Dieses Protokoll ist besonders relevant, da es die Erkennung und Auswahl einzelner Zellen aus einem Pool gemischter Zellen für die nachfolgende nachgelagerte Analyse mit einer Einzelzellenauflösung ermöglicht. Der Hauptvorteil dieser Technik ist das Potenzial, einzelne zirkulierende Tumorzellen oder CTCs von Blutzellen für eine Analysezulage zu trennen, die eine hohe Reinheit erfordern. Beginnen Sie mit dem Starten der Mikromanipulator-Software und dem Einschalten des Mikromanipulators.
Schließen Sie den Mikromanipulator an den Computer an, und klicken Sie auf Gerät verbinden und initialisieren, um den Roboterarm in der Mikroskopphase zu initialisieren. Reinigen Sie die Außen- und Innenflächen des Schutzschranks mit Ethanol und schließen Sie den Schutzschrank nach jeder Manipulation der Maschine, um das Gerät durch den Computer manövrieren zu können. Installieren Sie eine neue 20 bis 30 Mikrometer Glaskapillare auf dem Roboterarm und spülen Sie Systemöl durch das System, um Blasen in den Schläuchen zu entfernen.
Füllen Sie sterilisationsbehälter eins mit 70%Ethanol, Sterilisationstank zwei mit sterilem Nuklease-freiem Wasser und den Puffertank mit sterilem Dulbecco es PBS. Sterilisieren Sie die Kapillare zweimal mit 70% Ethanol und ersetzen Sie Sterilisationstank eins durch Sterilisationstank zwei, um die Sterilisationsfunktion zu verwenden, um die Kapillare mindestens dreimal in Wasser zu waschen. Starten Sie in der Mikromanipulator-Software ein neues Experiment und wählen Sie die Art des Kommissionierexperiments aus dem automatischen und dem manuellen Auswahlmodus aus.
Konfigurieren Sie das Decktablett, um die Positionen des Sterilisationsbehälters, puffern und ablagernden Fachs anzugeben, und legen Sie die Temperatur der Flüssigkeitstanks in der ausgewählten Ablageschale auf vier Grad Celsius fest. Positionieren Sie eine ultraniedrige Befestigungsplatte mit der freigesetzten CTC-Lösung unter dem Mikroskop im Mikromanipulatorschrank. Entfernen Sie den Deckel von der Platte und schließen Sie den Schrank.
Zentrifugieren Sie eine 384-Well-Platte mit 20 MikroliterCT-Kulturmedium pro Brunnen, um sicherzustellen, dass das Medium an der Unterseite jedes Brunnens sequestriert wird, und legen Sie die Platte in das Ziel eine Position der vier Grad Celsius ausgewählten Ablageschale. Wählen Sie manuell das Mikroskopobjektiv für die Kommissionierung und die Belichtungszeit aller notwendigen Kanäle aus. Wählen Sie Brunnennavigator anzeigen aus, um den Abholtellertyp zu visualisieren und auszuwählen.
Kalibrieren Sie dann eine Aufnahmeposition in der Mitte des Brunnens, der die CTC-Lösung enthält, ohne Zellen in der Mitte des Sichtfeldes. Verwenden Sie den Sensor, um den Boden der Platte vorsichtig mit einer Kapillare zu berühren und die Aufnahmeposition auf 0,05 Millimeter über dem Boden der Platte einzustellen. Senken Sie den Roboterarm vorsichtig um 10 Mikrometer auf eine Zeit, um eine Beschädigung der Kapillare zu vermeiden.
Wählen Sie den Zellentyp und die Entnahmeparameter aus. Wählen Sie für die Einzelzellenauswahl den manuellen Modus aus. Verwenden Sie den Joystick, um die Glaskapillare innerhalb des Brunnens zu navigieren und legen Sie die Kapillare auf eine einzelne Zelle von Interesse mindestens einen Millimeter von der Brunnengrenze.
Fügen Sie dann manuell Partikel hinzu und wählen Sie Aktivierte Partikel auswählen, um mit der Kommissionierung zu beginnen. Wenn alle Zellen entnommen wurden, zentrifugieren Sie die Platte, um die Zellen am Boden jedes Brunnens zu sedimentieren. Bio-Amino-Färbung mit Anti-Epithel-Zell-Adhäsionsmolekül-Antikörper ermöglicht die Visualisierung von Krebszellen in der Suspension mit einer genauen Unterscheidung von CD45-positiven Ereignissen.
Die präzise CTC-Isolierung zeichnet sich durch die Aspiration nur des gewünschten Ziels ohne die umgebenden Schadstoffzellen aus. Als vermutet, CTC-Cluster zeigen eine Erhöhung des Überlebens im Vergleich zu einzelnen CTCs, was zu Zellkolonien innerhalb von 56 Tagen nach in-vitro-Kultur führt. Insbesondere zeigen CTC-Cluster auch eine höhere Proliferationsrate und erreichen somit höhere endgültige Zellzahlen, was darauf hindeutet, dass der direkte Kontakt mit anderen Tumorzellen einen Einfluss auf die Lebensfähigkeit der Tumorzellen und die Proliferationsrate hat.
Die einzellige RNA-Sequenzierung von CTCs, die direkt von Brustkrebspatientinnen isoliert wurden, zeigt eine T-verteilte stochastische Nachbareinbettung von Einzelzellen, die aus einzelnen CTCs, CTC-Clustern oder CTC-Weißblutzellclustern abgeleitet wurden. Denken Sie daran, die Glaskapillare zu installieren, um Luftblasen innerhalb des Fluidsystems des Mikromanipulators zu entfernen und die Aufnahmeposition zu kalibrieren, um eine effiziente Einzelzellenkommissionierung zu gewährleisten. Die Einzelzellen können für die Sequenzierung der nächsten Generation gesät oder weiterverarbeitet werden, um eine Ex-vivo-Analyse und CTC-Charakterisierung in einer einzelzelligen Auflösung zu ermöglichen, um den metastasierenden Prozess zu untersuchen.
