Das Ziel der Methode in unserem Manuskript ist es also, eine vergleichende Analyse der Signalwege in myeloischen Zellen mit Hilfe von Menschen- und Maussystemen zu ermöglichen. Es hilft zu definieren, welcher Signalweg nach dem Vorbild ausgewählter Mustererkennungsrezeptoren beteiligt ist. Diese Methode ist also einfach zu implementieren.
Es stützt sich auf primäre Zellpräparate und validierte Referenzverbindungen, die für die Aufklärung von Signalmechanismen unerlässlich sind. Demonstriert wird das Verfahren von Ratiba Touil und Adeline Unterreiner, bzw. Wissenschaftlerin und wissenschaftliche Mitarbeiterin in unserer Gruppe. In einer laminaren Fließhaube wurde eine sterile Schere, ein Ein-Liter-Becher und eine Plastiktüte aufgestellt.
Legen Sie den zuvor erhaltenen Buffy-Mantel in den Becher und verwenden Sie die Schere, um es vorsichtig zu öffnen. Mit einer 25-mm-Pipette 100 ml PBS hinzufügen, ergänzt mit 2 Millimolar EDTA. Mischen Sie durch langsames Pipettieren nach oben und unten.
Und dann 25 ml der verdünnten Buffy-Schicht in sechs 50 ml konische Zentrifugenröhrchen geben, die jeweils mit 15 ml Polysaccharid-basiertem Dichtegradienten vorgefüllt wurden. Zentrifugieren Sie die Rohre für 20 Minuten bei 800 g mit moderater Beschleunigung ohne Bruch, um eine Trennung der Zellen auf der Grundlage ihrer Dichte zu ermöglichen. Nach der Zentrifugation werden drei Schichten sichtbar sein, ein Pellet mit roten Blutkörperchen und Granulozyten, eine obere Schicht aus Plasma und ein weißer Ring, der periphere mononukleäre Blutzellen enthält.
Verwenden Sie eine 10 ml Pipette, um die PBMC-Ringe zu ernten und in eine neue 50 ml Tube zu übertragen. Aufladen mit PBS und EDTA. Führen Sie drei aufeinanderfolgende Wäbungen mit abnehmender Zentrifugationszeit und -geschwindigkeit durch, wie im Textprotokoll beschrieben.
Nach der letzten Wäsche das Pellet in 25 ml eiskalter Lysepuffer wieder aufsetzen, um die roten Blutkörperchen durch osmotischen Druck zu lysen. Inkubieren Sie die Lösung bei Raumtemperatur, bis klar wird. Fügen Sie dann 25 ml Trennpuffer hinzu, um die Reaktion zu stoppen.
Zentrifuge bei 150 g für acht Minuten, um die Lösung zu waschen. Den Überstand abgießen und das Pellet mit Trennpuffer wieder aufhängen. Nach dem Zählen der Zellen, verdünnen Sie sie in Kulturmedium bis zu 12, 500 Zellen pro Brunnen.
Verteilen Sie 30 ml dieser Zellsuspension in jeden Brunnen einer 384 Brunnenplatte. Als nächstes fügen Sie 15 Mikroliter viermal konzentrierte Zusammengesetzte Lösungen zu jedem Brunnen und preinkubieren die Platte bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid für eine Stunde. Auf Wunsch entweder LPS zur Endkonzentration von 1 ng pro ml oder dezimiertes Zymosan auf eine Endkonzentration von 100 mcg pro ml.
Dann inkubieren Sie die Platte über Nacht bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid. Am nächsten Tag nehmen Sie 10 Mikroliter des Überstandes, um die abgesonderten TNF-Alpha-Spiegel zu messen. Um die serielle Verdünnung zu beginnen, verdünnen Sie die MLT-827-Stammlösung mit Medium, um eine Konzentration von 8 Mikromolaren in einem Rutsch zu erreichen.
Führen Sie eine sechsstufige 1:5-Serienverdünnung mit Medium mit 0,08%DMSO durch. Zur Vorbereitung auf Einzeldosis-Tests, verdünnen Sie die MLT-827, AFN700, und zusammengesetzt 11 Stock-Lösungen mit Medium, um eine Konzentration von 4 Mikromolar in einem Rutsch zu erreichen. Fügen Sie zunächst 2 ml steriles Endotoxin-freies Wasser zu 10 mg dezimiertem Zymosan hinzu.
Vortex diese Lagerlösung, um sie zu homogenisieren. Aliquot die Lösung und dann speichern Sie die Aliquots bei 20 Grad Celsius. In dieser Studie werden menschliche PBMCs und Mausmilzzellen entweder mit dezimiertem Zymosan, einem Dectin-1-Agonisten, oder Lipopolysaccharid, einem TL4-Agonisten, stimuliert.
DIE NTNF-Alpha-Freisetzung im Überstand wird nach 20 Stunden gemessen. Sowohl in den Human- als auch in der Maus-Assays blockiert die MLT-827-Verbindung selektiv die TNF-Alpha-Produktion, die durch den Dectin-1-Signalweg, aber nicht durch den TLR4-Signalweg angetrieben wird. In Monozyten, die mit LPS stimuliert werden, wird die Produktion von TNF alpha fast vollständig durch AFN700 aufgehoben, aber es ist nicht empfindlich gegenüber Cpd11, was mit der Abhängigkeit des TLR4-Pfades von Der NF-kappa B-Aktivität und seiner Unabhängigkeit von SIC-Aktivität übereinstimmt.
Im Gegensatz dazu zeigt die Von-Dectin-1- und MODCs angetriebene TNF-Alpha-Produktion eine Empfindlichkeit gegenüber MLT-827, AFN700 und Cpd11. Dies liefert weitere Beweise für die Beteiligung einer SIC CBM-Signalkaskade im Dectin-1-Signalweg. Die Produktion von IL-1 beta, IL-6 und IL-23 ist auch empfindlich auf die drei Inhibitoren, was auf Regulatorische Mechanismen ähnlich TNF alpha hinweist.
Die begrenzte Wirkung auf die Produktion von IL-8 deutet jedoch darauf hin, dass dieses Zytokin einen eigenen Regulierungsmechanismus hat. Die Anhebung der Trehalose-Dibehenat-Konzentrationen über 50 mcg pro ml führt zur Produktion von TNF alpha, IL-6 und IL-1 beta, die auf MALT1 Paracaspase-Aktivität nach der blockierenden Wirkung von MLT-827 beruhte. Ähnliche Ergebnisse wurden gesehen, wenn die MODCs mit zunehmenden Konzentrationen von erschöpftem Zymosan herausgefordert wurden, um Dectin-1 zu stimulieren.
Diese Methode ermöglichte es zu zeigen, dass die Paracaspase MALT1 selektiv die C-Typ-Lectin-ähnliche Rezeptor-Signalisierung reguliert. Es ist wichtig, gut charakterisierte Referenzverbindungen zu verwenden. Achten Sie auf das Verfahren zur Verdünnung von Lagerlösungen.
Dies ist entscheidend für Verbindung mit begrenzter Löslichkeit.
