Name: fabrication of a biomimetic nano-matrix with janus base nanotubes and fibronectin for stem cell adhesion
Uploaded: 2020-05-10T14:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 14 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fabrication of a Biomimetic Nano-Matrix with Janus Base Nanotubes and Fibronectin for Stem Cell Adhesion at JoVE.com

Diese Arbeit wird finanziell unterstützt durch NIH (Grants 1R01AR072027-01, 1R03AR069383-01), NSF Career Award (1653702) und University of Connecticut.

1. Synthese von JBNTs
HINWEIS: JBNT monomer wurde wie zuvor veröffentlicht11erstellt.
<ol><li>Synthese der Verbindung A1<ol>
<li>Bereiten Sie eine Lösung vor, die 8,50 g 2-Cyanoessigsäure und 9,80 g Ethylcarbamat in 25 ml Toluin und 2,5 ml N, N-Dimethylformamid enthält. 4,90 ml Phosphorylchlorid tropfenweise hinzufügen. Dann die Mischung auf 70 °C erhitzen und 1,5 h rühren.</li>
		<li>Kühlen Sie das Reaktionsgemisch auf Raumtemperatur und gießen Sie 100 g Eiswasser ein. Die wässrige Schicht mit Ethylacetat (3 x 250 ml) abziehen und mit 100 ml Sole waschen. Trocknen Sie die organische Schicht über wasserfreiem Natriumsulfat, filtern und verdampfen Flüchtige unter Vakuum, um einen hellgelben Feststoff zu erhalten.</li>
		<li>Den gelben Feststoff der Kieselgel-Flashsäulenchromatographie (3% Methanol/Dichlormethan) unterziehen, um 15,61 g Verbindung A1 als weißes Pulver zu ergeben.</li>
	</ol></li>
	<li>Synthese der Verbindung A2<ol>
<li>3,12 g Verbindung A1 und 2,75 g Kaliumcarbonat in 50 ml N, N-Dimethylformamid mischen. Bei Raumtemperatur 2 h umrühren.</li>
		<li>Fügen Sie der Reaktionssuspension 2,6 ml Kohlenstoffdisulfid hinzu. Halten Sie rühren für 4 h.</li>
		<li>Absolutes Ethanol bei 0 °C in das Reaktionsgemisch geben. Filtern Sie den gelben Niederschlag heraus und waschen Sie ihn mit dem Ethylether. Unter Vakuum über Nacht trocknen, um 6,18 g Verbindung A2 als hellgelb fest zu ergeben.</li>
	</ol></li>
	<li>Synthese der Verbindung A3<ol>
<li>2,7 ml Methyljodid in 15 ml Acetonitril hinzufügen. Außerdem eine Lösung der Verbindung A2 separat vorbereiten, indem 6,18 g A2 bis 80 ml Wasser/Acetonitril (7:3-Verhältnis) hinzugefügt werden. Mischen Sie beide Lösungen und rühren Sie bei Raumtemperatur für 30 min.</li>
		<li>Das Reaktionsgemisch auf 95 °C erhitzen und 3 h rühren.</li>
		<li>Kühlen Sie das Reaktionsgemisch auf Raumtemperatur, und verdampfen Sie dann die Flüchtigen unter Vakuum.</li>
		<li>Den Rückstand 3x mit 100 ml Ethylacetat extrahieren und mit Salzlake waschen. Trocknen Sie die organische Schicht über wasserfreiem Natriumsulfat, filtern und verdampfen Sie die Flüchtigen unter Vakuum, um einen gelben Feststoff zu erhalten.</li>
		<li>Den gelben Feststoff der Kieselgel-Blitzsäulenchromatographie (30% Ethylacetat/Hexane) unterziehen, um 4,52 g der Verbindung A3 als hellgelben Feststoff zu ergeben.</li>
	</ol></li>
	<li>Synthese der Verbindung A4<ol>
<li>Bereiten Sie die Allylaminlösung vor, indem Sie 925 L Allylamin in 20 ml Ethanol hinzufügen. Fügen Sie diese Lösung tropfenweise in die Lösung der Verbindung A3, vorbereitet durch Zugabe von 3,14 g A3 in 75 ml absolutem Ethanol, über 30 min. Dann erhitzen Sie das Reaktionsgemisch zu Reflux für 16 h.</li>
		<li>Kühlen Sie das Reaktionsgemisch auf Raumtemperatur und verdampfen Sie die Flüchtigen, um einen gelben Feststoff zu geben.</li>
		<li>Den gelben Feststoff der Kieselgel-Säulenchromatographie (50% Ethylacetat/Hexanen bis 2% Methanol/Dichlormethan) unterziehen, um 1,80 g Verbindung A4 als weißen Kristall zu ergeben.</li>
	</ol></li>
	<li>Synthese der Verbindung A5<ol>
<li>2,05 g Guanidiniumhydrochlorid und 7,8 ml Natriumethoxid (21 Gew.-% in Ethanol) in 14 ml absolutes Ethanol hinzufügen. Das Gemisch 15 min auf 45 °C erhitzen.</li>
		<li>Filtern Sie das unlösliche Material ab und fügen Sie das Filtrat direkt in die Lösung der Verbindung A4 ein, die durch Zugabe von 2,70 g A4 in 40 ml absolutem Ethanol hergestellt wird. Erhitzen Sie das Reaktionsgemisch auf Reflux für 16 h.</li>
		<li>Filtern Sie den Niederschlag heraus, um 2,65 g Verbindung A5 als off-white Feststoff zu erhalten.</li>
	</ol></li>
	<li>Synthese der Verbindung A6<ol>
<li>Fügen Sie 24,9 ml Triethylamin langsam in das Güllegemisch, das durch Zugabe von 2,11 g Verbindung A5 und 1,10 g 4-Dimethylaminopyridin in 120 ml Tetrahydrofuran über 1 min erhalten wird. Bei Raumtemperatur 2 min rühren.</li>
		<li>20,7 ml Di-Tert-Butyldicarbonat tropfenweise in das Reaktionsgemisch geben und bei Raumtemperatur 40 h rühren.</li>
		<li>Fügen Sie 20 ml Wasser hinzu, um die Reaktion zu löschen. Verdampfen Sie die Flüchtigen unter Vakuum.</li>
		<li>Extrahieren Sie den roten viskosen Rückstand mit 500 ml Ethylacetat. Dann mit 250 ml Wasser, 75 ml 10% Zitronensäure, 2x mit 200 ml Wasser, 200 ml gesättigtem Natriumbicarbonat und 200 ml Sole einwaschen. Trocknen Sie die organische Schicht über wasserfreiem Natriumsulfat, filtern und verdampfen Sie die Flüchtigen unter Vakuum, um einen rot/orange festen Körper zu geben.</li>
		<li>Den Feststoff der Kieselgel-Säulenchromatographie (0-20% Ethylacetat/Hexane) unterziehen, um 3,87 g Verbindung A6 als weißen Schaum zu ergeben.</li>
	</ol></li>
	<li>Synthese der Verbindung A7<ol>
<li>N-Methylmorpholine N-Oxid (50 Gew.% in Wasser, 1,64 ml) tropfenweise in die Lösung der Verbindung A6 (2,93 g) in Aceton/Wasser (8:1, 58,5 ml) geben und bei Raumtemperatur 5 min rühren.</li>
		<li>Osmiumtetraoxid (4% wässrige Lösung) über einen Zeitraum von 3 min tropfenweise in das Gemisch geben und bei Raumtemperatur 24 h rühren.</li>
		<li>Die Reaktion mit 1,0 M wässrigem Natriumsulfit ablöschen, bis die Lösung farblos wird. Entfernen Sie die flüchtigen Stoffe unter Vakuum, um eine weiße Gülle in Wasser zu führen. Den Rückstand mit 350 ml Dichlormethan abziehen und dann mit 150 ml Wasser waschen, gefolgt von einer Wäsche mit 150 ml Sole.</li>
		<li>Trocknen Sie die organische Schicht über wasserfreiem Natriumsulfat, filtern und verdampfen Sie die Flüchtigen unter Vakuum, um 2,45 g Verbindung A7 als weißen Feststoff zu ergeben.</li>
	</ol></li>
	<li>Synthese der Verbindung A8<ol>
<li>760 g Natriumperiodid in 35 ml Dichlormethan/Wasser (6:1, 35 ml) in das Gemisch von 1,36 g Verbindung A7 geben und bei Raumtemperatur 42 h rühren.</li>
		<li>Filtern Sie das unlösliche Material ab und konzentrieren Sie das Filtrat unter Vakuum. Die resultierenden Rückstände mit 250 ml Dichlormethan extrahieren und dann mit 100 ml Wasser und 100 ml Sole waschen. Trocknen Sie die organische Schicht über wasserfreiem Natriumsulfat, filtern und verdampfen Sie die Flüchtigen unter Vakuum, um das Rohprodukt zu erhalten.</li>
		<li>Das Rohprodukt der Kieselgel-Säulenchromatographie (5-40% Ethylacetat/Hexane, dann 5% Methanol/Dichlormethan) auf 1,08 g Verbindung A8 auferliegen.</li>
	</ol></li>
	<li>Synthese der Verbindung A9<ol>
<li>Bereiten Sie eine Lösung von 830 mg Verbindung A8 in 15 ml 1,2-Dichlorethan vor. Fügen Sie die Lösung tropfenweise in das Gemisch aus 6-Benzyloxycarbonylamino-2-L-Amino-Hexanosäure-Trimethylsilyl-Ethylester (649,5 mg) und N,N-Diisopropylethylamin (591 l) in 24 ml von 1,2-Dichlorethan über 3 min und rühren bei Raumtemperatur für 15 min.</li>
		<li>360,3 mg Natriumtriacetoxyborohydrid in die Lösung geben und bei Raumtemperatur 24 h rühren.</li>
		<li>Das Reaktionsgemisch mit 6 ml Wasser ablöschen. Das Reaktionsgemisch 3x mit 200 ml Dichlormethan extrahieren und mit 200 ml 10% Zitronensäure in Wasser, 2x mit 200 ml Wasser, 200 ml gesättigtem Natriumbicarbonat und 200 ml Sole in dieser Reihenfolge waschen. Trocknen Sie die organische Schicht über wasserfreiem Natriumsulfat, filtern und verdampfen Sie die Flüchtigen unter Vakuum, um das Rohprodukt zu erhalten.</li>
		<li>Das Rohprodukt der Kieselgel-Flashsäulenchromatographie (5-30% Ethylacetat/Hexane) auf 885 mg Verbindung A9 aussetzen.</li>
	</ol></li>
	<li>Synthese von JBNT-Monomer<ol>
<li>0,54 g Verbindung A9 (0,54 g) in 10 ml 94% Trifluoressigsäure/Thioanisollösung auflösen und bei Raumtemperatur 72 h rühren.</li>
		<li>Diethylether (80 ml) dem Reaktionsgemisch hinzufügen und den Niederschlag zentrieren. Gießen Sie die klare Trifluoressigsäure, die Überstand enthält, und waschen Sie den weißen Niederschlag mit Demethylether und Methanol, um 168,6 mg Roh-JBNT-Monomer(Ergänzungsdatei 1) zu ergeben.</li>
		<li>Reinigen Sie das rohe JBNT-Monomer durch eine hochleistungsreiche Flüssigkeitschromatographie (HPLC) mit einer Reverse-Phase-Säule. Das Isolationsprogramm ist unten aufgeführt: Lösungsmittel A: 100% Wasser; Lösungsmittel B: 100% Acetonitril; Lösungsmittel C: pH=1 HCl-Wasserlösung; Durchfluss: 3 ml/min (siehe Tabelle 1).</li>
		<li>Sammeln Sie den größten Gipfel in etwa 7,2 min.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Herstellung für JBNT/FN
<ol><li>Fügen Sie die wässrige Lösung JBNT mit 80 l von 1 mg/ml mehrmals in eine 1 mg/ml FN-Wässerlösung und Pipette.</li>
	<li>Prüfen Sie, ob eine weiße Feststoffsuspension nach dem Pipetieren ca. 10 s ist. HINWEIS: Ein Video wurde aufgenommen, um den Selbstmontageprozess von NM (Supplemental File 2) zu erfassen.</li>
</ol>3. Beobachtung lyophilisierter Proben
HINWEIS: Dieser Schritt wird ausgeführt, um die Gerüststruktur von NM aus JBNTs und FN anzuzeigen.
<ol><li>Bereiten Sie FN-, JBNT- und FN/JBNT NM-Lösungen für die Lyophilisierte Materialbeobachtung vor. Verdünnen Sie 10 l von 100 g/ml FN mit 40 l destilliertem Wasser, um eine 20-g/ml-Lösung von FN herzustellen.</li>
	<li>Bereiten Sie 100 mg/ml Lösung von JBNTs durch Verdünnung von 5 l von 1 mg/ml JBNTs in 45 l DI-Wasser vor.</li>
	<li>Mischen Sie 10 l von 100 g/ml FN und 5 x l von 1 mg/ml JBNTs in 35 l DI-Wasser, um die NM-Lösung zu bilden.</li>
	<li>Beschichten Sie drei Bohrungen mit 96-gut klaren rundrunden Boden-Mikroplatten mit der FN-, JBNT-Lösung bzw. NM-Lösung. Jeder Brunnen erhält 50 l der Lösung.</li>
	<li>Führen Sie eine Lyophilisierung durch, wie unten beschrieben, um die Gerüststruktur des NM zu visualisieren.<ol>
<li>Einfrieren der Platte bei -80 °C über Nacht.</li>
		<li>Schalten Sie das lyophilisierte Instrument und die Vakuumpumpe ein.</li>
		<li>Drücken Sie die Abkühltaste, um die Temperatur des Systems auf -50 °C zu reduzieren.</li>
		<li>Legen Sie die gefrorene Platte in das lyophilisierte Instrument und schließen Sie alle Öffnungen der Instrumente.</li>
		<li>Klicken Sie auf die Starttaste, um den Systemdruck auf 0,9 mbar zu reduzieren.</li>
		<li>Nach 4 h drücken Sie die Belüftungstaste und öffnen Sie das Ventil, um den Systemdruck auf den atmosphärischen Druck zu erhöhen.</li>
		<li>Nehmen Sie die Platte aus dem lyophilisierten Instrument.</li>
		<li>Verwenden Sie ein Mikroskop, um die FN, JBNTs und das resultierende selbstmontierte NM zu beobachten. Nehmen Sie mehrere Fotos mit einer Kamera für die Materialien.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Absorptionsspektrenmessung
HINWEIS: Verwenden Sie den Spektrenwechsel für FN und JBNTs, um den selbst montierten JBNT/FN NM12vorzustellen.
<ol><li>Mischen Sie 30 l von 100 g/ml FN mit 15 l destilliertem Wasser und 5 l von 1 mg/ml JBNTs, um die JBNT/FN NM-Lösung vorzubereiten. Weiße feste Suspension kann nach dem Pipettieren der Lösung mehrmals gesehen werden. ANMERKUNG: Die Endkonzentrationen von JBNTs und FN in der Lösung betragen 100 g/ml bzw. 60 g/ml. JBNTs und FN-Lösungen in der gleichen Konzentration wie in der NM-Lösung wurden ebenfalls als Steuerungslösungen vorbereitet.</li>
	<li>Verdünnen Sie 5 l von 1 mg/ml JBNTs mit 45 l destilliertem Wasser, um die JBNT-Kontrolllösung vorzubereiten.</li>
	<li>Zur Herstellung der FN-Kontrolllösung 30 l von 100 g/ml FN mit 20 l destilliertem Wasser verdünnen.</li>
	<li>Messen Sie die UV-Vis-Absorptionsspektren von FN-, JBNT- und JBNT/FN NM-Lösungen mit dem Spektralphotometer (siehe Materialtabelle), um die Montage von NM zu charakterisieren.<ol>
<li>Klicken Sie auf die Schaltfläche UV-Vis. Reinigen Sie die Testfläche des Spektralphotometers und lassen Sie 2 l destilliertes Wasser darauf fallen. Messen Sie es als Leerzeichen von 190-850 nm.</li>
		<li>Reinigen Sie die Testfläche des Spektralphotometers und lassen Sie 2 L FN-Lösung darauf fallen. Messen Sie die UV-Vis Absorptionsspektren der FN-Lösung von 190 nm bis 850 nm.</li>
		<li>Reinigen Sie die Testfläche des Spektralphotometers und lassen Sie 2 L JBNT-Lösung darauf fallen. Messen Sie die Absorptionsspektren der JBNT-Lösung von 190 nm bis 850 nm.</li>
		<li>Reinigen Sie die Testoberfläche des Spektralphotometers und lassen Sie 2 L JBNT/FN NM-Lösung darauf fallen. Messen Sie die Absorptionsspektren der JBNT/FN NM-Lösung von 190 nm bis 850 nm.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Vorbereitung von JBNT/FN NM für die elektronische Übertragungsmikroskopie (TEM)
<ol><li>Reinigen Sie mehrere Gitter vor negativer Färbung mit einem grundlegenden Plasmareiniger (siehe Materialtabelle).</li>
	<li>Führen Sie die negative Färbung für die Proben nach zwei verschiedenen Prozessen durch.<ol>
<li>Lassen Sie 3 l von 1 mg/ml jbNTs wässrige Lösung und 3 l JBNT/FN NM-Lösung auf getrennten Gittern fallen und lassen Sie es für 2 min. Spülen Sie dann jedes Gitter mit 100 l 0,5% Uranylacetat (UA) Lösung. Entleeren Sie die überschüssige Lösung mit Filterpapier und trocknen Sie die Gitter lufttrocken.</li>
		<li>Mischen Sie die JBNT/FN NM-Lösung mit einer Lösung von 3 l mit einer UA-Lösung von 2,0 % und führen Sie sie mehrmals durch. Pipette die gemischte Lösung auf den Gittern und halten Sie es auf den Gittern für 2 min. Verwenden Sie ein Filterpapier, um die gemischte Lösung aus den Gittern zu entfernen und die Gitter bei Raumtemperatur zu trocknen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Schließlich charakterisieren Sie die Probe für JBNTs, JBNT/FN NM mit Schritt 5.2.1 und JBNT/FN NM mit Schritt 5.2.2 mit dem TEM gebeizt.</li>
</ol>6. In-vitro-Biologische Funktion Assay
<ol><li>Fügen Sie 200 L Negativsteuerungen (NC, PBS), JBNTs, FN und die JBNT/FN NM-Lösungen in einen Brunnen einer 8-Well-Kammerrutsche ein.</li>
	<li>Das 8-well-kammerförmige Deckglas mit dem lyophilisierten Instrument trocknen, um Materialien auf dem Boden der Brunnen zu beschichten. Das Protokoll zum Gefriertrocknen entspricht Schritt 3.5.</li>
	<li>Dann 10.000 Zellen/Brunnen hMSCs (Passage 3) in die Brunnen geben und 24 h bei 37 °C mit 5%CO2bebrüten.</li>
	<li>Nach der Inkubation das Zellkulturmedium aus den Brunnen herauspipetten und die Kultur mit 1x PBS-Lösung abspülen.</li>
	<li>Fügen Sie 100 l der fixativen Lösung zu jedem Brunnen mit Zellen hinzu und lassen Sie sie 5 min. Spülen Sie zellen vorsichtig mit 1x PBS zweimal.</li>
	<li>1% Triton-X 100 bis 0,1% verdünnen. Fügen Sie 100 l von 0,1% Triton-X 100 zu jedem Brunnen mit Zellen hinzu und lassen Sie es 10 min. Spülen Sie zellen vorsichtig mit 1x PBS zweimal.</li>
	<li>Verdünnen Sie das Rhodamine Phalloidin auf 1,65 m. Fügen Sie 100 L Rhodamine Phalloidin zu jedem Brunnen mit Zellen hinzu und inkubieren Sie das kammerförmige Deckglas, das bei Raumtemperatur 30 min vom Licht gehalten wird. Spülen Sie zellen vorsichtig mit 1x PBS zweimal.</li>
	<li>Erfassen Sie die Zellbilder mit einem Fluoreszenzmikroskop.</li>
	<li>Zählen Sie die Zellennummern für fluoreszierende Bilder für jede Gruppe. Berechnen Sie die Zellhaftungsdichte, indem Sie in jedem Brunnen drei zufällige Bereiche durchschnittlich umstellen.</li>
	<li>Präsentieren Sie alle Daten als durchschnittliche ± Standardabweichung (SD). Führen Sie statistische Analysen mit einem einseitigen t-Test durch, gefolgt von einer Varianzanalyse (ANOVA) mit p<0.05, die als statistisch signifikant angesehen wird.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Yao, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+mobilization+of+exogenous+mesenchymal+stem+cells+to+bone+for+fracture+healing+and+sex+difference.">Improved mobilization of exogenous mesenchymal stem cells to bone for fracture healing and sex difference.</a> Stem Cells. 34 (10), 2587-2600 (2016).</li><li>Salasznyk, R. M., Williams, W. A., Boskey, A., Batorsky, A., Plopper, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesion+to+vitronectin+and+collagen+I+promotes+osteogenic+differentiation+of+human+mesenchymal+stem+cells.">Adhesion to vitronectin and collagen I promotes osteogenic differentiation of human mesenchymal stem cells.</a> Journal of Biomedicine and Biotechnology. 1 (2004), 24-34 (2004).</li><li>Hadjiargyrou, M., O'Keefe, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+convergence+of+fracture+repair+and+stem+cells:+interplay+of+genes,+aging,+environmental+factors+and+disease.">The convergence of fracture repair and stem cells: interplay of genes, aging, environmental factors and disease.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 29 (11), 2307-2322 (2014).</li><li>De Becker, A., Riet, I. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homing+and+migration+of+mesenchymal+stromal+cells:+How+to+improve+the+efficacy+of+cell+therapy.">Homing and migration of mesenchymal stromal cells: How to improve the efficacy of cell therapy.</a> World Journal of Stem Cells. 8 (3), 73-87 (2016).</li><li>Chen, Y., Song, S., Yan, Z., Fenniri, H., Webster, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembled+rosette+nanotubes+encapsulate+and+slowly+release+dexamethasone.">Self-assembled rosette nanotubes encapsulate and slowly release dexamethasone.</a> International Journal of Nanomedicine. 6, 1035-1044 (2011).</li><li>Song, S., Chen, Y., Yan, Z., Fenniri, H., Webster, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembled+rosette+nanotubes+for+incorporating+hydrophobic+drugs+in+physiological+environments.">Self-assembled rosette nanotubes for incorporating hydrophobic drugs in physiological environments.</a> International Journal of Nanomedicine. 6, 101-107 (2011).</li><li>Fenniri, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helical+Rosette+Nanotubes:+Design,+Self-Assembly,+and+Characterization.">Helical Rosette Nanotubes: Design, Self-Assembly, and Characterization.</a> Journal of the American Chemical Society. 123 (16), 3854-3855 (2001).</li><li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembled+rosette+nanotube/hydrogel+composites+for+cartilage+tissue+engineering.">Self-assembled rosette nanotube/hydrogel composites for cartilage tissue engineering.</a> Tissue Engineering Part C Methods. 16 (6), 1233-1243 (2010).</li><li>Van den Bogaerdt, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagen+cross-linking+by+adipose-derived+mesenchymal+stromal+cells+and+scar-derived+mesenchymal+cells:+Are+mesenchymal+stromal+cells+involved+in+scar+formation.">Collagen cross-linking by adipose-derived mesenchymal stromal cells and scar-derived mesenchymal cells: Are mesenchymal stromal cells involved in scar formation.</a> Wound Repair and Regeneration. 17 (4), 548-558 (2009).</li><li>Erickson, H. P., Carrell, N., McDonagh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibronectin+molecule+visualized+in+electron+microscopy:+a+long,+thin,+flexible+strand.">Fibronectin molecule visualized in electron microscopy: a long, thin, flexible strand.</a> Journal of Cell Biology. 91 (3), 673-678 (1981).</li><li>Chen, Q., Yu, H. C., Chen, Y. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> U. S. Patent. , (2017).</li><li>Zhou, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembled+biomimetic+Nano-Matrix+for+stem+cell+Anchorage.">Self-assembled biomimetic Nano-Matrix for stem cell Anchorage.</a> Journal of Biomedical Materials and Research. 108, 984-991 (2020).</li><li>Jones, M., Leroux, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymeric+micelles+-+a+new+generation+of+colloidal+drug+carriers.">Polymeric micelles - a new generation of colloidal drug carriers.</a> European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 48 (2), 101-111 (1999).</li><li>Singh, P., Schwarzbauer, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibronectin+and+stem+cell+differentiation+-+lessons+from+chondrogenesis.">Fibronectin and stem cell differentiation - lessons from chondrogenesis.</a> Journal of Cell Science. 125, 3703-3712 (2012).</li><li>Martino, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlling+integrin+specificity+and+stem+cell+differentiation+in+2D+and+3D+environments+through+regulation+of+fibronectin+domain+stability.">Controlling integrin specificity and stem cell differentiation in 2D and 3D environments through regulation of fibronectin domain stability.</a> Biomaterials. 30 (6), 1089-1097 (2009).</li><li>Somaiah, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagen+promotes+higher+adhesion,+survival+and+proliferation+of+mesenchymal+stem+cells.">Collagen promotes higher adhesion, survival and proliferation of mesenchymal stem cells.</a> PLoS One. 10 (12), 0145068 (2015).</li><li>Ogura, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+the+human+mesenchymal+stem+cells+derived+from+bone+marrow+and+enhancement+of+cell+attachment+by+fibronectin.">Differentiation of the human mesenchymal stem cells derived from bone marrow and enhancement of cell attachment by fibronectin.</a> Journal of Oral Science. 46 (4), 207-213 (2004).</li><li>Do, A. V., Khorsand, B., Geary, S. M., Salem, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+Printing+of+scaffolds+for+tissue+regeneration+applications.">3D Printing of scaffolds for tissue regeneration applications.</a> Advanced Healthcare Materials. 4 (12), 1742-1762 (2015).</li><li>Shi, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structurally+and+functionally+optimized+silk-fibroin-gelatin+scaffold+using+3D+printing+to+repair+cartilage+injury+in+vitro+and+in+vivo.">Structurally and functionally optimized silk-fibroin-gelatin scaffold using 3D printing to repair cartilage injury in vitro and in vivo.</a> Advanced Material. 29, 1701089 (2017).</li><li>Journeay, W. S., Suri, S. S., Moralez, J. G., Fenniri, H., Singh, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+inflammatory+activation+by+self-assembling+Rosette+nanotubes+in+human+Calu-3+pulmonary+epithelial+cells.">Low inflammatory activation by self-assembling Rosette nanotubes in human Calu-3 pulmonary epithelial cells.</a> Small. 4 (6), 817-823 (2008).</li><li>Journeay, W. S., Suri, S. S., Moralez, J. G., Fenniri, H., Singh, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rosette+nanotubes+show+low+acute+pulmonary+toxicity+in+vivo.">Rosette nanotubes show low acute pulmonary toxicity in vivo.</a> International Journal of Nanomedicine. 3 (3), 373-383 (2008).</li></ol>

Dr. Yupeng Chen ist Mitbegründer von NanoDe Therapeutics, Inc.

In dieser Studie entwickelten wir ein selbstzusammengesetztes biomimetisches NM, das mit DNA-inspirierten JBNTs und FN gebildet wurde. Bei der Herstellung der JBNT-Lösung sollte das lyophilisierte JBNT-Pulver anstelle von PBS ins Wasser aufgelöst werden, da PBS eine Agglomeration von JBNTs verursacht, was ihre Montage hemmt. Darüber hinaus sollte das NM auch in Wasser montiert werden, wenn wir die nanofibrilen Strukturen des NM beobachten wollen, da das Salz in PBS mit NM-Fasern gebündelt wird, was die Auflösung der Bilder erheblich reduzieren kann.
Das NM hat ein großes Potenzial gezeigt, als neuartiges Gewebe-Engineering-Gerüst zu dienen, obwohl viele Anstrengungen unternommen wurden, um geweberegenerative Gerüste herzustellen, die verwendet wurden, um die Haftung und Differenzierung von hMSCs zu erleichtern. Die meisten dieser Materialien sind jedoch mit einer bestimmten Form vorgefertigt, wie z. B. ein 3D-gedrucktes Gerüst18,19. Als solche sind sie nicht einfach, in verletzte Stellen implantiert zu werden, die tief im Gelenk sind. Die NM-Lösung kann hier jedoch als Flüssigkeit injiziert werden und dann als Gerüst für die Zellhaftung dienen.
Eine Einschränkung ist, dass der NM nicht mechanisch stark ist. Im Gegensatz zu Polymeren werden sie durch Selbstmontage von nichtkovalenten Wechselwirkungen hergestellt, so dass sie keine große mechanische Belastung oder Spannung ertragen können. Andererseits weist die nichtkovalente Struktur auch eine sehr gute biologische Abbaubarkeit und Biokompatibilität auf, die für biologische Funktionen geeignet ist8,20,21.
Das injizierbare NM hat ein großes Potenzial gezeigt, einen Zielort und ein Gerüst für MSC-Homing zur Verbesserung der Knochenbruchheilung im Körper bereitzustellen. Wenn jedoch in die verletzte Stelle injiziert, kann das nichtkovalente NM für eine lange Zeit nicht an Ort und Stelle bleiben, was die therapeutische Wirkung reduzieren kann. In Zukunft werden wir versuchen, andere Materialien (wie Hydrogele) zu integrieren oder die NM-Strukturen zu wechseln, um die Eigenschaften des NM-Gerüstes weiter zu optimieren.

Humane mesenchymale Stammzellen (hMSCs) haben das Potenzial für Selbsterneuerung und Selbstdifferenzierung entlang verschiedener mesenchymaler Abstammunggezeigt, was bei der Regeneration und Erhaltung von Geweben hilft1. Basierend auf dem Differenzierungspotenzial werden hMSCs als Kandidaten für mesenchymale Gewebeverletzungen und hämatopoetische Störungstherapie2betrachtet. hMSCs haben die Fähigkeit gezeigt, die Wundheilung durch Erhöhung der Gewebereparatur, Angiogenese und Verringerung der Entzündung3zu fördern. Ohne hilfe durch biochemische oder biomaterialien ist die Effizienz der hMSCs, ein Zielgewebe zu erreichen und am gewünschten Ort zu funktionieren, gering4. Obwohl verschiedene technische Gerüste verwendet wurden, um hMSCs anzuziehen, um an den Läsionen festzuhängen, sind einige Stellen wie Wachstumsplattenfrakturen in der Mitte eines langen Knochens nicht leicht zugänglich durch die herkömmlichen vorgefertigten Gerüste, die möglicherweise nicht perfekt in eine unregelmäßig geformte verletzte Stelle passen.
Hier haben wir ein biomimetisches Nanomaterial entwickelt, das sich vor Ort selbst zusammenbauen und in ein schwer erreichbares Zielgebiet injiziert werden kann. Das injizierbare Biogerüst NM besteht aus Janus-Basis-Nanoröhren (JBNTs) und Fibronectin (FN). JBNTs, auch bekannt als Rosette Nanotubes (RNTs), werden aus DNA-Basenpaaren abgeleitet, insbesondere Thymin und Adenin, hier5,6,7. Wie in Abbildung 1dargestellt, bilden sich die Nanoröhren, wenn sich sechs Moleküle der abgeleiteten DNA-Basenpaare selbst über Wasserstoffbindungen zu einer Ebene6zusammensetzen. Sechs Moleküle werden dann über eine starke Pi-Stacking-Wechselwirkung7,die bis zu 200-300 m lang sein kann, in einer Ebene übereinander gestapelt. Die JBNTs wurden entwickelt, um Kollagenfasern morphologisch nachzuahmen, so dass FN mit ihnen reagiert.
FN ist ein hochmolekulares Klebeglykoprotein, das in der extrazellulären Matrix (ECM)9zu finden ist. Diese können die Befestigung von Stammzellen an anderen Komponenten des ECM, insbesondere Kollagen10, vermitteln. Wir haben JBNTs entwickelt, um Kollagenfasern morphologisch nachzuahmen, so dass FN mit ihnen reagieren kann, um NM in wenigen Sekunden durch nicht kovalente Bindung zu bilden. Daher ist NM ein vielversprechendes Biogerüst, das in eine Knochenbruchstelle injiziert werden kann, die von den konventionell gefertigten Gerüsten nicht zugänglich ist. Hier präsentiert das injizierbare NM eine hervorragende Fähigkeit, die hMSC-Verankerung in vitro zu verbessern und zeigt ihr Potenzial, als Gerüst für die Geweberegeneration zu dienen.

<table><tbody><tr><td>1,2-dichloroethane</td><td>Alfa Aesar</td><td>39121</td><td></td></tr><tr><td>2-cyanoacetic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C88505</td><td></td></tr><tr><td>4-Dimethylaminopyridine</td><td>TCI America</td><td>D1450</td><td></td></tr><tr><td>8 wells Chambered Coverglass</td><td>Thermo Fisher</td><td>155409</td><td></td></tr><tr><td>96-well plate</td><td>Corning</td><td>353072</td><td></td></tr><tr><td>absolute ethanol</td><td>Thermo Fisher</td><td>BP2818500</td><td></td></tr><tr><td>acetone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>179124</td><td></td></tr><tr><td>acetonitrile</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34851</td><td></td></tr><tr><td>allylamine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>145831</td><td></td></tr><tr><td>Basic Plasma Cleaner</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC32G</td><td></td></tr><tr><td>citric acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>251275</td><td></td></tr><tr><td>concentrated hydrochloric acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1758</td><td></td></tr><tr><td>Deionized water</td><td>Thermo Fisher</td><td>15230147</td><td></td></tr><tr><td>dichloromethane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>270997</td><td></td></tr><tr><td>diethyl ether</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>296082</td><td></td></tr><tr><td>Di-tert-butyl dicarbonate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>361941</td><td></td></tr><tr><td>ethyl acetate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>319902</td><td></td></tr><tr><td>ethylcarbamate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U2500</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectin</td><td>Thermo Fisher</td><td>PHE0023</td><td></td></tr><tr><td>Fixative Solution (4 % formaldehyde prepared in PBS)</td><td>Thermo Fisher</td><td>R37814</td><td></td></tr><tr><td>guanidinium hydrochloride</td><td>Alfa Aesar</td><td>A13543</td><td></td></tr><tr><td>hexanes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>227064</td><td></td></tr><tr><td>Human mesenchymal stem cells</td><td>Lonza</td><td>PT-2501</td><td></td></tr><tr><td>methanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34860</td><td></td></tr><tr><td>methyl iodide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>289566</td><td></td></tr><tr><td>N,N-Diisopropylethylamine</td><td>Alfa Aesar</td><td>A17114</td><td></td></tr><tr><td>N,N-dimethylformamide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>227056</td><td></td></tr><tr><td>N-Methylmorpholine N-oxide</td><td>Alfa Aesar</td><td>A19802</td><td></td></tr><tr><td>Osmium tetraoxide</td><td>Alfa Aesar</td><td>45385</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Thermo Fisher</td><td>15140163</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffer Solution</td><td>Thermo Fisher</td><td>20012050</td><td></td></tr><tr><td>phosphoryl chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>201170</td><td></td></tr><tr><td>potassium carbonate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>347825</td><td></td></tr><tr><td>reverse phase column</td><td>Thermo Fisher</td><td>25305-154630</td><td></td></tr><tr><td>Rhodamine Phalloidin</td><td>Thermo Fisher</td><td>R415</td><td></td></tr><tr><td>silica gel</td><td>TCI America</td><td>S0821</td><td></td></tr><tr><td>sodium bicarbonate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>sodium ethoxide</td><td>Alfa Aesar</td><td>L13083</td><td></td></tr><tr><td>sodium periodide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71859</td><td></td></tr><tr><td>sodium sulfate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>239313</td><td></td></tr><tr><td>sodium sulfite</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0505</td><td></td></tr><tr><td>sodium triacetoxyborohydride</td><td>Alfa Aesar</td><td>B22060</td><td></td></tr><tr><td>spectrophotometer(NanoDrop One/One&lt;sup&gt;c&lt;/sup&gt; UV-Vis)</td><td>Thermo Fisher</td><td>ND-ONE-W</td><td></td></tr><tr><td>Stem Cell Growth Medium BulletKit</td><td>Lonza</td><td>PT-3001</td><td></td></tr><tr><td>tetrahydrofuran</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>401757</td><td></td></tr><tr><td>thioanisole</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T28002</td><td></td></tr><tr><td>toluene</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>179418</td><td></td></tr><tr><td>triethylamine</td><td>Alfa Aesar</td><td>A12646</td><td></td></tr><tr><td>trifluoroacetic acid</td><td>Alfa Aesar</td><td>A12198</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Thermo Fisher</td><td>HFH10</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA solution</td><td>Thermo Fisher</td><td>25200056</td><td></td></tr></tbody></table>

fabrication of a biomimetic nano-matrix with janus base nanotubes and fibronectin for stem cell adhesion

Ein biomimetisches NM wurde entwickelt, um als gewebetechnisches biologisches Gerüst zu dienen, das die Stammzellverankerung verbessern kann. Das biomimetische NM wird aus JBNTs und FN durch Selbstmontage in wässriger Lösung gebildet. JBNTs messen 200-300 m lang mit inneren hydrophoben Hohlkanälen und äußeren hydrophilen Oberflächen. JBNTs sind positiv geladen und FNs sind negativ geladen. Daher werden sie, wenn sie in eine neutrale wässrige Lösung injiziert werden, über nicht kovalente Bindungen zu den NM-Bündeln zusammengebunden. Der Selbstmontageprozess wird innerhalb weniger Sekunden ohne chemische Initiatoren, Wärmequelle oder UV-Licht abgeschlossen. Wenn der pH-Wert der NM-Lösung niedriger ist als der isoelektrische Punkt von FNs (pI 5.5-6.0), werden sich die NM-Bundles aufgrund des Vorhandenseins von positiv geladenem FN selbst freisetzen.
NM ist dafür bekannt, die extrazelluläre Matrix (ECM) morphologisch nachzuahmen und kann daher als injizierbares Gerüst verwendet werden, das eine hervorragende Plattform zur Verbesserung der hMSC-Haftung bietet. Zelldichteanalysen und Fluoreszenz-Bildgebungsexperimente zeigten, dass die NMs die Verankerung von hMSCs im Vergleich zur Negativkontrolle signifikant erhöhten.

Unsere Studien entdeckten, dass die Bildung des NM von JBNTs und FN schnell ist, was in 10 Sekunden geschah. Wie in Abbildung 2dargestellt, wurde weißes Flockel erhalten, wenn die JBNT-Lösung mit der FN-Lösung gemischt und mehrmals pipettiert wurde. Der Entstehungsprozess von NM ist vollständig biomimetisch. Es sind keine äußeren Reize erforderlich. Der Herstellungsprozess ist viel einfacher als der einiger aufkommenden Biomaterialien, die auf ultraviolettem Licht oder chemischem Initiator für die Vernetzung13basieren.
Wir haben die Kamerabilder von FN, JBNTs und dem NM aufgenommen und analysiert (Abbildung 3). Für die FN-Gruppe wurden bis auf kurze weiße Flecken keine langen Fasern beobachtet. Die kurzen Cluster waren die Protein-Agglomerationen, die aus FN bestehen, was darauf hindeutet, dass die Gerüststruktur nicht mit FN allein ohne JBNTs gebildet werden kann (Abbildung 3A). Wie in Abbildung 3Bdargestellt, weisen die langen und dünneren Fasern auf die Existenz von JBNTs hin. Die Breite der weißen Stränge des NM ist im Vergleich zu JBNTs breiter, was darauf hindeutet, dass die JBNTs und FN miteinander verbunden sind und NM bilden. Die NM-Faser kann bis zu mehreren Zentimeter lang werden (Abbildung 3C).
Wir haben die UV-Vis-Spektren erhalten, um die Montage zwischen JBNTs und FN anzuzeigen. Wie in Abbildung 4dargestellt, weist JBNTs zwei Absorptionsspitzen bei 220 nm bzw. 280 nm auf. Im Vergleich zu JBNTs hat der JBNT/FN NM zwei Absorptionsspitzen an der gleichen Stelle mit einem deutlich reduzierten Wert, der von JBNTs stammte, aber von den nicht kovalenten selbstmontierten JBNTs und FN dazwischen beeinflusst wurde.
TEM wurde verwendet, um die Morphologie der JBNTs und NM zu charakterisieren. Wie in Abbildung 5Adargestellt, sind die JBNTs schlanke Rohre mit gleichmäßigen Durchmessern. Unter neutralen Bedingungen werden JBNTs positiv geladen, während FN negativ geladen werden. Wenn sie gemischt wurden, bildeten sie lange fibroide NM über Ladungsinteraktionen (Abbildung 5B). Wenn der pH-Wert niedriger ist als der isoelektrische Punkt des FN (pI von 5.5-6.0), präsentieren die NM-Bündel aufgrund des positiv geladenen FN eine Selbstfreigabe. Wie in Abbildung 5Cdargestellt, wurde das NM, wenn es in einer Lösung mit niedrigem pH-Wert (4,0) konserviert wurde, dissembled, und eine Menge FN wurde aus dem NM freigesetzt. Der neben der Nanoröhre verteilte FN ist auch ein starker Beweis dafür, dass das NM von JBNTs und FN10hergestellt wurde.
Wir untersuchten die Wirkung des JBNT/FN NM auf die Zellhaftung. Wie in Abbildung 6dargestellt, zeigte die Zellhaftungsdichte der NM-Gruppe einen signifikanten Differenzwert (p-Wert <0,05) im Vergleich zum Negativkontrollwert. Der Unterschied kann daran liegen, dass das NM entwickelt wurde, um ECM morphologisch nachzuahmen, das ein Gerüst für die Zellhaftung14zur Verfügung stellt. Das ECM bestand aus Kollagenen und zellklebenden Glykoproteinen wie Fibronectin15. Kollagen wurde mit der Fähigkeit präsentiert, höhere Haftung und Proliferation von hMSCs16zu fördern. Darüber hinaus hat sich gezeigt, dass Fibronectin die hMSCs Haftung an der verletzten Stelle sowie15verbessert. Fluoreszenz-Bildgebung zeigte auch, dass die hMSCs-Adhärenz der NM-Gruppe im Vergleich zur Negativkontrollgruppe signifikant zunahm (Abbildung 7)15,17.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61317/61317fig01.jpg"> Abbildung 1: Schematische Darstellung der hierarchischen Selbstmontage von JBNTs mit einer Lysin-Seitenkette. Diese Abbildung wird mit Genehmigung der vorherigen Publikation12neu gedruckt. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61317/61317fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61317/61317fig02.jpg"> Abbildung 2: Demonstration für den selbstzusammengesetzten Prozess des NM. (A) FN-Lösung. (B) JBNTs gemischt mit FN. Diese Abbildung wird mit Genehmigung der vorherigen Publikation12neu gedruckt. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61317/61317fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61317/61317fig03.jpg"> Abbildung 3: Brightfield-Fotos. Brightfield Fotografien von (A) FN (B) JBNTs und (C) NM, gebildet von JBNTs und FN. Jeder Bereich hat einen Durchmesser von 2 cm. Diese Abbildung wird mit Genehmigung der vorherigen Publikation12neu gedruckt. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61317/61317fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61317/61317fig04.jpg"> Abbildung 4: Absorptionsspektren von FN, JBNTs und JBNT/FN NM. Diese Zahl wird aus der vorherigen Publikation12nachgedruckt. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61317/61317fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61317/61317fig05.jpg"> Abbildung 5: TEM-Bilder. TEM Bilder von (A) JBNTs (B) JBNT/FN NM und (C) veröffentlicht JBNT/FN NM. Diese Abbildung wird mit Genehmigung der vorherigen Publikation12neu gedruckt. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61317/61317fig05large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61317/61317fig06.jpg"> Abbildung 6: Statistische Analyse der zellulären Adhäsion. In diesem Experiment wurde die Zellhaftungsdichte aufgezeichnet. *p<0.01 im Vergleich zu Negativkontrollen. **p<0.05 im Vergleich zu JBNT allein. N=3. Diese Abbildung wird mit Genehmigung der vorherigen Publikation12neu gedruckt. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61317/61317fig06large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61317/61317fig07.jpg"> Abbildung 7: Fluoreszenzbilder. Fluoreszenzbilder von (A) den hMSCs und (B) der hMSC inkubiert mit den JBNTs. (C) die hMSC inkubiert mit dem FN. (D) die hMSC mit dem JBNT/FN NM inkubiert. Maßstabsleiste: 100 m. Diese Abbildung wird mit Genehmigung der vorherigen Publikation12neu gedruckt. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61317/61317fig07large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Zeit</td>
			<td>A%</td>
			<td>B%</td>
			<td>C%</td>
		</tr>
<tr>
<td>0.00 min</td>
			<td>98</td>
			<td>0</td>
			<td>2</td>
		</tr>
<tr>
<td>15.00 Min.</td>
			<td>68</td>
			<td>30</td>
			<td>2</td>
		</tr>
<tr>
<td>25.00 Min.</td>
			<td>8</td>
			<td>90</td>
			<td>2</td>
		</tr>
<tr>
<td>26.00 Min.</td>
			<td>0</td>
			<td>100</td>
			<td>0</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 1: Gradientenelutionszeit.
Ergänzende Datei 1: Schema für die Synthese von JBNT-Monomer. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61317/61317supfig01.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Abbildung herunterzuladen.</a>
Ergänzende Datei 2: Video zur Selbstmontage des FN/JBNT NM. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61317/Supplemental_File_2.mp4" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.</a>

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Fabrication of a Biomimetic Nano-Matrix with Janus Base Nanotubes and Fibronectin for Stem Cell Adhesion

Ziel dieses Protokolls ist es, die Montage einer biomimetischen Nanomatrix (NM) mit Janus-Basis-Nanoröhren (JBNTs) und Fibronectin (FN) zu zeigen. Bei der Kokultur mit humanen mesenchymalen Stammzellen (hMSCs) weisen die NMs eine ausgezeichnete Bioaktivität bei der Förderung der hMSCs Adhäsion auf.

Herstellung einer biomimetischen Nano-Matrix mit Janus Base Nanotubes und Fibronectin zur Stammzellhaftung

A biomimetic NM was developed to serve as a tissue-engineering biological scaffold, which can enhance stem cell anchorage. The biomimetic NM is formed ...

fabrication-biomimetic-nano-matrix-with-janus-base-nanotubes

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

4.0K Aufrufe.  University of Connecticut. Ziel dieses Protokolls ist es, die Montage einer biomimetischen Nanomatrix (NM) mit Janus-Basis-Nanoröhren (JBNTs) und Fibronectin (FN) zu zeigen. Bei der Kokultur mit humanen mesenchymalen Stammzellen (hMSCs) weisen die NMs eine ausgezeichnete Bioaktivität bei der Förderung der hMSCs Adhäsion auf.

Serie: Fabrication of a Biomimetic Nano-Matrix with Janus Base Nanotubes and Fibronectin for Stem Cell Adhesion

Preparation of 3D Fibrin Scaffolds for Stem Cell Culture Applications

Stem cells are found in naturally occurring 3D microenvironments in vivo, which are often referred to as the stem cell niche 1. Culturing stem cells inside of 3D biomaterial scaffolds provides a way to accurately mimic these microenvironments, providing an advantage over traditional 2D culture methods using polystyrene as well as a method for engineering replacement tissues 2. While 2D tissue culture polystrene has been used for the majority of cell culture experiments, 3D biomaterial scaffolds can more closely replicate the microenvironments found in vivo by enabling more accurate establishment of cell polarity in the environment and possessing biochemical and mechanical properties similar to soft tissue.3 A variety of naturally derived and synthetic biomaterial scaffolds have been investigated as 3D environments for supporting stem cell growth. While synthetic scaffolds can be synthesized to have a greater range of mechanical and chemical properties and often have greater reproducibility, natural biomaterials are often composed of proteins and polysaccharides found in the extracelluar matrix and as a result contain binding sites for cell adhesion and readily support cell culture. Fibrin scaffolds, produced by polymerizing the protein fibrinogen obtained from plasma, have been widely investigated for a variety of tissue engineering applications both in vitro and in vivo 4. Such scaffolds can be modified using a variety of methods to incorporate controlled release systems for delivering therapeutic factors 5. Previous work has shown that such scaffolds can be used to successfully culture embryonic stem cells and this scaffold-based culture system can be used to screen the effects of various growth factors on the differentiation of the stem cells seeded inside 6,7.
 This protocol details the process of polymerizing fibrin scaffolds from fibrinogen solutions using the enzymatic activity of thrombin. The process takes 2 days to complete, including an overnight dialysis step for the fibrinogen solution to remove citrates that inhibit polymerization. These detailed methods rely on fibrinogen concentrations determined to be optimal for embryonic and induced pluripotent stem cell culture. Other groups have further investigated fibrin scaffolds for a wide range of cell types and applications - demonstrating the versatility of this approach 8-12.

This work details the preparation of 3D fibrin scaffolds for culturing and differentiating plutipotent stem cells. Such scaffolds can be used to screen the effects of various biological compounds on stem cell behavior as well as modified to contain drug delivery systems.

Erstellung von 3D-Fibrin-Gerüste für Stem Cell Culture Anwendungen

Stem cells are found in naturally occurring 3D microenvironments in vivo, which are often referred to as the stem cell niche 1. Culturing stem cells ...

Forschung

Biotechnik

Capillary Force Lithography for Cardiac Tissue Engineering

Cardiovascular disease remains the leading cause of death worldwide1. Cardiac tissue engineering holds much promise to deliver groundbreaking medical discoveries with the aims of developing functional tissues for cardiac regeneration as well as in vitro screening assays. However, the ability to create high-fidelity models of heart tissue has proven difficult. The heart&#8217;s extracellular matrix (ECM) is a complex structure consisting of both biochemical and biomechanical signals ranging from the micro- to the nanometer scale2. Local mechanical loading conditions and cell-ECM interactions have recently been recognized as vital components in cardiac tissue engineering3-5.
A large portion of the cardiac ECM is composed of aligned collagen fibers with nano-scale diameters that significantly influences tissue architecture and electromechanical coupling2. Unfortunately, few methods have been able to mimic the organization of ECM fibers down to the nanometer scale. Recent advancements in nanofabrication techniques, however, have enabled the design and fabrication of scalable scaffolds that mimic the in vivo structural and substrate stiffness cues of the ECM in the heart6-9.
Here we present the development of two reproducible, cost-effective, and scalable nanopatterning processes for the functional alignment of cardiac cells using the biocompatible polymer poly(lactide-co-glycolide) (PLGA)8 and a polyurethane (PU) based polymer. These anisotropically nanofabricated substrata (ANFS) mimic the underlying ECM of well-organized, aligned tissues and can be used to investigate the role of nanotopography on cell morphology and function10-14.
Using a nanopatterned (NP) silicon master as a template, a polyurethane acrylate (PUA) mold is fabricated. This PUA mold is then used to pattern the PU or PLGA hydrogel via UV-assisted or solvent-mediated capillary force lithography (CFL), respectively15,16. Briefly, PU or PLGA pre-polymer is drop dispensed onto a glass coverslip and the PUA mold is placed on top. For UV-assisted CFL, the PU is then exposed to UV radiation (&#955; = 250-400 nm) for curing. For solvent-mediated CFL, the PLGA is embossed using heat (120 &#176;C) and pressure (100 kPa). After curing, the PUA mold is peeled off, leaving behind an ANFS for cell culture. Primary cells, such as neonatal rat ventricular myocytes, as well as human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes, can be maintained on the ANFS2.

In this protocol, we demonstrate the fabrication of biomimetic cardiac cell culture substrata made from two distinct polymeric materials using capillary force lithography. The described methods provide a scalable, cost-effective technique to engineer the structure and function of macroscopic cardiac tissues for in vitro and in vivo applications.

Kapillar-Force-Lithographie für Herz-Tissue Engineering

Cardiovascular disease remains the leading cause of death worldwide1. Cardiac tissue engineering holds much promise to deliver groundbreaking medical ...

ECM Protein Nanofibers and Nanostructures Engineered Using Surface-initiated Assembly

The extracellular matrix (ECM) in tissues is synthesized and assembled by cells to form a 3D fibrillar, protein network with tightly regulated fiber diameter, composition and organization. In addition to providing structural support, the physical and chemical properties of the ECM play an important role in multiple cellular processes including adhesion, differentiation, and apoptosis. In vivo, the ECM is assembled by exposing cryptic self-assembly (fibrillogenesis) sites within proteins. This process varies for different proteins, but fibronectin (FN) fibrillogenesis is well-characterized and serves as a model system for cell-mediated ECM assembly. Specifically, cells use integrin receptors on the cell membrane to bind FN dimers and actomyosin-generated contractile forces to unfold and expose binding sites for assembly into insoluble fibers. This receptor-mediated process enables cells to assemble and organize the ECM from the cellular to tissue scales. Here, we present a method termed surface-initiated assembly (SIA), which recapitulates cell-mediated matrix assembly using protein-surface interactions to unfold ECM proteins and assemble them into insoluble fibers. First, ECM proteins are adsorbed onto a hydrophobic polydimethylsiloxane (PDMS) surface where they partially denature (unfold) and expose cryptic binding domains. The unfolded proteins are then transferred in well-defined micro- and nanopatterns through microcontact printing onto a thermally responsive poly(N-isopropylacrylamide) (PIPAAm) surface. Thermally-triggered dissolution of the PIPAAm leads to final assembly and release of insoluble ECM protein nanofibers and nanostructures with well-defined geometries. Complex architectures are possible by engineering defined patterns on the PDMS stamps used for microcontact printing. In addition to FN, the SIA process can be used with laminin, fibrinogen and collagens type I and IV to create multi-component ECM nanostructures. Thus, SIA can be used to engineer ECM protein-based materials with precise control over the protein composition, fiber geometry and scaffold architecture in order to recapitulate the structure and composition of the ECM in vivo.

A method to obtain nanofibers and complex nanostructures from single or multiple extracellular matrix proteins is described. This method uses protein-surface interactions to create free-standing protein-based materials with tunable composition and architecture for use in a variety of tissue engineering and biotechnology applications.

ECM-Protein-Nanofasern und Nanostrukturen Engineered Mit Oberflächen initiierte Versammlung

The extracellular matrix (ECM) in tissues is synthesized and assembled by cells to form a 3D fibrillar, protein network with tightly regulated fiber ...

Electrospun Nanofiber Scaffolds with Gradations in Fiber Organization

The goal of this protocol is to report a simple method for generating nanofiber scaffolds with gradations in fiber organization and test their possible applications in controlling cell morphology/orientation. Nanofiber organization is controlled with a new fabrication apparatus that enables the gradual decrease of fiber organization in a scaffold. Changing the alignment of fibers is achieved through decreasing deposition time of random electrospun fibers on a uniaxially aligned fiber mat. By covering the collector with a moving barrier/mask, along the same axis as fiber deposition, the organizational structure is easily controlled. For tissue engineering purposes, adipose-derived stem cells can be seeded to these scaffolds. Stem cells undergo morphological changes as a result of their position on the varied organizational structure, and can potentially differentiate into different cell types depending on their locations. Additionally, the graded organization of fibers enhances the biomimicry of nanofiber scaffolds so they more closely resemble the natural orientations of collagen nanofibers at tendon-to-bone insertion site compared to traditional scaffolds. Through nanoencapsulation, the gradated fibers also afford the possibility to construct chemical gradients in fiber scaffolds, and thereby further strengthen their potential applications in fast screening of cell-materials interaction and interfacial tissue regeneration. This technique enables the production of continuous gradient scaffolds, but it also can potentially produce fibers in discrete steps by controlling the movement of the moving barrier/mask in a discrete fashion.

Here, we present a protocol to fabricate electrospun nanofiber scaffolds with gradated organization of fibers and explore their applications in regulating cell morphology/orientation. Gradients with regard to physical and chemical properties of the nanofiber scaffolds offer a wide variety of applications in the biomedical field.

Elektronanofasergerüste mit Abstufungen in Fiber-Organisation

The goal of this protocol is to report a simple method for generating nanofiber scaffolds with gradations in fiber organization and test their possible ...

Expanding Nanopatterned Substrates Using Stitch Technique for Nanotopographical Modulation of Cell Behavior

Substrate nanotopography has been shown to be a potent modulator of cell phenotype and function. To dissect nanotopography modulation of cell behavior, a large area of nanopatterned substrate is desirable so that enough cells can be cultured on the nanotopography for subsequent biochemical and molecular biology analyses. However, current nanofabrication techniques have limitations to generate highly defined nanopatterns over a large area. Herein, we present a method to expand nanopatterned substrates from a small, highly defined nanopattern to a large area using stitch technique. The method combines multiple techniques, involving soft lithography to replicate poly(dimethylsiloxane) (PDMS) molds from a well-defined mold, stitch technique to assemble multiple PDMS molds to a single large mold, and nanoimprinting to generate a master mold on polystyrene (PS) substrates. With the PS master mold, we produce PDMS working substrates and demonstrate nanotopographical modulation of cell spreading. This method provides a simple, affordable yet versatile avenue to generate well-defined nanopatterns over large areas, and is potentially extended to create micro-/nanoscale devices with hybrid components.

A protocol for producing a large area of nanopatterned substrate from small nanopatterned molds for study of nanotopographical modulation of cell behavior is presented.

Der Ausbau nano Substraten Stichtechnik für Nanotopographical Modulation des Zellverhaltens

Substrate nanotopography has been shown to be a potent modulator of cell phenotype and function. To dissect nanotopography modulation of cell behavior, a ...

Dendrimer-based Uneven Nanopatterns to Locally Control Surface Adhesiveness: A Method to Direct Chondrogenic Differentiation

Cellular adhesion and differentiation is conditioned by the nanoscale disposition of the extracellular matrix (ECM) components, with local concentrations having a major effect. Here we present a method to obtain large-scale uneven nanopatterns of arginine-glycine-aspartic acid (RGD)-functionalized dendrimers that permit the nanoscale control of local RGD surface density. Nanopatterns are formed by surface adsorption of dendrimers from solutions at different initial concentrations and are characterized by water contact angle (CA), X-ray photoelectron spectroscopy (XPS), and scanning probe microscopy techniques such as scanning tunneling microscopy (STM) and atomic force microscopy (AFM). The local surface density of RGD is measured using AFM images by means of probability contour maps of minimum interparticle distances and then correlated with cell adhesion response and differentiation. The nanopatterning method presented here is a simple procedure that can be scaled up in a straightforward manner to large surface areas. It is thus fully compatible with cell culture protocols and can be applied to other ligands that exert concentration-dependent effects on cells.

A method to obtain dendrimer-based uneven nanopatterns that permit the nanoscale control of local arginine-glycine-aspartic acid (RGD) surface density is described and applied for the study of cell adhesion and chondrogenic differentiation.

Dendrimer-basierte ungleiche Nanopatterns, lokal Steuerfläche Haftfähigkeit: eine Methode, um direkte Chondrogenic Differenzierung

Cellular adhesion and differentiation is conditioned by the nanoscale disposition of the extracellular matrix (ECM) components, with local concentrations ...

Fabrication of Custom Agarose Wells for Cell Seeding and Tissue Ring Self-assembly Using 3D-Printed Molds

Engineered tissues are being used clinically for tissue repair and replacement, and are being developed as tools for drug screening and human disease modeling. Self-assembled tissues offer advantages over scaffold-based tissue engineering, such as enhanced matrix deposition, strength, and function. However, there are few available methods for fabricating 3D tissues without seeding cells on or within a supporting scaffold. Previously, we developed a system for fabricating self-assembled tissue rings by seeding cells into non-adhesive agarose wells. A polydimethylsiloxane (PDMS) negative was first cast in a machined polycarbonate mold, and then agarose was gelled in the PDMS negative to create ring-shaped cell seeding wells. However, the versatility of this approach was limited by the resolution of the tools available for machining the polycarbonate mold. Here, we demonstrate that 3D-printed plastic can be used as an alternative to machined polycarbonate for fabricating PDMS negatives. The 3D-printed mold and revised mold design is simpler to use, inexpensive to produce, and requires significantly less agarose and PDMS per cell seeding well. We have demonstrated that the resulting agarose wells can be used to create self-assembled tissue rings with customized diameters from a variety of different cell types. Rings can then be used for mechanical, functional, and histological analysis, or for fabricating larger and more complex tubular tissues.

This protocol describes a platform for fabricating self-assembled tissue rings in variable sizes using a customized 3D-printed plastic mold. PDMS negatives are cured in the 3D-printed mold; then agarose is cast in the cured PDMS negatives. Cells are seeded into the resulting agarose wells where they aggregate into tissue rings.

Herstellung von benutzerdefinierten Agarose Brunnen für die Aussaat von Zelle und Gewebe Ring Selbstmontage mit 3D-Druck Formen

Engineered tissues are being used clinically for tissue repair and replacement, and are being developed as tools for drug screening and human disease ...

Fabrication of Gradient Nanopattern by Thermal Nanoimprinting Technique and Screening of the Response of Human Endothelial Colony-forming Cells

Nanotopography can be found in various extracellular matrices (ECMs) around the body and is known to have important regulatory actions upon cellular reactions. However, it is difficult to determine the relation between the size of a nanostructure and the responses of cells owing to the lack of proper screening tools. Here, we show the development of reproducible and cost-effective gradient nanopattern plates for the manipulation of cellular responses. Using anodic aluminum oxide (AAO) as a master mold, gradient nanopattern plates with nanopillars of increasing diameter ranges [120-200&#8239;nm (GP 120/200), 200-280&#8239;nm (GP 200/280), and 280-360&#8239;nm (GP 280/360)] were fabricated by a thermal imprinting technique. These gradient nanopattern plates were designed to mimic the various sizes of nanotopography in the ECM and were used to screen the responses of human endothelial colony-forming cells (hECFCs). In this protocol, we describe the step-by-step procedure of fabricating gradient nanopattern plates for cell engineering, techniques of cultivating hECFCs from human peripheral blood, and culturing hECFCs on nanopattern plates.

Here, we present a protocol for the fabrication of gradient nanopattern plates via thermal nanoimprinting and the method of screening responses of human endothelial progenitor cells to the nanostructures. By using the described technology, it is possible to produce a scaffold that can manipulate cell behavior by physical stimuli.

Herstellung von Gradient Nanopattern durch thermische Nanoimprinting Technik und Screening der Reaktion des menschlichen koloniebildenden Endothelzellen

Nanotopography can be found in various extracellular matrices (ECMs) around the body and is known to have important regulatory actions upon cellular ...

Fabrication and Characterization of Layer-By-Layer Janus Base Nano-Matrix to Promote Cartilage Regeneration

Various biomaterial scaffolds have been developed to guide cell adhesion and proliferation in hopes to promote specific functions for in vitro and in vivo uses. The addition of growth factors into these biomaterial scaffolds is generally done to provide an optimal cell culture environment, mediating cell differentiation and its subsequent functions. However, the growth factors in a conventional biomaterial scaffold are typically designed to be released upon implantation, which could result in unintended side effects on surrounding tissue or cells. Here, the DNA-inspired Janus base nano-matrix (JBNm) has successfully achieved a highly localized microenvironment with a layer-by-layer structure for self-sustainable cartilage tissue constructs. JBNms are self-assembled from Janus base nanotubes (JBNts), matrilin-3, and transforming growth factor beta-1 (TGF-&#946;1) via bioaffinity. The JBNm was assembled at a TGF-&#946;1:matrilin-3:JBNt ratio of 1:4:10, as this has been the determined ratio at which proper assembly into the layer-by-layer structure could occur. First, the TGF-&#946;1 solution was added to the matrilin-3 solution. Then, this mixture was pipetted several times to ensure sufficient homogeneity before the addition of the JBNt solution. This formed the layer-by-layer JBNm, after pipetting several times again. A variety of experiments were performed to characterize the layer-by-layer JBNm structure, JBNts alone, matrilin-3 alone, and TGF-&#946;1 alone. The formation of JBNm was studied with UV-Vis absorption spectra, and the structure of the JBNm was observed with transmission electron microscopy (TEM). As the innovative layer-by-layer JBNm scaffold is formed on a molecular scale, the fluorescent dye-labeled JBNm could be observed. The TGF-&#946;1 is confined within the inner layer of the injectable JBNm, which can prevent the release of growth factors to surrounding areas, promote localized chondrogenesis, and promote an anti-hypertrophic microenvironment.

This protocol describes the assembly of a layer-by-layer Janus base nano-matrix (JBNm) scaffold by adding Janus base nanotubes (JBNts), matrilin-3, and Transforming Growth Factor Beta-1 (TGF-&#946;1) sequentially. The JBNm was fabricated and characterized; additionally, it displayed excellent bioactivity, encouraging cell functions such as adhesion, proliferation, and differentiation.

Herstellung und Charakterisierung von Schicht-für-Schicht-Janus-Basis-Nano-Matrix zur Förderung der Knorpelregeneration

Various biomaterial scaffolds have been developed to guide cell adhesion and proliferation in hopes to promote specific functions for in vitro and in vivo ...

Fabricating Engineered Nanofibrillar Collagen with Directed Patterning

Production of Nanofibrillar Patterned Collagen for Tissue Engineering

Regenerative biomaterials are designed to facilitate cell-material interactions to guide the repair of damaged tissues and organs. These materials are designed to emulate the biophysical properties of native tissue, providing cellular phenotypic and morphological guidance that contributes to the restoration of the regenerative tissue niche. Collagen, a prevalent extracellular matrix protein, is a common component of these regenerative biomaterials due to its biocompatibility and other favorable properties. The current study describes a novel and straightforward method for the fabrication of engineered nanofibrillar collagen with directed fibril patterning. Through the manipulation of shear stress, temperature, and pH, collagen fibrillogenesis and alignment are precisely controlled without requiring specialized equipment. This approach allows for the creation of nanofibrillar collagen biomaterials that mimic the native structure of tissues exhibiting either anisotropic or isotropic characteristics. The flexibility in collagen nanofibril patterning not only facilitates the study of nanoscale patterning on cell behavior but also offers diverse possibilities for patterned tissue engineering applications.

The following protocol presents a shear-based extrusion method for the fabrication of collagen hydrogels with nanoscale patterned fibrils, which can be applied to a broad range of tissue engineering applications.

Regenerative biomaterials are designed to facilitate cell-material interactions to guide the repair of damaged tissues and organs. These materials are ...