Dieses Protokoll ermöglicht es, die Fähigkeit von Antikörpern zu messen, die Phagozytose von Plasmodium falciparum infizierten Erythrozyten zu opsonisieren und zu induzieren. Antikörper, die im Serum von Personen vorhanden sind, die natürlich einer Parasiteninfektion ausgesetzt sind, sowie solche, die durch Immunisierung mit Parasitenantigenen induziert werden, können getestet werden. Mit mir wird Maiken Visti, eine Technikerin aus meinem Labor, das Verfahren demonstrieren.
Um eine THP-1-Zellkultur für einen Phagozytose-Assay einzurichten, säten die Zellen am Tag vor dem Experiment die Zellen in einem 25-Zentimeter-Quadrat-Kulturkolben und einer Konzentration von 2,5 mal 10 bis zu den fünften Zellen pro Milliliter in THP ein Zellkulturmedium. Am Tag des Experiments, mindestens eine Stunde vor dem Experimentblock, um 96-Well-Platten mit 150 Mikroliter sterilen 2%FBS pro Brunnen zu runden. Für die Ernte und Reinigung von Trophozoit-infizierten Erythrozyten im mittleren bis späten Stadium, bereiten Sie etwa 1,2 Milliliter verpackte P-Falciparum-Parasitenkultur in 10 Milliliter Parasitenkulturmedium zu, mit mindestens 5% Parasitenmie und fügen Sie eine magnetische Säule hinzu.
Waschen Sie die Säule mit 50 Milliliter Parasitenkulturmedium. Um die infizierten Erythrozyten zu elute, entfernen Sie die Säule vom Magneten und spülen Sie sie mit 50 Millilitern Parasitenkulturmedium. Dann sammeln Sie die infizierten Erythrozyten durch Zentrifugation und setzen Sie das Pellet in einem Milliliter frischen Parasitenkulturmedium zum Zählen wieder auf.
Stellen Sie die gereinigte infizierte Erythrozytensuspension um 3,3 mal 10 auf die siebten Zellen pro Milliliter in Parasitkulturmedium, das Ethidiumbromid enthält, auf eine Endkonzentration von 2,5 Mikrogramm pro Milliliter an. Entfernen Sie als Nächstes die Blockierlösung von einer 96-Well-Platte, indem Sie die Platte in einen Abfallbehälter schieben. Dann entfernen Sie einen Überschuss über einem Papiertuch und fügen Sie 30 Mikroliter des Ethidiumbromid-Etiketts infiziert Erythrozyten Suspension zu allen bis auf einen Brunnen in der oberen Hälfte der Platte.
Fügen Sie 30 Mikroliter Parasitenkulturmedium in den leeren Brunnen, und inkubieren Sie die Platte für 10 Minuten bei Raumtemperatur, vor Licht geschützt. Am Ende der Inkubation 170 Mikroliter Parasitenkulturmedium zu jedem Brunnen hinzufügen und die infizierten Erythrozyten an der Unterseite der Platte durch Zentrifugation sedimentieren. Entfernen Sie den Überstand, indem Sie die Platte in einen Abfallbehälter streichen, und waschen Sie die mit Ethidiumbromid beschrifteten infizierten Erythrozyten zwei weitere Male, mit 200 Mikrolitern Parasitenkulturmedium pro Brunnen, wie gerade gezeigt wurde.
Nach dem zweiten Waschen verwenden Sie eine Mehrkanalpipette, um das gesamte Volumen des Überstandes aus jedem Brunnen sorgfältig zu entfernen, ohne die Pellets zu stören. Und setzen Sie die mit Ethidiumbromid gekennzeichneten infizierten Erythrozyten in 30 Mikroliter Antikörperlösung wieder auf, einschließlich der entsprechenden Kontrollen und Testproben, die zuvor in parasitenkulturmedium hergestellt wurden. Dann legen Sie die Platte bei 37 Grad Celsius für 45 Minuten, vor Licht geschützt.
Während die infizierten Erythrozyten opsonisiert werden, sammeln Sie die THP-1-Zellen durch Zentrifugation, und setzen Sie das Pellet in 12 Milliliter frische, vorgewärmte THP-1-Zellkulturmedium. Nach einer zweiten Zentrifugation das Pellet in einem Milliliter THP-1-Zellkulturmedium zum Zählen wieder aufsetzen und die Zellkonzentration auf fünf mal 10 bis zu den fünften Zellen pro Milliliter im THP-1-Zellkulturmedium einstellen. Entfernen Sie die Blockierlösung von der zweiten 96-Well-Platte und fügen Sie jedem Brunnen 100 Mikroliter THP-1-Zellen hinzu.
Legen Sie dann die Platte in den Zellkultur-Inkubator. Am Ende der Opsonisierungsinkubation 170 Mikroliter Parasitenkulturmedium zu jedem Brunnen der Opsonisationsplatte hinzufügen und die infizierten Erythrozyten durch Zentrifugation an den Boden der Platte sedimentieren. Waschen Sie die opsonisierten infizierten Erythrozyten zweimal mit 200 MikroliterParasitenkulturmedium pro Brunnen, mit einer Mehrkanalpipette, um den Überstand nach der zweiten Wäsche vorsichtig zu entfernen.
Setzen Sie die opsonisierten infizierten Erythrozyten in 100 Mikrolitern vorgewärmter THP-1-Zellkulturmedium pro Brunnen aus, und übertragen Sie 50 Mikroliter jeder opsonisierten infizierten Erythrozytensuspension auf einen entsprechenden Brunnen in der Phagozytoseplatte. Wenn alle Zellen hinzugefügt wurden, legen Sie die Platte nicht mehr als 40 Minuten im Zellkultur-Inkubator, geschützt vor Licht. Am Ende der Inkubation, stoppen Sie die Phagozytose durch Zentrifugation bei vier Grad Celsius.
Entfernen Sie den Überstand und setzen Sie die Pellets mit 150 Mikrolitern Ammoniumchlorid-Lysing-Lösung pro Brunnen wieder auf. Nach genau drei Minuten 100 Mikroliter Eiskälte bei 2%FBS in PBS hinzufügen, um die Lyse zu stoppen, und die intakten Zellen durch Zentrifugation sedimentieren. Als nächstes waschen Sie die Zellen dreimal mit 200 Mikroliter frische eiskalte 2%FBS in PBS pro Brunnen, pro Waschgang.
Nach der letzten Wäsche das Zellpellet in 200 Mikroliter frischer Eiskälte 2%FBS in PBS pro Brunnen wieder aufsetzen. Für die Erfassung und Analyse der Durchflusszytometrie laden Sie die Zellen sofort auf ein Durchflusszytometer und verwenden Sie das lineare Vorwärts-gegen-Linear-Streudiagramm für die Brunnen ohne infizierte Erythrozyten, um die THP-1-Zellen zu gaten. Erwerben Sie 10.000 Ereignisse in diesem Tor, und verwenden Sie die THP-1-Zellen mit den infizierten Erythrozyten opsonisiert mit einer positiven Kontrolle, um ein Histogramm-Diagramm einzurichten, um die Ethidiumbromid-Fluoreszenzintensität zu messen.
Öffnen Sie zur Analyse das lineare Vorwärts- versus lineare Seitenstreudiagramm für die Brunnen ohne infizierte Erythrozyten und schließen Sie die THP-1-Zellen an. Richten Sie dann ein positives Tor in einem FL-3-Histogramm ein und kopieren Sie diese Tore auf alle anderen Probenbrunnen, um den Prozentsatz der Ethidiumbromid-positiven THP-1-Zellen zu bestimmen. Für jede getestete Probe kann phagozytose als absoluter Wert oder als relative Phagozytose als Prozentsatz berechnet werden, wobei die Positivkontrolle als Maximum verwendet wird.
Die THP-1-Zellen sollten regelmäßig auf die EXPRESSION des FC-Gammarezeptors durch Durchflusszytometrie überprüft werden. Die Zellen sollten negativ für CD16 und positiv für CD32 und CD64 sein. In diesem Opsonisierungsexperiment wurden die THP-1-Zellen zuerst nach ihren vorderen und seitlichen Streuprofilen abgezäutt, um eine Quantifizierung des Prozentsatzes der mit Ethidiumbromid gekennzeichneten Zellen zu ermöglichen, was auf Zellen hindeutet, die mindestens einen Antikörper transplantiert haben, der infiziertes Erythrozyten opsonisiert hat.
Die Negativkontrollproben sollten alle einen einzelnen negativen Peak im FL3-Kanal erzeugen, wobei nur wenige Ereignisse im Ethidiumbromid-Marker beobachtet werden. Dementsprechend sollten die mittleren Phagozytosewerte, sowohl als absolute Ethidiumbromid-positive THP-1-Zellen als auch als relative Phagozytose-Prozentsätze, sehr niedrig sein. Im Gegensatz dazu sollte die Positivkontrolle Spuren mit zwei Spitzen, einem negativen Peak und einem deutlich positiven und gut abgetrennten Peak innerhalb des Ethidiumbromidmarkers erzeugen.
Die durchschnittlichen Phagozytosewerte sind normalerweise am höchsten für die positive Kontrolle, gefolgt vom Malaria-exponierten Frauenpool und den einzelnen Malaria-exponierten Frauenkontrollen. Obwohl diese Methode konsistente Ergebnisse liefert, wurden Abweichungen im Neigungskoeffizienten der angepassten Linien beobachtet. Daher wird die Verwendung relativer Werte empfohlen, insbesondere wenn es nicht möglich ist, alle Stichproben in einem einzigen Experiment auszuführen.
Achten Sie darauf, das Experiment sorgfältig im Voraus zu planen, bereiten sowohl die THP-1-Zellen und die Parasiten entsprechend, mit nur Trophozyten mit einer Reinheit größer als 80%Darüber hinaus sollten Sie immer die entsprechenden Kontrollen enthalten, um die Qualität des Experiments zu bewerten und die Datenanalyse zu erleichtern.
