Diese Forschung wurde durch Stipendien des National Defense Medical College und durch ein Forschungsstipendium für Gesundheits- und Arbeitswissenschaften für die Erforschung hartnäckiger Krankheiten vom Ministerium für Gesundheit, Arbeit und Wohlfahrt, Japan, unterstützt.

Das experimentelle Protokoll wurde vom Animal Research Committee des National Defense Medical College (Nr. 16058) genehmigt. Die Tiere wurden auf Standardlabor Chow (CLEA Japan Inc, Tokyo, Japan) gehalten. Die Labortiere wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien der National Institutes of Health behandelt.
1. Sammlung und Trennung von Lymphozyten
HINWEIS: Da Lymphozyten frisch sein müssen und nicht gelagert werden können, müssen sie für jedes Experiment von Ratten gesammelt werden. Darüber hinaus müssen darm-tropische Lymphozyten direkt aus dem Brustkanal gesammelt werden, wo sie zirkulieren. Es wird erwartet, dass alle Eingriffe innerhalb von 6 Stunden abgeschlossen sein werden und alle Instrumente, Handschuhe und Oberflächen sauber sind. Um die Tiere in einem physiologisch stabilen Zustand zu halten, sollten alle im Experiment verwendeten Salz- und anderen Flüssigkeiten warm gehalten werden.
<ol><li>Bilden Sie ein Konservenrohr (1 mm Durchmesser) wie eine Heparinkurve (ein Radius von ca. 5 mm), nachdem Sie es in heißes Wasser (ca. 80–90 °C) eintauchen, und fixieren Sie es mit Klebeband für einige Stunden im Voraus an einer Kunststoffplatte.</li>
	<li>Anästhetisieren Sie eine männliche Wistar-Ratte (8-12 Wochen) mit intraperitonealer Injektion einer Mischung aus Midazolam (2mg/kg), Domitor (0,15mg/kg) und Betulphar (2,5mg/kg) und schneiden Sie das Körperhaar des Bauches mit einem Haarschneider. Entfernen Sie das Haar fest nach der Rasur, so dass das Haar nicht in die Bauchhöhle.</li>
	<li>Nach der Bestätigung, dass die stabile Tiefe der Anästhesie für den Eingriff erforderlich ist, wird durch Zehenkneifen erhalten, machen Sie einen Schnitt mit chirurgischer Schere horizontal von der Mittellinie zum linken subcostalen Bereich. Achten Sie darauf, die Blutgefäße im parietalen Peritoneum nicht zu beschädigen, indem Sie die Gefäße unter Licht beobachten.</li>
	<li>Wickeln Sie den Magen mit nasser Gaze und bewegen Sie den Magen sanft nach rechts außerhalb des Körpers, um die retroperitonealen Organe zu offenbaren. Legen Sie eine Kerbe zwischen den Erector-Muskeln der Wirbelsäule und dem Fettgewebe mit chirurgischer Schere und trennen Sie sie unverblümt mit den Fingern.</li>
	<li>Das Bindegewebe um den Brustkanal vorsichtig abstreifen. Das überschüssige Bindegewebe nimmt mit dem Alter zu. Setzen Sie den Brustkanal direkt unter dem linken Krusten des Zwerchfells kauenal aus, bis eine Länge von 20 mm des Brustkanals sichtbar war. Mit Präzisionspinzette oder nassen Wattestäbchen trennen Sie die Adhäsionen zwischen Brustkorb und Aorta sanft.<ol>
<li>Führen Sie diesen Prozess sorgfältig durch, da einige Ratten Arteriolen haben, die sich von der Baucharterie verzweigen, die sich über den Brustkanal kreuzen, oder einen kurzen Brustkanal aufgrund einer höheren Position des Lymphplexus (kleine Thoraxkanäle, die sich wie Spinnennetze ausbreiten). Vermeiden Sie unnötigen Kontakt mit dem Brustkanal, um ödeme zu vermeiden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tragen Sie eine Ligatur durch eine Schnur (3-0 Seide) auf den Brustkanal direkt unter dem linken Kruste des Zwerchfells auf. Der kaudale Thoraxkanal wird distended.</li>
	<li>Machen Sie ein Loch (5 mm Durchmesser) in der Bauchwand, indem Sie die Schneide der chirurgischen Schere stechen, das haargekrümmte Kanulationsrohr passieren und das Rohr an einer Stelle auf den Iliopsoas-Muskel legen. Füllen Sie das Cannulationsrohr mit normaler Salin, die 10 U/ml Heparin enthält.</li>
	<li>Nachdem Sie eine Schnur (3-0 Seide) unter den distended Thoraxkanal gesetzt haben, stechen Sie den Brustkanal mit der scharf geschnittenen Kante eines Kanulationsrohrs, können Sie ihn etwa 5 mm in Richtung des Schwanzes anbringen und den Brustkanal zur Fixierung mit einem Kanulationsrohr aufstellen.</li>
	<li>Um Die Saline zur Vermeidung von Austrocknung zu liefern, erstellen Sie ein Loch (3 mm Durchmesser) an der vorderen Wand des Magens mit präzisionspräziser Pinzette und übergeben Sie das Siliziumrohr (2 mm Durchmesser) durch den Pyloric-Ring an das Zwölffingerdarm. Nachdem Sie eine Wunde genäht und die Tiere in Bollmans Käfigen gehalten haben, beginnen Sie, zuckerhaltige Salzwäsche aus dem Siliziumrohr mit einer Durchflussrate von 3 ml/h in das Zwölffingerdarm jeder Ratte einzufließen. Bedecken Sie den gesamten Käfig mit einem Papiertuch, um ihn warm zu halten.</li>
	<li>Fixieren Sie das Konservenrohr am Loch in der Mitte des Deckels eines 50-ml-Koninusrohrs auf Eis, das 6 U/ml Heparin, 10% fetales Rinderserum und RPMI 1640 medium (pH 7.4; siehe Materialtabelle) enthält, und sammeln Sie thorakale Kanallymphozyten (TDLs) auf Eis. Achten Sie darauf, die Spitze des Rohres nicht an die Wand des konischen Rohres zu kontaktieren, um Kanülenrohrverschluss durch Fibringerbildung im Inneren des Rohres zu verhindern. Lymphflüssigkeit (ca. 20 ml) einschließlich ca. 1,0 x 108x 109 Lymphozyten kann in 6 Stunden erhalten werden. Um die Lymphozyten unter Vollständiger Anästhesie zu erhalten, wird die Anästhesieebene überwacht und der Lymphfluss entsprechend beobachtet. Die gleichen Anästhetika werden in der gleichen Dosis etwa 3 Stunden nach Ratten in Ballmans Käfig gesetzt, um tiefe Anästhesie kontinuierlich für 6 Stunden zu erhalten.</li>
</ol>2. Lymphozytenkennzeichnung mit Carboxyfluorescein-Diacetat-Succinimidylester (CFDSE)
<ol><li>CFDSE(Materialtabelle) in Dimethylsulfoxid (DMSO) bis 15,6 mM auflösen (500 g CFDSE gelöst in 60 l DMSO).</li>
	<li>Inkubieren Sie Lymphozyten (1 x 108x 109) in 50 ml RPMI 1640 mit 50 l CFDSE-Lösung für 30 min bei 37 °C, wie zuvor beschrieben10.</li>
</ol>3. Versuchsaufbau für mikrovaskuläre Studien
<ol><li>Anästhetisieren Empfängerratten (8-12 Wochen) mit intraperitonealer Injektion einer Mischung aus Midazolam (2mg/kg), Domitor (0,15mg/kg) und Betulphar (2,5mg/kg) und bestätigen die Tiefe der Anästhesie durch Zehenkneifung. Befeuchten Sie den Bauch, bevor Sie das Fell pflegen, um die Haarkontamination zu minimieren. Öffnen Sie dann den Bauch des Empfängers Wister Ratte über einen Mittellinienschnitt.</li>
	<li>Legen Sie eine Ratte auf eine tragbare Edelstahlplatte (ca. 120 x 300 mm) mit einem Rechteckloch um die Mitte, das mit einem Glasschlitten (24 x 50 mm) bedeckt ist. Wählen Sie ca. 10 cm des Ileal-Segments einschließlich PPs zur Beobachtung.</li>
	<li>Den Darm so warm wie möglich und feucht mit Phosphatgepufferter Saline (PBS) auf 37 °C erwärmt halten. Einweichen Gaze, die verwendet wird, um den Dünndarm mit PBS zu bedecken.</li>
	<li>Während sie eine kontinuierliche Anästhesie mit 2 % Isofluran gibt (siehe Materialtabelle), stellen Sie das Dia auf die Bühne des Mikroskops und wählen Sie geeignete Bereiche für die Beobachtung der Mikrozirkulation in PPs, wo einige HEVs durch die Serosa verlaufen. PPs reichen in der Größe; größere eignen sich zur Beobachtung der Mikrozirkulation mit CLSM. Der Dünndarm ist stellenweise nicht gerade; ein gerades Segment von mindestens 2 cm Länge ohne Spannung ist zur Beobachtung geeignet.</li>
	<li>Bedecken Sie das angrenzende Darmsegment und die Mesentery mit saugfähiger Baumwolle, die mit PBS getränkt ist. Legen Sie das Darmsegment zwischen zwei gerollten Baumwollkugeln und positionieren Sie es so weit wie möglich vom Körper der Ratte, um zu verhindern, dass es durch den Herzschlag und die Atmung der Ratte vibriert.</li>
	<li>Mit einer 1 ml Spritze langsam (über 1 min) CFSE-markierte TDLs (1 x 108 Zellen) in die Jugularvene der Empfängerratten injizieren. Eine schnelle intravenöse Injektion kann die systemische Durchblutung beeinflussen.</li>
</ol>4. Mikrozirkulation von Lymphozyten
<ol><li>Kontinuierliche Überwachung von TDLs in der Mikrovaskulatur von PPs mit CLSM und Aufnahme auf einem Computer für 3 Stunden mit Zeitraffer-Fotografie in 30 s Intervallen. Die Tiefe von der Serosa bis zum HEV von PPs beträgt ca. 25 m, was die Beobachtung der Stroma- und Kapillarlymphgefäße bis zu einer Tiefe von 30 m ermöglicht.</li>
	<li>Injizieren Sie Texas Red-Dextran (25 mg/kg) in die Jugularvene jeder Empfängerratte, um den Blutkreislauf zu färben, und Hoechest 33342 (5 mg/kg), um die Zellkerne zu färben.</li>
	<li>(Optional) Um die Lymphozytendynamik zu quantifizieren, definieren Sie Lymphozyten, die an HEVs halten, mehr als 30 Sekunden als "klebende Lymphozyten" und Lymphozyten, die von HEVs zu Stroma auswandern, als "wandernde Lymphozyten". Berechnen Sie dann den durchschnittlichen Prozentsatz der Migration (wandernde Lymphozyten / klebende Lymphozyten + wandernde Lymphozyten) pro Sichtfeld (ca. 0,3 mm2).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Miura, S., Hokari, R., Tsuzuki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucosal+immunity+in+gut+and+lymphoid+cell+trafficking.">Mucosal immunity in gut and lymphoid cell trafficking.</a> Annals of Vascular Diseases. 5, 275-281 (2012).</li><li>Stein, J. V., Nombela-Arrieta, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokine+control+of+lymphocyte+trafficking:+a+general+overview.">Chemokine control of lymphocyte trafficking: a general overview.</a> Immunology. 116, 1-12 (2005).</li><li>Yopp, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sphingosine-1-phosphate+receptors+regulate+chemokine-driven+transendothelial+migration+of+lymph+node+but+not+splenic+T+cells.">Sphingosine-1-phosphate receptors regulate chemokine-driven transendothelial migration of lymph node but not splenic T cells.</a> The Journal of Immunology. 175, 2913-2924 (2005).</li><li>Lucke, S., Levkau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+functions+of+sphingosine-1-phosphate.">Endothelial functions of sphingosine-1-phosphate.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 26, 87-96 (2010).</li><li>Bollman, J. L., Cain, J. C., Grindlay, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+for+the+collection+of+lymph+from+the+liver,+small+intestine,+or+thoracic+duct+of+the+rat.">Techniques for the collection of lymph from the liver, small intestine, or thoracic duct of the rat.</a> The Journal of Laboratory and Clinical. 333, 1349-1352 (1948).</li><li>Bhalla, D. K., Murakami, T., Owen, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microcirculation+of+Intestinal+Lymphoid+Follicles+in+Rat+Peyer's+Patches.">Microcirculation of Intestinal Lymphoid Follicles in Rat Peyer's Patches.</a> Gastroenterology. 81, 481-491 (1981).</li><li>Miura, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+Demonstration+of+Sequential+Migration+Process+of+Lymphocyte+Subpopulations+in+Rat+Peyer's+Patches.">Intravital Demonstration of Sequential Migration Process of Lymphocyte Subpopulations in Rat Peyer's Patches.</a> Gastroenterology. 109, 1113-1123 (1995).</li><li>Tomura, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+cellular+movement+in+vivo+with+photoconvertible+fluorescence+protein+"Kaede"+transgenic+mice.">Monitoring cellular movement in vivo with photoconvertible fluorescence protein "Kaede" transgenic mice.</a> Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 10871-10876 (2008).</li><li>Schulz, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypertrophy+of+Infected+Peyer's+Patches+Arises+From+Global,+Interferon-Receptor,+and+CD69-independent+Shutdown+of+Lymphocyte+Egress.">Hypertrophy of Infected Peyer's Patches Arises From Global, Interferon-Receptor, and CD69-independent Shutdown of Lymphocyte Egress.</a> Mucosal Immunology. 7, 892-904 (2014).</li><li>Higashiyama, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P-Selectin-Dependent+Monocyte+Recruitment+Through+Platelet+Interaction+in+Intestinal+Microvessels+of+LPS-Treated+Mice.">P-Selectin-Dependent Monocyte Recruitment Through Platelet Interaction in Intestinal Microvessels of LPS-Treated Mice.</a> Microcirculation. 15, 441-450 (2008).</li><li>Shirakabe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amelioration+of+colitis+through+blocking+lymphopcytes+entry+to+Peyer's+patches+by+sphingosine-1-phosphate+lyase+inhibitor.">Amelioration of colitis through blocking lymphopcytes entry to Peyer's patches by sphingosine-1-phosphate lyase inhibitor.</a> Journal of Gastroenterology and Hepatology. 33, 1608-1616 (2018).</li><li>Cenk, S., Thorsten, R. M., Irina, B. M., Ulrich, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+Microscopy:+Visualizing+Immunity+in+Context.">Intravital Microscopy: Visualizing Immunity in Context.</a> Immunity. 21, 315-329 (2004).</li><li>Alex, Y. C. H., Hai, Q., Ronald, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Illuminating+the+Landscape+of+In+Vivo+Immunity:+Insights+from+Dynamic+In+Situ+Imaging+of+Secondary+Lymphoid+Tissues.">Illuminating the Landscape of In Vivo Immunity: Insights from Dynamic In Situ Imaging of Secondary Lymphoid Tissues.</a> Immunity. 21, 331-339 (2004).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Hier beschrieben wir ein Protokoll zum Sammeln naiver Darm-Tropen-Lymphozyten und zur Beobachtung ihrer Migration in Ratten-PPs. Diese Verfahren können zeigen, wie sich Lymphozyten in der Mikrovaskulatur von PPs bewegen und es ermöglichen, ihre Dynamik unter einem normalen oder medikamentösen Zustand visuell zu vergleichen. Die direkte Beobachtung dieser Dynamik hat viel Verdienst, einen Hinweis auf eine immunologische Veränderung durch einige Medikamente zu erhalten, obwohl der Beobachtungszeitraum auf wenige Stunde...

Peyers Pflaster (PPs) bestehen aus Hunderten von Lymphfollikel in der Lamina propria des Dünndarms. PPs sind in Follikel, die interfollikuläre Region und Keimzentren im unteren Teil der Follikel unterteilt, wo Lymphozyten durch Antigen-Präsentation stimuliert werden. Es gibt keine afferenten Lymphgefäße, und die Antigene dringen über die Epithelzellschicht aus dem Darmlumen in die Lamina propria ein. Die epitheliale Region, die Lymphfollikel bedeckt, wird follikelassoziiertes Epithel genannt, in dem spezialisierte interspersierte M-Zellen Schleimhautantigene aufnehmen. M-Zellen nehmen Antigene von der luminalen Seite auf und Antigene werden dann von dendritischen Zellen eingefangen und in Richtung naiver Lymphozyten präsentiert, die durch das Endothel von hohen endothelialen Venulen (HEVs)inPPs fließen. PPs spielen eine wichtige Rolle bei der Darmimmunität und sind mit dem frühen Stadium der Entzündung verbunden. Viele molekulare Wechselwirkungen beinhalten den Eintritt von Lymphozyten zu sekundären Lymphorganen (SLOs), einschließlich Adhäsionsmoleküle, Chemokine2,3und Sphingosin-1-Phosphat4; Daher gibt es viele erwartete therapeutische Ziele. Daher ermöglicht die Beobachtung der Lymphozytendynamik innerhalb von PPs, einen Einblick in das sehr frühe Stadium der Entzündung zu erhaschen und die Nützlichkeit mehrerer vielversprechender Medikamente zu untersuchen.
Die Methode konzentriert sich hier auf die Migration von Lymphozyten in PPs, die mehrere Verfahren umfasst (Kannulation in den Brustkanal5 und Das Sammeln von Lymphozyten und Langzeitbeobachtung nach der Injektion in gesammelte Lymphozyten). Da diese Verfahren komplex sind und es schwierig war, genau zu sehen, wie jedes Verfahren in früheren Berichten durchgeführt wurde, haben wir hier einige Tipps erwähnt, um eine erfolgreiche Beobachtung zu erreichen. Zum Beispiel war die Cannulation der Rohre in den Brustkanal sehr schwierig, und die anfängliche Erfolgsrate der Cannulation betrug weniger als 50%. Wir haben die Methode jedoch verbessert und eine Erfolgsquote von über 80 % erzielt. Wir haben einige weitere Tipps in diesem Manuskript erwähnt, die für die erfolgreiche Beobachtung notwendig sind, um die quantitative Auswertung der transendotheliale Migration von Lymphozyten unter verschiedenen Bedingungen zu ermöglichen.
In früheren Berichten war es schwierig, die dreidimensionalen Veränderungen im Laufe der Zeit zu verstehen, wie die intravenöse Injektion von Indientinte, um die Gefäßstruktur von PPs6zu färben, oder das Mikroskop ist monofokal7. In den letzten Jahren hat eine Beobachtungsmethode mit einigen photoconvertiblefluoreszenzproteintransgenen Tieren wie Kaede-Mäusen systematische zelluläre Bewegungen in vivo8geklärt. Die andere Studie verdeutlichte CD69 unabhängige Abschaltung von Lymphozyten austritt aus PPs9. Wir verwendeten konfokale Laserscanmikroskopie (CLSM) wegen seiner hohen Analysefähigkeit. Jetzt können wir leicht hochauflösende Bilder erhalten und sie verwenden, um die Lymphozytendynamik zu analysieren.
In diesem Bericht haben wir eine Reihe von Methoden zur Bewertung der Lymphozytenmigration in PPs demonstriert. Zuerst zeigten wir raffinierte Methoden der thorakalen Kanalkannulation, um Lymphozyten zu sammeln. Zweitens haben wir die Beobachtungsmethoden auf verschiedene Weise verbessert, um objektive Organe nach Möglichkeit unter mikroskopischer Beobachtung zu erhalten, so dass wir 3 Stunden lang qualitativ hochwertige Bilder erhalten können. Drittens quantifizierten wir die zellulären Bewegungen der Lymphozytenmigration, um die Auswirkungen einiger Medikamente zu bewerten. Diese geänderten Protokolle werden zur Entwicklung von Mukosal-Immunologie-Evaluierungen beitragen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:913px;" width="913">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">A1R+</td>
			<td style="width:213px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:265px;">Comfocal Laser Scanning Microscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">C1157</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hoechest 33342</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">H3570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Isoflurane</td>
			<td>Wako Pure Chemical Industries</td>
			<td style="width:119px;">099-06571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPMI 1640 medium</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td style="width:119px;">11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Texas Red&#8211;dextran</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">D1863</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microscopic observation of lymphocyte dynamics in rat peyer's patches

Naive Lymphozyten zirkulieren unter physiologischem Zustand aus dem Blut in das Lymphgewebe und es wird allgemein als ein wichtiges Phänomen in der Darmimmunität anerkannt. Die Stroma von sekundären Lymphorganen, wie Peyers Pflaster (PPs) oder mesenterischen Lymphknoten, sind, wo naive Lymphozyten Antigene spüren. Naive Lymphozyten zirkulieren durch den Blutkreislauf, um hohe endotheliale Venules zu erreichen, das Portal des Eintritts in PPs. Es wird geschätzt, dass einige Immunmodulatoren die Lymphozytenmigration beeinflussen, aber die genaue Bewertung der Mikrozirkulationsdynamik ist sehr schwierig, und die Festlegung einer Methode zur Beobachtung der Lymphozytenmigration in vivo kann zur Klärung der genauen Mechanismen beitragen. Wir verfeinerten die Methode, Lymphozyten aus dem Lymphkanal zu sammeln und die detaillierte Dynamik von Darm-tropischen Lymphozyten in Ratten-PPs zu beobachten. Wir haben uns für die konfokale Laserscanmikroskopie entschieden, um Ratten-PPs in vivo zu beobachten und sie mit Zeitrafferfotografie aufzuzeichnen. Wir können jetzt klare Bilder erhalten, die zur Analyse der Lymphozytendynamik beitragen können.

Sammeln von Lymphozyten aus Lymphe Um die Ratte auf die Thoraxkanalkannulation vorzubereiten, machen Sie einen Schnitt in den angespannten Brustkanal, wie in Abbildung 1 dargestellt, und halten Sie die Ratte dann in einem Bollman-Käfig, wie in Abbildung 2dargestellt.
Wenn die Lymphozyten gut gesammelt sind, können wir etwa 20 ml/6 h Lymphflüssigkeit mit etwa 107x 108/mL Lymphozyten erhalten...

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Microscopic Observation of Lymphocyte Dynamics in Rat Peyer's Patches

Hier beschreiben wir eine präzise Methode zum Sammeln von Thoraxkanallymphozyten und zur Beobachtung der Migration von darm-tropischen Lymphozyten in Ratten-Peyer-Pflastern für 3 Stunden mit Zeitrafferfotografie. Diese Technik kann klären, wie die Dynamik von Lymphozyten unter entzündlichen Bedingungen beeinflusst wird.

Mikroskopische Beobachtung der Lymphozytendynamik in Rat Peyers Patches

Na&#239;ve lymphocytes recirculate from the blood to the lymphoid tissues under physiological condition and it is commonly recognized as an important ...

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Serie: Microscopic Observation of Lymphocyte Dynamics in Rat Peyer's Patches

Hyperinsulinemic-Euglycemic Clamp in the Conscious Rat

Type 2 diabetes (T2D) is rapidly rising in prevalence. Characterized by either inadequate insulin production or the inability to utilize insulin produced, T2D results in elevated blood glucose levels. The "gold-standard" in assessing insulin sensitivity is a hyperinsulinemic-euglycemic clamp or insulin clamp. In this procedure, insulin is infused at a constant rate resulting in a drop in blood glucose. To maintain blood glucose at a constant level, exogenous glucose (D50) is infused into the venous circulation. The amount of glucose infused to maintain homeostasis is indicative of insulin sensitivity. Here, we show the basic clamp procedure in the chronically catheterized, unrestrained, conscious rat. This model allows blood to be collected with minimal stress to the animal. Following the induction of anesthesia, a midline incision is made and the left common carotid artery and right jugular vein are catheterized. Inserted catheters are flushed with heparinized saline, then exteriorized and secured. Animals are allowed to recover for 4-5 days prior to experiments, with weight gain monitored daily. Only those animals who regain weight to pre-surgery levels are used for experiments. On the day of the experiment, rats are fasted and connected to pumps containing insulin and D50. Baseline glucose is assessed from the arterial line and used a benchmark throughout the experiment (euglycemia). Following this, insulin is infused at a constant rate into the venous circulation. To match the drop in blood glucose, D50 is infused. If the rate of D50 infusion is greater than the rate of uptake, a rise in glucose will occur. Similarly, if the rate is insufficient to match whole body glucose uptake, a drop will occur. Titration of glucose continues until stable glucose readings are achieved. Glucose levels and glucose infusion rates during this stable period are recorded and reported. Results provide an index of whole body insulin sensitivity. The technique can be refined to meet specific experimental requirements. It is further enhanced by the use of radioactive tracers that can determine tissue specific insulin-stimulated glucose uptake as well as whole body glucose turnover.

The hyperinsulinemic-euglycemic clamp is the "gold standard" for the assessment of insulin action. Insulin is infused at a constant rate stimulating glucose uptake. The amount of exogenous glucose infused to counter this drop is indicative of insulin sensitivity. Here the procedure is performed on a conscious, unrestrained rat.

Hyperinsulinämische-euglykämische Clamp in der Conscious Rat

Type 2 diabetes (T2D) is rapidly rising in prevalence. Characterized by either inadequate insulin production or the inability to utilize insulin produced, ...

Forschung

Medizin

Angiogenesis in the Ischemic Rat Lung

The adult lung is perfused by both the systemic bronchial artery and the entire venous return flowing through the pulmonary arteries. In most lung pathologies, it is the smaller systemic vasculature that responds to a need for enhanced lung perfusion and shows robust neovascularization. Pulmonary vascular ischemia induced by pulmonary artery obstruction has been shown to result in rapid systemic arterial angiogenesis in man as well as in several animal models. Although the histologic assessment of the time course of bronchial artery proliferation in rats was carefully described by Weibel 1, mechanisms responsible for this organized growth of new vessels are not clear. We provide surgical details of inducing left pulmonary artery ischemia in the rat that leads to bronchial neovascularization. Quantification of the extent of angiogenesis presents an additional challenge due to the presence of the two vascular beds within the lung. Methods to determine functional angiogenesis based on labeled microsphere injections are provided.

The lung is perfused by both the systemic bronchial artery and pulmonary arteries. In most lung pathologies, it is the smaller systemic vasculature that shows robust neovascularization. Cessation of pulmonary blood flow promotes brisk bronchial angiogenesis. We provide surgical details of inducing left pulmonary artery ischemia that promotes bronchial neovascularization.

Angiogenese im ischämischen Rat Lung

The  adult lung is perfused by both the systemic bronchial artery and the entire  venous return flowing through the pulmonary arteries. In most lung ...

Optimized LC-MS/MS Method for the High-throughput Analysis of Clinical Samples of Ivacaftor, Its Major Metabolites, and Lumacaftor in Biological Fluids of Cystic Fibrosis Patients

Defects in the cystic fibrosis trans-membrane conductance regulator (CFTR) are the cause of cystic fibrosis (CF), a disease with life-threatening pulmonary manifestations. Ivacaftor (IVA) and ivacaftor-lumacaftor (LUMA) combination are two new breakthrough CF drugs that directly modulate the activity and trafficking of the defective CFTR-protein. However, there is still a dearth of understanding on pharmacokinetic/pharmacodynamic parameters and the pharmacology of ivacaftor and lumacaftor. The HPLC-MS technique for the simultaneous analysis of the concentrations of ivacaftor, hydroxymethyl-ivacaftor, ivacaftor-carboxylate, and lumacaftor in biological fluids in patients receiving standard ivacaftor or ivacaftor-lumacaftor combination therapy has previously been developed by our group and partially validated to FDA standards. However, to allow the high-throughput analysis of a larger number of patient samples, our group has optimized the reported method through the use of a smaller pore size reverse-phase chromatography column (2.6 &#181;m, C8 100 &#197;; 50 x 2.1 mm) and a gradient solvent system (0-1 min: 40% B; 1-2 min: 40-70% B; 2-2.7 min: held at 70% B; 2.7-2.8 min: 70-90% B; 2.8-4.0 min: 90% B washing; 4.0-4.1 min: 90-40% B; 4.1-6.0 min: held at 40% B) instead of an isocratic elution. The goal of this study was to reduce the HPLC-MS analysis time per sample dramatically from ~15 min to only 6 min per sample, which is essential for the analysis of a large amount of patient samples. This expedient method will be of considerable utility for studies into the exposure-response relationships of these breakthrough CF drugs.

Ivacaftor and ivacaftor-lumacaftor combination are two new CF drugs. However, there is still a dearth of understanding on their PK/PD and pharmacology. We present an optimized HPLC-MS technique for the simultaneous analysis of ivacaftor and its major metabolites, and lumacaftor.

Optimierte LC-MS/MS-Methode für die Hochdurchsatz-Analyse der klinischen Proben von Ivacaftor, seinen Hauptmetaboliten und Lumacaftor in biologischen Flüssigkeiten von Mukoviszidose-Patienten

Defects in the cystic fibrosis trans-membrane conductance regulator (CFTR) are the cause of cystic fibrosis (CF), a disease with life-threatening ...

Implantation of hiPSC-derived Cardiac-muscle Patches after Myocardial Injury in a Guinea Pig Model

Due to the limited regeneration capacity of the heart in adult mammals, myocardial infarction results in an irreversible loss of cardiomyocytes. This loss of relevant amounts of heart muscle mass can lead to the heart failure. Besides heart transplantation, there is no curative treatment option for the end-stage heart failure. In times of organ donor shortage, organ independent treatment modalities are needed. Left-ventricular assist devices are a promising therapy option, however, especially as destination therapy, limited by its side-effects like stroke, infections and bleedings. In recent years, several cardiac repair strategies including stem cell injection, cardiac progenitors or myocardial tissue engineering have been investigated. Recent improvements in cell biology allow for the differentiation of large amounts of cardiomyocytes derived from human induced pluripotent stem cells (iPSC). One of the cardiac repair strategies currently under evaluation is to transplant artificial heart tissue. Engineered heart tissue (EHT) is a three-dimensional in vitro created cardiomyocyte network, with functional properties of native heart tissue. We have created EHT-patches from hiPSC derived cardiomyocytes. Here we present a protocol for the induction of left ventricular myocardial cryoinjury in a guinea pig, followed by implantation of hiPSC derived EHT on the left ventricular wall.

Here we present a protocol for the induction of left ventricular cryoinjury followed by the implantation of a cardiac muscle patch, derived from human iPS-cell cardiomyocytes in a guinea pig model.

Implantation von HiPSC abgeleitete Herzmuskel Patches nach Myokard-Schädigung in einem Meerschweinchen-Modell

Due to the limited regeneration capacity of the heart in adult mammals, myocardial infarction results in an irreversible loss of cardiomyocytes. This loss ...

A Rat Carotid Artery Pressure-Controlled Segmental Balloon Injury with Periadventitial Therapeutic Application

Cardiovascular disease remains the leading cause of death and disability worldwide, in part due to atherosclerosis. Atherosclerotic plaque narrows the luminal surface area in arteries thereby reducing adequate blood flow to organs and distal tissues. Clinically, revascularization procedures such as balloon angioplasty with or without stent placement aim to restore blood flow. Although these procedures reestablish blood flow by reducing plaque burden, they damage the vessel wall, which initiates the arterial healing response. The prolonged healing response causes arterial restenosis, or re-narrowing, ultimately limiting the long-term success of these revascularization procedures. Therefore, preclinical animal models are integral for analyzing the pathophysiological mechanisms driving restenosis, and provide the opportunity to test novel therapeutic strategies. Murine models are cheaper and easier to operate on than large animal models. Balloon or wire injury are the two commonly accepted injury modalities used in murine models. Balloon injury models in particular mimic the clinical angioplasty procedure and cause adequate damage to the artery for the development of restenosis. Herein we describe the surgical details for performing and histologically analyzing the modified, pressure-controlled rat carotid artery balloon injury model. Additionally, this protocol highlights how local periadventitial application of therapeutics can be used to inhibit neointimal hyperplasia. Lastly, we present light sheet fluorescence microscopy as a novel approach for imaging and visualizing the arterial injury in three-dimensions.

The rat carotid artery balloon injury mimics the clinical angioplasty procedure performed to restore blood flow in atherosclerotic vessels. This model induces the arterial injury response by distending the arterial wall, and denuding the intimal layer of endothelial cells, ultimately causing remodeling and an intimal hyperplastic response.

Eine Ratte Carotis Arterie Druck-kontrollierte segmentale Ballonverletzung mit periadventitialen therapeutischen Anwendung

Cardiovascular disease remains the leading cause of death and disability worldwide, in part due to atherosclerosis. Atherosclerotic plaque narrows the ...

Acupuncture in a Rat Model of Asthma

A high platform can fix rats without restriction and completely expose the acupoints on the back during acupuncture manipulation. This article describes methods for the fabrication of the high platform, establishes a rat model of asthma and measures changes in respiratory function using a noninvasive and real-time whole-body plethysmography (WBP) system.

Akupunktur in einem Rattenmodell von Asthma

A high platform can fix rats without restriction and completely expose the acupoints on the back during acupuncture manipulation. This article describes ...

Advanced Cardiac Rhythm Management by Applying Optogenetic Multi-Site Photostimulation in Murine Hearts

Ventricular tachyarrhythmias are a major cause of mortality and morbidity worldwide. Electrical defibrillation using high-energy electric shocks is currently the only treatment for life-threatening ventricular fibrillation. However, defibrillation may have side-effects, including intolerable pain, tissue damage, and worsening of prognosis, indicating a significant medical need for the development of more gentle cardiac rhythm management strategies. Besides energy-reducing electrical approaches, cardiac optogenetics was introduced as a powerful tool to influence cardiac activity using light-sensitive membrane ion channels and light pulses. In the present study, a robust and valid method for successful photostimulation of Langendorff perfused intact murine hearts will be described based on multi-site pacing applying a 3 x 3 array of micro light-emitting diodes (micro-LED). Simultaneous optical mapping of epicardial membrane voltage waves allows the investigation of the effects of region-specific stimulation and evaluates the newly induced cardiac activity directly on-site. The obtained results show that the efficacy of defibrillation is strongly dependent on the parameters chosen for photostimulation during a cardiac arrhythmia. It will be demonstrated that the illuminated area of the heart plays a crucial role for termination success as well as how the targeted control of cardiac activity during illumination for modifying arrhythmia patterns can be achieved. In summary, this technique provides a possibility to optimize the on-site mechanism manipulation on the way to real-time feedback control of cardiac rhythm and, regarding the region specificity, new approaches in reducing the potential harm to the cardiac system compared to the usage of non-specific electrical shock applications.

This work reports a method for controlling the cardiac rhythm of intact murine hearts of transgenic channelrhodopsin-2 (ChR2) mice using local photostimulation with a micro-LED array and simultaneous optical mapping of epicardial membrane potential.

Fortschrittliches Herzrhythmusmanagement durch Anwendung optogenetischer Multi-Site-Photostimulation bei murinen Herzen

Ventricular tachyarrhythmias are a major cause of mortality and morbidity worldwide. Electrical defibrillation using high-energy electric shocks is ...

The Microscopic Transcanal Approach in Stapes Surgery Revisited

The microscopic transcanal (aka transmeatal) surgical approach was first described in the 60s, offering a minimally invasive means of reaching the external auditory canal, the middle ear, and epitympanon. Such an approach avoids a retroauricular or endaural skin incision; however, working through a narrow space needs angled microsurgical instruments and specific training in otologic surgery. The transcanal approach restricts the working space; however, it offers a binocular microscopic vision into the middle ear without extended skin incisions and thus, reducing post-operative pain and bleeding. In addition, this minimally invasive approach avoids scar tissue complications, hypoesthesia of the auricle, and potential protrusion of the pinna. Despite its numerous advantages, this method is still not routinely performed by otologic surgeons. Since this minimally invasive technique is more challenging, there is a need for extensive training in order for it to be widely adopted by otologic surgeons. This article provides step-by-step surgical instructions for stapes surgery and reports possible indications, pitfalls, and limitations using this microscopic transcanal technique.

This article describes the microscopic transcanal technique for stapes surgery, providing step-by-step surgical instructions for familiarizing surgeons with this approach.

Der mikroskopische Transkanalansatz in der Stabschirurgie neu interpretiert

The microscopic transcanal (aka transmeatal) surgical approach was first described in the 60s, offering a minimally invasive means of reaching the ...

Microscopic Replantation of Penile Glans Amputation Due to Circumcision

Circumcision using a disposable stapler is becoming quite popular in China. However, improper surgical procedures also bring the risk of penile glans amputation, which is a very rare iatrogenic genital injury. Such complication is conventionally treated by simple hemostasis to achieve self-healing, early gross replantation, or delayed plastic surgery. However, these may lead to obvious unfavorable outcomes such as amputated glans loss, necrosis, malformation healing, or urethral orifice stenosis. In the present study, we adopted microscopic replantation as an emergency approach to achieve the precise anastomoses and anatomic reconstruction of penile glans. The goal of this protocol is to present a detailed emergency management strategy with meticulous surgical skills for the penile glans amputation. The postoperative results showed that the original shape of the glans was perfectly restored with satisfactory cosmetic appearance. The micturition function was completely restored to normal without any obvious complications. There was also no significant reduction in the sensation of amputated glans area. Hence, early meticulous microscopic replantation as soon as possible is an ideal emergency management strategy for the penile glans amputation due to circumcision.

The present protocol describes the emergency management of microscopic replantation of penile glans amputation due to circumcision.

Mikroskopische Replantation von Penisdlanen Amputation durch Beschneidung

Circumcision using a disposable stapler is becoming quite popular in China. However, improper surgical procedures also bring the risk of penile glans ...

Microscopic Cyst Resection for the Treatment of Patients Diagnosed with Epididymal Cyst

Epididymal cysts mostly occur in men aged 20-40 years old. Previous reports have covered concerns about postoperative complexes, including postoperative asoedema, hematoma, sustaining pain, and seminal tract obstruction in patients who have undertaken nonmicroscopic epididymal cyst resection or epididymal resection. Nonmicroscopic epididymal cyst surgery is suggested for patients with childbirth plans as a precaution. The treatment of male epididymal cysts via microtechnology is obviously a beneficial option; we took the lead in carrying out microscopic epididymal exploration and cyst resection surgery in China. From September 2017 to April 2021, 41 young and middle-aged male patients diagnosed with epididymal cysts underwent microtechnology treatment in a program titled &#34;microscopic epididymal exploration and cystectomy&#34;. The postoperative follow-up lasted for 3-50 months. The results confirmed that, as microscopic manipulation largely improved visualization of the subtle tissue structures of the epididymis, the cyst could be clearly dissected apart and completely removed intact under the microscope. Bleeding during the operation was significantly reduced (2-3 mL) and wound drainage was not required. According to follow-up data, microscopic treatment significantly reduced the incidence of postoperative scrotal hematoma, edema, and long-term postoperative pain, thereby promising a higher surgical success rate as well as recurrence prevention. Besides, preliminary experience and reflection suggest that microscopic epididymal exploration and cystectomy provide efficient preservation of the epididymal patency through refined treatment, while a better prognosis can be achieved. We recommend that surgery be carried out before the epididymal cyst develops to 0.8 cm in diameter, for fear that a larger epididymal cyst (&#62;0.9 cm in diameter) could cause the complete destruction of all tubules of the ipsilateral epididymis - a more severe case with damage to the testicular output network.

Here, we present a protocol to treat patients diagnosed with an epididymal cyst using microscopic cyst resection. Based on microscopic manipulation, a largely improved visualization of the subtle tissue structures of the epididymis was obtained, so the cyst could be clearly dissected apart and completely removed intact.

Mikroskopische Zystenresektion zur Behandlung von Patienten mit Nebenhodenzyste

Epididymal cysts mostly occur in men aged 20-40 years old. Previous reports have covered concerns about postoperative complexes, including postoperative ...