Es gibt eine hohe Anzahl von EDC-Chemikalien in unserer Umwelt, vor allem östrogene Substanzen. Die chemische Vielfalt der zur Gruppe gehörenden Stoffe erschwert ihre Prüfung, da für ihren Nachweis unterschiedliche Methoden erforderlich sind. Basierend auf der chemischen Struktur, Es ist wirklich schwierig zu bestimmen, ob eine Substanz tatsächlich in der Lage ist, als Östrogen zu arbeiten.
Darüber hinaus sind diese Stoffe nie in reiner Form in der Umwelt vorhanden, so dass ihre Auswirkungen auch durch andere Verbindungen beeinflusst werden können. Dieses Problem wird durch Wirkung Stratierungsmethoden wie die Verwendung von Biomonitor gelöst, Bioindikator-Organismen, die Östrogen-Wirkung zeigen. Es ist bekannt, dass bestimmte Gene empfindlich auf Östrogen in lebenden Organismen reagieren.
Der Nachweis von Genprodukten durch molekulare Methoden ist auch auf Protein- oder mRNA-Ebene möglich, beinhaltet aber in der Regel Tieropfer. Die Tierschutzgesetze werden immer strenger, und die Nachfrage nach alternativen Testsystemen steigt. Die crossgenetischen Technologien stellen die Möglichkeit mit dieser Entwicklung dar und mit der Entdeckung fluoreszierender Proteine wurde der Weg für die Herstellung von Biomarkern geebnet.
Mit Hilfe einer solchen kann die Aktivierung von Östrogen-sensitiven Genen in vivo getestet werden. In diesem Video wird eine mögliche Methode zur Verwendung von vtg:1mCherry transgenen Zebrafischembryonen gezeigt, um östrogene Substanzen mit Hilfe von zwei Verbindungen zu testen. Das Protokoll kann als Hintergrund für die Untersuchung der Östrogenwirkung verschiedener chemischer oder Umweltproben auf Biomarker-Embryonen dienen.
Die Zebrafischlinie, die in unseren Experimenten verwendet wird, ist eine vitellogenin Reporter transgene Zebrafischlinie. Die Linie wurde mit dem Tol2 Transposon-System erstellt. Das für die Entwicklung verwendete Transgenkonstrukt trug die lange natürliche Vitellogenin-1-Promotorsequenz mit einer hohen Anzahl von ERI-Seiten.
Die Expression des fluoreszierenden Signals beim geschlechtsreifen Weibchen ist kontinuierlich. Bei Männern in Embryonen tritt dies jedoch nur durch die Wirkung oder das Vorhandensein östrogener Substanzen auf, so dass letztere besser für Tests geeignet sind. Die Empfindlichkeit und Verwendbarkeit der Embryonen der Linie wurde an mehreren östrogenen Verbindungen sowie an Umweltproben getestet.
Alle Versuche an lebenden Tieren wurden nach dem ungarischen Tierschutzgesetz durchgeführt und alle Studien wurden abgeschlossen, bevor die Tiere die freie Fütterung erreichten. Füllen Sie die Paarungstanks mit Systemwasser und stellen Sie die Fische für die Paarung der vor der Ernte Eier. Legen Sie männliche und weibliche Fische in den Tank und trennen Sie sie mit Hilfe eines Teilers.
Entfernen Sie den Teiler aus den Tanks, wenn sich das Licht am nächsten Morgen einschaltet. Überprüfen Sie die Paarungstanks alle 15 bis 20 Minuten auf Eier. Ernten Sie alle Embryonen mit einem Teesieb oder dicht gewebtem, feinem Netz und kombinieren Sie sie zu einer großen Petrischale mit E3-Puffer oder klarem Systemwasser.
Legen Sie die Embryonen in die Brutkästen eingestellt auf 25,5 Grad Celsius. Ein bis eineinhalb Stunden später unbefruchtete oder unzureichend geteilte Eier mit einer Kunststoff-Transferpipette unter einem Sezierendes Mikroskop entfernen und entsorgen. Legen Sie die ausgewählten Embryonen in die Behandlungsgefäße, z.B. in Petrischalen oder Gewebekulturplatten, die bereits gekennzeichnet und mit unterschiedlichen Konzentrationen der Prüfsubstanz gefüllt wurden.
Die Embryonen bis zum Ende des Experiments bei 25,5 Grad Celsius brüten. Erfrischen Sie die Testlösung, wenn dies zur Aufrechterhaltung der Behandlungskonzentration erforderlich ist. Seien Sie vorsichtig, wenn Sie die Testlösung ändern, um eine Beschädigung der Embryonen zu vermeiden.
Bereiten Sie vier Prozent Methoseladose mit ms 222 im Voraus vor. Legen Sie die fünf Tage alten Larven in eine fünf Zentimeter lange Petrischale pro Behandlungsgruppe mit einer Plastikpipette. Entfernen Sie die Behandlungslösung aus den Larven mit einer Kunststoffpipette, dann füllen Sie die Petrischale mit zwei Millilitern 0,02 Prozent ms 222 Anästhesielösung.
Füllen Sie jedes Quadrat einer speziell gestalteten 10-Zentimeter-Petrischale mit vier Prozent Methoseladose ms 222. Übertragen Sie die anästhesierten Larven auf methoseladose mit etwas Wasser in einem der beiden Quadrate. Vom ersten Quadrat die Larven in das zweite Quadrat übertragen.
Im zweiten Quadrat drehen und orientieren Larven auf der linken Seite und drücken Sie sie vorsichtig auf den Boden des mit einer Mikrolader Pipettenspitze bis zu zwei Zentimeter geschnitten. Um das Signal des ausgedrückten Reporters auszuwerten, bilden Sie die Embryonen in der gleichen Ansicht und Inden. Legen Sie die Petrischale auf die Bühne des Mikroskops.
Konzentrieren Sie sich auf die Leber des Embryos, und erfassen Sie ein helles Feldbild mit der zugehörigen Software. Schalten Sie das Mikroskop auf den mCherry-Filter um und nehmen Sie ein floreszierendes Bild der Leber unter fluoreszierendem Licht mit der zugehörigen Software auf. Wiederholen Sie die vorherigen beiden Schritte, bis Sie alle Embryonen im Experiment gefangen haben.
Öffnen Sie ImageJ, und laden Sie dann das fluoreszierende Bild hoch, das analysiert werden soll, indem Sie das Bild entweder ziehen und ablegen oder auf Datei öffnen klicken. Klicken Sie auf Bild, Farbe, Split-Kanäle, um das Bild des Floreszenzfilters entsprechend der RGB-Farbkarte aufzuteilen. Arbeiten Sie mit dem Roten Kanal-Bildspektrum.
Schließen Sie die anderen Kanäle. Legen Sie einen elliptischen Bereich in ähnlicher Größe im Bild fest, damit volle Signale die Auswertung nicht stören. Mit den ovalen Werkzeugen ziehen Sie eine Ellipse so genau wie möglich über den hervorgehobenen Leberbereich.
Wenn das Signal schwach ist, verwenden Sie leichte mikrospic Bilder, das helle Feldpaar des fluoreszierenden Bildes, um die Position der Leber zu bestimmen. Klicken Sie auf Analysieren, Messen, um die Signalstärke und die Größe des beeinten Bereichs zu bestimmen. Der integrierte Dichtewert wird automatisch von der Softwarespalte im Diagramm berechnet.
Setzen Sie die Analyse fort, indem Sie die vorherigen Schritte wiederholen, bis Sie alle Fluoreszenzbilder aller Embryonen in der Behandlungsgruppe analysieren. Speichern Sie die Daten, und analysieren Sie dann die integrierten Dichtewerte. Im Experiment wurden Östrogen-empfindliche Embryonen der Biomarker-Zebrafischlinie mit 0,5 und acht Mikromol-Konzentrationen von Alpha- und Beta-Zearalenol oder ZOL zur Befruchtung bis zum Alter von fünf Tagen behandelt.
Wir untersuchten, ob floreszierende Signale in der Leber des Fisches am Ende des Experiments aufgrund von Substanzen auftreten, und ob es Unterschiede in der Östrogenität der beiden Substanzen gibt. Die Ergebnisse wurden anhand von fluoreszierenden Bildern und integrierten Dichtewerten ausgewertet. Im Falle von alpha-ZOL starben bei der höchsten Testkonzentration alle Individuen.
In diesem Fall konnte das Fluoreszenzsignal also nicht untersucht werden. Bei niedrigeren Konzentrationen kann ein starkes fluoreszierendes Signal in der Leber des Embryos beobachtet werden. Ohne signifikanten Unterschied in der Stärke des fluoreszierenden Signals und der Größe der beleuchteten Bereiche.
Es gab auch keinen signifikanten Unterschied zwischen den integrierten Dichtewerten und den Behandlungen. Es gab keine Sterblichkeit während der Behandlung mit Beta-ZOL. Die Substanz induzierte Transgenaktivität in allen Behandlungskonzentrationen.
Die Zunahme der fluoreszierenden Signalintensität und die Größe des beleuchteten Bereichs können in den Fluoreszenzbildern beobachtet werden, wenn die Konzentration zunimmt. Durch die Untersuchung der integrierten Werte von beta-ZOL kann diese Veränderung auch erkannt werden. Der durchschnittliche integrierte Dichtewert verdoppelt sich fast zwischen der niedrigsten und der höchsten Behandlungskonzentration.
Bei Beta-ZOL haben wir jedoch keinen signifikanten Unterschied zwischen den integrierten Dichtewerten einzelner Konzentrationen gefunden. Durch die Untersuchung der integrierten Dichtewerte, die aus den gleichen Behandlungskonzentrationen der beiden Substanzen gewonnen wurden, kann gesagt werden, dass alpha-ZOL in jedem Fall höhere integrierte Dichtedurchschnitte im Verhältnis zu Beta-ZOL ergab, was mit den Unterschieden zwischen der Signalstärke in fluoreszierenden Bildern übereinstimmt. Dies ist in allen Konzentrationen signifikant.
Die Verwendung von Bioindikatoren für Östrogen-Effekte hat sich in toxikologischen Studien ausgebreitet. Mehrere transgene Linien, die Östrogen-Effekte zeigen, wurden auch von Zebrafischen produziert, von denen vtg:1mCherry in unseren Studien verwendet wurde. Die hier beschriebene Methode veranschaulicht ein mögliches Protokoll zur Prüfung von Embryonen dieser Linie, um den In-vivo-Nachweis der Östrogenaktivität bei reinen Wirkstoffen zu ermöglichen.
Es ist wichtig zu erwähnen, dass bei Embryonen die Expression des Transgens, ähnlich wie bei der Produktion von endogenem Vitellogenin, eine große Dispersion aufweist und Unterschiede in der individuellen Empfindlichkeit bei der Gestaltung von Experimenten berücksichtigt werden sollten. Ein wichtiger Aspekt bei der Bestimmung der Behandlungskonzentrationen ist, dass Zellen von Embryonen, einschließlich Leberzellen, durch höhere Konzentrationen hochgiftiger Substanzen geschädigt werden können, was zu einem Rückgang der Vitellogenin-Induktion führen kann. Daher sollten Tests in Konzentrationen unter L-C 10 durchgeführt werden.
Dieses Protokoll kann an vielen Punkten entsprechend den geplanten Testendpunkten und den zu testenden Proben geändert werden. Es kann mit anderen Testmethoden, z.B. molekularen Methoden, ergänzt werden. Daher hoffen wir, dass die Verwendung der vtg:1mCherry Linie als Modell für Östrogenitätstests erscheinen wird und möglicherweise auch ein Modell für standardisierte Testmethoden sein kann.
