Dieses Projekt wurde von der norwegischen Universität für Biowissenschaften und der Forschung Rat von Norwegen, Grant-Nummer 243811 und 244461 (Aquakultur Programm) finanziert. Wir sind dankbar, Lourdes Carreon Tan an der norwegischen Universität für Biowissenschaften für die Aufrechterhaltung der Fisch-Anlage.

Die Tierversuche durchgeführt in dieser Studie wurden von der norwegischen Universität für Biowissenschaften, folgende Richtlinien für die Pflege und das Wohlergehen der Versuchstiere genehmigt.
1. Vorbereitung der Lösungen
<ol><li>Kalibrieren Sie die XR und pH Meter-Instrumente nach den Anweisungen des Herstellers um korrekte Messungen zu gewährleisten.</li>
	<li>
Bereiten Sie 500 mL Ca2 +- und Mg2 +-freie Dulbeccos Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (dPBS), Einstellung des pH-Werts auf 7,75 (Schritt 1.2.1) und der Osmolalität auf 290 mOsm/kg (Schritt 1.2.2) vor einer Sterilfiltration (Schritt 1.2.3).
	<ol>
<li>Stellen Sie den pH-Wert auf 7,75 mit einem kalibrierten pH-Meter indem Sie sorgfältig Tropfen einer 1 M NaOH-Lösung die Lösung sorgfältig rühren.</li>
		<li>Messen Sie die Osmolalität der Lösung mit einem kalibrierten XR zu und berechnen Sie die Höhe der Mannit musste die Osmolalität auf 290 mOsm/kg zu erhöhen. Fügen Sie die erforderliche Menge an Mannit und Messen Sie dann die Osmolalität der Lösung wieder auf die richtige Einstellung zu gewährleisten. Hinweis: Die Höhe der Mannit benötigt richtet sich nach der Osmolalität gemessen, die in der Regel zwischen verschiedenen Chargen variiert. Ein Molekül Mannit entspricht 1 osmotischen Teilchen.</li>
		<li>Steril-Filter die dPBS Lösung mit einem 0,2 µm-Filter. Hinweis: Die Lösung kann bei 4 ° C für mindestens 3 Monate aufbewahrt werden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereiten Sie 500 mL Kulturmedium Leibovitz (L-15) ohne L-Glutamin und Bikarbonat und ergänzen Sie es mit 10 mM Nahco33 (Schritt 1.3.1), 4,5 mM Glukose (Schritt 1.3.2) und 2 mM im Handel erhältlichen Glutamin (Schritt 1.3.3). Passen Sie die Lösung für 290 mOsm/kg (Schritt 1.3.4), Sterilfilter es (Schritt 1.3.5) und 2,5 mL einer Penicillin-Streptomycin-Lösung (Schritt 1.3.6). Hinweis: Die Lösung kann für mindestens 4 Wochen bei 4 ° C aufbewahrt werden.<ol>
<li>Fügen Sie 420 mg Nahco33 pro 500 mL Kulturmedium eine 10 mM-Lösung zu erreichen.</li>
		<li>Fügen Sie 405 mg Glukose pro 500 mL Kulturmedium Herbeiführung eine 4,5 mM-Lösung hinzu.</li>
		<li>Fügen Sie 100 X Lager einer Glutamin-Lösung 5 mL in 500 mL Kulturmedium eine 2 mM-Lösung zu erreichen. Rühren Sie, bis alle gelösten Stoffen gelöst werden.</li>
		<li>Passen Sie die Lösung auf 290 mOsm/kg mit Mannit mit einer XR (wie in Schritt 1.2.2 ausgeführt).</li>
		<li>Führen Sie eine sterile Filtration des L-15 Mediums mit einem 0,2 µm-Filter.</li>
		<li>Fügen Sie nach der Sterilfiltration 2,5 mL einer Penicillin-Streptomycin-Lösung, entsprechend 50 U/mL Penicillin und 50 µg/mL Streptomycin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereiten Sie 50 mL einer Trypsin-Lösung mit 1 mg/mL (0,1 %)-Trypsin-Typ II-S in der modifizierten dPBS (vorbereitet in Schritt 1.2) aufgelöst. Aliquote von 2 mL in sterilen Kunststoffrohre und speichern Sie diese bei-20 ° C bis zur Verwendung. Hinweis: Aliquote von 2 mL können bei-20 ° C für mindestens 3 Monate gespeichert werden.</li>
	<li>Bereiten Sie 50 mL einer Trypsin-Inhibitor-Lösung mit 1 mg/mL (0,1 %) Trypsin Inhibitor Typ I-S und ergänzen Sie es mit 2 µg/mL DNase, die ich in der modifizierten dPBS (vorbereitet in Schritt 1.2) aufgelöst. Aliquote von 2 mL in sterilen Kunststoffrohre und speichern Sie diese bei-20 ° C bis zur Verwendung. Hinweis: Aliquote von 2 mL können bei-20 ° C für mindestens 3 Monate gespeichert werden.</li>
</ol>2. Vorbereitung der Ausrüstung
<ol><li>Bereiten Sie glaspipetten durch Feuer Polieren der Tipp für die Zelle Dissoziation vor. Tipps mit 2 verschiedenen Größenklassen zu machen (eine mittlere Öffnung von 0,6-0,8 µm und eine kleine Öffnung von 0,4 – 0,6 µm) durch das Spiel mit der Zeit und den Abstand von der Flamme und drehen Sie gleichzeitig die Pipette. Ablegen der glaspipetten in einem sauberen Behälter und Autoklaven (mit der solid-Modus bei 105 ° C für 45 min.).</li>
	<li>Bereiten Sie eine Styroporbox mit Eis.</li>
	<li>Bereiten Sie ein Kunststoffrohr mit 1,5 mL veränderte dPBS (vorbereitet in Schritt 1.2) übertragen die Hypophysen, während der Präparation und halten sie auf dem Eis.</li>
	<li>Bereiten Sie eine 15 mL-Tube mit 10 mL der modifizierten dPBS (vorbereitet in Schritt 1.2) und lassen Sie ihn auf Eis, bis die Zelle Dissoziation.</li>
	<li>Frisch bereiten Sie zu oder tauen Sie Aliquote des Trypsin und Trypsin-Inhibitor-Lösungen (vorbereitet in Schritten 1.4 und 1.5 auf) und halten sie auf dem Eis bis zur Verwendung.</li>
	<li>26 ° C im Wasserbad vor Beginn der Dissektion damit das Wasser die gewünschte Temperatur vor der chemischen Dissoziation der Hypophysen erreichen soll.</li>
	<li>Reinigen Sie alle Dissektion Werkzeuge mit 70 % Ethanol, vor, während und nach dem Gebrauch, einschließlich feine Pinzette für die Zerlegung und feinen Nadeln und eine Wachs-Platte verwenden, um die Fische zu fixieren. Verwenden Sie saubere Handschuhe (ändern und häufig reinigen) während des gesamten Verfahrens um eine mögliche Verschmutzung der Zellen zu vermeiden.</li>
</ol>(3) die Hypophyse Dissektion und Zelle Dissoziation
<ol><li>Einschläfern der Fisch durch Eintauchen in Slush Eis (0 ° C). Lassen Sie den Fisch in den Matsch Eis mindestens 1 min. um eine irreversible hypothermen Schock zu gewährleisten. Hinweis: Immobilisierung und Gleichgewicht Verlust wird nach wenigen Sekunden auftreten. Stellen Sie sicher, der Fisch ist komplett in das Eis Wasser getaucht und liegt nicht auf dem Eis, da Letzteres zum ersticken führt und potenzielle Haut, anstatt einen schnellen und humane hypothermen Schock brennt.</li>
	<li>Schnell übertragen Sie die Fische in einem Netz auf einer Wachs-Platte unter dem Mikroskop Dissektion und zerstören Sie die Wirbelsäule durch eine Nadel Punch durch den Hals.</li>
	<li>Heften Sie den Kopf des Fisches, die Wachs-Platte mit feinen Nadeln, durch eine Nadel in der Front (über den Mund) und eine auf jeder Seite des Kopfes (hinter dem Gehirn) um den Kopf vor der Präparation zu stabilisieren.</li>
	<li>Sehen Sie die Fische unter dem Mikroskop Dissektion und vorsichtig abkratzen der Schuppen auf der Oberseite des Kopfes mit feinen Pinzette mit abgewinkelter Spitze.</li>
	<li>Sorgfältig führen Sie die abgewinkelte Spitze der feinen Zange unter die Haut von der Seite des Kopfes und entfernen Sie der Schädel-Dach, indem Sie langsam die Zange in die Richtung des Mundes, halten Sie einen festen Griff um die Zange umschließen das Schädel-Dach.</li>
	<li>Abschneiden des Rückenmarks komplett mit Pinzette mit abgewinkelter Spitze. Hinweis: Es ist ein wichtiger Faktor, so arbeiten effizient und genau die Zeit begrenzen verbrachte aus der Dissektion der Hypophysen bis die Zellen in der Schale überzogen sind. Nach einiger Übung Hypophyse Dissektion dauert ca. 2 – 3 min. pro Fisch, von denen nur rund 10 s sind notwendig, um die Hypophyse zu holen, wenn das Gehirn bereits ausgesetzt ist.</li>
	<li>Drehen Sie sorgfältig das Gehirn in Richtung der Mündung zu entlarven die Hypophyse und mit sauberen Pinzette mit einer geraden Spitze zu sezieren. Die Hypophyse auf ein Kunststoffrohr mit 1,5 mL geändert dPBS übertragen (für Details, siehe Schritt 2.3) auf Eis gelegt. Überprüfen Sie die Spitze der Zange unter die Lupe genommen, um sicherzustellen, dass die Hypophyse erfolgreich, um das Rohr hinzugefügt wird und nichts auf der Zange bleibt. Hinweis: Sezieren Sie soviele Hypophysen Bedarf, abhängig von der Anzahl der Kultur Gerichte, die gleichzeitig zubereitet werden. Als Faustregel gilt berechnen Sie mindestens 10 Hypophysen von ausgewachsenen Fischen pro Schale, eine entsprechende Dichte der Zellen (die von der nachgeschalteten Anwendung abhängt).</li>
	<li>Spin-down der Hypophysen in einer Tischplatte Zentrifuge für 1 – 2 s bei Raumtemperatur. Sorgfältig die dPBS mit einer Glaspipette zu entfernen und um zu vermeiden, entfernen alle Hypophysen kümmern.</li>
	<li>Fügen Sie 1 mL Trypsin-Lösung (in Schritt 1.4 vorbereitet) zu waschen die Hypophysen, drehen sie sich in einer Tischplatte Zentrifuge für 1 – 2 s und der Großteil der Flüssigkeit mit einer Glaspipette vor dem Hinzufügen einer zusätzlichen 1 mL Trypsin-Lösung zu entfernen.</li>
	<li>Inkubieren Sie das Rohr in einem Wasserbad bei 26 ° C für 30 min, vorzugsweise mit sanft schütteln, oder alternativ, streichen Sie dem Rohr ein paar Mal während der Inkubationszeit.</li>
	<li>Spin-down der Hypophysen in einer Tischplatte Zentrifuge für 1 – 2 s bei Raumtemperatur und sicherstellen, dass alle Hypophysen an der Unterseite des Rohres befinden. Entfernen Sie die meisten der Trypsin-Lösung mit einer Glaspipette und 1 mL der Trypsin-Inhibitor-Lösung (vorbereitet in Schritt 1.5) um die Trypsin zu inaktivieren und waschen die Hypophysen.</li>
	<li>Sammeln Sie die Hypophysen an der Unterseite des Rohres durch Drehen sie nach unten in eine Tischplatte Zentrifuge für 1 – 2 s bei Raumtemperatur. Entfernen Sie die meisten der Flüssigkeit mit einer Glaspipette und 1 mL die Trypsin-Inhibitor-Lösung (in Schritt 1.5 vorbereitet). Legen Sie das Rohr auf einem Wasserbad bei 26 ° C für 20 min, vorzugsweise mit sanft schütteln, oder alternativ, streichen Sie dem Rohr ein paar Mal während der Inkubationszeit, die Trypsin zu inaktivieren.</li>
	<li>Bereiten Sie eine 35 mm-Poly-d-Lysin-beschichtete Zelle Kulturschale mit einem zentralen Glasboden durch Hinzufügen von 2 mL des L-15 Mediums und lassen, dass für mindestens 10 min bei 26 ° C und mit 1 % CO2 zu Bebrüten, so dass es die richtige Temperatur und pH-Wert erreichen kann, vor der galvanischen Zellen. Hinweis: Die Kulturschale Kunststoff Zelle kann auch verwendet werden. Der wesentliche Vorteil der Verwendung einer Gerichts mit einem zentralisierten Glasboden ist, dass der Bereich, wo die Zellen überzogen sind, kleiner, und daher weniger Hypophyse Zellen pro Gericht erforderlich sind. Einige downstream-Anwendungen erfordern möglicherweise auch ein Glasboden (d.h., einige bildgebenden Verfahren).</li>
	<li>Die kühle Zentrifuge für die 15 mL-Tuben bis 4 ° C erlauben es, die gewünschte Temperatur zu erreichen, bevor Sie beginnen die mechanische Dissoziation festgelegt.</li>
	<li>Sammeln die Hypophysen am unteren Ende der Röhre durch Drehen hinunter den Schlauch mit Trypsin Inhibitor Lösung (aus Schritt 3.11) in einer Tischplatte Zentrifuge für 1 – 2 s bei Raumtemperatur und sicherstellen, dass alle Hypophysen befinden sich am Boden des Röhrchens vor sorgfältig entfernen die meisten der Trypsin-Inhibitor-Lösung mit einer Glaspipette. Hinweis: Führen Sie alle folgenden Schritte des Protokolls in einer Laminar-Flow Bank (LAF) zertifiziert für Zelle Arbeit um eine Kontamination der Zellen zu vermeiden.</li>
	<li>Die Hypophyse Gewebe Stücke 1 mL eiskaltes modifizierte dPBS (vorbereitet in Schritt 2.4) hinzu und saugen Sie sanft die Gewebe Stücke nach oben und unten (6 – 7 X) in eine feuerpolierte Glaspipette (in Schritt 2.1 vorbereitet). Hinweis: Die Temperatur ist ein wichtiger Aspekt, also halten Sie alle Lösungen bei 4 ° C. Ab diesem Zeitpunkt alle Schritte auf dem Eis wenn möglich.</li>
	<li>Spin-down der Gewebe-Stücke in einer Tischplatte Zentrifuge für 1 – 2 s bei Raumtemperatur und übertragen Sie sorgfältig am oberen Ende des dPBS der dissoziierten Zellen (fast 1 mL), eine neue 15 mL Tube auf Eis gelegt. Vermeiden Sie die Pipette in Richtung zur Unterseite des Rohrs bewegen, wo sind die Gewebe Stücke übrig.</li>
	<li>Wiederholen Sie Schritt 3.16 – 3.17, wehre die Zellen in 1 mL eiskaltes dPBS hintereinander, bis alle 10 mL des dPBS verwendet wird. Starten Sie mit einer Glaspipette mit einem mittleren Öffnung und Umstellung auf eine Glaspipette mit einer kleineren Öffnung gegen Ende (für die letzten 3 – 4 mL des dPBS hinzugefügt) die Dissoziation. Wenn es noch sichtbare Gewebe Stücke am Ende des Verfahrens Dissoziation, pipettieren, ca. 10 X auf die 2 letzten Schritte des dPBS zur Dissoziation zu erhöhen, und schließlich die verbleibende Gewebe Stücke hinterlassen. Aufschwemmen der Zellen vorsichtig und vermeiden Sie Luftblasen zu schaffen, als es Zellschäden verursachen, wenn die Zellen an der Oberfläche der Blasen befestigen. Hinweis: Dies ist ein kritischer Schritt dieses Protokolls und erfordert einige Übung, ein gutes Ergebnis zu erreichen.</li>
	<li>Balancieren Sie das Rohr in die Zentrifuge (vorgekühlt auf 4 ° C) und Spin-down der Zellen bei 200 X g für 10 min bei 4 ° C. Achten Sie auf die Seite des Rohres zu markieren, wo die Zelle Pellet werden.</li>
	<li>Entfernen Sie vorsichtig den Schlauch aus der Zentrifuge und übertragen Sie den Überstand mit einer Glaspipette sanft auf eine leere 15 mL-Kunststoff-Rohr direkt nach der Zentrifugation. Achten Sie darauf, entfernen die meisten des Überstands aber achten Sie darauf, nicht zu verlieren die kleinen Pellets (oft unsichtbar) Zelle.</li>
	<li>Sorgfältig Aufschwemmen der Zelle Pellet in 50-100 µL L-15 Kulturmedium. Hinweis: Bei diesem Schritt ist es möglich, zählen die Zellen und/oder führen Sie einen Test der Lebensfähigkeit (z. B. eine Zelle zählen im Beisein von Trypan blau mit einem Hemocytometer), aber hüten Sie sich vor, dass mit einem Teil der Zellsuspension zu diesem Zweck die Ausbeute senken. Vermeiden Sie die Verwendung einer großen Aussetzung Volumen da es das Risiko einer Verbreitung außerhalb der Mitte der Schale Zellen erhöht wird.</li>
	<li>Sorgfältig abtropfen der dissoziierten Zellen in der Mitte der Zelle Kulturschale mit 2 mL des L-15 Mediums (vorbereitet in Schritt 3.13). Lassen Sie die Zellen an der Unterseite der Schale für ca. 5 min zu versenken, bevor Sie verschieben sie in den Inkubator zu vermeiden, dass die Zellen außerhalb der versunkenen Teil der Glasboden zu verbreiten.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Schüssel bei 26 ° C und 1 % CO2 erlauben die Zellen gründlich zu versenken und legen auf den Boden der Schale.</li>
	<li>Schauen Sie nach 30 min sich die Zellen im Mikroskop, um sicherzustellen, dass sie an der Kulturschale angeschlossen haben.</li>
	<li>Weiterhin die Zellen bei 26 ° C und 1 % CO2inkubieren.</li>
	<li>Sorgfältig zu ändern die meisten (aber nicht alle) das Medium alle 3 – 4 Tage. Hinweis: Vermeiden Sie Ändern des Mediums immer häufiger, wie es möglicherweise die Zellen stören und machen sie von der Glasboden zu lösen. Verwenden Sie die Zellen innerhalb einer Woche nach der Aussaat sie für Experimente.</li>
</ol>

<ol>
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Die Autoren haben nichts zu verzollen.

In-vitro- Zellkultursysteme bieten leistungsstarke Tools für Forscher, eine Fülle von verschiedenen biologischen Fragen zu beantworten, wenn im richtigen Weg1verwendet. Es ist wichtig zu bedenken, dass dissoziierte Zellen, die ihre Verbindungen zu den benachbarten Zellen verloren haben unterschiedliche funktionale Eigenschaften erhalten haben können, als sie in Vivo ursprünglich. Um zu vermeiden, wird auf die Gefahr hin falsch interpretiert, die Ergebnisse von in-vitro- Experimente, ist es wichtig zu prüfen, Anpassen der Primärzelle Kultur Verfahren auf die Arten und Zelle Art von Interesse. Selbst moderate Anpassungen von standard Kultur Verfahren und eingesetzten Lösungen sind oft ausreichend, um die Kulturbedingungen von einem bestimmten Zelltyp tiefgreifend verändern.
Dieses Protokoll beschreibt optimierte Bedingungen für die Vorbereitung und Erhaltung der primären Zellkulturen von Erwachsenen Medaka Hypophysen, was erreicht werden kann, durch Anpassung der Parameter wie Temperatur, pH-Wert, Osmolalität und pCO2 der Lösungen verwendet, zu entsprechen Sie die physiologischen Bedingungen dieser Art. Der pH-Wert ist temperaturabhängig und sollte daher auch zwischen verschiedenen Arten von teleost Fische bei unterschiedlichen Temperaturen17angepasst werden. Die Osmolalität aller Lösungen während der Zelle Dissoziation und Kultivierung verwendet sollte auch angepasst werden, um den Zustand der Zellen zu verbessern. Vor allem, wenn in Osmolalität gibt es eine Diskrepanz zwischen verschiedenen Lösungen bei der Isolierung verwendet, kann es verheerende Auswirkungen auf die Kultur-Qualität, was zu einer verringerten Lebensfähigkeit (die Autors eigene unveröffentlichte Ergebnisse) haben. Hyperosmotic Lösungen werden dazu führen, dass die Zellen schrumpfen (und umgekehrt), so stören die Membran Integrität und Membrane Protein Funktion21. Ein wichtiger Punkt in diesem Zusammenhang ist, dass die Parameter wie Osmolalität und pH-Wert in der Regel nicht gemessenen noch zwischen verschiedenen Chargen von kommerziellen Puffern und Kulturmedien verwendet in Säugetieren Kulturbedingungen stabil sind. Unterschiede in der Osmolalität und der pH-Wert zwischen verschiedenen Lösungen bei der Isolierung sollten stets vermieden werden.
Die Erfolgsquote dieses Protokolls wird durch Training verbessert, so dass erwartet wird Forscher brauchen etwas Zeit um mit den verschiedenen Schritten der Technik kennen zu lernen. Zum Beispiel ist die Zeit von der Präparation der Hypophysen bis die Zellen in der Schale vergoldet sind umgekehrt Zellgesundheit verwandt. Die mechanische Trennung von der Hypophysen mit einer Glaspipette ist ein besonders wichtiger Schritt des Protokolls und es erfordert einige Übung, ein gutes Ergebnis zu erreichen. Die Dissoziation Verfahren kann osmotische und mechanische Belastungen einzuführen, die schädlich für die Zellen ist. Die Zugabe von kleinen Mengen von modifizierten dPBS in wiederholten Schritten für die mechanische Dissoziation sorgt für eine sanftere Dissoziation Verfahren wo bereits dissoziierte Zellen in einen neuen Schlauch und Links unangetastet, übertragen werden, während die Forscher weiterhin distanzieren Sie weitere Zellen aus dem Gewebe in ein neues Volume des dPBS.
Dieses Protokoll ist für Erwachsene Medaka Hypophysen Zellen optimiert. Verschiedene Arten, Gewebe oder sogar verschiedene Lebensphasen des Tieres innerhalb des gleichen Gewebes erfordern Optimierungen die Kulturbedingungen. Zum Beispiel Zellen aus unreifen Tiere möglicherweise empfindlicher und daher anfälliger gegenüber Apoptose und Zelltod und somit die Notwendigkeit einer Anpassung des Protokolls, vor allem gegen ein sanfter Dissoziation Verfahren erfordern. Die mechanische Dissoziation mit einer Glaspipette ist ein sehr wichtiger Schritt des Verfahrens, da eine nicht vorsichtig genug mechanische Dissoziation zu einen niedrigeren Gewinn führt, während eine zu grobe ein Apoptose und/oder Zelle Tod verursachen kann. Wenn verschiedene Enzyme für die Dissoziation gelten, möglicherweise es notwendig, eine andere Verdauung Zeit und Enzym-Konzentration zu verwenden. Medaka Hypophysen sind sehr klein und relativ leicht zu distanzieren, mit dem beschriebenen Protokoll. Optimierungen für andere Arten erfordern jedoch möglicherweise die Verwendung von einem Siebfilter nach der Dissoziation, Ablagerungen zu entfernen. Der Erfolg dieses Protokolls hängt auch stark von den Schritten unter sterilen Bedingungen zur Vermeidung einer Kontamination der Zellen.
Die Anzahl der Zellen zu Samen pro Schale richtet sich nach der Anzahl der Hypophysen zu Beginn als auch den Erfolg des Verfahrens Dissoziation. Es gibt ungefähr rund 15.000 Zellen in einer intakten Erwachsenen Medaka Hypophyse. Allerdings Zellen werden während der Dissoziation verloren und dies sollte berücksichtigt werden bei der Berechnung der Anzahl der Hypophysen benötigt für ein Experiment. Mit mindestens 10 Hypophysen pro Schale führt in der Regel in einer Dichte von rund 50.000 – 100.000 Zellen pro Schale. Bei dieser Dichte bildet Aggregation nicht in jedem bedeutenden Betrag auch nach 7 Tagen in der Kultur. Merklich, Aggregation scheint Dichte abhängig ist, desto Dichter sind die Zellen ausgesät, je mehr sie scheinen zu aggregieren. Bestimmte Verfahren erfordern eine dichtere Kultur und die optimale Aussaatdichte sollte daher abhängig von der nachgeschalteten Anwendung. Es ist ein wichtiger Punkt zu berücksichtigen bei der Planung der Zahl der Hypophysen pro Schale verwenden.
Am häufigsten verwendete downstream-Anwendungen verwenden Primärzelle Kulturen innerhalb der ersten paar Tage nach der Aussaat. Aus der Zellviabilität die elektrophysiologische Aufnahmen hier vorgestellten Ergebnisse zeigen, dass es möglich ist, gute Ergebnisse aus primären Zellkulturen unter Verwendung der beschriebenen Protokoll für bis zu 1 Woche nach der Aussaat zu erhalten. Dennoch Kulturen können länger aufbewahrt werden, und gesunde Zellen sind noch heute nach über 2 Wochen in Kultur (die Autors eigene unveröffentlichte Ergebnisse). Die optimierten Konditionen präsentiert in diesem Protokoll erleichtert physiologisch sinnvolle Ergebnisse und kann für andere Wissenschaftler Vorbereitung primären Zellkulturen aus nicht-Säugetier-Zellen vorteilhaft sein.

Zellkultur ist eines der wichtigsten Instrumente für die molekularbiologische Forschung, bietet eine ausgezeichnete Modellsystem für verschiedene biologische Fragen von normalen zellulären Physiologie bis hin zu Drogen-Screening und in der Karzinogenese1. Primärzellen, direkt aus dem tierischen Gewebe mit enzymatischen und/oder mechanischen Methoden isoliert werden oft als mehr biologisch relevante als Zell-Linien wie die biologische Reaktion auf die in-Vivo -Situation näher sein kann. Protokolle für die Zubereitung von primären Zellkulturen sollten optimiert werden, für jede Spezies und Zelle Interesse um imitieren die Eigenschaften, die eine Zelle angepasst ist, und physiologisch sinnvolle Ergebnisse zu erzielen.
Zahlreiche Protokolle beschreiben Kulturbedingungen für Säugetier-Zelle Systeme, während ähnliche Protokolle beschreiben Primärkultur Bedingungen für Fisch-Zellen im Vergleich eher knapp sind. Zellen sind anfällig für schnelle Änderungen in Temperatur, pH-Wert und Osmolalität und sind besonders empfindlich bei der Dissoziation. Kommerzielle Salzlösungen und Kulturmedien verwendet für Säugetier-Zelle Kulturen sind nicht optimal für teleost Fische, vor allem in Bezug auf die pH-Puffer-Systeme und Osmolalität. Deshalb ist es wichtig, zu messen und passen die Lösungen an physiologisch relevanten Ebenen dieser Parameter in den Arten von Interesse.
Hypophyse Primärkulturen von mehreren teleost Fischarten, darunter Karpfen vorgenommen wurden (Cyprinus Carpio)2,3, Rasen Karpfen (Ctenopharyngodon Idella)4, Goldfisch (Carassius Auratus )5, Regenbogenforelle (Oncorhynchus Mykiss)6, Europäischer Aal (Anguilla Anguilla)7, Tilapia (Oreochromis Mossambicus)8, Zebrafisch (Danio Rerio)9, und Atlantischer Kabeljau (Gadus Morrhua)10. Neben der Anpassung der Inkubationstemperatur auf die Arten von Interesse, haben einige dieser Protokolle der Zellen bei Säugetier-ähnlichen Bedingungen inkubiert, die möglicherweise für die Arten von Interesse, mit einem pH-Wert von 7,2 bis 7,5 in eine feuchte Atmosphäre suboptimale mit 3-5 % CO2. Darüber hinaus ist es unklar, ob die Osmolalität von Lösungen für die Zubereitung verschiedener diese primären Zellkulturen angepasst wurden und zwischen verschiedenen Lösungen stabil.
Das aktuelle Protokoll basiert auf früheren Arbeiten mit Primärkulturen von Atlantischer Kabeljau10 und besteht aus Anpassungen der Inkubationstemperatur, Osmolalität, pH-Wert und pH-Puffer-Systeme, einschließlich der Partialdruck des Kohlendioxids (pCO2), um die Physiologie des Medaka (O. Latipes). Medaka ist ein klein (3 – 4 cm) Süßwasserfisch, ursprünglich aus Ostasien. Heutzutage dient es als ein Modell-Arten in vielen Forschungslabors auf der ganzen Welt, da es relativ einfach zu züchten und sehr widerstandsfähig gegen viele gemeinsame Fisch Krankheiten11ist. Es gibt mehrere Vorteile bei der Verwendung von Medaka als Vorbild, darunter eine Temperatur-Toleranz von 4 – 40 ° C11, eine kurze Generationszeit, transparente Embryonen, ein Geschlecht-Bestimmung gen12, und eine sequenzierte Genom13, sowie viele andere verfügbaren genetischen Ressourcen.
Die primäre Kulturbedingungen in diesem Protokoll werden optimiert, entsprechend der Temperatur von 26 ° C, die Medakas in der Fisch-Anlage gehalten werden. Darüber hinaus die Osmolalität von 320 mOsm/kg aus Atlantischer Kabeljau in Salzwasser bis 290 mOsm/kg für Medaka Leben im Süßwasser lebenden reduziert und steht im Einklang mit der normalen Osmolalität von Medaka Plasma14. Im Vergleich dazu ist die typische Osmolalität von Säugetieren Plasma im Bereich von 275-295 mOsm15. Fische leben in einer Vielzahl von Temperaturen und haben Kiemen, die in direktem Kontakt mit Wasser, so dass der pH und Puffer Kapazität des Blutes und der extrazellulären Flüssigkeit in den Fischen unterscheiden sich von denen bei Säugetieren sind. Säugetier-Kultur Medien umfassen in der Regel Puffersysteme, die einen pH-Wert von etwa 7,4 führen, wenn die Medien sind zu einem standard-Atmosphäre von 5 % CO2 in befeuchtete Luft bei 37 ° c equilibriert Der pH-Wert ist temperaturabhängig und der Wert für pH-neutral (im Wasser) steigt mit abnehmender Temperatur16. Typische teleost Fische Plasma pH-Bereiche von 7,7 bis 7,917. Die Optimierung dieses Protokolls enthalten eine Reduzierung von pH 7,85 für Kabeljau auf pH 7,75 für Medaka auf 26 ° C gehalten, durch die Erhöhung der CO2 von 0,5 % bis 1 % bei 12 ° C gehalten.
Darüber hinaus unterscheidet sich die Bicarbonat-Pufferkapazität in Fischen und Säugetieren. CO2 ist leicht über die Kiemen bei Fischen ausgetauscht und die pCO2 im Wasser ist nur ein kleiner Bruchteil des pCO2 in der Lunge-18. Entweder die Temperatur oder die pCO2 ändert pH und Puffer des Mediums ändern. Weder den pH-Wert noch die pCO2 empfohlen für die Inkubation von Säugerzellen deshalb optimal für Fisch-Zellen, und daher sollte die Nährmedien mit Puffersysteme, die physiologisch relevanten Werte für Fische optimiert werden und die bestimmte Arten von Interesse. Dieses Protokoll beschreibt die primären Zellkulturen von Medaka Hypophysen vorzubereiten und umfassen Anpassungen der Inkubation Osmolalität, Temperatur, pH-Wert und pH Puffersystem, neben anderen wichtigen Parameter, die bei der Vorbereitung der Primärzelle Kulturen von nicht-Säugetier-Arten.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline (dPBS), without calcium chloride and magnesium chloride</td>
			<td>Sigma (Merck, Damstadt, Germany)</td>
			<td>D8537</td>
			<td>Adjust solution to pH 7.75 with 1M NaOH and 290 mOsm with mannitol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-15 medium (Leibovitz), witout L-glutamine</td>
			<td>Sigma (Merck, Damstadt, Germany)</td>
			<td>L5520</td>
			<td>Supplement 500 ml culture medium with 10mM NaHCO3, 4.5 mM glucose, 2 mM Glutamax. Adjust solution to 290 mOsm with mannitol and filter solution through a 0.2 &#181;m PES sterile filter, before adding 2.5 ml Penicillin-Streptomycin solution (see below for details).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Sigma (Merck, Damstadt, Germany)</td>
			<td>S5881</td>
			<td>Add drops of 1M solution to increase pH of dPBS and culture medium to 7.75.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma (Merck, Damstadt, Germany)</td>
			<td>S5761</td>
			<td>10 mM NaHCO3 equals 420 mg per 500 ml culture medium.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-mannitol</td>
			<td>Sigma (Merck, Damstadt, Germany)</td>
			<td>63565</td>
			<td>Use to increase osmolality of dPBS and culture medium. Calculate correct amount needed to reach an osmolality of 290 mOsm.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose</td>
			<td>Sigma (Merck, Damstadt, Germany)</td>
			<td>G5400</td>
			<td>4.5 mM&#160; D-glucose equals 405 mg per 500 ml culture medium.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX Supplement</td>
			<td>Gibco (Life Technologies, Paisley, UK)</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>Alternative to L-glutamine, with increased stability. 2 mM Glutamax equals 5 ml of 100X stock in 500 ml culture medium.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma (Merck, Damstadt, Germany)</td>
			<td>P0781</td>
			<td>Stock solution 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin per mL. Use 2.5 ml of stock solution in 500 ml L-15 medium (equivalent of 50 U/ml Penicillin and 50 &#181;g/ml Streptomycin).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin type II-S</td>
			<td>Sigma (Merck, Damstadt, Germany)</td>
			<td>T7409</td>
			<td>Prepare 1 mg/ml in dPBS solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin inhibitor type I-S</td>
			<td>Sigma (Merck, Damstadt, Germany)</td>
			<td>T6522</td>
			<td>Prepare 1 mg/ml in dPBS solution, supplement with 2 &#181;g/ml Dnase I (see details below).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase I</td>
			<td>Sigma (Merck, Damstadt, Germany)</td>
			<td>D5025</td>
			<td>Use in trypsin inhibitor solution (see above).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 &#181;m Polyethersulfone (PES) sterile filter system</td>
			<td>Corning Inc. (Corning, NY)</td>
			<td>431097</td>
			<td>Use for sterile filtration of dPBS and L-15 medium after adjustments.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm cell culture dish with glass bottom, poly d-lysine coated</td>
			<td>MatTek Corporation (Ashland, MA)</td>
			<td>P35GC-1.5-10-C</td>
			<td>Can also be replaced by plastic dish, depending on downstream application.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 fine forceps</td>
			<td>Fine Science Tools (CA)</td>
			<td>11254-20</td>
			<td>Straigt tip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5/45 fine forceps</td>
			<td>Fine Science Tools (CA)</td>
			<td>11253-25</td>
			<td>Angled 45&#176; tip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscope SZ61</td>
			<td>Olympus Corp. (Tokyo, Japan)</td>
			<td></td>
			<td>Use for dissection of pituitaries.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alegra X-22R Centrufuge</td>
			<td>Beckman Coulter Inc. (Brea, CA)</td>
			<td></td>
			<td>With cooling option (similar to current model XR-30).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Techne (Staffordshire, UK)</td>
			<td></td>
			<td>Any water bath with the possibility of adjusting temperature will do.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur glass pipettes</td>
			<td>VWR (NY)</td>
			<td>612-1701</td>
			<td>Outer diameter 1.6 mm, fire polish and autoclave before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Galaxy MiniStar table centrifuge</td>
			<td>VWR (NY)</td>
			<td>521-2844</td>
			<td>Any small table centrigue will do.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine needles / insect pins</td>
			<td>Fine Science Tools (CA)</td>
			<td>26001-40</td>
			<td>Diameter 0.03 mm. Other fine needles can be used instead.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wax plate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Custom made by adding melted paraffin wax in large petri dish.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of a high-quality primary cell culture from fish pituitaries

Primärzelle Kultur ist ein leistungsfähiges Werkzeug, das häufig von Wissenschaftlern verwendet, um zellulare Eigenschaften und Mechanismen der isolierten Zellen in einer kontrollierten Umgebung zu studieren. Trotz der großen Unterschiede in der Physiologie zwischen Säugetieren und Fischen Primärzelle Kultur Protokolle von den Fischen oft Säugetier-Kulturbedingungen, oft mit nur geringfügigen Änderungen basieren. Die ökologischen Unterschiede beeinflussen nicht nur die Körpertemperatur, sondern auch Blutserum Parameter wie Osmolalität, pH-Wert und Pufferkapazität pH. Da Zellkulturmedien und ähnlich funktionierende Lösungen imitieren Merkmale der extrazellulären Flüssigkeit bzw. Blutserum sollen, bei denen eine Zelle angepasst ist, ist es wichtig, dass diese Parameter speziell auf das betreffende Tier angepasst werden.
Das aktuelle Protokoll beschreibt optimierte Primärkultur Bedingungen für Medaka (Oryzias Latipes). Das Protokoll bietet detaillierte Schritte auf, wie zu isolieren und halten gesund dissoziiert Hypophyse Zellen für mehr als eine Woche und umfasst folgende Schritte: 1. gefunden die Einstellung der Osmolalität auf die Werte im Blutplasma Medaka, 2. die Anpassung der Inkubationstemperatur auf normalen Medaka Temperatur (hier in der Aquarium-Anlage), und 3. die Einstellung des pH und Bicarbonat Puffer zu Werten vergleichbar mit anderen Fischarten Leben bei ähnlichen Temperaturen. Die Ergebnisse, die mit dem beschriebenen Protokoll physiologisch sinnvolle Ergebnisse für Medaka fördern und von Wissenschaftlern machen primären Zellkulturen von anderen nicht-Säugetier-Arten als Nachschlagewerk verwendet werden können.

Dieses Protokoll beschreibt die Vorbereitung einer Primärzelle Kultur von Medaka Hypophysen und bietet gesunde Zellen, die in einer Kultur für mindestens eine Woche gewartet werden können. Das Protokoll basiert auf physiologisch relevanten Werte für Medaka14 und ist zusätzlich mit der Hypophyse Gewebe im ausgewachsenen Fischen, mit einem pH-Wert von 7,75 und eine Osmolalität von 290 mOsm/kg während des gesamten Verfahrens von der Gewebe-Ernte, die vergoldeten optimiert Zellen in Kultur (Abbildung 1 und Abbildung 2).
Repräsentative Ergebnisse aus Experimenten an primären Zellkulturen produziert durch dieses Protokoll sind in Abbildung 3, Abbildung 4und Abbildung 5angezeigt. Für die hier vorgestellten Ergebnisse einer transgenen Medaka Linie, wo luteinizing Hormon (Lh)-Gonadotrope Zellen zum Ausdruck bringen des grünen fluoreszierenden Proteins (GFP), verwendete19war. Abbildung 3 zeigt einen repräsentativen Bereich in der Schale einer Primärzelle Kultur von Tag 0, Tag 7 nach der Aussaat, einschließlich beide Hellfeld und Fluoreszenz-Mikroskopie-Bilder zeigen die GFP exprimierenden Lh-Gonadotrope Zellen. Mit rund 10 Erwachsenen Medaka Hypophysen pro Gericht in der Regel ergibt sich eine Dichte von etwa 5 x 104 – 1 x 105 Zellen pro Schale nach der Aussaat. Die Lebensfähigkeit der Hypophysen Zellen in der Kultur auf die Gesamtzahl der GFP exprimierenden Zellen in der Kultur am Tag 1, 3 und 7 nach der Beschichtung, im Vergleich zu Tag 0 (Abbildung 4) errechnet. Das Diagramm in Abbildung 4 dargestellte weist darauf hin, dass die Anzahl der sterbenden Zellen im Laufe der Zeit mit mehr als 95 % der Zellen lebendig nach 1 Tag, fast konstant ist, während über 90 % nach 3 Tagen noch am Leben ist. Zwar gibt es ein leichten Rückgang im Zellviabilität mit der Zeit, sind die meisten Zellen (ca. 75 %) nach einer Woche in Kultur noch am Leben. Elektrophysiologische Aufnahmen der GFP exprimierenden Lh-Gonadotrope Zellen (wie in Strandabø, Et Al.beschrieben durchgeführt) 20 zeigen, dass die Zellen in der Lage, spontan nach 4 Tagen in der Kultur (Abbildung 5A) Aktionspotentiale ausgelöst. Darüber hinaus ist nach Stimulation des Hormons Gonadotropin – Releasing, eine erste vorübergehende Hyperpolarisation der Zellmembran gefolgt von einen dramatischen Anstieg der feuern Frequenz, die mit einer Depolarisation und erhöhte Dauer der Maßnahme ist Potentiale (Abb. 5 b).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58159/58159fig1.jpg"> Abbildung 1: Übersicht über die Hypophyse Primärzelle Kultur Technik. Hypophysen werden mit feinen Pinzette zerlegt und an ein Kunststoffrohr mit modifizierten dPBS auf Eis (Schritt 1 des Protokolls) bis die enzymatische Verdauung der Hypophysen mit Trypsin bei 26 ° C (Schritt 2), gefolgt von einer Inaktivierung mit einem Trypsin-inhibitor bei 26 ° C (nicht dargestellt). Die mechanische Trennung von enzymatisch verdauten Hypophysen mit einer Glaspipette erfolgt sorgfältig dPBS auf Eis (Schritt 3), gefolgt von einer Zentrifugation bei 4 ° C (Schritt 4). Zu guter Letzt wird die Zelle Pellet in Kulturmedium und die Zellen überzogen in der Zelle Kulturschale (Schritt 5) aufgelöst. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58159/58159fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58159/58159fig2.jpg"> Abbildung 2: Details zu den Medaka Hypophyse Dissektion. (A) den Kopf von einem immobilisierten Medaka (dorsalansicht) ist mit einer Wachs-Platte fixiert, und der Schädel-Dach wird mit feinen Pinzette setzen Sie die Spitze des Gehirns entfernt. (B) das Rückenmark durchtrennt, und das Gehirn umgedreht in Richtung der Vorderseite des Kopfes, so dass die Hypophyse ausgesetzt ist. (C) der Hypophyse wird mit sauberen, feinen Pinzette gesammelt. Pfeilspitze zeigt auf die Hypophyse im Bedienfeld ", B und C. Maßstabsleiste = 1.000 µm. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58159/58159fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58159/58159fig3.jpg"> Abbildung 3: Medaka Hypophyse Primärzelle Kultur. Diese Platten zeigen hochauflösende konfokale Bilder einer repräsentativen Medaka Hypophyse Primärzelle Kultur am Tag 0, Tag 3 und Tag 7 nach der Aussaat. Die obere Leiste zeigt Hellfeld Mikroskopie Bilder eines repräsentativen Feldes in der Schale der mittleren Spalte zeigt Fluoreszenz-Mikroskopie-Bilder von der gleichen Sichtfeld anzeigen GFP exprimierenden Lh-Gonadotrope Zellen, und im unteren Bereich ist eine Überlagerung der beiden. Maßstabsleiste = 20 µm. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58159/58159fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58159/58159fig4.jpg"> Abbildung 4: Lebensfähigkeit von Medaka Hypophysen Zellen in der Kultur. Diese Abbildung zeigt die Lebensfähigkeit der Hypophyse Primärzelle Kulturen gemessen am Tag 0, 1, 3 und 7 nach der Aussaat. Die Zahlen werden anhand der Open-Source-Software CellProfiler V2 und basieren auf die Gesamtzahl der GFP exprimierenden Lh-Gonadotrope Zellen pro Teller zu den verschiedenen Zeitpunkten im Vergleich zum Zeitpunkt 0. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58159/58159fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58159/58159fig5.jpg"> Abbildung 5: elektrophysiologische Aufnahmen von Hypophysen Zellen. Diese Tafeln zeigen elektrophysiologische Aufnahmen aus einer Lh-Gonadotrope GFP exprimierenden Zelle in einer Primärzelle Kultur durchgeführt am Tag 4 nach der Aussaat, zeigen (A) eine repräsentative Spur von spontan Aktionspotentiale, gefolgt von (B) eine Stimulation mit Gonadotropinen – Releasing Hormon Gnrh1 für 10 s. Die Stimulation von Gnrh1 induziert eine biphasische Reaktion mit eine Hyperpolarisation der Zellmembran, gefolgt von einer Depolarisation und erhöhte Dauer der Aktionspotentiale (gemessen bei 50 % Spitzenwert) von 8,9 ± 3,0 ms vor der Stimulation 29,2 ± 9,9 ms nach der die Stimulation. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58159/58159fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

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Preparation of a High-quality Primary Cell Culture from Fish Pituitaries

Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Vorbereitung und Hypophyse primären Zellkulturen von Medaka (Oryzias Latipes) zu erhalten. Die optimierte Bedingungen in diesem Protokoll nehmen wichtige Parameter wie Temperatur, Osmolalität und pH berücksichtigt durch die Nachahmung der physiologischen Bedingungen der Fische, wodurch es physiologisch mehr aussagekräftige Ergebnisse.

Vorbereitung einer qualitativ hochwertigen Primärzelle Kultur von Fisch Hypophysen

Primary cell culture is a powerful tool commonly used by scientists to study cellular properties and mechanisms of isolated cells in a controlled ...

preparation-high-quality-primary-cell-culture-from-fish

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

15.1K Aufrufe.  Norwegian University of Life Sciences. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Vorbereitung und Hypophyse primären Zellkulturen von Medaka (Oryzias Latipes) zu erhalten. Die optimierte Bedingungen in diesem Protokoll nehmen wichtige Parameter wie Temperatur, Osmolalität und pH berücksichtigt durch die Nachahmung der physiologischen Bedingungen der Fische, wodurch es physiologisch mehr aussagekräftige Ergebnisse.

Serie: Preparation of a High-quality Primary Cell Culture from Fish Pituitaries

Whole Cell Recording from an Organotypic Slice Preparation of Neocortex

We have been studying the expression and functional roles of voltage-gated potassium channels in pyramidal neurons from rat neocortex. Because of the lack of specific pharmacological agents for these channels, we have taken a genetic approach to manipulating channel expression. We use an organotypic culture preparation (16) in order to maintain cell morphology and the laminar pattern of cortex. We typically isolate acute neocortical slices at postnatal days 8-10 and maintain the slices in culture for 3-7 days. This allows us to study neurons at a similar age to those in our work with acute slices and minimizes the development of exuberant excitatory connections in the slice. We record from visually-identified pyramidal neurons in layers II/III or V using infrared illumination (IR-) and differential interference contrast microscopy (DIC) with whole cell patch clamp in current- or voltage-clamp. We use biolistic (Gene gun) transfection of wild type or mutant potassium channel DNA to manipulate expression of the channels to study their function. The transfected cells are easily identified by epifluorescence microscopy after co-transfection with cDNA for green fluorescent protein (GFP). We compare recordings of transfected cells to adjacent, untransfected neurons in the same layer from the same slice.

This is a protocol to prepare and maintain a neocortical slice preparation in organotypic culture for the purpose of making electrical recordings from pyramidal neurons.

Whole Cell Aufnahme von einem organotypischen Vorbereitung der Neocortex

We have been studying the expression and functional roles of voltage-gated potassium channels in pyramidal neurons from rat neocortex.  Because of the ...

Forschung

Neurowissenschaften

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to mesenchymal transition (EMT) and migrates throughout the embryo, giving rise to diverse cell types 1-3. NC also has the unique ability to influence the differentiation and maturation of target organs4-6. When explanted in vitro, NC progenitors undergo self-renewal, migrate and differentiate into a variety of tissue types including neurons, glia, smooth muscle cells, cartilage and bone. 
NC multipotency was first described from explants of the avian neural tube7-9. In vitro isolation of NC cells facilitates the study of NC dynamics including proliferation, migration, and multipotency. Further work in the avian and rat systems demonstrated that explanted NC cells retain their NC potential when transplanted back into the embryo10-13. Because these inherent cellular properties are preserved in explanted NC progenitors, the neural tube explant assay provides an attractive option for studying the NC in vitro. 
To attain a better understanding of the mammalian NC, many methods have been employed to isolate NC populations. NC-derived progenitors can be cultured from post-migratory locations in both the embryo and adult to study the dynamics of post-migratory NC progenitors11,14-20, however isolation of NC progenitors as they emigrate from the neural tube provides optimal preservation of NC cell potential and migratory properties13,21,22. Some protocols employ fluorescence activated cell sorting (FACS) to isolate a NC population enriched for particular progenitors11,13,14,17. However, when starting with early stage embryos, cell numbers adequate for analyses are difficult to obtain with FACS, complicating the isolation of early NC populations from individual embryos. Here, we describe an approach that does not rely on FACS and results in an approximately 96% pure NC population based on a Wnt1-Cre activated lineage reporter23. 
The method presented here is adapted from protocols optimized for the culture of rat NC11,13. The advantages of this protocol compared to previous methods are that 1) the cells are not grown on a feeder layer, 2) FACS is not required to obtain a relatively pure NC population, 3) premigratory NC cells are isolated and 4) results are easily quantified. Furthermore, this protocol can be used for isolation of NC from any mutant mouse model, facilitating the study of NC characteristics with different genetic manipulations. The limitation of this approach is that the NC is removed from the context of the embryo, which is known to influence the survival, migration and differentiation of the NC2,24-28.

Isolation of embryonic neural crest from the neural tube facilitates the use of in vitro methods for studying migration, self-renewal, and multipotency of neural crest.

Isolierung und Kultivierung von Zellen der Neuralleiste aus embryonalen murinen Neuralrohr

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

Primary Culture of Mouse Dopaminergic Neurons

Dopaminergic neurons represent less than 1% of the total number of neurons in the brain. This low amount of neurons regulates important brain functions such as motor control, motivation, and working memory. Nigrostriatal dopaminergic neurons selectively degenerate in Parkinson&#39;s disease (PD). This progressive neuronal loss is unequivocally associated with the motors symptoms of the pathology (bradykinesia, resting tremor, and muscular rigidity). The main agent responsible of dopaminergic neuron degeneration is still unknown. However, these neurons appear to be extremely vulnerable in diverse conditions. Primary cultures constitute one of the most relevant models to investigate properties and characteristics of dopaminergic neurons. These cultures can be submitted to various stress agents that mimic PD pathology and to neuroprotective compounds in order to stop or slow down neuronal degeneration. The numerous transgenic mouse models of PD that have been generated during the last decade further increased the interest of researchers for dopaminergic neuron cultures. Here, the video protocol focuses on the delicate dissection of embryonic mouse brains. Precise excision of ventral mesencephalon is crucial to obtain neuronal cultures sufficiently rich in dopaminergic cells to allow subsequent studies. This protocol can be realized with embryonic transgenic mice and is suitable for immunofluorescence staining, quantitative PCR, second messenger quantification, or neuronal death/survival assessment.

Dopaminergic neurons play a vital regulatory role in the brain. Their loss is associated with Parkinson's disease. In this video, we show how to generate primary cultures of central dopaminergic neurons from embryonic mouse mesencephalon. Such cultures are useful to study the extreme vulnerability of these neurons to various stresses.

Primärkultur von Maus dopaminergen Neuronen

Dopaminergic neurons represent less than 1% of the total number of neurons in the brain. This low amount of neurons regulates important brain functions ...

Acquisition of High-Quality Digital Video of Drosophila Larval and Adult Behaviors from a Lateral Perspective

Drosophila melanogaster is a powerful experimental model system for studying the function of the nervous system. Gene mutations that cause dysfunction of the nervous system often produce viable larvae and adults that have locomotion defective phenotypes that are difficult to adequately describe with text or completely represent with a single photographic image. Current modes of scientific publishing, however, support the submission of digital video media as supplemental material to accompany a manuscript. Here we describe a simple and widely accessible microscopy technique for acquiring high-quality digital video of both Drosophila larval and adult phenotypes from a lateral perspective. Video of larval and adult locomotion from a side-view is advantageous because it allows the observation and analysis of subtle distinctions and variations in aberrant locomotive behaviors. We have successfully used the technique to visualize and quantify aberrant crawling behaviors in third instar larvae, in addition to adult mutant phenotypes and behaviors including grooming.

Acquisition of High-Quality Digital Video of Drosophila Larval and Adult Behaviors from a Lateral Perspective

Here we describe a simple and widely accessible microscopy technique to acquire high-quality digital video of Drosophila adult and larval mutant phenotypes from a lateral perspective.

Erwerb von qualitativ hochwertigen digitalen Video<em&gt; Drosophila</em&gt; Larven und Verhalten der Erwachsenen aus einer seitlichen Perspektive

Drosophila melanogaster is a powerful experimental model system for studying the function of the nervous system. Gene mutations that cause dysfunction of ...

Preparation of Primary Mixed Glial Cultures from Adult Mouse Spinal Cord Tissue

It has been well-accepted that spinal cord glial responses contribute significantly to the development of neuropathic pain. Tremendous information regarding glial activities at the cellular and molecular levels has been obtained through in vitro cell culture systems. The in vitro systems utilized, mainly include primary glia derived from neonatal brain cortical tissue and immortalized cell lines. However, these systems may not reflect the characteristics of spinal cord glial cells in vivo. In order to further investigate the roles of spinal cord glial cells in the development of peripheral nerve injury-induced neuropathic pain using a culture system that better reflects the in vivo condition, our laboratory has developed a method to establish primary spinal cord mixed glial cultures from adult mice. Briefly, spinal cords are collected from adult mice and processed through papain digestion followed by myelin removal with a density-gradient medium. Single cell suspensions are cultured in complete Dulbecco&#39;s modified Eagle media (cDMEM) supplemented with 2-mercaptoethanol (2-ME) at 35.9 oC. These culture conditions were optimized specifically for the growth of mixed glial cells. Under these conditions, cells are ready to be used for experimentation between 12 - 14 d&#160;(cells are usually in log phase during this time) after the establishment of the culture (D 0) and can be kept in culture conditions up to D 21. This culture system can be used to investigate the responses of spinal cord glial cells upon stimulation with various substances and agents. Besides neuropathic pain, this system can be used to study glial responses in other diseases that involve pathological changes of spinal cord glial cells.

The development of neuropathic pain involves pathological changes of spinal cord glial cells. A reliable glial culture system derived from adult spinal cord tissue and designed for studying these cells in vitro is lacking. Therefore, we show here how&#160;to establish primary mixed glial cultures from adult mouse spinal cord tissue.

Herstellung von primären gemischten Gliazellen Kulturen von erwachsenen Maus Rückenmarksgewebe

It has been well-accepted that spinal cord glial responses contribute significantly to the development of neuropathic pain. Tremendous information ...

Live Imaging of Primary Cerebral Cortex Cells Using a 2D Culture System

During cerebral cortex development, progenitor cells undergo several rounds of symmetric and asymmetric cell divisions to generate new progenitors or postmitotic neurons. Later, some progenitors switch to a gliogenic fate, adding to the astrocyte and oligodendrocyte populations. Using time-lapse video-microscopy of primary cerebral cortex cell cultures, it is possible to study the cellular and molecular mechanisms controlling the mode of cell division and cell cycle parameters of progenitor cells. Similarly, the fate of postmitotic cells can be examined using cell-specific fluorescent reporter proteins or post-imaging immunocytochemistry. More importantly, all these features can be analyzed at the single-cell level, allowing the identification of progenitors committed to the generation of specific cell types. Manipulation of gene expression can also be performed using viral-mediated transfection, allowing the study of cell-autonomous and non-cell-autonomous phenomena. Finally, the use of fusion fluorescent proteins allows the study of symmetric and asymmetric distribution of selected proteins during division and the correlation with daughter cells fate. Here, we describe the time-lapse video-microscopy method to image primary cerebral cortex murine cells for up to several days and analyze the mode of cell division, cell cycle length and fate of newly generated cells. We also describe a simple method to transfect progenitor cells, which can be applied to manipulate genes of interest or simply label cells with reporter proteins.

Live imaging is a powerful tool to study cellular behaviors in real time. Here, we describe a protocol for time-lapse video-microscopy of primary cerebral cortex cells that allows a detailed examination of the phases enacted during the lineage progression from primary neural stem cells to differentiated neurons and glia.

Bildgebung des primären Hirnrinde Zellen unter Verwendung einer 2D Kultursystem zu leben

During cerebral cortex development, progenitor cells undergo several rounds of symmetric and asymmetric cell divisions to generate new progenitors or ...

Simple Generation of a High Yield Culture of Induced Neurons from Human Adult Skin Fibroblasts

Induced neurons (iNs), the product of somatic cells directly converted to neurons, are a way to obtain patient-derived neurons from tissue that is easily accessible. Through this route, mature neurons can be obtained in a matter of a few weeks. Here, we describe a straightforward and rapid one-step protocol to obtain iNs from dermal fibroblasts obtained through biopsy samples from adult human donors. We explain each step of the process, including the maintenance of the dermal fibroblasts, the freezing procedure to build a stock of the cell line, seeding of the cells for reprogramming, as well as the culture conditions during the conversion process. In addition, we describe the preparation of glass coverslips for electrophysiological recordings, long-term coating conditions, and fluorescence activated cell sorting (FACS). We also illustrate examples of the results to be expected. The protocol described here is easy to perform and can be applied to human fibroblasts derived from human skin biopsies from patients with various different diagnoses and ages. This protocol generates a sufficient amount of iNs which can be used for a wide array of biomedical applications, including disease modeling, drug screening, and target validation.

Direct neuronal reprogramming generates neurons that maintain the age of the starting somatic cell. Here, we describe a single vector-based method to generate induced neurons from dermal fibroblasts obtained from adult human donors.

Einfache Erstellung einer High-Yield-Kultur der induzierten Neuronen aus Menschenhaut Erwachsenen Fibroblasten

Induced neurons (iNs), the product of somatic cells directly converted to neurons, are a way to obtain patient-derived neurons from tissue that is easily ...

A Stainless Protocol for High Quality RNA Isolation from Laser Capture Microdissected Purkinje Cells in the Human Post-Mortem Cerebellum

Laser capture microdissection (LCM) is an advantageous tool that allows for the collection of cytologically and/or phenotypically relevant cells or regions from heterogenous tissues. Captured product can be used in a variety of molecular methods for protein, DNA or RNA isolation. However, preservation of RNA from postmortem human brain tissue is especially challenging. Standard visualization techniques for LCM require histologic or immunohistochemical staining procedures that can further degrade RNA. Therefore, we designed a stainless protocol for visualization in LCM with the intended purpose of preserving RNA integrity in post-mortem human brain tissue. The Purkinje cell of the cerebellum is a good candidate for stainless visualization, due to its size and characteristic location. The cerebellar cortex has distinct layers that differ in cell density, making them a good archetype to identify under high magnification microscopy. Purkinje cells are large neurons situated between the granule cell layer, which is a densely cellular network of small neurons, and the molecular layer, which is sparse in cell bodies. Because of this architecture, the use of stainless visualization is feasible. Other organ or cell systems that mimic this phenotype would also be suitable. The stainless protocol is designed to fix fresh-frozen tissue with ethanol and remove lipids with xylene for improved morphological visualization under high magnification light microscopy. This protocol does not account for other fixation methods and is specifically designed for fresh-frozen tissue samples captured using an ultraviolet (UV)-LCM system. Here, we present a full protocol for sectioning and fixing fresh frozen post-mortem human cerebellar tissue and purification of RNA from Purkinje cells isolated by UV-LCM, while preserving RNA quality for subsequent RNA-sequencing. In our hands, this protocol produces exceptional levels of cellular visualization without the need for staining reagents and yields RNA with high RNA integrity numbers (&#8805;8) as needed for transcriptional profiling experiments.

This protocol uses a stain-free approach to visualize and isolate Purkinje cells in fresh-frozen tissue from human post-mortem cerebellum via laser capture microdissection. The purpose of this protocol is to generate sufficient amounts of high-quality RNA for RNA-sequencing.

Ein Edelstahl-Protokoll für hochwertige RNA Isolation aus Laser Capture Microdissected Purkinje-Zellen im menschlichen Post-Mortem Kleinhirn

Laser capture microdissection (LCM) is an advantageous tool that allows for the collection of cytologically and/or phenotypically relevant cells or ...

Primary Cell Culture of Purified GABAergic or Glutamatergic Neurons Established through Fluorescence-activated Cell Sorting

The overall goal of this protocol is to generate purified neuronal cultures derived from either GABAergic or glutamatergic neurons. Purified neurons can be cultured in defined media for 16 days in vitro and are amenable to any analyses typically performed on dissociated cultures, including electrophysiological, morphological and survival analyses. The major advantage of these cultures is that specific cell types can be selectively studied in the absence of complex external influences, such as those arising from glial cells or other neuron types. When planning experiments with purified cells, however, it is important to note that neurons strongly depend on glia-conditioned media for their growth and survival. In addition, glutamatergic neurons further depend on glia-secreted factors for the establishment of synaptic transmission. We therefore also describe a method for co-culturing neurons and glial cells in a non-contact arrangement. Using these methods, we have identified major differences between the development of GABAergic and glutamatergic neuronal networks. Thus, studying cultures of purified neurons has great potential for furthering our understanding of how the nervous system develops and functions. Moreover, purified cultures may be useful for investigating the direct action of pharmacological agents, growth factors or for exploring the consequences of genetic manipulations on specific cell types. As more and more transgenic animals become available, labeling additional specific cell types of interest, we expect that the protocols described here will grow in their applicability and potential.

This protocol describes a cell sorting based method for the purification and culture of fluorescent GABAergic or glutamatergic neurons from the neocortex and hippocampus of postnatal mice or rats.

Primärzellkultur von gereinigten Gurified GABAergic oder Glutamatergic Neuronen, die durch Fluoreszon-Sortierung gegründet wurden

The overall goal of this protocol is to generate purified neuronal cultures derived from either GABAergic or glutamatergic neurons. Purified neurons can ...

Primary Culture of Neurons Isolated from Embryonic Mouse Cerebellum

The use of primary cell cultures has become one of the major tools to study the nervous system in vitro. The ultimate goal of using this simplified model system is to provide a controlled microenvironment and maintain the high survival rate and the natural features of dissociated neuronal and nonneuronal cells as much as possible under in vitro conditions. In this article, we demonstrate a method of isolating primary neurons from the developing mouse cerebellum, placing them in an in vitro environment, establishing their growth, and monitoring their viability and differentiation for several weeks. This method is applicable to embryonic neurons dissociated from cerebellum between embryonic days 12&ndash;18.

Conducting in vitro experiments to reflect in vivo conditions as adequately as possible is not an easy task. The use of primary cell cultures is an important step toward understanding cell biology in a whole organism. The provided protocol outlines how to successfully grow and culture embryonic mouse cerebellar neurons.

Primäre Kultur der Neuronen isoliert von Embryonal Mouse Cerebellum

The use of primary cell cultures has become one of the major tools to study the nervous system in vitro. The ultimate goal of using this simplified model ...