Dies ist ein Kristallisationsprotokoll, das entwickelt wurde, um das Wachstum eines Proteinkristalls zu optimieren und gleichzeitig das Protein mit einem Phasing-Molekül zu leiten, um die Struktur eines Proteins durch Röntgenkristallographie zu bestimmen. Um die Röntgenkristallstruktur eines völlig neuartigen Proteins zu bestimmen, werden die Kristallisationsbedingungen optimiert, um Hochwertigekristalle zu erzeugen. Bei einem völlig neuartigen Protein müssen schwere Atome in den Kristall eingeführt werden, um einen derivatisierten Kristall zu erzeugen.
Röntgenbeugungsdaten werden aus dem derivatisierten Kristall gesammelt und müssen rechnerisch gelöst werden, um eine Röntgenkristallstruktur zu erzeugen. Kristallisation und Ableitung sind beides mühsame Prozesse. Um diese Engpässe zu beheben, haben wir ein optimiertes Screening-Verfahren entwickelt, das beide Ziele gleichzeitig erreicht.
Dieses Protokoll verwendet eine zuvor entwickelte Technik, die als zufälliges Mikrosaat-Matrix-Screening bekannt ist. Kristalle oder kristalliner Niederschlag werden zu Mikrosaaten zerkleinert, die verwendet werden können, um das Kristallwachstum unter völlig unabhängigen Bedingungen zu beginnen. Gleichzeitig führen wir ein Phasing-Molekül namens I3C in den Kristallisationszustand ein.
Dieses Molekül liefert ein großes anomales Signal, das es ermöglicht, die Struktur durch eine einzige Wellenlänge anomale Diskussion Phasing gelöst werden. Für Anwender, die mit der experimentellen Dimensionierung von Kristallstrukturen nicht vertraut sind, stellen wir eine benutzerfreundliche Software-Pipeline vor, um die Strukturlösung teilweise zu automatisieren, die sie an das anomale Signal von I3C anpasst. Der erste Schritt besteht darin, eine I3C-Aktie zu erstellen.
Messen Sie 120 Milligramm I3C in ein Mikrozentrifugenrohr. Fügen Sie dem Mikrozentrifugenrohr 200 Mikroliter zwei molares Lithiumhydroxid hinzu. Das Erhitzen des Rohres bei 40 bis 60 Grad und Wirbel können verwendet werden, um die Auflösung zu fördern.
Der einzige Molvorrat an Lithium I3C Lösung sollte braun sein. Zwei Methoden können verwendet werden, um I3C in den Proteinbestand einzuführen. Lithium I3C kann direkt in den Proteinbestand aufgenommen werden.
3,75 Mikroliter bis 30 Mikroliter I3C können 150 Mikroliter Protein zugesetzt werden, um eine Konzentration zwischen fünf und 14 Millimolar zu ergeben. Einige Proteine können bei Kontakt mit hohen Konzentrationen von I3C ausfallen. In diesen Fällen kann Lithium I3C einem Proteinverdünnungspuffer zugesetzt werden, der puffert und das Probenprotein auf eine Endkonzentration zwischen 10 und 80 Millimolar abgestimmt hat.
150 Mikroliter des Proteinverdünnungspuffers zu 150 Mikrolitern Proteinprobe hinzufügen. Eine Glassonde zum Zerkleinern von Kristallen besteht aus einer Glaspasteurpipette. Mit einem Bunsenbrenner auf der blauen Flamme die Pasteurpipette in die Mitte erhitzen.
Mit einer Pinzette ziehen Sie die Enden der Pasteur Pipette in einen dünnen Durchmesser von weniger als 0,3 Millimetern. Halten Sie dieses Segment in der Flamme, um die Pipette an dieser Stelle zu trennen und um das Ende der Pipette zu runden, um die Glassonde zu beenden. Dies ist ein Beispiel dafür, wie die Glaspipette aussehen sollte.
Kristall-Crushes können auch von Drittanbietern als Alternative zur Herstellung Ihres eigenen A-Mikrosaat-Bestands bestellt werden, der durch Zerkleinern von Proteinkristallen oder kristallinem Niederschlag erzeugt wird. Fünf 1,5 ml Mikrozentrifugenrohre auf Eis legen. Wählen Sie unter einem Lichtmikroskop die besten Morphologiekristalle oder kristallinen Niederschlag aus, die geopfert werden können.
Für 96 brunnenkristallisationsschalen öffnen sie den Brunnen durch Schneiden des Kunststoff-Dichtungsbandes. Zum Aufhängen von Fallschalen kann der Deckelschlupf mit einer Pinzette entfernt und auf eine flache Oberfläche gedreht werden. 70 Mikroliter Reservoirlösung auf eines der Mikrozentrifugenrohre übertragen und auf Eis kühlen.
Auf die restlichen Röhren, übertragen 90 Mikroliter Reservoir-Lösung auf sie und kehren sie zu Eis zu kühlen. Bei ausreichendem Reservoirvolumen kann durch Mischen der entsprechenden Reagenzien ein Kristallisationsreservoir hergestellt und stattdessen verwendet werden. Die Kristalle im Kristallisationstropfen mit der Glassonde gründlich zerkleinern.
Der Fortschritt kann unter dem Mikroskop überwacht werden, bis keine Kristalle oder kristallines Material sichtbar sind. Übertragen Sie die gesamte Flüssigkeit aus dem Tropfen in das Mikrozentrifugenrohr mit 70 Mikroliter Reservoirlösung. Mischen Sie durch Pipettieren nach oben und unten.
Zwei bis drei Mikroliter Mischung zurück in den Brunnen geben und den Brunnen durch Pipettieren nach oben und unten abspülen. Übertragen Sie das Gemisch zurück in das Mikrozentrifugenrohr. Dieser Spülschritt sollte noch einmal wiederholt werden.
Das Mikrozentrifugenrohr sollte von diesem Punkt an kalt gehalten werden, um ein Schmelzen der Mikrosaaten zu vermeiden. Wirbeln Sie die Röhre bei maximaler Geschwindigkeit bei vier Grad für etwa drei Minuten kühlen die Röhre auf Eis regelmäßig, um eine Überhitzung zu verhindern. eine von 10 seriellen Verdünnungen des Saatgutbestands durch sequenzielle Übertragung von 10 Mikrolitern zwischen den Kühlbehälterlösungen.
Zwischen den Verdünnungen des Samenbestands sollte das Rohr gewirbelt werden. Saatgutvorräte, die nicht sofort verwendet werden, sollten in einem minus 80 Grad Ultra-Kühlschrank gelagert werden. Ein 96 gut zufälliger Mikrosaatmatrix-Bildschirm kann mit einem Flüssigkeitsdosierroboter eingerichtet werden.
Legen Sie den Samenbestand, die Protein-Lagerlösung, ergänzt durch I3C und den Kristallisationssieb im Roboter. Mit dem Roboter übertragen Sie 75 Mikroliter vom Kristallisationssieb auf das 96-Well-Tray. Fügen Sie dem Kristallisationstropfen einen Mikroliter und dem Reservoir 74 Mikroliter hinzu.
Übertragen Sie einen Mikroliter Protein, das mit I3C ergänzt wird, auf den Kristallisationstropfen. Übertragen Sie 0,1 Mikroliter Saatgut auf den Kristallisationsabfall. Versiegeln Sie die Platte mit Dichtband.
Hängende Fallgitter können in 24 gut hängenden Tropfenkristallisationsschalen aufgestellt werden. Fetten Sie die Ränder der hängenden Fallbrunnen. Übertragen Sie 500 Mikroliter Kristallisationslösung in das Reservoir.
In der Nähe der Mitte einer Glasabdeckung Schieben platzieren einen Ein-Mikroliter-Tropfen der Kristallisationslösung. Zu diesem Tropfen, fügen Sie einen Mikroliter Protein mit Lithium I3C und 0,1 Mikroliter Samenbestand ergänzt. Invertieren Sie den Deckelschlitten und versiegeln Sie die Kristallisation gut, indem Sie den Deckelschlitten in das Fett schieben.
Hängende Tropfen- und Dichttropfenschalen werden bei konstanter Temperatur inkubiert, damit sich Kristalle bilden können. Sie sollten regelmäßig unter dem Mikroskop auf Kristallwachstum untersucht werden. Nachdem Beugungsdaten erhalten, integriert und skaliert wurden, wie im beigefügten schriftlichen Protokoll erläutert, kann die automatische Kristallstrukturbestimmungspipeline Auto-Rickshaw verwendet werden, um das Phasenproblem zu lösen und das Protein zu modellieren.
Klicken Sie auf der Auto-Rickshaw-Zielseite auf die Schaltfläche "Weiterfahren". Geben Sie Ihre institutionelle E-Mail im Auto-Rickshaw-Webformular ein und klicken Sie auf Weiterfahren mit der Ausführung von Auto-Rickshaw. Für Proteine ohne Homologie moto Vorlage führen Sie das SAD-Protokoll von Auto-Rickshaw im erweiterten Modus.
Geben Sie die erforderlichen Parameter ein. Wählen Sie Protein als Molekültyp aus. Geben Sie die Wellenlänge der Datensammlung in angstroms ein.
So wie ich als Unterstrukturelement verwendet wurden Jodatome verwendet. Wählen Sie den Unterstrukturtyp I3C aus, um anzugeben, dass I3C das Phasing-Molekül war. Wählen Sie sub_direct als Unterstrukturbestimmungsmethode aus.
Wählen Sie drei als Anzahl der erwarteten Unterstrukturen pro Monomer aus. Geben Sie eine als Reservierungsschnitt der Unterstruktursuche ein. Dadurch kann Auto-Rickshaw automatisch einen geeigneten Auflösungsschnitt bestimmen.
Geben Sie die Anzahl der Rückstände in einem einzigen Monomer, die Raumgruppe des Datensatzes und die Anzahl der Moleküle in der asymmetrischen Einheit basierend auf dem Matthews-Koeffizienten ein. Wählen Sie die geeignete Verbreitungsstufe von Röntgendaten aus, die Ihren Anforderungen entspricht. Geben Sie die anomalen Daten als leere Set-Datei ein.
Geben Sie Ihre Proteinsequenz als SEQ-, PIR- oder TXT-Datei ein. Geben Sie Ihre institutionelle E-Mail-Adresse ein. Die Ergebnisse werden Ihnen über einen Weblink an die angegebene E-Mail-Adresse übermittelt.
Wenn Auto-Rickshaw die Struktur nicht mithilfe der festgelegten Unterstruktur löst, die die Unterstruktur validiert, könnte dies bei der Fehlerbehebung bei der Lösung der Lösung bei der Fehlerbehebung helfen. Laden Sie die Liste der schweren Atom-Sites von der Auto-Rickshaw-Ergebnisseite herunter. Es ist ein Hyperlink, der als schwere Atomstandorte bezeichnet wird.
Dadurch wird eine Textdatei mit den schweren Atom-Sites heruntergeladen. Ändern Sie die Dateierweiterung der Datei von txt in pdb. Öffnen Sie die pdb-Datei in Coot.
Aktivieren Sie die Symmetrie, um alle schweren Atome benachbarter asymmetrischer Einheiten zu sehen. Messen Sie die Abstände zwischen den schweren Atomen, auch über asymmetrische Einheiten hinweg. I3C erscheint als gleichseitiges Dreieck mit einer Seitenlänge von sechs Angstroms.
Das Vorhandensein eines Dreiecks mit diesen Dimensionen zeigt an, dass die Platzierungen dieser schweren Atome korrekt sind. Wenn die Auto-Rickshaw-Unterstruktur falsch ist, können andere Auto-Rickshaw-Einstellungen wie im geschriebenen Protokoll beschrieben getestet werden. Die I3C RMMS-Methode wurde an zwei Proteinen getestet, dem Hühnereiweiß-Lysozym mit dem in HT-Bildschirm von Hampton Research und der Domäne des Orf11-Lysinproteins aus Bakteriophagen P68.
Für jedes Protein wurden vollständige Bildschirme eingerichtet, die dem Kontrollbildschirm ohne I3C oder Mikrosaat entsprechen, Bildschirm mit Mikrosaat hinzugefügt, Bildschirm mit I3C und schließlich der Bildschirm mit I3C und Microseed. Das Hinzufügen von I3C zu einem Kristallbildschirm scheint die Anzahl der Kristallisationstreffer nicht zu erhöhen. Bei Hühnereiweißlysozym sank die Zahl der Erkrankungen von 31 auf 26.
Mit der Orf11-Domäne wurde eine einzige Trefferbedingung im Kontrollbildschirm gefunden. Das Hinzufügen von I3C auf dem Bildschirm gab auch einen einzigen Treffer unter den gleichen Bedingungen. Die Zugabe von Mikrosaat zu dem Brunnen führte zu einer signifikanten Zunahme der Trefferbedingungen, was zu einer 2,1- bzw. sechsfachen Erhöhung für Hühnerei-Weiß-Lysozym bzw. die Orf11-Domäne führte.
Dieses Ergebnis stimmt mit anderen Studien überein, in der RMMS getestet werden. Am wichtigsten ist, dass das Hinzufügen von I3C und Mikrosaat zu einem Bildschirm auch die Anzahl der Trefferbedingungen relativ zum Kontrollbildschirm erhöhte, was eine 2,3- bzw. siebenfache Erhöhung für Hühnerei-Weiß-Lysozym bzw. die Orf11-Domäne zeigt. Dies zeigt, dass die I3C RMMS-Methode effizient neue Bedingungen für derivatisierte Kristalle erzeugen kann.
Kristalle aus diesen Bedingungen könnten geerntet und verwendet werden, um die Kristallstruktur zu lösen. Sowohl die Struktur der Henne Eiweiß Lysozyme Orf11 Domain konnte mit SAD-Phasing auf der Auto-Rickshaw-Pipeline gelöst werden, mit dem anomalen Signal von I3C zeigt eine erfolgreiche Derivitisierung durch den I3C RMMS Bildschirm. Wir haben ein einfaches und effizientes Protokoll zur Herstellung hochwertiger Kristalle vorgelegt, die mit dem Phasing Molekül I3C abgeführt werden.
Es minimiert die Anzahl der Siebe und kristallinen Handhabungsschritte und ist daher von besonderem Interesse für Strukturbiologen, die neuartige Proteine untersuchen. Wir empfehlen dringend, die Kristallgröße zu optimieren, indem verschiedene Verdünnungen des Saatgutbestands getestet werden, die während der Saatgutstoffaufbereitung hergestellt wurden. Und dieser Schritt ist abgeschlossen, nachdem die ersten Bildschirme abgeschlossen wurden.
I3C ist weit verbreitet und es ist kostengünstig zu kaufen und daher glauben wir, dass diese Methode in reichweite für die meisten strukturellen Biologie Laboratorien ist.
