Dieses Protokoll beschreibt die Etablierung eines neuartigen Mausmodells zur Untersuchung des Hautpilzes Malassezia und seiner Wechselwirkung mit der Säugetierhaut in vivo. Im Gegensatz zu In-vitro-Ansätzen ermöglicht dieses Infektionsmodell die Untersuchung angeborener und adaptiver Immunmechanismen gegen Malassezia in voller Komplexität und gewebespezifisch. Malassezia ist mit verschiedenen Hauterkrankungen verbunden, wie atopische Dermatitis.
Das Verständnis der Immunantwort auf Pilze kann neue Strategien zur Behandlung solcher häufigen und chronisch entzündlichen Hauterkrankungen bieten. Experimentelle Hautinfektion mit Malassezia bietet ein lang erwartetes Modell für die Untersuchung, wie hautkomische Pilze das Immunsystem modulieren und dadurch den Verlauf und die Schwere verschiedener Hauterkrankungen beeinflussen. Zur Zubereitung eines Malassezia inoculum summe 10 Milliliter flüssiges mDixon-Medium und drei bis fünf einzelne Malassezia-Kolonien von einer mDixon-Agarplatte zu einem sterilen 100-Milliliter-Erlenmeyerkolben hinzu.
Dann stellen Sie den Kolben bei 30 Grad Celsius und 180 Umdrehungen pro Minute für 48 bis 96 Stunden. Wenn die Kultur cremefarben und trüb ist, zwei Milliliter der Kultur in ein steriles Zwei-Milliliter-Mikrozentrifugenrohr übertragen und die Hefe durch Zentrifugation sedimentieren. Setzen Sie das Pellet in einem Milliliter PBS für eine zweite Zentrifugation wieder auf, gefolgt von einer Resuspension in einem Milliliter frischer PBS mit kräftiger Pipettierung.
Verdünnen Sie die Malassezia-Aufhängung 20 bis 50 Mal mit PBS, um sicherzustellen, dass der Messwert zwischen 0,1 und eins liegt, und messen Sie den OD 600 auf einem Spektrometer. Aliquot ein Volumen der Malassezia Suspension in PBS, die einem OD 600 von vier in einem sterilen Zwei-Milliliter-Rohr pro zu befallendem Tier entspricht und die Hefe durch Zentrifugation sedimentiert. Dann die Pellets in 200 Mikroliter nativem Olivenöl wieder aussetzen.
Um eine Malassezia-Infektion zu initiieren, bestätigen Sie einen Mangel an Reaktion auf Pedalreflex in einem sechs bis acht Wochen alten Weibchen C57 Black6 Maus und tragen Salbe auf die Augen des Tieres. Verwenden Sie einen Bremssattel, um die Dicke von zwei verschiedenen Bereichen beider Ohren zu messen, um die Berechnung der durchschnittlichen Dicke pro Ohr zu ermöglichen. Dann tragen Sie ein kleines Stück Klebeband auf die Haut eines Ohres auf, bevor Sie das Band mit einem neuen Stück Klebeband jedes Mal schnell von der Ohrhaut entfernen.
Nach dem verwenden Sie eine sterile Pipette, um 100 Mikroliter der Malassezia OlivenölSuspension auf die dorsale Seite jedes Ohres aufzutragen und 200 Mikroliter sterile, vorgewärmte 2%Glukoselösung subkutan in die Nuchalfalte zu injizieren, um den Stoffwechsel und die Rehydratation zu unterstützen. Dann lassen Sie die Maus auf einem Heizkissen für 30 Minuten mit Überwachung erholen, bevor Sie das Tier in seinen Käfig zurück. Verwenden Sie zu den entsprechenden Versuchszeitpunkten einen Bremssattel, um zwei verschiedene Bereiche jedes Mausohrs zu messen, um die Berechnung der durchschnittlichen Dicke pro Ohr zu ermöglichen.
Um die Pilzbelastung in der infizierten Haut zu messen, fügen Sie 500 Mikroliter sterile 0,05%NP40 in destilliertem Wasser und eine autoklavierte Stahlkugel mit fünf MilliliterDurchmesser zu einem Zwei-Milliliter-Mikrozentrifugenrohr pro Ohr hinzu und wiegen jedes Rohr auf einem Gleichgewicht. Als nächstes ernten Sie die Ohren von jedem Tier an der Basis und legen Sie das Gewebe in einzelne Röhren von NP40. Wiegen Sie jedes Rohr auf der Waage, um das Gewicht jeder Ohrprobe zu bestimmen, bevor Sie das Ohrgewebe sechs Minuten lang bei 25 Hertz homogenisieren.
Dann 100 Mikroliter jeder Probe auf mDixon Agarplatten verteilen und die Suspensionen homogen über den Agar verteilen, bevor die auf den Kopf gestellte Inkubation bei 30 Grad Celsius. Hier werden repräsentative Bilder für das Wachstum von Malassezia sympodialis im flüssigen mDixon-Medium und auf mDixon-Agar gezeigt, wie gezeigt. Eine Erhöhung der Ohrdicke kann nach Malassezia Furfur Anwendung auf die Haut beobachtet werden, die Barriere gestört wurde im Vergleich zu der ungestörten Haut von wilden Typ C57 Black6 Mäuse.
Tatsächlich zeigt die Quantifizierung der Zunahme der Ohrdicke im Laufe der Zeit, dass die Veränderung der Dicke im Vergleich zur mit Fahrzeugen behandelten Haut signifikant ist. Weiterhin liegt die Pilzbelastung in der Ohrenhaut am zweiten Tag nach einer Infektion mit Malassezia pachydermatis 100 bis 1000 Mal über der Nachweisgrenze. Malassezia neigt dazu, Aggregate zu bilden und ist nicht leicht aushängen.
Gewährleisten Sie daher die Homogenisierung der Ölpilzsuspension durch umfangreiches Wirbeln. Weitere Auslesungen können Histologie zur Bestimmung der Hautpathologie und die Isolierung von Immunzellen von der Haut und entwässernde Lymphknoten sein, um die antimykotische Immunantwort zu untersuchen. Dieses Modell eröffnet die Möglichkeit, die Immunantwort gegen Malassezia zu untersuchen und die Rolle des Pilzes als Komonal im Kontext verschiedener Hauterkrankungen zu untersuchen.
Malassezia-Arten werden in einigen Ländern als BSL-2-Organismen klassifiziert. Achten Sie darauf, die Vorschriften Ihrer lokalen Behörden zu befolgen und die entsprechenden Sicherheitsmaßnahmen zu ergreifen.
