie jeden Erwachsenen 10 Sekunden lang mit Kohlendioxid. Sobald die Fliegen unbeweglich werden, leeren Sie das Fläschchen auf ein Fliegenpolster, das mit dem Kohlendioxidtank mit kontinuierlichem Kohlendioxid verbunden ist, und verwenden Sie eine Farbkamera, die mit einem fluoreszierenden Stereomikroskop verbunden ist, um die Phänotypen der Fliegen zu bewerten und abzubilden.
Zählen Sie dann die Anzahl der Nachkommen mit verschiedenen Phänotypen entsprechend der fluoreszierenden Signalexpression. Basierend auf der Mendelschen Genetik wird erwartet, dass 50% der Nachkommen die Ziel-RNA exprimieren. Beachten Sie, dass die Toxizität des Ubiq CasRx-Systems das Verhältnis der zielgerichteten RNA, die Nachkommen exprimiert, auf weniger als 50% reduzieren kann. Um ein allgegenwärtiges in vivo exogenes RNA-Targeting mit einem Drei-Komponenten-CasRx-System einzurichten, sammeln Sie acht bis 10 virgin adulte weibliche Fliegen aus einer dualen Luciferase-Exprimationslinie und vier bis fünf erwachsene männliche Fliegen aus dem ausgewogenen heterozygoten Ubiq CasRx Curly plus TM6. STB-Linie, die gleichzeitig weiße Augen, lockige Flügel und ds rote Fluoreszenz aufweist.
Legen Sie den elterlichen Schritt eins cross-by in eine Durchstechflasche, die mit 100 Mikrogramm Trockenhefepulver ergänzt wird, und ziehen Sie dieses Kreuz für 48 Stunden bei 26 Grad Celsius auf. Entfernen Sie am Ende der Inkubation alle Elternfliegen aus jeder Durchstechflasche und bringen Sie die Fläschchen für mindestens 14 Tage in den 26 Grad Celsius heißen Inkubator zurück. Im Laufe von 14 Tagen, wie bereits erwähnt, sammeln Sie acht bis 10 weibliche Jungfrauen aus der homozygoten Glühwürmchen-Luciferase, die dreimal auf die gRNA-Linie abzielt.
Beobachten Sie jeden Tag die Schritt-eins-Durchstechflaschen, um zu sehen, ob neue erwachsene Nachkommen aus den Puppen hervorgegangen sind, die mit Kohlendioxid betäubt werden, um die Sammlung von vier bis fünf männlichen Fliegen zu ermöglichen, die sowohl den Ubiq CasRx als auch den dualen Luciferase-Reporter als verfügbar ausdrücken. Legen Sie die Fliegen in eine neue Durchstechflasche mit 10 Virgin-Weibchen aus der Fruchtfliegen-Luciferase,die auf die gRNA-Linie abzielt, und platzieren Sie diese Schritt-zwei-Kreuze bei 26 Grad Celsius für 48 Stunden. Sammeln Sie weitere fünf einen Tag alte Männchen, die sowohl den Ubiq CasRx als auch den Dual-Luciferase-Reporter aus dem Schritt-eins-Kreuzfläschchen ausdrücken, und inkubieren Sie die Fliegen für zwei bis vier Tage allein bei 26 Grad Celsius, bevor Sie sie in eine 1,5-Milliliter-Zentrifuge für minus 80 Grad Celsius übertragen.
Entfernen Sie am Ende der Inkubation alle elterlichen Fläschchen von jedem der beiden Kreuzfläschchen der Stufe zwei. Und geben Sie die Fläschchen für mindestens 20 Tage in den 26 Grad Celsius heißen Inkubator zurück. Beobachten Sie jeden Tag die Schritt-Zwei-Kreuzfläschchen, um zu sehen, ob neue erwachsene Nachkommen aus dem Schambein hervorgegangen sind, betäuben Sie die Fliegen mit Kohlendioxid, sobald sie verfügbar sind, und bewerten und bilden Sie ihre Phänotypen ab, wie gezeigt.
Die Mendelsche Genetik legt nahe, dass, wenn alle Fliegen lebensfähig sind, 25% der Nachkommen die Ziel-RNA exprimieren sollten. Um einen Luciferase-Assay durchzuführen, erzeugen Sie die dreifach trans heterozygoten Fliegen sowie die Kontrollfliegen wie demonstriert. Sammeln Sie die männlichen Fliegen bei der Geburt und altern Sie sie bis zum Alter von drei Tagen.
Übertragen Sie die drei Tage alten Fliegen in 1,5 Milliliter Zentrifugenröhrchen und lysieren Sie sie mit einem Puffer im Luciferase-Lysepuffer aus einem handelsüblichen Luciferase-Assay-Kit. Verwenden Sie dann fünf Mikroliter lysiertes Gewebe aus jeder Probe und jedem Luminometer, um sowohl die Fruchtfliegen als auch die Luciferase-Aktivität gemäß den Standard-Luciferase-Assay-Protokollen zu messen. F1, trans heterozygotes CasRx, haben signifikant niedrigere Überlebensraten im Vergleich zu trans heterozygoten dCasRx-Fliegen.
Die U6 gRNA Y heterozygoten Fliegen bestätigen die Toxizität des Ubiq CasRx-Systems der drei Zielgene und sind nicht lebensfähig und wachsen nicht über das zweite Larvenstadium hinaus. Die überlebenden Ubq CasRx und U6 gRNA W heterozygoten Fliegen zeigen einen ausgeprägten vollständig durchdringenden Phänotyp mit großen Augen. Darüber hinaus wird auch eine signifikante Reduktion der Zielgentranskripte für drei Zielgene beobachtet.
Hinweise auf eine durch CasRx induzierte Off-Target-Aktivität werden auch beobachtet, wenn differentiell exprimierte Transkripte zwischen Proben von CasRx-exprimierenden Fliegen und Proben von dCasRx-exprimierenden Fliegen verglichen werden. Im Zwei-Stufen-Kreuz führt nur die Kombination aller drei Trans-Gene zu einer 100%igen Letalität. Wenn gewebespezifisches RNA-Targeting mit einem Drei-Komponenten-CasRx-Systemdesign verwendet wird, wird das Toxizitätsniveau reduziert, wenn die Gesamtex-CasRx-Expression mit dem UAST-Promotor im Vergleich zu der des Ubiq-Promotors gesenkt wird.
Es ist wichtig, den genetischen Prozess mit Fliegen des richtigen Geschlechts und korrekter Phänotypen richtig einzurichten.
