Diese Arbeit wurde unterstützt durch Zuschüsse aus dem National Health and Medical Research Council (NHMRC), H-JZ. TMBW ist ein Empfänger von Australien Postgraduate Award der australischen Regierung und der Ann Henderson Top-up Stipendium von australischen Rotary Gesundheit auf Partner mit Rotary Templestowe und Dine für eine Heilung.

Alle Tierversuche wurden von der University of Melbourne-Tier-Ethik-Kommission genehmigt.
Hinweis: Die Sequenz, Bau und Generation Protokoll für die adenovirale Vektoren pAd-CMV-Td-Tom, pAd-CMV-GFP und pAd-CAGA12- Luc/Td-Tom schon zuvor beschriebenen11,12, 13. Alle Vektoren sind im Handel erhältlich.
1. Virus-Titer-Bestimmung mit 50 % Gewebekultur infektiöse Dosis (TCID50)
<ol><li>Bereiten Sie 1 x 106 HEK293A Zellen in 10 mL DMEM + 10 % FBS Medien.</li>
	<li>Samen Sie 100 µL Zellsuspension in jede Vertiefung eine 96-Well flach-Boden Zellplatte Kultur.</li>
	<li>Bereiten Sie 1 mL einer 1: 100 Verdünnung des Virus bestand im kompletten Medium. Geben Sie 11 µL verdünnter Virus in jeder Spalte 1.</li>
	<li>10-divisibel Verdünnungsreihen direkt in den 96-well-Platte ausführen, indem 11 µL verdünnter Virus mit 100 µL Zellsuspension mischen, bis eine endgültige Verdünnung von 1 X1012 erreicht ist. Obwohl nicht-anhaftende Zellen zu diesem Zeitpunkt, die Anzahl der Zellen übertragen zwischen Brunnen bleibt konstant.</li>
	<li>Pipette 11 µL jeder Verdünnung in jeder Spalte, beginnend mit der höchsten Verdünnung von 104. Ersetzen Sie Pipettenspitzen mit jeder Verdünnung, Cross-Over aus Viruspartikel zu begrenzen.</li>
	<li>Spalte 12 11 µL virenfrei komplette Medien als Negativkontrolle hinzufügen.</li>
	<li>7-10 Tage bei 37 ° C mit 10 % CO2inkubieren Sie Platte.</li>
	<li>Zählen Sie unter Verwendung eines Mikroskops, die Anzahl der Bohrungen in jeder Spalte zeigt Anzeichen von zytopathischen oder zytotoxischen Wirkungen. Betrachten Sie eine sehr Positive, wenn Anzeichen einer Infektion vorhanden ist.</li>
	<li>Den Anteil der positiven Vertiefungen für jede Verdünnung mit Reed und Münch (1938) statistische Methode14zu berechnen.</li>
	<li>Berechnung der proportionalen Abstand (PD) mit: (A-50)/(A-B), wo A ist der Prozentsatz Antwort oben oder gleich 50 % und B reagiert die Prozentsatz unter 50 %.</li>
	<li>TCID50 mit zu berechnen: 10X-PD, wo X ist die Verdünnung eine Antwort größer als 50 %.</li>
	<li>Virale Titer von den folgenden berechnen: 0,69 / (0,011 X TCID50) PFU/mL</li>
</ol>(2) Adenovirus-MOI-Bestimmung
<ol><li>Samen 1.0-1.5 x 105 MDA-MB-231-Zellen mit 500 μL DMEM Nährmedien mit 5 %, die FBS in jede Vertiefung einer 12 gut Platte (35 % Zelle Konfluenz, 6 Brunnen insgesamt).</li>
	<li>Berechnen Sie die Volumen der Ad-CMV-Td-Tom Lager benötigt für 0, 250, 500, 2500 und 5000 MOI folgende Formel verwenden: MOI = (Volumen [μl] x PFU/μL) / Anzahl der Zellen. Für Ad-CMV-Td-Tom mit einem Titer von 1 x 1010 (PFU/mL), das Volumen der Virus-Infektion sind erforderliche MOIs 0, 3,75, 7,5, 37,5 und 75 μl.</li>
	<li>Pipettieren virale Lager direkt in die Vertiefungen mit guten Durchmischung, um die Zellen die berechneten Mengen an Ad-CMV-Td-Tom in Abschnitt 2.2 zu infizieren.</li>
	<li>Legen Sie die Platte in den Inkubator bei 37 ° C mit 10 % CO2 für 24 h.</li>
	<li>Entfernen Sie das Medium aus dem Brunnen und sofort behoben Sie werden die Zellen mit 500 μl 10 % Formalin für 5 Minuten.</li>
	<li>Aspirieren Sie Formalin aus Brunnen und waschen Sie Brunnen mit 500 μl PBS einmal.</li>
	<li>Führen Sie der Zellkern mit 500 μL der Hoechst-Lösung für 5 min zu Flecken.</li>
	<li>Entfernen Sie die Hoechst-Lösung und waschen Sie die Brunnen mit 500 μl PBS 3 Mal.</li>
	<li>Bild das Td-Tomate-Protein und Zellkern signalisieren mit 200 X Vergrößerung auf dem Fluoreszenzmikroskop. Td-Tomate-Proteins an 554 begeistern nm und der Hoechst-Farbstoff auf 352 nm.</li>
	<li>Analysieren von Bildern mit ImageJ um die Arbeiten zu bestimmen, die, das Moi für 100 % Infektion von Td-Tomaten15erforderlich.</li>
</ol>3. Dual-Adenovirus Transduktion in Live Einzelzellen
<ol><li>Samen 1.0-1.5 x 105 MDA-MB-231-Zellen mit 500 μL DMEM Nährmedien mit 5 %, die FBS in jede Vertiefung einer 12 gut Platte (35 % Zelle Konfluenz, 2 Brunnen insgesamt).</li>
	<li>Zellen mit 75 μL der Ad-CMV-GLP infizieren (Titer = 5 x 109 PFU/mL) und 7,5 μl des Ad-CAGA12-Td-Tom (Titer = 5 x 1010 PFU/mL), eine 2.500 MOI 100 % Infektion Positivität erreichen zu erwirken.</li>
	<li>Zellen mit oder ohne 0,25 μl der TGF-β pro Bohrloch (10 mg/mL auf Lager, 5 ng/μl als die Endkonzentration) unmittelbar nach der Adenovirus-Infektion zu behandeln.</li>
	<li>Legen Sie die Platte in den Inkubator bei 37 ° C mit 10 % CO2 für 24 h.</li>
	<li>Bild lebenden Zellen mit Phase Kontrast Fluoreszenzmikroskop. Excite GFP bei 470 nm und Td-Tomate-Proteins an 554 nm.</li>
	<li>Beheben Sie Zellen zu und Flecken Sie Zellkern beschriebenen Schritte 1.6 - 1.9.</li>
	<li>Bild das Td-Tomate-Protein und Hoechst färben mit einem Fluoreszenzmikroskop. Begeistern die Hoechst-Farbstoff auf 352 nm.</li>
	<li>Verwendung von ImageJ, berechnen Sie der Prozentsatz der GFP und Td-Tomate positiven15Zellen.</li>
</ol>4. live einzelne Zelle Signalisierung Wundheilung im Test
<ol><li>Samen 4 bis 5 x 105 MDA-MB-231-Zellen mit 1 mL DMEM Nährmedien mit 5 %, die FBS in jede Vertiefung eines 6 gut Platte (50 % Zelle Konfluenz, 2 Brunnen insgesamt).</li>
	<li>Die Zellen mit 22,5 μL des Ad-CAGA12-Td-Tom infizieren (Titer = 5 x 1010 PFU/mL, MOI = 2.500).</li>
	<li>Legen Sie die Platte in den Inkubator bei 37 ° C mit 10 % CO2 für 24 h.</li>
	<li>Kratzen Sie zwei gekreuzte Linien auf der Zellschicht von jedem Bohrloch mit einer PIPETTENSPITZE P200.</li>
	<li>Die alten Medien vom Brunnen entfernen und ersetzen mit 2 mL frische 5 % FBS Medien mit oder ohne 0,5 μL der TGF-β pro Bohrloch (10 mg/mL auf Lager, 5 ng/μl als Endkonzentration).</li>
	<li>Die Platte im Inkubator bei 37 ° C mit 10 % CO2 für 5 min und nehmen Sie Bilder von ausgewählten Wunde Bereiche mit 100 X Vergrößerung auf dem Phase-Kontrast-Mikroskop.</li>
	<li>Legen Sie die Platte in den Inkubator bei 37 ° C mit 10 % CO2 für 24 h.</li>
	<li>Nehmen Sie Bilder von den Wundverschluss an den gleichen Stellen wie vor.</li>
	<li>Beheben Sie die Zellen zu, Färben Sie Zellkern beschriebenen Schritte 1.6 - 1.9 und visualisieren Sie Td-Tomate-Signal in das wundgebiet und nicht wundbereich mit 200 X Vergrößerung auf ein Fluoreszenzmikroskop zu.</li>
	<li>Den Anteil der Td-Tomate positive Zellen in die Wunde und nicht-wundbereich mit ImageJ Software15zu quantifizieren.</li>
</ol>5. in-vitro- Luciferase Assay
<ol><li>Bereiten Sie eine Zellsuspension von 3-5 x 104 MDA-MB-231-Zellen in 1 mL DMEM Medium mit 5 % FBS.</li>
	<li>Infizieren Zellsuspension mit 2,5 μL des Ad-CAGA12- Luc (Titer = 5 x 1010 PFU/mL, MOI = 2.500).</li>
	<li>Samen der infizierten Zellen in einem 96 Platte auch bei 3.000 Zellen/100 µL/Well.</li>
	<li>Legen Sie die Platte in den Inkubator bei 37 ° C mit 10 % CO2 für 24 h.</li>
	<li>Alte Medien aus Brunnen zu entfernen und ersetzen Sie durch 100 µL frische 5 % FBS Medien mit oder ohne 0,1 μL der TGF-β pro Bohrloch (1 mg/mL auf Lager, 1 ng/μl als die Endkonzentration) und das Vorhandensein oder Fehlen von 0,17 μL der TGF-β-Inhibitor pro Bohrloch (7 mg/mL auf Lager 12 ng/μl als Endkonzentration) (ein neuartiges TGF-β Liganden Falle Protein, Chen Et Al., unveröffentlichte Arbeit).</li>
	<li>Legen Sie die Platte in den Inkubator bei 37 ° C mit 10 % CO2 für 24 h.</li>
	<li>Die Luciferase Assay System Substrat tauen Sie auf und bereiten Sie 1 X Zelle Kultur Lyse-Reagenz in doppelt destilliertem Wasser (DDW zu).</li>
	<li>Entfernen Sie Medien aus den 96 Brunnen und lösen Sie Brunnen mit 50 μL der 1 X Zelle Kultur Lyse Puffer auf Eis mit einem Orbitalschüttler mit sanften Agitation für 30 min.</li>
	<li>30 μl der lysate aus jedem Brunnen in eine undurchsichtige Luciferase-Teller und die Platte auf Raumtemperatur erwärmen.</li>
	<li>Erstellen Sie auf dem Luminometer Software ein neues Protokoll. Wählen Sie für 1 Injektor mit Messungen vor und nach der Injektion. Messungen vor der Injektion auf 1 festgelegt s für Verzögerung bei der Messung und Integrationszeit. Für nach der Injektion Messung stellen Sie Injektionsvolumen 40 µL mit einer Verzögerung bei der Messung von 1 s nach der Injektion und 5 s Integrationszeit. Bestätigen Sie Einstellungen wählen Sie "OK".</li>
	<li>Legen Sie den Injektor-Schlauch in DDW und klicken Sie Injektor 1 unter den Prime -Einstellungen der Injektor Tube vor Gebrauch zu reinigen. Als nächstes Entfernen der Injektor-Röhre aus der DDW und in Luft, gefolgt von zwei weiteren Primzahlen des Injektors 1, all-Lösung aus der Tube zu spülen. Legen Sie den Injektor-Schlauch in Firefly Substrat und wieder Prime zweimal, um das Substrat zu bereiten.</li>
	<li>Legen Sie die undurchsichtige Luciferase-Platte mit den Proben in der Luminometer und wählen Sie Optionen der Software. Markieren Sie die Brunnen von Interesse und klicken Sie auf anwenden. Drücken Sie, um Luciferase Signal zu messen beginnen .</li>
	<li>Sobald Messungen abgeschlossen sind, abnehmen und die Platte mit Wasser ausspülen. Alle restlichen Substrat in den Injektor Rohr indem man das Rohr in die Luft und Prime Injektor 1 zurück in Firefly Substrat Rohr zu erholen. Legen Sie den Injektor-Schlauch in DDW und führen Sie zwei weitere Primzahlen um den Injektor Tube alle restlichen Substrat zu reinigen.</li>
</ol>6. Zelle Vorbereitung für Live Signalisierung Bildgebung In Vivo
<ol><li>48 Stunden vor der Tumor-Implantation, Samen 2-3 x 106 MDA-MB-231-Zellen in 175 cm2 Fläschchen (10 Flaschen insgesamt). Kulturzellen in 20 mL DMEM Medium mit 5 % FBS bei 37 ° C, 10 % CO2.</li>
	<li>24 h später hinzufügen 300 μL des Ad-CAGA12- Luc (Titer = 5 x 1010 PFU/mL, MOI = 2.500) in jedem Kolben. Halten Sie Zellen in der Kultur für ein weiteres 24 h.</li>
	<li>Am Tag der Implantation entfernen Sie die alten Medien und waschen Sie die Adenovirus infiziert Zellen einmal mit 20 mL PBS, pH 7.4. 2 mL 0,05 % Trypsin-EDTA in die Flasche und schütteln Sie die Flasche leicht um Trypsin, die Kolben Fläche zu ermöglichen. Legen Sie die Flasche in in den Inkubator 37 ° C, 10 % CO2 3 min.</li>
	<li>Die Trypsin durch Zugabe von 8 mL DMEM FBS-haltigen Medien in Fläschchen zu stillen. Übertragen Sie alle Zellsuspensionen in einer Glasflasche Reagenz.</li>
	<li>Zählen der Anzahl von Zellen mit einem Hemocytometer und 4,8 x 107 Zellen in zwei 50 ml Zentrifuge Röhren zu übertragen.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Zellen bei 400 X g für 5 min bei RT entfernen Trypsin und Aufschwemmen Zellen in 720 mL frische FBS-DMEM Medien.</li>
	<li>Übertragen Sie die Zellsuspensionen in ein steriles 5 mL Röhrchen geben und 160 μl Matrigel (10 % insgesamt Matrigel Suspension).</li>
	<li>Bewahren Sie Zellen auf Eis bis Implantation.</li>
</ol>(7) Orthotopen Implantation
<ol><li>Wiegen Sie 12 SCID Mäuse und nach dem Zufallsprinzip zuordnen Sie Mäuse in Behandlung und Eindämmung der Gruppen (6 Mäuse/Gruppe zu).</li>
	<li>Führen Sie die Implantation in einem sterilen Bio-Schrank in einer sterilen Umgebung halten. Betäuben Sie die Maus mit 2,5-4,5 % Isofluran mit einer Sauerstoff-Durchfluss von 1 L/min statt der Maus auf ein Heizkissen und Tropfen Sie ein schmieren Augensalbe auf beiden Augen Hornhaut Schaden zu vermeiden. Befestigen Sie die Maus, um das Wärmekissen in Rückenlage, während Anästhesie beibehalten, indem man die Schnauze in einem Prüfkopf mit der Isofluran verbunden.</li>
	<li>Bestätigen Sie den Erfolg der Anästhesie durch den Mangel an Reaktion bis zu den Zehen Prise. Reduzieren Sie Isofluran auf eine Erhaltungsdosis von 1,5 bis 2,5 % mit 1 L/min Sauerstoff für die Erinnerung der Implantation.</li>
	<li>Reinigen Sie die Haut aus der vierten Brustwarze auf beiden Seiten der Mittellinie mit dem Wattestäbchen zu 80 % Ethanol getaucht.</li>
	<li>Finden Sie 4th Mamma Fettpolster durch Abtasten zu, und drücken Sie die Fettpolster, die das Gewebe weiter aussetzen.</li>
	<li>Mischen Sie die Zellsuspension gut durch pipettieren rauf und runter. Sanft 50 µL der Zelle Mischung in eine 27G Insulin Spritze Aspirieren und injizieren in die Mamma Fettpolster auf beiden Seiten der Maus.</li>
	<li>Bestätigen Sie eine erfolgreiche Injektion durch Abtasten Schwellung der Fettpolster. Lassen Sie die Fettpolster sanft und platzieren Sie die Maus zurück in den Käfig.</li>
	<li>Lassen Sie die Käfige auf das Wärmekissen für mindestens 30 min um die Mäuse zu gewinnen Bewusstsein und legen Sie dann die Käfige zurück in die Holding-Zimmer für 3 Tage zu ermöglichen.</li>
</ol>8. IVIS Imaging
<ol><li>Öffnen Sie die Living Image -Software.</li>
	<li>Initialisieren Sie das IVIS System Initialisieren IVIS System klicken Sie auf das Control Panel. Warten Sie, bis die Temperatur Zeichen auf grün schaltet.</li>
	<li>Wählen Sie die lumineszierenden Imaging-Modus auf dem Bedienfeld.</li>
	<li>Isofluran-Narkose auf die Kammer und IVIS System einschalten.</li>
	<li>Betäuben Sie die Mäuse mit 2,5-4,5 % Isofluran mit 1 L/min Sauerstoff. Einmal betäubt, Set Isofluran mit 1,5-2,5 % für die Wartung. Injizieren Sie 150 mg/kg Körpergewicht von D-Luciferin in Mäusen durch intraperitoneale (i.p.) Injektion.</li>
	<li>Sofortüberweisung Mäuse in das IVIS-System, legen Sie sie auf die temperaturgeführte imaging Plattform und platzieren Sie ihre Nase in die bugnase.</li>
	<li>Klicken Sie auf die Sequenz Setup -Taste auf dem Bedienfeld, und wählen Sie Medium Binning.</li>
	<li>Richten Sie die bildgebenden Belichtungszeit wie folgt: 10 s, 20 s, 30 s, 60 s und 120 s. Beginn ca. 3 min nach der Injektion von Luciferin imaging und weiterhin Bild, bis das Signal zu fallen beginnt (normalerweise dauert dies ca. 20 min).</li>
	<li>Die Mäuse aus IVIS unter Beibehaltung Isofluran-Narkose durch eine Nase Kegel und behandeln Sie die Mäuse mit 50 µL PBS oder 50 µL TGF-β Signalisierung Inhibitor (50 μg/Tumor) mittels Intra-Tumor-Injektion zu.</li>
	<li>Legen Sie die Mäuse wieder in den Käfig und lassen Sie sie auf das Wärmekissen für mindestens 30 Minuten. Dann legen Sie den Käfig zurück in den Raum halten.</li>
	<li>IVIS bildgebende Verfahren, wie beschrieben, am Tag nach der Behandlung zu wiederholen.</li>
</ol>9. die Datenanalyse
<ol><li>Offene Dateien in Living Image -Software gespeichert.</li>
	<li>Finden Sie die Bildinformationen mit Ansicht | Bildinformationen.</li>
	<li>Wählen Sie Fotos zu einem ähnlichen Zeitpunkt mit der gleichen Belichtungszeit aufgenommen. Laden Sie Fotos als Gruppe.</li>
	<li>Deaktivieren Sie das einzelne Feld im Bild anzupassen , um die Intensität zu normalisieren.</li>
	<li>Wählen Sie Photon -Modus, um die Intensität zu analysieren. Quantifizieren Sie die Intensität des Signals durch die Region von Interesse (ROI) -Schaltfläche im ROI-Tools.</li>
	<li>Ziehen Sie den ROI-Kreis in der Region, die biolumineszente Signal enthält und klicken Sie auf Messen , um die Signalstärke zu erwerben.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Massague, J., Like, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+receptors+for+type+beta+transforming+growth+factor.+Ligand+binding+and+affinity+labeling+in+human+and+rodent+cell+lines.">Cellular receptors for type beta transforming growth factor. Ligand binding and affinity labeling in human and rodent cell lines.</a> The Journal of biological chemistry. 260, 2636-2645 (1985).</li><li>Xu, L., Chen, Y. 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Die Autoren Berichten keine Interessenkonflikte.

Wir entwickelten eine Technik, um Echtzeit-Bildgebung der TGF-β/Smad3 Signalisierung im einzigen lebenden Zellen zu ermöglichen. Mit dieser neuartigen Methode haben wir zuvor eine Subpopulation von Zellen mit dynamischen TGF-β/Smad3 transkriptionelle Aktivität identifiziert, die mit verstärkten Invasion und Migration8verbunden war. Diese Methode verbessert auf traditionelle Assays für die TGF-β-Signalisierung, wie westliche Flecken der Smad3 Phosphorylierung und TGF-β gezielt Genexpression, durch die Erfassung der Heterogenität der TGF-β/Smad3 Signalisierung in der Tumor-Bevölkerung und Hervorhebung der Bedeutung der einzelnen Zelle Biologie. Darüber hinaus Alternative Methoden der Einzelzelle imaging wie nukleare Translokation zeitaufwendig und kostenintensiv sein kann erfolgt in Zellen Leben und können nicht immer auf Gen Transkription16,17übersetzen. Diese Methoden sind, zwar wichtig, die vorgelagerten Wege der Signaltransduktion zu untersuchen bietet das Adenovirus-Reporter-System eine einzigartige Perspektive auf TGF-β/Smad3 signalisieren in den einzelnen Zellen in Bezug auf biologische Funktion.
Deutlich, unsere Methode bietet eine sensible und reproduzierbare Methode für in Vivo Nachweis der TGF-β/Smad3 Signalweg in Echtzeit während der Tumorprogression und Behandlung. Ähnlich wie bei traditionellen stabile Luciferase in Vivo Imaging, Erkennung von TGF-β/Smad3 Signalisierung innerhalb der Maus ist abhängig von der Anzahl der Zellen und Niveau der Promotor-Aktivität18. Subkutanes Gewebe wenig Störungen für die Analyse bietet, wird größere Tiefe der Zellen die Nachweisempfindlichkeit Signal verringern. Es ist möglich, die Methode für den Einsatz in andere Organe, wie Lunge, Knochen und anderen Krebsarten zu erweitern; Signal-Optimierung oder ex-Vivo Bildgebung empfiehlt jedoch, die Empfindlichkeit für die Krebs-Modell von Interesse erforderlichen zu erreichen.
Ein weiterer Vorteil der Verwendung des Adenovirus-Reporter-Systems ist, dass ihre Anwendung zur Analyse der mehrere Signalwege in lebenden Zellen gleichzeitig erweitern dürfte. In Abbildung 2Ahaben wir bewiesen, dass MDA-MB-231-Zellen mit 2 separaten Adenovirus-Vektoren, CMV-GFP und CAGA-TOM ausgestrahlt werden könnte. Dieses Dual-Infektion-System kann weiter ausgebaut werden, um zwei verschiedene Signalwege über Fluoreszenz Reporter Proteine und Luciferase Reporter (mit Firefly und Guassia Luciferase Reporter Proteine) zu melden. Unser Labor hat erreicht gleichzeitige Signalisierung von BMP/Smad1 und TGF-β/Smad3 Signalwege in einer Reihe von live Krebszelllinien (Daten nicht gezeigt).
Adenovirus-Reporter-Systeme bieten einer einfachen und bequeme Methode für das live Cell Imaging von TGF-β/Smad-Signalweg sowohl in Vitro und in Vivo. Dieses System hat deutliche Vorteile gegenüber anderen Systemen häufig verwendete Reporter. Erstens sind Adenoviren Vektoren berichtet, haben unter der höchsten virale Transduktion Wirksamkeit, so dass sie ein optimales System für Zell-Linien, die schwer zu transduzieren19,20,21,22. Zusätzlich können mit aktuellen Fortschritt in virale Technologien, "gutless" Adenovirus Vektoren durch entfernen die meisten des Virusgenoms zulassend erhöhte exogene DNA-Kapazität23erzeugt werden. Im Vergleich zu nicht-viralen Trägersysteme repräsentieren Adenovirus Vektoren eine kostengünstige, schnelle und einfache Anwendung für Zelle Transduktion, die Ergebnisse in viel größere Lieferung Effizienz19,20,21 ,22.
Dieses Protokoll verwendet eine zweite Generation Adenovirus Expressionssystems, die Replikation-inkompetent ist in Säugerzellen, die nicht die E1a und E1b Proteine Ausdrücken, biologische Sicherheit Risiko24zu minimieren. Doch trotz diese erweiterte biologische Funktionen, Adenoviren kann Partikel noch transduzieren primären humanen Zellen mit hoher Wirksamkeit25,26. US-Biosafety Level 2 und Eindämmung von adenovirale Vektoren wird empfohlen, beim Umgang mit und Entsorgung von Adenovirus Gerät kontaminiert. Großflächige Verstärkung der Adenoviren in den HEK293A Zellen führt zu einer seltenen Generation von Replikation zuständigen "Wildtyp" Adenovirus27. PCR-Screening sollte durchgeführt werden, um Wildtyp Kontamination27zu identifizieren.
Replikation-inkompetent Adenovirus Vektoren sind vorübergehend in Ausdruck und nicht mit Host DNA-20,21zu integrieren. Es wird empfohlen, dass der Experimentator die Stabilität im Ausdruck ihrer Reporter Protein identifizieren, wenn das Adenovirus-Reporter-System verwenden, um die Gültigkeit des langfristigen Experimente bestätigen. Der Ausdruck der Adenovirus-Vektor innerhalb einer Zelle ist proportional zur Zeit Teilung der Zelle und virale MOI. Um reproduzierbare Ergebnisse zu gewährleisten, ist es wichtig, dass die virale Titer für jede virale Partie genau bestimmt ist. Zusätzlich zu hohe Mengen an das Adenovirus zytotoxischen oder zytopathischen Effekte führen können und es ist wichtig, dass eine optimale MOI für jede Zelle gefüttert empirisch bestimmt wird verwendet, um optimale Ergebnisse zu gewährleisten. Darüber hinaus kann in Vivo Verwendung von Adenovirus Vektoren Immunreaktionen induzieren; wo sind Immune Antwort nicht die primäre Beobachtung des Experiments immungeschwächter Tiere20,21empfohlen. Zusätzliche Qualitätskontrolle ist erforderlich, wenn die adenoviralen Vektoren zum Ziel Immunantworten, mit, obwohl die Verwendung von das Adenovirus als Adjuvans zu Impfstoff Therapien28,29validiert wurde.
Das Adenovirus-Reporter-System verwendet werden, auf ein breites Spektrum von Primär- und kultivierten Zelllinien geteilt und nicht geteilt Natur20,22. Mit dem Adenovirus-Reporter-System haben wir 100 % Infektionsraten in einer Reihe von Krebszelllinien einschließlich Gehirn erreicht, Brustkrebs, Darmkrebs als auch primäre Maus embryologischen Fibroblasten (MEF) und Canine Kidney epithelialen (MDCK) Zellen. Darüber hinaus können adenovirale Vektoren weiter geändert werden, um die Affinität für Zelltyp spezifische Rezeptoren, bietet verbesserte Orgel-targeting und Wirksamkeit für die Transduktion30,31zu erhöhen.
Anwendungen dieser Methode können auf andere Signalwege und Zelle Gastgeber erweitert werden. Die wichtigsten Vorteile des adenoviralen Reporter Systems sind billig, hohe Transduktion Wirksamkeit, schnelle Versuchsaufbau und mangelnde Integration mit Host DNA-21,32. Diese Methode kann zu vielen aktuellen Tests und in-Vivo -Modelle, darunter bei der Bewertung der neuen zielgerichteten Therapeutika33angewendet werden. Wir hoffen, dass die Verwendung dieser Technik unser Verständnis des Verhältnisses zwischen Signalisierung Wege und biologische Prozesse führen zu neuen biologischen Entdeckungen und die Entwicklung neuer Therapien verbessern wird.

Transforming Growth Factor β (TGF-β) ist eine wesentliche Zytokin verwickelt in der menschlichen Entwicklung, das signalisiert durch ein heterodimerisierenden Komplex bestehend aus Typ II und Typ-I-Rezeptoren1. Bindung an II Rezeptor Typ Ergebnisse bei der Rekrutierung und Phosphorylierung von Typ I-Rezeptor, der wiederum nachgelagerten Smad2/3 Proteine2,3phosphorylates. Diese aktiviert Smad2/3 Proteine binden an Smad4, bilden einen Komplex, der translocates in den Zellkern und reguliert gen Transkription4. Homöostatische Bedingungen TGF-β/Smad-Signalisierung ist streng reguliert; jedoch bei vielen Krankheiten der Signalweg ist dereguliert und häufig überexprimiert führende bis zum Fortschreiten der Erkrankung5,6,7. Jüngste Studien haben gezeigt, dass zelluläre Reaktion, TGF-β heterogen ist und Subpopulationen von TGF-β/Smad aktiven Zellen verantwortlich für die biologische Funktion in einem Zeit-abhängigen Weise8,9 sind. Gemeinsame zelluläre Analyse der TGF-β/Smad-Signal beinhaltet die Verwendung von festen Endpunkt-Assays, die bieten nur einer Momentaufnahme der Zellaktivität und oft quantitate die durchschnittliche TGF-β/Smad-Effekt10. Diese Methoden können jedoch nicht genau die molekulare Verhalten der TGF-β/Smad-Signal in den physiologischen Zustand während der Progression der Erkrankung darstellen. Image-basierte Analyse von lebenden Zellen erfassen die Dynamik zellulärer und biologische Prozesse mit einem räumlichen und zeitlichen Verständnis.
Unser Ziel war es, eine empfindliche Hochdurchsatz-Methode für das live Cell Imaging der TGF-β/Smad Signalisierung mit Adenovirus-basierte Reagenzien zu entwickeln. Hier infiziert wir die menschliche Brust-Krebs-Zell-Linie MDA-MB-231 mit ein Adenovirus auszudrücken Smad3 CAGA Motiv Bindung Sequenz und eine Luciferase (Luc) oder Td-Tomate (Td-Tom) Reporter-gen. Adenoviralen Reporter-Systeme bieten eine schnelle und billige Methode für Plasmid-Einführung, die eine 100 %-Infektionsrate in Krebs-Zell-Linien führen können. Adenoviralen Reporter Systeme wurden auch erfolgreich auf Zell-Linien angewendet, die schwer mit herkömmlichen Plasmid11transfizieren sind. In diesem Protokoll beschreiben wir ein reproduzierbar und nicht-invasive Verfahren zur live Cell Imaging von TGFβ/Smad-Signalweg zu erreichen in Vivo und in Vitro.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>1881024</td>
			<td>Warm in 37 &#176;C waterbath before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foetal Bovine Serum</td>
			<td>Scientifix Life</td>
			<td>FBS500-S</td>
			<td>Heat inactivated before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human TGF-&#946;1</td>
			<td>PEPROTECH</td>
			<td>100-21</td>
			<td>Aliquot in DDW to make final concentration at 10 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst-33258</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>5117</td>
			<td>Dilute in to PBS to make final concentration at 1 &#956;L/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luciferase Reporter Assay Kit</td>
			<td>Promega</td>
			<td>197897</td>
			<td>Dilute 5x in PBS before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminometer</td>
			<td>Promega</td>
			<td>9100-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phase contrast fluorescence microscopy</td>
			<td>OLYMPUS</td>
			<td>IX50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>5810 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VivoGl Luciferin</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P1041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS Lumina III In Vivo Imaging System</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>CLS136334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5% Trypsin-EDTA (10x)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15400-054</td>
			<td>Diltue to 0.05% (1x) in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Lysis 5x Reagent</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E153A</td>
			<td>Dilute to 1x in DDW</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% Formalin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F5554-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK 293A</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>R70507</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDA-MB-231</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRM-HTB-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PRKDC-SCID</td>
			<td>Animal Resources Centre</td>
			<td>SCIDF6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Zoetis</td>
			<td>26675-46-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Chem-supply</td>
			<td>EA043-10L-P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refresh Night Time</td>
			<td>Allergan</td>
			<td>1750D</td>
			<td>Lubricating Eye Ointment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Composition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>NaH2PO4.2H2O (4 mM); NaHPO4 (16 mM); NaCl (0.12M)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS-DMEM&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5% heat inactivated FBS; 10 &#956;g/mL penicillin; 100 &#956;g/mL streptomycin</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live cell imaging of the tgf-	&beta;/smad3 signaling pathway in vitro and in vivo using an adenovirus reporter system

Transforming Growth Factor β (TGF-β) Signalisierung regelt viele wichtige Funktionen, die für die zelluläre Homöostase erforderlich und wird im allgemeinen gefunden in vielen Krankheiten, einschließlich Krebs überexprimiert. TGF-β ist stark in Metastasen während späten Stadium Krebs Fortschreiten, impliziert eine Teilmenge der Zugvögel und invasive Tumorzellen zu aktivieren. Aktuelle Methoden zur Signalisierung Pathway Analyse konzentrieren sich auf Endpunkt-Modelle, die oft versuchen, Signalisierung Post-hoc- des biologischen Ereignisses zu messen und spiegeln nicht die progressive Natur der Krankheit. Hier zeigen wir eine neuartige Adenovirus Reporter System speziell für die TGF-β/Smad3 Signalweg, die transkriptionelle Aktivierung in lebenden Zellen erkennen kann. Mit Hilfe eines Ad-CAGA12-Td-Tom -Reporter, erreichen wir eine 100 %-Infektionsrate von MDA-MB-231 Zellen innerhalb von 24 h in Vitro. Die Verwendung von fluoreszierenden Reporter ermöglicht für die Darstellung von live Einzelzellen in Echtzeit mit direkten Identifizierung von transcriptionally aktiven Zellen. Stimulation der infizierten Zellen mit TGF-β zeigt nur einen Teil der Zellen, die transcriptionally aktiv und spezifischen biologischen Funktionen beteiligt sind. Dieser Ansatz ermöglicht hohe Spezifität und Sensitivität auf eine einzelne Zellenebene das Verständnis biologischer Funktionen im Zusammenhang mit TGF-β Signalisierung in Vitrozu fördern. Smad3 transkriptionelle Aktivität auch kann berichtet in Vivo in Echtzeit durch die Anwendung eine Ad-CAGA12- Luc Reporter. Ad-CAGA12- Luc in der gleichen Weise wie herkömmliche stabil transfizierten Luciferase-Zell-Linien gemessen werden. Smad3 transkriptionelle Aktivität der implantierten Zellen in Vivo werden durch konventionelle IVIS Bildgebung analysiert und live während der Tumorprogression, einzigartige Einblicke in die Dynamik der TGF-β-Signalweg überwacht. Unser Protokoll beschreibt eine vorteilhafte Reporter-Delivery-System ermöglicht schnelle Hochdurchsatz-Bildgebung live Zelle Signalwege in Vitro und in Vivo. Diese Methode kann zu einer Reihe von bildbasierte Assays und Geschenke als sensibel und reproduzierbare Ansatz für grundlegende Biologie und therapeutische Entwicklung erweitert werden.

Einzelne Zelle in Vitro imaging zu leben
Um die Aktivierung von TGF-β/Smad-Signalisierung in Einzelzellen mit Adenoviren basierte Reagenzien genau zu beurteilen, ist es wichtig, zunächst die optimale Multiplizität der Infektion (MOI) für jede Zelllinie zu bestimmen. Die optimale MOI wird bestimmt, wenn 100 % der Zellen für adenovirale Infektion ohne vorliegende zytopathischen oder zytotoxische Effekte positiv sind. Um dies festzustellen, verwendeten wir einen konstitutiv aktiven Ad-CMV-Td-Tom -Reporter, die als Marker für positive Infektion gehandelt. Der Anteil der Adenovirus infiziert Zellen wurde gewissermaßen MOI abhängig von 0 bis 5.000 MOI erhöht. Bei 2.500 MOI beobachteten wir 100 % Td-Tom Ausdruck im MDA-MB-231 Zellen (Abb. 1A, 1 b). Pixel Intensität/Zelle erhöht auch mit MOI, bietet verbesserte Empfindlichkeit und Erkennung von transkriptionelle Ausgabe (Abbildung 1). Daher wurde eine funktionierende MOI von 2.500 verwendet, um eine dual-Infektion führen, wo Zellen mit Ad-CMV-GLP (diente als Positivkontrolle für Zelle Infektion) und Ad-CAGA12-Td-Tom gleichzeitig infiziert waren. Einzelne Zellen präsentiert unterschiedlicher Td-Tom Ausdruck heterogenen Aktivierung der TGF-β/Smad3 Transkription zellenübergreifend in Live- und festen Zellen anzeigt. (Abb. 2A, 2 b). 100 % der MDA-MB-231 Zellen präsentiert mit GFP Expression, während nur etwa 26 % der Zellen nachweisbar TGF-β/Smad3 transkriptionelle Aktivität 24 h nach der TGF-β-Stimulation, im Vergleich zu 0 % Positivität ohne TGF-β-Behandlung (Abbildung 2) angezeigt. Das Adenovirus basierte Reagenz verwenden, um die TGF-β/Smad3 transkriptionelle Aktivität während der biologischen Prozesse zu untersuchen, wurden MDA-MB-231 Zellen mit Ad-CAGA12-Td-Tom bei 2500 MOI infiziert und eine Wundheilung Assay. Infizierte Zellen von MDA-MB-231 ausgestellt normal Migrationsverhalten und Zellen mit 5 ng/mL TGF-β zeigte verbesserte Wundverschluss im Vergleich zu nicht-TGF-β behandelten Zellen (Abbildung 3A) behandelt. Bemerkenswert ist, präsentiert etwa 62 % Zellen in das wundgebiet positive TGF-β/Smad3 transkriptionelle Aktivität, die deutlich höher ist als in wundgebiet (32 %) nach der TGF-β-Behandlung (Abb.3 b) beobachtet. Als solche validiert die Adenovirus-basierte Reagenzien ihre Anwendung für die Bildgebung der TGF-β-Signalweg in live Einzelzelle in Vitro.
TGF-β signalisieren Bildgebung in Vivo zu leben
Die Empfindlichkeit der Anzeige-CAGA12- Luc -Reporter war erste getestete in-vitro- als Reaktion auf die TGF-β-Stimulation und die Anwesenheit von TGF-β-Inhibitor. Wenn infizierte Zellen von MDA-MB-231 mit 1 ng/mL TGF-β stimuliert wurden, erhöhte Luciferase Reporter Aktivität 1,200-fold im Vergleich zu den basalen unbehandelten MDA-MB-231-Ebenen. Diese Antwort wurde bemerkenswert durch 12 µg/mL von TGF-β-Inhibitor (Abb. 4A) blockiert. Die Ad-CAGA12- Luc Reagenz wurde anschließend in einer Brust Tumor orthotopen Implantation Tiermodell getestet. Kontrolle und der TGF-β-Inhibitor behandelt Gruppen demonstrierte ähnliche Luciferase Reporter Tätigkeit vor der Behandlung. Jedoch für die Kontrollgruppe änderte das Luciferase-Signal nach der PBS Behandlung sich nicht in der Erwägung, dass Mäuse mit der TGF-β-Inhibitor zeigte rund 3-fold Signal-Reduktion (Abbildung 4 b, 4 C) behandelt. Diese Ergebnisse zeigen gemeinsam das Potenzial für live und in Echtzeit Überwachung der TGF-β Signalisierung Aktivität in Vivo ohne Tieropfer.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57926/57926fig1v2.jpg"> Abbildung 1: Bestimmung des Innenministeriums der Adenovirus-basierte Reagenz. MDA-MB-231-Zellen wurden mit Ad-CMV-Td-Tom bei verschiedenen MOI infiziert und in eine Platte 12 Brunnen ausgesät. 24 h nach der Infektion, Zellen wurden behoben und nukleare befleckt von Hoechst. (A) Bilder wurden Td-Tom positive Zellen (rot) und Kern (blau) zu visualisieren und durch ImageJ quantifiziert. (B) Prozentsatz der Td-Tom positive Zellen. (C) Td-Tom Pixel Intensität/Zelle normiert auf Hintergrund. Diese Zahlen sind repräsentativ für mindestens 3 unabhängige Experimente. Angezeigten Daten sind Mittel von Triplicates ± SD Scale bar = 50 µm (200 X). <a href="/files/ftp_upload/57926/57926fig1v2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57926/57926fig2.jpg"> Abbildung 2: Einzelne Zelle Imaging für dual Infektion. MDA-MB-231-Zellen wurden dual, infiziert mit Ad-CMV-GFP und Ad-CAGA12-Td-Tom am MOI (2.500) und in eine Platte 12 Brunnen ausgesät. 24 h nach der Infektion Zellen wurden behandelt, mit oder ohne 5 ng/mL TGF-β. (A) 24 Stunden nach der Behandlung, Zellen wurden live abgebildet um GFP positiv (grün) und Td-Tom positiven (roten) Zellen zu visualisieren. Zellen wurden dann fixiert und nukleare befleckt von Hoechst zur Quantifizierung. (B) Bilder wurden zur GFP-positiven (grün), Td-Tom positiv (rot) Zellen und Kern (blau) zu visualisieren. (C) die GFP oder Td-Tom positive Zellen wurden von ImageJ quantifiziert und der Anteil der positiven Zellen berechnet. Diese Zahlen sind repräsentativ für mindestens 3 unabhängige Experimente. Angezeigten Daten sind Mittel von Triplicates ± SD statistische Bedeutung, indem der Student t-Test ermittelt wurden (*** p ≤0.0001). Maßstabsleiste = 50 µm (200 X). <a href="/files/ftp_upload/57926/57926fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57926/57926fig3.jpg"> Abbildung 3. Live Cell TGF-β-Signalisierung fördert die Zellmigration. MDA-MB-231 Zellen waren infiziert mit Ad-CAGA12-Td-Tom am MOI (2.500) und auf einen Teller 6 Brunnen ausgesät. 24 h nach der Infektion, Zellen wurden mit einer PIPETTENSPITZE P200 erstelle ich eine Wunde gekratzt und Medien ersetzt, mit oder ohne 5 ng/mL TGF-β. Nach einer anderen 24 h Zellen wurden behoben und nukleare befleckt von Hoechst zur visuellen Darstellung. (A) Phase Kontrast der Wundverschluss, Skala bar = 100 µm (100 X). (B) Td-Tom positiven (roten) Zellen und Kern (blau). Maßstabsleiste = 50 µm (200 X) (C) Td-Tom positive Zellen wurden von ImageJ quantifiziert und der Anteil der positiven Zellen berechnet wurde. Diese Zahlen sind repräsentativ für mindestens 3 unabhängige Experimente. Angezeigten Daten sind Mittel von Triplicates ± SD statistische Bedeutung, indem der Student t-Test ermittelt wurden (*** p ≤0.0001). <a href="/files/ftp_upload/57926/57926fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57926/57926fig4.jpg"> Abbildung 4. In Vivo Leben Signalisierung Bildgebung TGF-β. (A) MDA-MB-231 Zellen infiziert waren, mit Ad-CAGA12- Luc und dann ausgesät in 96 Wells Platte für 24 h. Danach wurden Zellen mit oder ohne 1 ng/mL TGF-β in das Vorhandensein oder Fehlen von 12 µg/mL TGF-β-Hemmer über Nacht behandelt. Die Luciferase-Aktivität wurde auf die gesamte Zelle lysate gemessen. Als der Falte der Induktion auf keine Behandlungskontrolle normalisiert wurden Luciferase Aktivitäten vorgestellt. Angezeigten Daten sind Triplicates ± SD (B) MDA-MB-231 Zellen infiziert waren, mit Ad-CAGA12- Luc 24 h vor der Implantation. Zellen wurden in Mamma Fettpolster an beiden Seiten des SCID-Mäuse implantiert. 72 h später IVIS imaging wurde vor und nach 24 h Behandlung (PBS für Kontrollgruppe) und 50 µg/Tumor TGF-β-Inhibitor für Behandlungsgruppe durchgeführt. (C) Photon Flux wurde von Living Image Software quantifiziert. Angezeigten Daten sind jeder Behandlungsgruppe (n = 12) ± SD statistische Bedeutung wurden ermittelt, indem der Student t-Test (** p ≤0.01 *** p ≤0.0001). p/s bezieht sich auf Photonen/s. <a href="/files/ftp_upload/57926/57926fig4large.jpg" target="_blank">Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.</a>

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Live Cell Imaging of the TGF-	&beta;/Smad3 Signaling Pathway In Vitro and In Vivo Using an Adenovirus Reporter System

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll für das live Cell Imaging von TGF-β/Smad3 Signalisierung Aktivität mit einem Adenovirus-Reporter-System. Dieses System verfolgt transkriptionelle Aktivität in Echtzeit und kann angewendet werden, um sowohl einzelne Zellen in Vitro und in lebenden TierenModelle.

Live Cell Imaging der TGF-β/Smad3 Signalisierung Pathway In Vitro und In Vivo mit einem Adenovirus-Reporter-System

Transforming Growth Factor &#946; (TGF-&#946;) signaling regulates many important functions required for cellular homeostasis and is commonly found ...

live-cell-imaging-tgf-smad3-signaling-pathway-vitro-vivo-using-an

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Cancer Research

10.3K Aufrufe.  University of Melbourne. Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll für das live Cell Imaging von TGF-β/Smad3 Signalisierung Aktivität mit einem Adenovirus-Reporter-System. Dieses System verfolgt transkriptionelle Aktivität in Echtzeit und kann angewendet werden, um sowohl einzelne Zellen in Vitro und in lebenden TierenModelle.

Serie: Live Cell Imaging of the TGF-	β/Smad3 Signaling Pathway In Vitro and In Vivo Using an Adenovirus Reporter System

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

This protocol demonstrates the capability of low-field electron paramagnetic resonance (EPR)-based techniques in combination with functional paramagnetic probes to provide quantitative information on the chemical tumor microenvironment (TME), including pO2, pH, redox status, concentrations of interstitial inorganic phosphate (Pi), and intracellular glutathione (GSH). In particular, an application of a recently developed soluble multifunctional trityl probe provides unsurpassed opportunity for in vivo concurrent measurements of pH, pO2 and Pi in Extracellular space (HOPE probe). The measurements of three parameters using a single probe allow for their correlation analyses independent of probe distribution and time of the measurements.

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

Low-field (L-band, 1.2 GHz) electron paramagnetic resonance using soluble nitroxyl and trityl probes is demonstrated for assessment of physiologically important parameters in the tumor microenvironment in mouse models of breast cancer.

In Vivo EPR-Bewertung der pH, pO2, Redox-Status, und Konzentrationen von Phosphat und Glutathion in der Tumor-Mikroumgebung

This protocol demonstrates the capability of low-field electron paramagnetic resonance (EPR)-based techniques in combination with functional paramagnetic ...

Forschung

Krebsforschung

Radionuclide-fluorescence Reporter Gene Imaging to Track Tumor Progression in Rodent Tumor Models

Metastasis is responsible for most cancer deaths. Despite extensive research, the mechanistic understanding of the complex processes governing metastasis remains incomplete. In vivo models are paramount for metastasis research, but require refinement. Tracking spontaneous metastasis by non-invasive in vivo imaging is now possible, but remains challenging as it requires long-time observation and high sensitivity. We describe a longitudinal combined radionuclide and fluorescence whole-body in vivo imaging approach for tracking tumor progression and spontaneous metastasis. This reporter gene methodology employs the sodium iodide symporter (NIS) fused to a fluorescent protein (FP). Cancer cells are engineered to stably express NIS-FP followed by selection based on fluorescence-activated cell sorting. Corresponding tumor models are established in mice. NIS-FP expressing cancer cells are tracked non-invasively in vivo at the whole-body level by positron emission tomography (PET) using the NIS radiotracer [18F]BF4-. PET is currently the most sensitive in vivo imaging technology available at this scale and enables reliable and absolute quantification. Current methods either rely on large cohorts of animals that are euthanized for metastasis assessment at varying time points, or rely on barely quantifiable 2D imaging. The advantages of the described method are: (i) highly sensitive non-invasive in vivo 3D PET imaging and quantification, (ii) automated PET tracer production, (iii) a significant reduction in required animal numbers due to repeat imaging options, (iv) the acquisition of paired data from subsequent imaging sessions providing better statistical data, and (v) the intrinsic option for ex vivo confirmation of cancer cells in tissues by fluorescence microscopy or cytometry. In this protocol, we describe all steps required for routine NIS-FP-afforded non-invasive in vivo cancer cell tracking using PET/CT and ex vivo confirmation of in vivo results. This protocol has applications beyond cancer research whenever in vivo localization, expansion and long-time monitoring of a cell population is of interest.

We describe a protocol for preclinical in vivo tracking of cancer metastasis. It is based on a radionuclide-fluorescence reporter combining the sodium iodide symporter, detected by non-invasive [18F]tetrafluoroborate-PET, and a fluorescent protein for streamlined ex vivo confirmation. The method is applicable for preclinical in vivo cell tracking beyond tumor biology.

Radionuklid-Fluoreszenz-Reporter-Gen Imaging zu Tumorprogression in Nagetier Tumormodellen verfolgen

Metastasis is responsible for most cancer deaths. Despite extensive research, the mechanistic understanding of the complex processes governing metastasis ...

Long-term Live-cell Imaging to Assess Cell Fate in Response to Paclitaxel

Live-cell imaging is a powerful technique that can be used to directly visualize biological phenomena in single cells over extended periods of time. Over the past decade, new and innovative technologies have greatly enhanced the practicality of live-cell imaging. Cells can now be kept in focus and continuously imaged over several days while maintained under 37 &#176;C and 5% CO2 cell culture conditions. Moreover, multiple fields of view representing different experimental conditions can be acquired simultaneously, thus providing high-throughput experimental data. Live-cell imaging provides a significant advantage over fixed-cell imaging by allowing for the direct visualization and temporal quantitation of dynamic cellular events. Live-cell imaging can also identify variation in the behavior of single cells that would otherwise have been missed using population-based assays. Here, we describe live-cell imaging protocols to assess cell fate decisions following treatment with the anti-mitotic drug paclitaxel. We demonstrate methods to visualize whether mitotically arrested cells die directly from mitosis or slip back into interphase. We also describe how the fluorescent ubiquitination-based cell cycle indicator (FUCCI) system can be used to assess the fraction of interphase cells born from mitotic slippage that are capable of re-entering the cell cycle. Finally, we describe a live-cell imaging method to identify nuclear envelope rupture events.

Live-cell imaging provides a wealth of information on single cells or whole populations that is unattainable by fixed cell imaging alone. Here, live-cell imaging protocols to assess cell fate decisions following treatment with the anti-mitotic drug paclitaxel are described.

Langfristige Leben-Cell Imaging zu Zelle Schicksal als Reaktion auf Paclitaxel bewerten

Live-cell imaging is a powerful technique that can be used to directly visualize biological phenomena in single cells over extended periods of time. Over ...

Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion

Glioblastoma (GBM) is an aggressive brain tumor that is poorly controlled with the currently available treatment options. Key features of GBMs include rapid proliferation and pervasive invasion into the normal brain. Recurrence is thought to result from the presence of radio- and chemo-resistant brain tumor stem cells (BTSCs) that invade away from the initial cancerous mass and, thus, evade surgical resection. Hence, therapies that target BTSCs and their invasive abilities may improve the otherwise poor prognosis of this disease. Our group and others have successfully established and characterized BTSC cultures from GBM patient samples. These BTSC cultures demonstrate fundamental cancer stem cell properties such as clonogenic self-renewal, multi-lineage differentiation, and tumor initiation in immune-deficient mice. In order to improve on the current therapeutic approaches for GBM, a better understanding of the mechanisms of BTSC migration and invasion is necessary. In GBM, the study of migration and invasion is restricted, in part, due to the limitations of existing techniques which do not fully account for the in vitro growth characteristics of BTSCs grown as neurospheres. Here, we describe rapid and quantitative live-cell imaging assays to study both the migration and invasion properties of BTSCs. The first method described is the BTSC migration assay which measures the migration toward a chemoattractant gradient. The second method described is the BTSC invasion assay which images and quantifies a cellular invasion from neurospheres into a matrix. The assays described here are used for the quantification of BTSC migration and invasion over time and under different treatment conditions.

Here, we describe live-cell imaging techniques to quantitatively measure the migration and invasion of glioblastoma brain tumor stem cells over time and under multiple treatment conditions.

Live Cell Imaging-Assays Studie Glioblastom Gehirn Tumor Stammzellen Migration und Invasion

Glioblastoma (GBM) is an aggressive brain tumor that is poorly controlled with the currently available treatment options. Key features of GBMs include ...

Monitoring Hippo Signaling Pathway Activity Using a Luciferase-based Large Tumor Suppressor (LATS) Biosensor

The Hippo signaling pathway is a conserved regulator of organ size and has important roles in the development and cancer biology. Due to technical challenges, it remains difficult to assess the activity of this signaling pathway and interpret it within a biological context. The existing literature on large tumor suppressor (LATS) relies on methods that are qualitative and cannot easily be scaled-up for screening. Recently, we have developed a bioluminescence-based biosensor to monitor the kinase activity of LATS-a core component of the Hippo kinase cascade. Here, we describe procedures for how this LATS biosensor (LATS-BS) can be used to characterize Hippo pathway regulators. First, we provide a detailed protocol for investigating the effect of an overexpressed protein candidate (e.g., VEGFR2) on LATS activity using the LATS-BS. Then, we show how the LATS-BS can be used for a small-scale kinase inhibitor screen. This protocol can feasibly be scaled-up to perform larger screens, which undoubtedly will identify novel regulators of the Hippo pathway.

Monitoring Hippo Signaling Pathway Activity Using a Luciferase-based Large Tumor Suppressor LATS Biosensor

Here we present a luciferase-based biosensor to quantify the kinase activity of large tumor suppressor (LATS)-a central kinase in the Hippo signaling pathway. This biosensor has diverse applications in basic and translational research aimed at investigating Hippo pathway regulators in vitro and in vivo.

Überwachung von Hippo Signalisierung Pathway-Aktivität unter Verwendung eines Biosensors Luciferase-basierte großen Tumorsuppressor (LATS)

The Hippo signaling pathway is a conserved regulator of organ size and has important roles in the development and cancer biology. Due to technical ...

A Simple Migration/Invasion Workflow Using an Automated Live-cell Imager

Cancer cell mobility is crucial for the initiation of metastasis. Therefore, investigation of the cell movement and invasive capacity is of great significance. Migration assays provide basic insight of cell movement at a 2D level, whereas invasion assays are more physiologically relevant, mimicking in vivo cancer cell dislodgment from the original site and invading through the extracellular matrix. The current protocol provides a single workflow for migration and invasion assays. Together with the integrated automated microscopic camera for real-time HD images and built-in analysis module, it gives researchers a time-efficient, simple and reproducible experimental option. This protocol also includes substitutions for the consumables and alternative analysis methods for users to choose from.

The current protocol describes an integrated method investigating cancer cell migration and invasion on a single platform in real-time, providing an easily reproducible and time-efficient option to study cell mobility and morphology.

Eine einfache Migration/Invasion Workflow mit einer automatisierten Leben-Zelle-Imager

Cancer cell mobility is crucial for the initiation of metastasis. Therefore, investigation of the cell movement and invasive capacity is of great ...

Characterize Disease-related Mutants of RAF Family Kinases by Using a Set of Practical and Feasible Methods

The rapidly accelerated fibrosarcoma (RAF) family kinases play a central role in cell biology and their dysfunction leads to cancers and developmental disorders. A characterization of disease-related RAF mutants will help us select appropriate therapeutic strategies for treating these diseases. Recent studies have shown that RAF family kinases have both catalytic and allosteric activities, which are tightly regulated by dimerization. Here, we constructed a set of practical and feasible methods to determine the catalytic and allosteric activities and the relative dimer affinity/stability of RAF family kinases and their mutants. Firstly, we amended the classical in vitro kinase assay by reducing the detergent concentration in buffers, utilizing a gentle quick wash procedure, and employing a glutathione S-transferase (GST) fusion to prevent RAF dimers from dissociating during purification. This enables us to measure the catalytic activity of constitutively active RAF mutants appropriately. Secondly, we developed a novel RAF co-activation assay to evaluate the allosteric activity of kinase-dead RAF mutants by using N-terminal truncated RAF proteins, eliminating the requirement of active Ras in current protocols and thereby achieving a higher sensitivity. Lastly, we generated a unique complementary split luciferase assay to quantitatively measure the relative dimer affinity/stability of various RAF mutants, which is more reliable and sensitive compared to the traditional co-immunoprecipitation assay. In summary, these methods have the following advantages: (1) user-friendly; (2) able to carry out effectively without advanced equipment; (3) cost-effective; (4) highly sensitive and reproducible.

In this article, we presented a set of practical and feasible methods for characterizing disease-related mutants of RAF family kinases, which include in vitro kinase assay, RAF co-activation assay, and complementary split luciferase assay.

Charakterisieren Sie krankheitsbedingte Mutanten der Kinases der RAF-Familie durch die Verwendung einer Reihe praktischer und machbarer Methoden

The rapidly accelerated fibrosarcoma (RAF) family kinases play a central role in cell biology and their dysfunction leads to cancers and developmental ...

In Vitro Assay to Study Tumor-macrophage Interaction

Tumor associated macrophages (TAMs) account for a large percentage of cells in the tumor mass for different types of cancers. Glioblastoma (GBM), a malignant brain tumor with no cure, has up to a half the tumor mass TAMs. TAMs can be pro-tumoral or anti-tumoral, depending on the activation of specific genes in the cells. Genetic mutations in the tumors, through regulating cytokine expression, can affect recruitment of TAMs to the tumor microenvironment. Here, we describe a quantitative cell-based assay to assess macrophage recruitment by the conditioned medium from the tumor cells. This assay uses the human macrophage cell line MV-4-11 to study macrophage attraction by the conditioned medium from glioblastoma, allowing for high reproducibility and low variability. Data generated with this assay can contribute to a better understanding of the interaction between the tumor and the tumor microenvironment. Similar assay can be used to assess interaction between the tumor cells and other immune cells, including T cells and natural killer (NK) cells.

This article represents a useful in vitro assay to evaluate the capability of conditioned medium from tumor cells to attract macrophages.

In Vitro-Assay zur Untersuchung der Tumor-Makrophage-Interaktion

Tumor associated macrophages (TAMs) account for a large percentage of cells in the tumor mass for different types of cancers. Glioblastoma (GBM), a ...

In Vitro Establishment of a Genetically Engineered Murine Head and Neck Cancer Cell Line using an Adeno-Associated Virus-Cas9 System

The use of primary normal epithelial cells makes it possible to reproducibly induce genomic alterations required for cellular transformation by introducing specific mutations in oncogenes and tumor suppressor genes, using clustered regulatory interspaced short palindromic repeat (CRISPR)-based genome editing technology in mice. This technology allows us to accurately mimic the genetic changes that occur in human cancers using mice. By genetically transforming murine primary cells, we can better study cancer development, progression, treatment, and diagnosis. In this study, we used Cre-inducible Cas9 mouse tongue epithelial cells to enable genome editing using adeno-associated virus (AAV) in vitro. Specifically, by altering KRAS, p53, and APC in normal tongue epithelial cells, we generated a murine head and neck cancer (HNC) cell line in vitro,which is tumorigenic in syngeneic mice. The method presented here describes in detail how to generate HNC cell lines with specific genomic alterations and explains their suitability for predicting tumor progression in syngeneic mice. We envision that this promising method will be informative and useful to study tumor biology and therapy of HNC.

Development of murine models with specific genes mutated in head and neck cancer patients is required for understanding of neoplasia. Here, we present a protocol for in vitro transformation of primary murine tongue cells using an adeno-associated virus-Cas9 system to generate murine HNC cell lines with specific genomic alterations.

In Vitro Einrichtung einer gentechnisch veränderten Murine Kopf- und Halskrebszelllinie mit einem Adeno-assoziierten Virus-Cas9-System

The use of primary normal epithelial cells makes it possible to reproducibly induce genomic alterations required for cellular transformation by ...

In Vitro Evaluation of Oncogenic Transformation in Human Mammary Epithelial Cells

Tumorigenesis is a multi-step process in which cells acquire capabilities&#160;that allow their growth, survival, and dissemination under hostile conditions. Different tests seek to identify and quantify these hallmarks of cancerous cells; however, they often focus on a single aspect of cellular transformation and, in fact, multiple tests are required for their proper characterization. The purpose of this work is to provide researchers with a set of tools to assess cellular transformation in vitro from a broad perspective, thereby making it possible to draw sound conclusions.
A sustained proliferative signaling activation is the major feature of tumoral tissues and can be easily monitored under in vitro conditions by calculating the number of population doublings achieved over time. Besides, the growth of cells in 3D cultures allows their interaction with surrounding cells, resembling what occurs in vivo. This enables the evaluation of cellular aggregation and, together with immunofluorescent labeling of distinctive cellular markers, to obtain information on another relevant feature of tumoral transformation: the loss of proper organization. Another remarkable characteristic of transformed cells is their capacity to grow without attachment to other cells and to the extracellular matrix, which can be evaluated with the anchorage assay.
Detailed experimental procedures to evaluate cell growth rate, to perform immunofluorescent labeling of cell lineage markers in 3D cultures, and to test anchorage-independent cell growth in soft agar are provided. These methodologies are optimized for Breast Primary Epithelial Cells (BPEC) due to its relevance in breast cancer; however, procedures can be applied to other cell types after some adjustments.

This protocol provides experimental in vitro tools to evaluate the transformation of human mammary cells. Detailed steps to follow-up cell proliferation rate, anchorage-independent growth capacity, and distribution of cell lineages in 3D cultures with basement membrane matrix are described.