Diese Studie wurde unterstützt durch eine Beihilfe für Scientific Research (C) der Japan Society für Promotion of Science (JSPS) (Nr. 15 K 08397), Tomoaki Kahyo und Zuschüsse aus der Japan-Agentur für medizinische Forschung und Entwicklung (AMED) (Nr. 927960719), Beihilfe für die Explorative Forschung (Nr. 16K 15256), Ausgaben für assoziierte Projekte eines Incentive spezielle Budgets für die Förderung einer Reform der Nationaluniversität in Management Kosten Zuschüsse (Nr. 1019253) und das Rauchen Forschungsgemeinschaft Haruhiko Sugimura. Die Autoren danken Dr. Iwaizumi und Dr. Kurachi für ihre klinische Unterstützung. Die Geldgeber hatten keine Rolle bei der Erstellung des Manuskripts. Abbildung 3 Abbildung 4und Tabelle 4 sind angepasst und nachgedruckt aus einem Artikel von Kahyo Et al. 10, mit freundlicher Genehmigung von Elsevier.

Das Design der Studie wurde von der institutionellen Review Boards von Hamamatsu University School of Medicine (G-260-4) genehmigt. Schriftliche Einwilligung wurde von den Patienten und seine Eltern eingeholt.
1. Kontrolle der Qualität von genomischer DNA
Hinweis: Genomic DNA (gDNA) wurde aus dem peripheren Blut mit der etablierten Silica-Membran-basierten DNA-Reinigung-Methode extrahiert. Im Vorfeld der der folgenden Verfahren, war die Konzentration des gDNA mit einem Spektralphotometer bestimmt.
<ol><li>Die gDNA-Probe in einer Konzentration von 10 – 100 ng/µL vorbereiten.</li>
	<li>Fügen Sie 10 µL Probenpuffer DNA zu einem 8-Rohr-Strip.</li>
	<li>Die Röhren 1 µL DNA-Leiter oder gDNA hinzufügen. Wirbel die Mischung für 1 min mit dem Mikrotestplatte Anlage.</li>
	<li>Legen Sie das Rohr, die Gel-Gerät und Pipette Spitzen in der Elektrophorese instrument (Table of Materials) und den Durchlauf durch Drücken der Taste "Start" starten. Hinweis: Die Elektrophorese-System funktioniert automatisch mit einem Klick auf die Schaltfläche "Start".</li>
	<li>Bestätigen Sie, dass die untere Markierung in der DNA-Probe-Puffer enthalten korrekt auf der Electropherograms zugewiesen ist. Wenn es nicht ordnungsgemäß zugeordnet ist, manuell weisen Sie zu, die Markierung im "Electroherogram Modus" der Software. Hinweis: Die DNA-Integrität-Anzahl (DIN) wird automatisch berechnet. Der DIN Wert stammt aus der DNA-Integrität. Hohe und niedrige geben DIN Werte sehr intakt und stark degradierten gDNA, beziehungsweise.</li>
	<li>Geben Sie die Größe eines Bereichs von gDNA (> 200 bp) in der "Region-Modus" der Software zur automatischen Berechnung die Konzentration von gDNA (> 200 bp).</li>
</ol>(2) Primer und Sonde Design
<ol><li>Berechnen Sie die schmelzende (Tm)-Temperaturwerte mit einem beliebigen open-Access-Tool unter folgenden Bedingungen: 10 – 25 Basen, 50 mM Na+/+k, dNTPs 0,80 mM und 3 mM Mg2 + (Table of Materials). Entwerfen Sie die Forward- und reverse Primer, die genomische Region mit Ziel Allele mit T-m -Wert ca. 60 ° C und die Länge der Amplifikate bei 100 – 300 bp zu verstärken. Hinweis: Siehe Tabelle 1 für die Konzentration der Oligonukleotide.</li>
	<li>Design der verschlossene Nukleinsäure (LNA) für die Referenz und Variante Allel Sonden basiert auf den folgenden Bedingungen: (i) 1 – 6 LNAs sind in jeder Probe; (Ii) einem Fluoreszenzfarbstoff und einen Quencher befinden sich an der 5'- und 3'-Abfertigungseinrichtungen für jede Sonde bzw.; (Iii) der Unterschied zwischen den T-m -Werten der abgestimmten und nicht übereinstimmenden Sonden ist > 10 ° C; (iv) Tm -Werte der abgestimmten und nicht übereinstimmenden Sonden sind höher und niedriger als die der Primer, bzw. [z.B., forward Primer: 60,8 ° C, rückwärts-Primer: 59,8 ° C, Referenzfühler Allel (angepasst/stimmen nicht überein): 62.6/45.3 ° C, Variante Allel-Sonde (angepasst/stimmen nicht überein): 61.7/50.5 ° C]. Die T-m -Werte wurden berechnet mit dem open-Access-Tool auch für Schritt 2.1 verwendet.</li>
	<li>Sicherstellen Sie, dass die gestaltete Primer und Sonden nicht Einzel-Nukleotid-Polymorphismen mit einer Häufigkeit von > 0,1 umfassen % aus Datenbanken [z. B.die Single Nucleotide Polymorphismus-Datenbank (DbSNP)] ermittelt.</li>
</ol>3. digitale PCR
<ol><li>Bereiten Sie den Primer und Sonden gDNA Stammlösungen in den Konzentrationen, die in Tabelle 1 beschrieben mit einem TE-Puffer und speichern Sie diese-20 – 4 ° C.</li>
	<li>
Mischen der Reagenzien bei Raumtemperatur in einem Gesamtvolumen von 15 µL, eine Endkonzentration, wie in Tabelle 1 beschrieben.
	<ol>
<li>Fügen Sie 3 µL destilliertes Wasser anstelle von gDNA in einer keine-Template-Kontrolle (NTC).</li>
		<li>Bereiten Sie 3,5 x die Menge der PCR Mischung in dreifacher Ausfertigung zu pipettieren Fehler ausmachen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Pipette die PCR Mischung rauf und runter, um es zu mischen.</li>
	<li>Legen Sie die Ladefläche auf den Chips gebaut im 8-Rohr-Streifen und legen sie auf der Autoloader. Sicherstellen Sie, dass ein zwischen dem Chip und der Ladefläche Kontakt.</li>
	<li>Passt einen Laden-Schieberegler auf der Plattform und halten Sie den Schieberegler mit dem Stopper aus den Loader.</li>
	<li>Pipette 15 µL des PCR-Gemisches auf der Plattform in der Nähe der Spitze des Schiebers (Abb. 1A).</li>
	<li>Starten Sie den Loader durch Drücken der Taste des Laders (für ca. 1 min). Hinweis: Es ist kein Problem, wenn eine kleine Menge des PCR Mischung auf der Plattform bleibt. Es ist möglich, die nacheinander den Loader erneut ausführen.</li>
	<li>Legen Sie die Chip-in-a-Rohr gefüllt mit PCR Mischung an der Seite der Dichtung Enhancer. Drücken Sie die Folie Deckel und dem Rand der oberen Deckel, kein Bruch der Chip (Abbildung 1B).</li>
	<li>Führen Sie die Abdichtung Enhancer (ca. 2 min). Die Abdichtung Enhancer für 1 min erneut sequenziell ausgeführt, wenn eine Pfütze Flüssigkeit noch sichtbar ist, weil eine unvollständige Abdichtung eine Kreuzkontamination der positiven Signale (Zahlen 1 und 1 D) verursacht.</li>
	<li>Fügen Sie 230 µL Flüssigkeit, ein Öl-basierten Reagenz auf die Rohre abdichten. Hinweis: Die Chips sollten jetzt in die Flüssigkeit eingetaucht werden.</li>
	<li>Setzen Sie die Rohre in den Thermocycler. Führen Sie den Thermocycler, wie in Tabelle 2 (für ca. 2 h) beschrieben. Stellen Sie die Temperatur oder die Dauer der PCR ist eine ungleichmäßige Verteilung der positiven Partitionen (Abbildung 1E). Hinweis: Es empfiehlt sich, legen Sie die Ramp-Rate auf etwa 1 ° C/s.</li>
	<li>Verlassen Sie die Rohre in den Thermocycler für mindestens 15 Minuten um die Basislinie Rauschen zu reduzieren. Hinweis: Die Rohre können sowie über Nacht bleiben. Fluoreszenz-Signale wurden auch am folgenden Tag entdeckt.</li>
	<li>Legen Sie die Rohre auf die Erkennung Jig und Jig Gießen Sie 6 mL destilliertem Wasser. Wenn Luftblasen innerhalb und außerhalb der Rohre sichtbar sind, deaktivieren sie (Zahlen 1F und 1 G).</li>
	<li>Laden Sie die Vorrichtung in den Detektor und führen Sie es mit einem Klick auf die Schaltfläche "Ausführen" der Software nach der Auswahl des Fluorescene, Experiment und Probe/NTC Registerkarten (Table of Materials). Hinweis: Die dual Farberkennung von acht Proben mit einer Standardintensität dauert ca. 4-5 Minuten.</li>
	<li>Das positionsdiagramm, Histogramm und 2D Streudiagramm zu bestätigen. Hinweis: iIf der Fluoreszenzintensität der negativen Partitionen ist hoch, die Intensität, mit einem Klick auf die Schaltfläche "Einstellungen" der Software so einstellen, dass es innerhalb des Bereichs von 30 – 70 liegt.</li>
	<li>Berechnen Sie die Variante Allel Bruchteil (VAF) mithilfe der folgenden Formel: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/58199/58199eq1.jpg"> Hier sind Lebenslauf und Cr heftnummern die Variante und die Referenz-Allel. Hinweis: sie werden automatisch in das Software-Programm, basierend auf Poisson Statistiken berechnet.</li>
</ol>4. Sammlung von PCR-Produkt
<ol><li>Entfernen Sie die Dichtung Flüssigkeit aus der Tube.</li>
	<li>Hinzu kommt das Rohr 100 µL TE-Puffer. Vortex kräftig für 30 s und kurz Zentrifuge der Röhre.</li>
	<li>Übertragen Sie die TE-Lösung auf einem anderen Gefäß und 30 µL 3 M Natriumacetat und 200 µL Ethanol.</li>
	<li>Kühlen Sie die Lösung bei-20 ° C über Nacht.</li>
	<li>Die Lösung für 30 min bei 16.000 X g Zentrifugieren und den überstand zu entfernen.</li>
	<li>Am Rohr und Wirbel 300 µL von 80 % Ethanol hinzufügen.</li>
	<li>Die Lösung für 15 min bei 16.000 X g Zentrifugieren und den überstand zu entfernen. Lassen Sie den Niederschlag 5 min an der Luft trocknen.</li>
	<li>Den Niederschlag in 1 – 5 µL TE-Puffer nach Lufttrocknung zu lösen.</li>
	<li>Falls erforderlich, bewerten Sie die Produktgröße mit einem Elektrophorese-Instrument mit Bezug auf Schritt 1. 1 µL der Lösung mit dem Gel-Gerät für eine hohe Sensitivität (Table of Materials) zu laden.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Majumdar, N., Wessel, T., Marks, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+PCR+modeling+for+maximal+sensitivity,+dynamic+range+and+measurement+precision.">Digital PCR modeling for maximal sensitivity, dynamic range and measurement precision.</a> PLoS One. 10 (3), 0118833 (2015).</li><li>Huggett, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+digital+MIQE+guidelines:+Minimum+Information+for+Publication+of+Quantitative+Digital+PCR+Experiments.">The digital MIQE guidelines: Minimum Information for Publication of Quantitative Digital PCR Experiments.</a> Clinical Chemistry. 59 (6), 892-902 (2013).</li><li>Chen, L., Liu, P., Evans, T. C., Ettwiller, L. 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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymerase+chain+reaction:+basic+protocol+plus+troubleshooting+and+optimization+strategies.">Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies.</a> Journal of Visualized Experiments. (63), e3998 (2012).</li><li>Cao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+digital+polymerase+chain+reaction+(dPCR)+and+its+emerging+biomedical+applications.">Advances in digital polymerase chain reaction (dPCR) and its emerging biomedical applications.</a> Biosensors and Bioelectronics. 90, 459-474 (2017).</li><li>. Bio-Rad Laboratories Available from: <a target="_blank" href="https://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/Isr/literature/Bulletin_6311.pdf">https://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/Isr/literature/Bulletin_6311.pdf</a> (2018)</li><li>. Thermo Fisher Scientific Available from: <a target="_blank" href="https://www.garvan.org.au/research/capabilities/molecular-genetics/documents/qs-3d-user-guide.pdf">https://www.garvan.org.au/research/capabilities/molecular-genetics/documents/qs-3d-user-guide.pdf</a> (2013)</li></ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

DIN-Wert dient oft beschädigte DNA (z.B. gDNA aus Formalin fixierten Paraffin-eingebetteten Gewebe) vor der Quantifizierung oder Sequenzierung, zu beurteilen, da eine fortgeschrittene Schädigung der gDNA minderwertige Daten führen kann. DIN Bewertung wird somit ein wichtiger Schritt in der Qualitätskontrolle von menschlichen gDNA11. Da die gDNA in der repräsentativen Experiment verwendet 4 – 11 Jahre nach der Extraktion aus Blut bei 4 ° C aufbewahrt wurden, wurden die DIN-Werte für eine Qualitätskontrolle vor der dPCR-Assay bestimmt. Dieser Schritt ist besonders empfohlen, wenn die Materialien verdächtigt werden, beschädigt werden. Die Konzentration des gDNA wurde auch durch Elektrophorese bestimmt. Da der Dynamikbereich des dPCR nicht so breit wie für qPCR aufgrund der Einschränkungen der Partitionen ist, ist ein Maß für die Konzentration gDNA ein wichtiger Schritt für eine erfolgreiche dPCR Assay. Als die Menge an Eingaben DNA wurde mit der gesamtcopy Variante und Referenz Allele in der dPCR Assay korreliert (R-Quadrat = 0.935; ( Tabelle 4), Elektrophorese eignet sich zur Messung der Konzentration der gDNA vor dPCR Assay.
Das Laden und Abdichtung Prozesse sind wichtige Schritte für erfolgreiche Ergebnisse. Es ist entscheidend für die entsprechende Montage der PCR Mischung auf der Plattform zu bestätigen und sichern den Kontakt zwischen dem Chip und der Plattform (Abb. 1A). Vorwölbung des PCR Mischung aus den Schieberegler kann ungültige Verteilung auf dem Chip. Bestätigt die Verteilung der positiven und negativen Partitionen auf einem positionsdiagramm ist auch notwendig für eine genaue Analyse, da davon ausgegangen wird, in der Poisson-Statistik, dass DNA-Templates nach dem Zufallsprinzip in Kammern1unterteilt sind. In die repräsentativen Ergebnisse wurden den Chip (Abbildung 3) positive Partitionen verteilt. Dieses Ergebnis erfüllt die Anforderung Poisson Statistiken und zeigt, dass das Laden und Versiegelungsverfahren wirksam waren. Wenn die Rohre in die Abdichtung Enhancer einrichten, die Chips könnte gebrochen werden wenn der zentrale Teil der oberen Deckel zu stark gedrückt wird (Abbildung 1B). Um dies zu vermeiden, schieben Sie die Kante der oberen Deckel. Wenn es ist eine künstliche Ansammlung von positiven Partitionen (Abbildung 1-D), kann die Kopienzahl aufgrund einer Kreuzkontamination zwischen Partitionen überschätzt werden. Die Abdichtung Verfahren sollte verbessert werden, wenn eine Pfütze von Flüssigkeit auf der Oberfläche (Abbildung 1C) sichtbar ist (z. B.durch erneutes Ausführen nacheinander die Abdichtung Enhancer für 1 min). Ist eine ungleichmäßige Verteilung der positiven Partitionen (Abbildung 1E), kann die Kopienzahl aufgrund unzureichender Verstärkung oder Kontamination der Abdichtung Flüssigkeit und Wasser unterschätzt werden. Die PCR-Bedingungen sollte angepasst werden, in diesem Fall [z. B.durch tuning die Temperatur oder die Dauer der PCR (Schritt 3.11 des Protokolls), oder dadurch, dass die Abdichtung Flüssigkeit und Wasser gegossen in die Vorrichtung sauber sind]. Fluoreszenz-Signale werden von den 8-Röhre Streifen eingetaucht in destilliertem Wasser entdeckt. Wenn Luftblasen an der Rohroberfläche halten, gibt es die Möglichkeit, dass sie die Signalerkennung (Abb. 1F) eingreifen können. Daher sollte die Bläschen mit einem Tool wie eine feine PIPETTENSPITZE geklärt werden. Darüber hinaus können Luftblasen im Inneren der Rohre bilden, wenn sie in der Spannvorrichtung (Abbildung 1G) festgelegt sind. Wenn die Bläschen im Inneren der Rohre groß genug sind, um den Chip zu decken, sollten sie auch gelöscht werden. Die Bläschen können klar, wenn man sie für einige Minuten bei Raumtemperatur.
Der NTC könnte einige positive Partitionen erkannt werden. Zur Vermeidung eine Kontamination der DNA-Vorlagen halten Sie die Bank sauber zu und wenn möglich, machen Sie eine saubere Unterkunft mit einem Ventilator-Filter-Einheit. Bei auf eine Kontamination der DNA Vorlagen Verdacht gründlich reinigen Sie den Raum bzw. verwerfen Sie die verwendeten Reagenzien zu. Im Gegensatz dazu, wenn die positiven Partitionen des Referenz-Allels in Anwesenheit von gDNA nicht erkannt werden, bestätigen Sie die Konzentrationen der gDNA, Primer und Sonden. Insbesondere wurden die Primer bei einer niedrigeren Konzentration im repräsentativen Experiment, im Vergleich zu konventionellen PCR (Tabelle 1)12verwendet. Es ist auch entscheidend für die Ramp-Rate, zu bestätigen, die selten in der konventionellen PCR verändert wird.
Was dPCR mit dem Chip-in-Rohr-Format einzigartig macht, ist die Aufteilung der PCR Mischung innerhalb der universal 8-Röhre Streifen8,13. Eine Übertragung der Partitionierung Kammern in ein PCR-Röhrchen ist nicht in diesem System erforderlich, wodurch das Kontaminationsrisiko. Es gibt auch ein Vorteil im dPCR System mit Chip-in-Rohr-Format; Es dauert 4 h < bis Ende 96 Tests in diesem dPCR System, während es mindestens 5 h dauert, die gleiche Anzahl von Assays in Tröpfchen-basierte dPCR14zu beenden. Darüber hinaus ermöglicht die universelle 8-Röhre Streifen die Verwendung von einem konventionellen Thermocycler, im Gegensatz zu Chip-basierte dPCR weitere15, wonach ein Thermocycler mit einem flachen Block. Außerdem können das angesammelte Wissen und Reagenzien für die konventionelle PCR auf dPCR System angewendet werden. Dies wird für die Erweiterung der Anwendungen von dPCR hilfreich sein.
Es sei darauf hingewiesen, dass diese dPCR mehrere Einschränkungen hat. In dPCR mit dem Chip-in-Rohr-Format ist die Partitionsnummer des Chips relativ gering im Vergleich zu denen in anderen dPCR Plattformen. Weitere Verbesserung mit dem Chip-Gerät müssen den Dynamikbereich zu erhöhen, die abhängig von der Anzahl der Partitionen. Da der Innenraum der universal Röhre begrenzt ist, ist eine bahnbrechendes Design für die Chip-Gerät erforderlich, um die Anzahl der Partitionen erhöht. Die Automatisierung des gesamten dPCR Verfahrens in Zukunft würde erheblich vermindern, menschliches Versagen, was zu noch zuverlässigere Ergebnisse. Wegen seiner hohen Durchsatz und hochempfindlichen Natur soll dPCR mit Chip-in-Rohr-Format angewendet werden, um eine Anzahl von Proben für flüssigen Biopsien und Umwelt DNA zu behandeln.

Quantitative PCR (qPCR) wird häufig verwendet, um menschliche genetische Variation, darunter Einzel-Nukleotid-Varianten (SNVs) und DNA-Kopie Nummer Variationen (CNV) zu quantifizieren. In qPCR eine Polymerase-Reaktion wird in jedem Röhrchen auf die gleiche Weise wie bei der konventionellen Endpunkt PCR durchgeführt und eine Verstärkung Signal aus der Tube nach jedem thermischen Zyklus erworben wird. Dagegen in dPCR, d. h. Endpunkt dPCR in diesem Bericht die PCR Mischung wird geladen in vielen mikroskopisch kleinen Kammern, Partitionen bezeichnet, wo DNA-Vorlagen sind präsentieren oder fehlt eine begrenzende Verdünnung und jede Partition, die mit PCR Mischung als bewertet wird nach der vollständigen PCR positiv oder negativ. Es ist, zwar einfach zu schätzen, dass es keine DNA-Vorlagen in den negativen Partitionen ist unklar, wie viele Kopien der DNA-Templates in die positive Partitionen vorhanden sind. Daher ist die Anzahl der DNA-Vorlagen in den positiven Partitionen anhand der Poisson-Verteilung, über die Anzahl von negativen Partitionen1geschätzt. dPCR ist teurer und hat ein kleineren Dynamikbereich qPCR verglichen, aber diese Methode ermöglicht eine absolute Quantifizierung und bietet eine höhere Empfindlichkeit und größere Genauigkeit2.
Eine der Hauptanwendungen von dPCR ist die Validierung der Varianten von Next Generation Sequencing (NGS) identifiziert. Insbesondere bei seltenen Varianten, Bedeutung niedrige Variante Brüche, unbedingt Validierung durch Sequenzierung in NGS3auftretende Fehler. Während Sanger-Sequenzierung und qPCR sind nützliche Tools für die Validierung von SNVs und CNV, ihre Sensitivität ist gering im Vergleich zu dPCR. Daher ist dPCR Technologie gefragt für genetische Studien Umgang mit seltenen Varianten. Vor kurzem ist die Erkennung von flüssigen Biopsie von seltenen Varianten, die im Zusammenhang mit Krebs Eigenschaften, wie z.B. Resistenzen, ein heißes Thema in der molekularen Diagnostik und Therapie4geworden. Die dPCR Technologie für flüssigbiopsie Studien geeignet erscheint und wird voraussichtlich in naher Zukunft wichtige klinische Anwendungen haben, obwohl Verbesserungen im Zusammenhang mit der Dynamik und Kosten müssen noch umgesetzt werden.
Handelsüblichen dPCR Technologie kann grob in Tröpfchen und Chip-basierten Plattformen eingeteilt werden; der Unterschied ist wie die DNA-Templates sind partitionierte5,6,7. In der dPCR mit Chip-in-Rohr-Format ist die PCR Mischung durch die Kapillarwirkung in die Partitionen auf einem Chip verteilt. Die Chips sind in acht-Schlauch Streifen, welche viele Labormitarbeiter bereits mit vertraut werden, gebaut und somit acht Proben können zu einer Zeit8behandelt werden. In der Lesung Schritt dauert es < 1 h, 96 Proben zu behandeln, indem er das gesamte Bild des Chips und nicht jede Partition erkennt. Da dPCR mit dem Chip-in-Rohr-Format einen hohen Durchsatz im Vergleich zu anderen Systemen dPCR hat, sind Benutzerfreundlichkeit und Produktivität die wichtigsten Vorteile für die Nutzer.
In diesem Bericht somatische Mosaikbildung des APC -Gens bei einem Patienten mit sporadischen familiäre adenomatöse Polyposis dient als repräsentativer Fall und die Ergebnisse der dPCR und NGS verglichen. Der Hauptzweck dieses Berichts soll eine Einzel-Nukleotid-Variante mit dPCR mit dem Chip-in-Rohr-Format eindeutig zu quantifizieren. Wir hoffen, dass dieser Bericht hilfreich für Forscher bei der Verabschiedung der dPCR Plattform für ihre eigene Arbeit interessiert ist.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:772px;" width="771">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:147px;">QIAamp DNA Blood Maxi Kit</td>
			<td style="width:147px;">Qiagen</td>
			<td style="width:188px;">51194</td>
			<td style="width:291px;">Before Protocol 1: Extraction of genomic DNA</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:147px;">NanoDrop 1000</td>
			<td style="width:147px;">ThermoFisher SCIENTIFIC</td>
			<td style="width:188px;">ND-8000</td>
			<td>Before Protocol 1: Spectrophotometer</td>
		</tr>
		<tr height="81">
			<td height="81" style="height:81px;width:147px;">8-strip tube</td>
			<td style="width:147px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:188px;">401428</td>
			<td>Protocol 1</td>
		</tr>
		<tr height="98">
			<td height="98" style="height:98px;width:147px;">Genomic DNA sample buffer</td>
			<td style="width:147px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:188px;">5067-5366</td>
			<td style="width:291px;">Protocol 1: 
			A component of Genomic DNA Screen Tape Assay</td>
		</tr>
		<tr height="83">
			<td height="83" style="height:83px;width:147px;">DNA ladder</td>
			<td style="width:147px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:188px;">5067-5366</td>
			<td style="width:291px;">Protocol 1: 
			A component of Genomic DNA Screen Tape Assay</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:147px;">MS3 Basic Small Shaker</td>
			<td style="width:147px;">IKA</td>
			<td style="width:188px;">3617000</td>
			<td>Protocol 1: Vortex mixer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:147px;">Genomic DNA ScreenTape</td>
			<td style="width:147px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:188px;">5067-5365</td>
			<td>Protocol 1: Gel device</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:147px;">2200 TapeStation system</td>
			<td style="width:147px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:188px;">G2965AA</td>
			<td>Protocol 1: Electrophoresis instrument</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:147px;">TapeStation Analysis Software</td>
			<td style="width:147px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:188px;">Bundled with G2965AA</td>
			<td>Protocol 1: Analysis software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:147px;">DNA oligo primers</td>
			<td style="width:147px;">IDT</td>
			<td style="width:188px;">Custom order</td>
			<td>Protocol 2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:147px;">LNA probes</td>
			<td style="width:147px;">IDT</td>
			<td style="width:188px;">Custom order</td>
			<td>Protocol 2</td>
		</tr>
		<tr height="51">
			<td height="51" style="height:51px;width:147px;">Software tool</td>
			<td style="width:147px;">IDT</td>
			<td style="width:188px;">Web site: http://biophysics.idtdna.com/</td>
			<td>Protocol 2</td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:147px;">dbSNP database</td>
			<td style="width:147px;">NCBI</td>
			<td style="width:188px;">Web site: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/</td>
			<td>Protocol 2</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:147px;">TE buffer</td>
			<td style="width:147px;">ThermoFisher SCIENTIFIC</td>
			<td style="width:188px;">12090015</td>
			<td>Protocol 3</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:147px;">DNase/RNase-Free Distilled Water</td>
			<td style="width:147px;">ThermoFisher SCIENTIFIC</td>
			<td style="width:188px;">10977015</td>
			<td>Protocol 3 (Table 1)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:147px;">Clarity Digital PCR Probe Mastermix</td>
			<td style="width:147px;">JN Medsys</td>
			<td style="width:188px;">12013</td>
			<td style="width:291px;">Protocol 3 (Table 1): 2xPCR Master Mix 
			A component of #10011</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:147px;">Clarity Sealing Fluid</td>
			<td style="width:147px;">JN Medsys</td>
			<td style="width:188px;">12005</td>
			<td style="width:291px;">Protocol 3: Sealing fluid 
			A component of #10011</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:147px;">Clarity JN Solution</td>
			<td style="width:147px;">JN Medsys</td>
			<td style="width:188px;">12006</td>
			<td style="width:291px;">Protocol 3 (Table 1): 20xdPCR solution 
			A component of #10011</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:147px;">Clarity Tube-strip</td>
			<td style="width:147px;">JN Medsys</td>
			<td style="width:188px;">12007</td>
			<td style="width:291px;">Protocol 3: Chip-in-a-tube 
			A component of #10011</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:147px;">Clarity Sample Loading Kit</td>
			<td style="width:147px;">JN Medsys</td>
			<td style="width:188px;">12008</td>
			<td style="width:291px;">Protocol 3: Loading platform and slider 
			A component of #10011</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:147px;">Clarity Auto Loader</td>
			<td style="width:147px;">JN Medsys</td>
			<td style="width:188px;">11002</td>
			<td style="width:291px;">Protocol 3: Auto loader 
			A component of #10001</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:147px;">Clarity Sealing Enhancer</td>
			<td style="width:147px;">JN Medsys</td>
			<td style="width:188px;">11003</td>
			<td style="width:291px;">Protocol 3: Sealing enhancer 
			A component of #10001</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:147px;">Clarity Reader</td>
			<td style="width:147px;">JN Medsys</td>
			<td style="width:188px;">11004</td>
			<td style="width:291px;">Protocol 3: Reader 
			A component of #10001</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:147px;">Life Eco Thermal Cycler</td>
			<td style="width:147px;">Bioer Technology</td>
			<td style="width:188px;">TC-96GHbC</td>
			<td>Protocol 3: Thermal cycler</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:147px;">Clarity Software</td>
			<td style="width:147px;">JN Medsys</td>
			<td style="width:188px;">Bundled with #10001</td>
			<td style="width:291px;">Protocol 3: Analysis software</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:147px;">High Sensitivity D1000 screen tape</td>
			<td style="width:147px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:188px;">5067-5584</td>
			<td>Protocol 4: Gel device for high sensitivity</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

digital polymerase chain reaction assay for the genetic variation in a sporadic familial adenomatous polyposis patient using the chip-in-a-tube format

Die Quantitative Analyse der menschlichen genetischen Variation ist entscheidend für das Verständnis der molekularen Eigenschaften des schweren Erkrankungen leiden, wie z. B. Tumoren. Da digitale Polymerase-Kettenreaktion (PCR) die genaue Quantifizierung der DNA-Kopie Zahl Varianten ermöglichen, werden sie ein wesentliches Instrument zur Erkennung von seltenen genetischen Variationen, wie z.B. Medikamenten-resistenten Mutationen. Es wird erwartet, dass Molekulare Diagnostik mittels digitaler PCR (dPCR) in naher Zukunft in der klinischen Praxis verfügbar sind; so, wie man effizient dPCR mit menschlichen Erbgut durchzuführen ist ein heißes Thema. Hier stellen wir eine Methode zur Erkennung adenomatöse Polyposis coli (APC) somatische Mosaikbildung mit dPCR mit der Chip-in-Rohr-Format, das acht dPCR Reaktionen gleichzeitig durchgeführt werden kann. Beim Füllen und verschließen das Reaktionsgemisch auf den Chips ist Vorsicht geboten. Dieser Artikel veranschaulicht, wie die über- und Unterschätzung der positiven Partitionen zu vermeiden. Ausserdem stellen wir ein einfaches Verfahren zum Sammeln von dPCR Produkt von Partitionen auf die Chips, die dann verwendet werden können, um die spezifische Verstärkung zu bestätigen. Wir hoffen, dass dieser Bericht hilft die dPCR mit der Chip-in-Rohr-Methode in der genetischen Forschung zu fördern.

Wir überprüften somatische Mosaikbildung des APC -Gens bei einem Patienten mit sporadischen familiäre adenomatöse Polyposis gemäß den oben beschriebenen Verfahren. In einer früheren Studie, die APC c.834 + 2 t > C Mutation fand sich bei den Patienten, aber nicht in ihrer Eltern, mit Sanger-Sequenzierung und NGS9. Die Entwürfe der Primer und Sonden verwendet in die repräsentativen Ergebnisse sind in Tabelle 3dargestellt. Genomischer DNA wurde aus dem Blut der Probanden, die Eltern und sechs gesunden Spendern gewonnen. Die DIN-Werte der neun gDNA Proben reichten bis 6,7 – 7,9 (Abbildung 2 und Tabelle 4). FAM und HEX als Fluoreszenz-Farbstoffen für die C und T Allel bzw. dienten. Die grünen und gelben Flecken auf die Position Grundstücke stellen FAM-positiv und HEX-positiven Partitionen bzw.(Abbildung 3). Die blauen Flecken sind negative Partitionen für FAM und HEX. Der schwarze Hintergrund entspricht Partitionen, wo das Reaktionsgemisch nicht hinzugefügt wurde. Viele positive Partitionen C und T Allele wurden in der Probanden nachgewiesen, während einige positive Partitionen für das C-Allel in der proband Vater oder der NTC festgestellt wurden und in den letzteren, positiven Partitionen des T Allel nicht erkannt wurden. Die Signaltrennung zwischen C und T Allele war klar auf das zweidimensionale (2D) Streudiagramm, und die meisten positiven Signale des HEX und FAM waren einander (Abbildung 3B). VAF von den Probanden war 13,2 %, das ist ähnlich wie mit NGS (12,7 %) ermittelt (Tabelle 4). Die VAFs der Probanden Eltern und gesunden Spendern waren < 0,1 %. Die Nachweisgrenze für die APC -c.834 + 2 t > C Mutation wurde auf 0,3 % geschätzt mit 3 x die Standardabweichung für die wiederholten Messungen mit 10 – 11 ng des gesamten gDNA10.
Die Größe der Amplifikate in dPCR Assay für APC c.834 + 2 t > C wurde vorhergesagt, 123 bp. Um zu bestätigen, dass das dPCR Produkt wie ein einzelnes Band verstärkt wurde, war das dPCR Produkt aus dem definierten Chip gesammelt. Elektrophorese, ein single-Band wurde klar erkannt und die Produktgröße Stand im Einklang mit der Vorhersage (Abbildung 4).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58199/58199fig1.jpg"> Abbildung 1 : Punkte, die für die dPCR Assay mit Chip-in-Rohr-Format beachten. (A) dieses Panel zeigt, wie der 8-Röhre Streifen in den Autoloader einrichten. (B) dieses Panel zeigt defekte Chips. (C) dieses Panel zeigt wie der Chip kurz nach (i) be- und (Ii) Abdichtung Oberflächen. (Iii) eine Pfütze von Flüssigkeit ist im Falle einer unvollständigen Abdichtung sichtbar. (D) dieses Panel zeigt das positionsdiagramm im Falle einer Kreuzkontamination. (E) dieses Panel zeigt das positionsdiagramm bei einer ungleichmäßigen Verteilung. (F) dieses Panel zeigt Luftblasen wie auf der Rohroberfläche in Wasser getaucht. (G) dieses Panel zeigt Luftblasen im Inneren der Röhre. Während die gesamte Figur schwarz-weiß Pfeilspitzen zeigen defekten Chip Stücke und Luftblasen, beziehungsweise. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58199/58199fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58199/58199fig2.jpg"> Abbildung 2 : Vertreter Electropherograms von Blut gDNA. Electropherograms von Blut gDNA mit DIN-Werten von 6,7 und 7,9 erscheinen im oberen und unteren Bereich. Das Sternchen gibt einen niedrigeren Marker. DIN: DNA-Integrität-Nummer. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58199/58199fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58199/58199fig3.jpg"> Abbildung 3 : Repräsentative Ergebnisse der APC somatische Mosaikbildung dPCR mit dem Chip-in-Rohr-Format verwenden. (A) die Position Grundstücke und (B) Scatterplots keine-Template-Kontrolle (NTC), der proband und der Vater sind hier zu sehen. HEX und FAM entsprechen bzw. die Referenz und Variante Allel. Vertikalen und horizontale Linien zeigen die Schwellen von HEX und FAM Intensitäten, beziehungsweise. Diese Zahl wurde von Kahyo Et Al. modifiziert 10. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58199/58199fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58199/58199fig4.jpg"> Abbildung 4 : Sammlung von dPCR Produkte aus dem definierten Chip. Die gesammelten und konzentrierte dPCR Produkte wurden Elektrophorese unterzogen. Die prognostizierte Zielgröße war 123 bp. Diese Zahl wurde von Kahyo Et Al. modifiziert 10. NTC: keine-Template-Kontrolle. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58199/58199fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Reagenz</td>
			<td>Konzentration der Stammlösung</td>
			<td>Volumen (μL)</td>
			<td>Endkonzentration</td>
			<td>Empfohlen Endkonzentration</td>
		</tr>
<tr>
<td>DNase/RNase-freie destilliertes Wasser</td>
			<td>-</td>
			<td>1.75</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>2 x PCR Master mix</td>
			<td>-</td>
			<td>7.5</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>LNA-Sonde für große Allel</td>
			<td>2 ΜM</td>
			<td>0,5</td>
			<td>66,7 nM</td>
			<td>3.33 – 100 nM</td>
		</tr>
<tr>
<td>LNA-Sonde für kleinere Allel</td>
			<td>2 ΜM</td>
			<td>0,5</td>
			<td>66,7 nM</td>
			<td>3.33 – 100 nM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Forward primer</td>
			<td>1 ΜM</td>
			<td>0,5</td>
			<td>33,3 nM</td>
			<td>3.33 – 50,0 nM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Rückwärts-primer</td>
			<td>1 ΜM</td>
			<td>0,5</td>
			<td>33,3 nM</td>
			<td>3.33 – 50,0 nM</td>
		</tr>
<tr>
<td>20 x dPCR Lösung</td>
			<td>-</td>
			<td>0,75</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>gDNA</td>
			<td>3.33 ng/μl</td>
			<td>3</td>
			<td>666 Pg/μL</td>
			<td>20 Pg/μL – 2.000 Pg/μl1
</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 1: Reagenzien für die dPCR Assay. 1 Je nach erwarteter Präzision und Feingefühl.
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Schritt</td>
			<td>Temperatur</td>
			<td>Zeit</td>
			<td>Zyklen</td>
		</tr>
<tr>
<td>Initial denaturieren</td>
			<td>95 ° C</td>
			<td>5 m</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>Denaturieren Glühen und Erweiterung</td>
			<td>95 ° C 58 ° C</td>
			<td>50 s 90 s</td>
			<td>42</td>
		</tr>
<tr>
<td>Letzte Erweiterung</td>
			<td>70 ° C</td>
			<td>5 m</td>
			<td>1</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 2: Thermocycler Bedingungen.
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Name</td>
			<td>Sequenz1</td>
			<td>Tm Wert2</td>
		</tr>
<tr>
<td>Forward primer</td>
			<td>5'-GGTCAAGGAGTGGGAGAAATC-3 '</td>
			<td>60,8 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Rückwärts-primer</td>
			<td>5'-TCTTAGAACCATCTTGCTTCATACT-3 '</td>
			<td>59,8 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>LNA-Sonde für T Allel</td>
			<td>5'-HEX-ATTT [A] CCTGACCA-IBFQ-3 "</td>
			<td>Abgestimmt: 62,6 ° C Nicht übereinstimmende: 45,3 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>LNA-Sonde für C-Allel</td>
			<td>5'-FAM-TTT [G] CCTGACC-IBFQ-3 "</td>
			<td>Abgestimmt: 61,7 ° C Nicht übereinstimmende: 50,5 ° C</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 3: Gestaltung der Primer und Sonden. 1 Klammern und unterstrichenen Buchstaben sind die LNA und gezielte Variante bzw.. 2 Nach Schritt 2 des Protokolls berechnet.
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>NGS3</td>
			<td colspan="4">dPCR4</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">Beispiel1</td>
			<td rowspan="2">Gewebe</td>
			<td rowspan="2">Eingabe DNS (ng)</td>
			<td rowspan="2">DIN2</td>
			<td rowspan="2">VAF (%)</td>
			<td rowspan="2">Variante (Kopien)</td>
			<td rowspan="2">Referenz (Kopien)</td>
			<td colspan="2">VAF (%)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Meine</td>
			<td>RSD</td>
		</tr>
<tr>
<td>NTC</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>1.23</td>
			<td>0</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
<tr>
<td>Proband</td>
			<td>Blut</td>
			<td>11.3</td>
			<td>7.6</td>
			<td>12.7</td>
			<td>379</td>
			<td>2,48 x 103
</td>
			<td>13.2</td>
			<td>0.0353</td>
		</tr>
<tr>
<td>Vater</td>
			<td>Blut</td>
			<td>10.3</td>
			<td>7.7</td>
			<td>0.0167</td>
			<td>1.08</td>
			<td>3,42 x 103
</td>
			<td>0.0341</td>
			<td>0.439</td>
		</tr>
<tr>
<td>Mutter</td>
			<td>Blut</td>
			<td>10.8</td>
			<td>7.6</td>
			<td>0.0136</td>
			<td>0.956</td>
			<td>3,04 x 103
</td>
			<td>0.0313</td>
			<td>0,637</td>
		</tr>
<tr>
<td>Spender-1</td>
			<td>Blut</td>
			<td>11.7</td>
			<td>7.3</td>
			<td>-</td>
			<td>1.64</td>
			<td>3.01 x 103
</td>
			<td>0.0543</td>
			<td>0.414</td>
		</tr>
<tr>
<td>Spender-2</td>
			<td>Blut</td>
			<td>10.5</td>
			<td>7.6</td>
			<td>-</td>
			<td>1.06</td>
			<td>2,90 x 103
</td>
			<td>0,0406</td>
			<td>0.539</td>
		</tr>
<tr>
<td>Spender-3</td>
			<td>Blut</td>
			<td>17.6</td>
			<td>7.9</td>
			<td>-</td>
			<td>4.24</td>
			<td>5,65 x 103
</td>
			<td>0.0713</td>
			<td>0.783</td>
		</tr>
<tr>
<td>Spender-4</td>
			<td>Blut</td>
			<td>12.3</td>
			<td>7.6</td>
			<td>-</td>
			<td>2.38</td>
			<td>4.16 x 103
</td>
			<td>0.0666</td>
			<td>0.557</td>
		</tr>
<tr>
<td>Spender-5</td>
			<td>Blut</td>
			<td>19.2</td>
			<td>7</td>
			<td>-</td>
			<td>1,48</td>
			<td>6,79 x 103
</td>
			<td>0.0213</td>
			<td>0.571</td>
		</tr>
<tr>
<td>Spender-6</td>
			<td>Blut</td>
			<td>14.4</td>
			<td>6.7</td>
			<td>-</td>
			<td>3.44</td>
			<td>4.67 x 103
</td>
			<td>0.0728</td>
			<td>0.729</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 4: Ergebnisse der dPCR assay für APC somatische Mosaikbildung. 1 NTC: keine-Template-Kontrolle; Spender: gesunden Spenders. 2 DIN: DNA-Integrität-Nummer. 3 Iwaizumi Et al. 9, Hum Genom var. 2 15057 (2015). 4 Die Experimente wurden in dreifacher Ausfertigung und unabhängig wiederholten 3 X laufen; die Daten sind als Mittelwert ausgedrückt; RSD: relative Standardabweichung; N/a: nicht zutreffend. Die Tabelle wurde von Kahyo Et Al. modifiziert 10.

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Digital Polymerase Chain Reaction Assay for the Genetic Variation in a Sporadic Familial Adenomatous Polyposis Patient Using the Chip-in-a-tube Format

Digitalen Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ist ein nützliches Werkzeug zum hochempfindlichen Nachweis von Einzel-Nukleotid und DNA-Kopie Zahl Varianten. Hier zeigen wir wichtige Überlegungen zur Messung der seltenen Varianten im menschlichen Genom mittels digitaler PCR mit dem Chip-in-Rohr-Format.

Digitalen Polymerase-Kettenreaktion-Assay für die genetische Variation bei einem sporadischen familiäre adenomatöse Polyposis Patienten mit dem Chip-in-Rohr-Format

The quantitative analysis of human genetic variation is crucial for understanding the molecular characteristics of serious medical conditions, such as ...

digital-polymerase-chain-reaction-assay-for-genetic-variation

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Cancer Research

10.8K Aufrufe.  Hamamatsu University School of Medicine. Digitalen Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ist ein nützliches Werkzeug zum hochempfindlichen Nachweis von Einzel-Nukleotid und DNA-Kopie Zahl Varianten. Hier zeigen wir wichtige Überlegungen zur Messung der seltenen Varianten im menschlichen Genom mittels digitaler PCR mit dem Chip-in-Rohr-Format.

Serie: Digital Polymerase Chain Reaction Assay for the Genetic Variation in a Sporadic Familial Adenomatous Polyposis Patient Using the Chip-in-a-tube Format

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the context of a whole organism. Sophisticated techniques to generate genetic mosaics facilitate induction of visually marked, genetically defined clones surrounded by normal tissue. The clones can be analyzed through diverse molecular, cellular and omics approaches. This study describes how to generate fluorescently labeled clonal tumors of varying malignancy in the eye/antennal imaginal discs (EAD) of Drosophila larvae using the Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker (MARCM) technique. It describes procedures how to recover the mosaic EAD and brain from the larvae and how to process them for simultaneous imaging of fluorescent transgenic reporters and antibody staining. To facilitate molecular characterization of the mosaic tissue, we describe a protocol for isolation of total RNA from the EAD. The dissection procedure is suitable to recover EAD and brains from any larval stage. The fixation and staining protocol for imaginal discs works with a number of transgenic reporters and antibodies that recognize Drosophila proteins. The protocol for RNA isolation can be applied to various larval organs, whole larvae, and adult flies. Total RNA can be used for profiling of gene expression changes using candidate or genome-wide approaches. Finally, we detail a method for quantifying invasiveness of the clonal tumors. Although this method has limited use, its underlying concept is broadly applicable to other quantitative studies where cognitive bias must be avoided.

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

This protocol demonstrates how to generate fluorescently marked, genetically defined clonal tumors in the Drosophila eye/antennal imaginal discs (EAD). It describes how to dissect the EAD and brain from the third instar larvae and how to process them to visualize and quantify gene expression changes and tumor invasiveness.

Das<em&gt; Drosophila</em&gt; Imaginalscheibe Tumormodell: Visualisierung und Quantifizierung von Genexpression und Tumorinvasivität mit Genetischen Mosaiken

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

Forschung

Krebsforschung

A Comprehensive Procedure to Evaluate the In Vitro Performance of the Putative Hemangioblastoma Neovascularization Using the Spheroid Sprouting Assay

The inactivation of the von Hippel-Lindau (VHL) tumor suppressor gene plays a crucial role in the development of hemangioblastomas (HBs) within the human central nervous system (CNS). However, both the cytological origin and the evolutionary process of HBs (including neovascularization) remain controversial, and anti-angiogenesis for VHL-HBs, based on classic HB angiogenesis, have produced disappointing results in clinical trials. One major obstacle to the successful clinical translation of anti-vascular treatment is the lack of a thorough understanding of neovascularization in this vascular tumor. In this article, we present a comprehensive procedure to evaluate in vitro whether classic tumor angiogenesis exists in HBs, as well as its role in HBs. With this procedure, researchers can accurately understand the complexity of HB neovascularization and identify the function of this common form of angiogenesis in HBs. These protocols can be used to evaluate the most promising anti-vascular therapy for tumors, which has high translational potential either for tumors treatment or for aiding in the optimization of the anti-angiogenic treatment for HBs in future translations. The results highlight the complexity of HB neovascularization and suggest that this common form angiogenesis is only a complementary mechanism in HB neovascularization.

A Comprehensive Procedure to Evaluate the In Vitro Performance of the Putative Hemangioblastoma Neovascularization Using the Spheroid Sprouting Assay

This paper presents a comprehensive procedure to evaluate in vitro whether classic tumor angiogenesis exists in hemangioblastomas (HBs) and its role in HBs. The results highlight the complexity of HB-neovascularization and suggest that this common form of angiogenesis is only a complementary mechanism in the HB-neovascularization.

Ein umfassendes Verfahren zur Bewertung der In-vitro- Leistung von der vermeintlichen Hämangioblastom Neovaskularisation mit den Sphäroid sprießen Assay

The inactivation of the von Hippel-Lindau (VHL) tumor suppressor gene plays a crucial role in the development of hemangioblastomas (HBs) within the human ...

Modeling Osteosarcoma Using Li-Fraumeni Syndrome Patient-derived Induced Pluripotent Stem Cells

Li-Fraumeni syndrome (LFS) is an autosomal dominant hereditary cancer disorder. Patients with LFS are predisposed to a various type of tumors, including osteosarcoma--one of the most frequent primary non-hematologic malignancies in the childhood and adolescence. Therefore, LFS provides an ideal model to study this malignancy. Taking advantage of iPSC methodologies, LFS-associated osteosarcoma can be successfully modeled by differentiating LFS patient iPSCs to mesenchymal stem cells (MSCs), and then to osteoblasts--the cells of origin for osteosarcomas. These LFS osteoblasts recapitulate oncogenic properties of osteosarcoma, providing an attractive model system for delineating the pathogenesis of osteosarcoma. This manuscript demonstrates a protocol for the generation of iPSCs from LFS patient fibroblasts, differentiation of iPSCs to MSCs, differentiation of MSCs to osteoblasts, and in vivo tumorigenesis using LFS osteoblasts. This iPSC disease model can be extended to identify potential biomarkers or therapeutic targets for LFS-associated osteosarcoma.

Here, we present a protocol for the generation of induced pluripotent Stem Cells (iPSCs) from Li-Fraumeni Syndrome (LFS) patient derived fibroblasts, differentiation of iPSCs via mesenchymal stem cells (MSCs) to osteoblasts, and modeling in vivo tumorigenesis using LFS patient-derived osteoblasts.

Modellierung von Osteosarkom mit Li-Fraumeni-Syndrom, die Patienten abgeleitet induzierten pluripotenten Stammzellen

Li-Fraumeni syndrome (LFS) is an autosomal dominant hereditary cancer disorder. Patients with LFS are predisposed to a various type of tumors, including ...

Patient-derived Heterogeneous Xenograft Model of Pancreatic Cancer Using Zebrafish Larvae as Hosts for Comparative Drug Assessment

Patient-derived tumor xenograft (PDX) and cell-derived tumor xenograft (CDX) are important techniques for preclinical assessment, medication guidance and basic cancer researches. Generations of PDX models in traditional host mice are time-consuming and only working for a small proportion of samples. Recently, zebrafish PDX (zPDX) has emerged as a unique host system, with the characteristics of small-scale and high efficiency. Here, we describe an optimized methodology for generating a dual fluorescence-labeled tumor xenograft model for comparative chemotherapy assessment in zPDX models. Tumor cells and fibroblasts were enriched from freshly-harvested or frozen pancreatic cancer tissue at different culture conditions. Both cell groups were labeled by lentivirus expressing green or red fluorescent proteins, as well as an anti-apoptosis gene BCL2L1. The transfected cells were pre-mixed and co-injected into the 2 dpf larval zebrafish that were then bred in modified E3 medium at 32 &#176;C. The xenograft models were treated by chemotherapy drugs and/or BCL2L1 inhibitor, and the viabilities of both tumor cells and fibroblasts were investigated simultaneously. In summary, this protocol allows researchers to quickly generate a large amount of zPDX models with a heterogeneous tumor microenvironment and provides a longer observation window and a more precise quantitation in assessing the efficiency of drug candidates.

This protocol describes optimization procedures in a virus-based dual fluorescence-labeled tumor xenograft model using larval zebrafish as hosts. This heterogeneous xenograft model mimics the tissue composition of pancreatic cancer microenvironment in vivo and serves as a more precise tool for assessing drug responses in personalized zPDX (zebrafish patient-derived xenograft) models.

Patientenabgeleitetes heterogenes Xenograft-Modell von Bauchspeicheldrüsenkrebs mit Zebrafischlarven als Wirte für vergleichende Arzneimittelbewertung

Patient-derived tumor xenograft (PDX) and cell-derived tumor xenograft (CDX) are important techniques for preclinical assessment, medication guidance and ...

Droplet Digital TRAP (ddTRAP): Adaptation of the Telomere Repeat Amplification Protocol to Droplet Digital Polymerase Chain Reaction

The telomere repeat amplification protocol (TRAP) is the most widely used assay to detect telomerase activity within a given a sample. The polymerase chain reaction (PCR)-based method allows for robust measurements of enzyme activity from most cell lysates. The gel-based TRAP with fluorescently labeled primers limits sample throughput, and the ability to detect differences in samples is restricted to two fold or greater changes in enzyme activity. The droplet digital TRAP, ddTRAP, is a highly sensitive approach that has been modified from the traditional TRAP assay, enabling the user to perform a robust analysis on 96 samples per run and obtain absolute quantification of the DNA (telomerase extension products) input within each PCR. Therefore, the newly developed ddTRAP assay overcomes the limitations of the traditional gel-based TRAP assay and provides a more efficient, accurate, and quantitative approach to measuring telomerase activity within laboratory and clinical settings.

Droplet Digital TRAP ddTRAP: Adaptation of the Telomere Repeat Amplification Protocol to Droplet Digital Polymerase Chain Reaction

We successfully converted the standard telomere repeat amplification protocol (TRAP) assay to be employed in droplet digital polymerase chain reactions. This new assay, called ddTRAP, is more sensitive and quantitative, allowing for better detection and statistical analysis of telomerase activity within various human cells.

Tröpfchendigital TRAP (ddTRAP): Anpassung des Telomere Repeat Amplification Protocol an die Reaktion auf die digitale Polymerase Chain Reaction

The telomere repeat amplification protocol (TRAP) is the most widely used assay to detect telomerase activity within a given a sample. The polymerase ...

Detection and Monitoring of Tumor Associated Circulating DNA in Patient Biofluids

Complications associated with upfront and repeat surgical tissue sampling present the need for minimally invasive platforms capable of molecular sub-classification and temporal monitoring of tumor response to therapy. Here, we describe our dPCR-based method for the detection of tumor somatic mutations in cell free DNA (cfDNA), readily available in&#160;patient biofluids. Although limited in the number of mutations that can be tested for in each assay, this method provides a high level of sensitivity and specificity. Monitoring of mutation abundance, as calculated by MAF, allows for the evaluation of tumor response to therapy, thereby providing a much-needed supplement to radiographic imaging.

Here, we present a protocol to detect tumor somatic mutations in circulating DNA present in patient biological fluids (biofluids). Our droplet digital polymerase chain reaction (dPCR)-based method enables quantification of the tumor mutation allelic frequency (MAF), facilitating a minimally invasive complement to diagnosis and temporal monitoring of tumor response.

Nachweis und Überwachung von tumorassoziierter zirkulierender DNA in Biofluiden von Patienten

Complications associated with upfront and repeat surgical tissue sampling present the need for minimally invasive platforms capable of molecular ...

Oncogenic Gene Fusion Detection Using Anchored Multiplex Polymerase Chain Reaction Followed by Next Generation Sequencing

Gene fusions frequently contribute to the oncogenic phenotype of many different types of cancer. Additionally, the presence of certain fusions in samples from cancer patients often directly influences diagnosis, prognosis, and/or therapy selection. As a result, the accurate detection of gene fusions has become a critical component of clinical management for many disease types. Until recently, clinical gene fusion detection was predominantly accomplished through the use of single-gene assays. However, the ever-growing list of gene fusions with clinical significance has created a need for assessing fusion status of multiple genes simultaneously. Next generation sequencing (NGS)-based testing has met this demand through the ability to sequence nucleic acid in massively parallel fashion. Multiple NGS-based approaches that employ different strategies for gene target enrichment are now available for use in clinical molecular diagnostics, each with its own strengths and weaknesses. This article describes the use of anchored multiplex PCR (AMP)-based target enrichment and library preparation followed by NGS to assess for gene fusions in clinical solid tumor specimens. AMP is unique among amplicon-based enrichment approaches in that it identifies gene fusions regardless of the identity of the fusion partner. Detailed here are both the wet-bench and data analysis steps that ensure accurate gene fusion detection from clinical samples.

This article details the use of an anchored multiplex polymerase chain reaction-based library preparation kit followed by next-generation sequencing to assess for oncogenic gene fusions in clinical solid tumor samples. Both wet-bench and data analysis steps are described.

Onkogene Genfusionsdetektion mit verankerter Multiplex-Polymerase-Kettenreaktion gefolgt von Sequenzierung der nächsten Generation

Gene fusions frequently contribute to the oncogenic phenotype of many different types of cancer. Additionally, the presence of certain fusions in samples ...

Enhanced Viability for Ex vivo 3D Hydrogel Cultures of Patient-Derived Xenografts in a Perfused Microfluidic Platform

Patient-derived xenografts (PDX), generated when resected patient tumor tissue is engrafted directly into immunocompromised mice, remain biologically stable, thereby preserving molecular, genetic, and histological features, as well as heterogeneity of the original tumor. However, using these models to perform a multitude of experiments, including drug screening, is prohibitive both in terms of cost and time. Three-dimensional (3D) culture systems are widely viewed as platforms in which cancer cells retain their biological integrity through biochemical interactions, morphology, and architecture. Our team has extensive experience culturing PDX cells in vitro using 3D matrices composed of hyaluronic acid (HA). In order to separate mouse fibroblast stromal cells associated with PDXs, we use rotation culture, where stromal cells adhere to the surface of tissue culture-treated plates while dissociated PDX tumor cells float and self-associate into multicellular clusters. Also floating in the supernatant are single, often dead cells, which present a challenge in collecting viable PDX clusters for downstream encapsulation into hydrogels for 3D cell culture. In order to separate these single cells from live cell clusters, we have employed density step gradient centrifugation. The protocol described here allows for the depletion of non-viable single cells from the healthy population of cell clusters that will be used for further in vitro experimentation. In our studies, we incorporate the 3D cultures in microfluidic plates which allow for media perfusion during culture. After assessing the resultant cultures using a fluorescent image-based viability assay of purified versus non-purified cells, our results show that this additional separation step substantially reduced the number of non-viable cells from our cultures.

This protocol demonstrates methods to enable extended in vitro culture of patient-derived xenografts (PDX). One step enhances overall viability of multicellular cluster cultures in 3D hydrogels, through straightforward removal of non-viable single cells. A secondary step demonstrates best practices for PDX culture in a perfused microfluidic platform.

Verbesserte Lebensfähigkeit für Ex vivo 3D Hydrogelkulturen von patientenabgeleiteten Xenografts in einer perfused Microfluidic Platform

Patient-derived xenografts (PDX), generated when resected patient tumor tissue is engrafted directly into immunocompromised mice, remain biologically ...

Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells

Metastasis, the primary cause of morbidity and mortality for most cancer patients, can be challenging to model preclinically in mice. Few spontaneous metastasis models are available. Thus, the experimental metastasis model involving tail-vein injection of suitable cell lines is a mainstay of metastasis research. When cancer cells are injected into the lateral tail-vein, the lung is their preferred site of colonization. A potential limitation of this technique is the accurate quantification of the metastatic lung tumor burden. While some investigators count macrometastases of a pre-defined size and/or include micrometastases following sectioning of tissue, others determine the area of metastatic lesions relative to normal tissue area. Both of these quantification methods can be exceedingly difficult when the metastatic burden is high. Herein, we demonstrate an intravenous injection model of lung metastasis followed by an advanced method for quantifying metastatic tumor burden using image analysis software. This process allows for investigation of multiple end-point parameters, including average metastasis size, total number of metastases, and total metastasis area, to provide a comprehensive analysis. Furthermore, this method has been reviewed by a veterinary pathologist board-certified by the American College of Veterinary Pathologists (SEK) to ensure accuracy.

Intravenous injection of cancer cells is often used in metastasis research, but the metastatic tumor burden can be difficult to analyze. Herein, we demonstrate a tail-vein injection model of metastasis and include a novel approach to analyze the resulting metastatic lung tumor burden.

Pathologische Analyse der Lungenmetastasierung nach lateraler Schwanzveneninjektion von Tumorzellen

Metastasis, the primary cause of morbidity and mortality for most cancer patients, can be challenging to model preclinically in mice. Few spontaneous ...

High-Throughput In Vitro Assay using Patient-Derived Tumor Organoids

Patient-derived tumor organoids (PDOs) are expected to be a preclinical cancer model with better reproducibility of disease than traditional cell culture models. PDOs have been successfully generated from a variety of human tumors to recapitulate the architecture and function of tumor tissue accurately and efficiently. However, PDOs are unsuitable for an in vitro high-throughput assay system (HTS) or cell analysis using 96-well or 384-well plates when evaluating anticancer drugs because they are heterogeneous in size and form large clusters in culture. These cultures and assays use extracellular matrices, such as Matrigel, to create tumor tissue scaffolds. Therefore, PDOs have a low throughput and high cost, and it has been difficult to develop a suitable assay system. To address this issue, a simpler and more accurate HTS was established using PDOs to evaluate the potency of anticancer drugs and immunotherapy. An in vitro HTS was created that uses PDOs established from solid tumors cultured in 384-well plates. An HTS was also developed for assessment of antibody-dependent cellular cytotoxicity activity to represent the immune response using PDOs cultured in 96-well plates.

High-Throughput In Vitro Assay using Patient-Derived Tumor Organoids

A highly accurate in vitro high-throughput assay system was developed to evaluate anticancer drugs using patient-derived tumor organoids (PDOs), similar to cancer tissues but are unsuitable for in vitro high-throughput assay systems with 96-well and 384-well plates.

Hochdurchsatz-In-vitro-Assay mit patientenabgeleiteten Tumororganoiden

Patient-derived tumor organoids (PDOs) are expected to be a preclinical cancer model with better reproducibility of disease than traditional cell culture ...