Die Autoren möchten den Mitarbeitern der experimentellen Chirurgie und Tier Labor am College of Medicine, König-Saud-Universität, für ihre Zusammenarbeit und Unterstützung vor allem Hussain Almukhayzim und Hisham Aloudah danken. Die Autoren möchte auch das Medienteam König Saud bin Abdul-Aziz University anerkennen, für die Vorbereitung des visuelles Materials vor allem Muath bin Ghannam und Abdulwahab Alsulami.

Das Protokoll folgt den Tierbetreuung Richtlinien des König-Saud-Universität Ethikkommission. Chirurgische Eingriffe, Anästhetika und andere Medikamente für Tiere verwendet werden von König-Saud-Universität Ethikkommission genehmigt. Alle experimentellen Arbeit erfolgt durch entsprechend geschultes Personal.
(1) Zelle Blatt Bau
<ol><li>Die Kultur-Gerichte (3,5 cm Temperatur reagierende Kultur Gerichte) mit unverdünntem fetalen bovine Serum (FBS) zu beschichten und stellen sicher, dass die Fläche der Schale. Hinweis: Dieser Schritt ist wichtig für die Ablösung des Blattes Zelle, da es das Wachstum der Zellen in einem monomolekularen Film unterstützt und Zelle Aggregation verhindert.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Gerichte für 24 h bei 37 ° C in eine feuchte Atmosphäre mit 5 % CO2 % bis 95 % Luft.</li>
	<li>Entfernen Sie die überschüssige FBS aus beschichteten Gerichte und lassen Sie die Gerichte bei Raumtemperatur (RT) für mindestens 1 h trocknen.</li>
	<li>Bereiten Sie die drei Zellsuspensionen: 1 x 106 HepG2-Zellen, 1 x 106 HepG2-Zellen mit BMMSCs und 1 x 106 HepG2-Zellen mit UCMSCs (im Verhältnis von 4:1 für BMMSCs und UCMSCs).</li>
	<li>Samen der entsprechenden Zellsuspension auf jede beschriftete Teller.</li>
	<li>Sperren Sie alle Zellen im Kulturmedium DMEM mit 10 % FBS und 1 % Penicillin/Streptomycin ergänzt.</li>
	<li>Inkubation der Zellen bei 37 ° C in eine feuchte Atmosphäre mit 5 % CO2 % bis 95 % Luft.</li>
</ol>(2) Zelle Blatt Ablösung
<ol><li>Nehmen Sie bei 100 % Zelle Zusammenströmen die Gerichte aus dem Inkubator 37 ° C.</li>
	<li>Inkubieren Sie die HepG2 Zelle Blatt Schale für 1 h bei RT, während der Inkubation HepG2/BMMSC und HepG2/UCMSC Zelle Blatt Gerichte für 30-40 min. bei 20 ° C in eine feuchte Atmosphäre mit 5 % CO2 % bis 95 % Luft. Hinweis: Die Zelle Blatt hergestellt aus nur HepG2 ist zerbrechlich; reduzieren die Temperatur auf 20 ° C verursacht Schäden an der Struktur des Blattes.</li>
</ol>3. Leistungen des chirurgischen Eingriffs
Hinweis: Während der Inkubationszeit für die Zelle Blatt Ablösung die tierische Prozedur starten.
<ol><li>
Anweisungen für die Vorbereitung der OP-Bereich
	<ol>
<li>Führen Sie alle chirurgischen Eingriffe in einem sterilen separaten Bereich innerhalb des Labors, wie eine Kapuze, Laminar-Flow Kabinett oder einer aseptischen Operationssaal. Sicherstellen Sie, dass alle Flächen von den OP-Bereich nicht-poröse, versiegelten, langlebig und desinfizierbare.</li>
		<li>Tragen Sie geeignete Schutzausrüstung, einschließlich Peelings, Handschuhe, Gesichtsmasken und Kopf und Schuh-covers.</li>
		<li>Verwendung chirurgische Werkzeuge, sind sauber und sterilisiert (durch Autoklavieren; gesättigten Stamm unter hohem Druck) zu Beginn der Operation.</li>
		<li>Ändern Sie Handschuhe zwischen Ratten.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Vorbereitung des Tieres für die Chirurgie
	<ol>
<li>Verwenden Sie 8 bis 12 Wochen alten nackte Ratten.</li>
		<li>Injizierbare Narkose für Ratten zu erstellen.<ol>
<li>Um die Anästhesie-Lösung vorzubereiten, Ketamin-Xylazin, mischen Sie 2 mL Ketamin, 1 mL Xylazin (in einer Konzentration von 20 mg/mL) und 1 mL sterile physiologische Kochsalzlösung (z.B. 0,9 % Natriumchlorid) in eine sterile 10-mL-Serum-Sammelbehälter und vor Gebrauch gut schütteln verwenden.</li>
			<li>Um Anästhesie anzuwenden, injizieren Sie 0,2 mL der Lösung Ketamin-Xylazin pro 100 g Körpergewicht der Ratte intraperitoneal. Hinweis: Die Gesamtdosis der Lösung ist 100 mg/kg Ketamin und 10 mg/kg Xylazin.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Der Operationsstelle entfernen Sie sichtbaren Schmutz/Schmutz.</li>
		<li>Prüfen Sie die Tiefe der Narkose durch Testen des Pedal Rückzug Reflexes (Foot Pad Prise auf beide Hinterpfoten). Hinweis: Wenn die Fuß-Pad-Prise eine Reaktion verursacht, wiederholen bei einer Dosis von 0,05 mL/100 g (ca. alle 30 min.), dann erneut die Narkose Tiefe.</li>
		<li>Desinfizieren Sie den OP-Bereich mit einem zwei-Phasen-Peeling von Povidon-Jod/Isopropanol.</li>
		<li>Decken Sie die Ratte mit einem sterilen Tuch zur Vermeidung von Kontaminationen des Schnittes.</li>
		<li>Die Ratten mit Buprenorphin (0,01 - 0,05 mg/kg) subkutan zu injizieren8 vor dem Einschnitt.</li>
		<li>Mit einem sterilen Skalpell, machen Sie eine 7 - bis 10 cm Schnitt zwischen Haut und darunter liegenden Muskeln, die Leber verfügbar zu machen.<ol>
<li>Trennen Sie die Bauchmuskulatur aus der Haut mit der flachen hinteren Kante des Skalpells.</li>
			<li>Sorgfältig zu erstechen die Linea Alba mit einem Skalpell und verlängern Sie den Schnitt mit einer scharfen Schere.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Blatt Zelltransplantation
Hinweis: Blatt Zelltransplantation erfolgt auf die Leber.
<ol><li>Sammeln Sie die Zelle Blatt aus der Kulturschale.<ol>
<li>Klopfen Sie leicht der Kulturschale über die Bank, das Blatt von der Oberfläche zu lösen.</li>
		<li>Das Gericht Oberfläche trennen Sie der Zelle Blatt durch abkratzen der Rand des Blattes in einem Halbkreis mit einer sterilen PIPETTENSPITZE.</li>
		<li>Entfernen Sie vorsichtig das gesamte Medium aus der Kulturschale.</li>
		<li>Sicherzustellen Sie, dass das Blatt ohne Beschädigung intakt ist; Ansonsten, es kann nicht sein (Abbildung 1) verwendet. Hinweis: Die resultierende Blätter können direkt mit dem Auge erkannt werden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereiten Sie eine sterile Membran (Filterpapier) der Zelle Blatt aus der Schale zu ernten.<ol>
<li>Zuerst, die Membran mit normalen Kochsalzlösung einweichen. Dann entfernen Sie die überschüssige Kochsalzlösung mit einem sterilen Wattepad.</li>
		<li>Legen Sie die nasse Membran über das Blatt Zelle unter Vermeidung von Falten und Luftblasen zwischen der Membran und die Zelle Blatt.</li>
		<li>Fügen Sie einige Tropfen des normalen Kochsalzlösung über die Membran und die Zelle Blatt, sie einfacher zu sammeln. Hinweis: Um zu vermeiden, brechen die Zelle Blatt, nicht kalten Kochsalzlösung verwenden und heben Sie die Membran und die Zelle-Blatt mit der Pinzette.</li>
		<li>Lassen Sie die Membran für ein paar Sekunden um sicherzustellen, dass die Zelle Blatt ordnungsgemäß mit der Membran verbunden ist, und dann sammeln.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereiten Sie die Leber für Blatt Zelltransplantation.<ol>
<li>Stellen Sie sicher, dass die Leber Oberfläche trocken ist, indem es vorsichtig mit einem sterilen Wattepad.</li>
		<li>Mit sterilen Pinzette, platzieren Sie die Membran der Zelle Blatt über eine einzelne Lappen der Leber der Ratte.</li>
		<li>Fügen Sie ein paar Tropfen sterilen Kochsalzlösung und üben Sie sanften Druck auf die Membrane der Zelle Blatt von ihm zu trennen.</li>
		<li>Warten Sie 5 min vor die Membran vorsichtig entfernen. Hinweis: Dies geschieht, um sicherzustellen, dass die Zelle Blatt ordnungsgemäß mit der Leber verbunden ist.</li>
		<li>Schließlich schließen Sie die darunter liegenden Muskeln und Haut Einschnitte mit 5: 0-Nylon-Fäden.</li>
		<li>Der OP-Bereich mit Povidon-Jod zu desinfizieren. Hinweis: Abbildung 2 zeigt ein Diagramm der Zelle Blatt Transplantationsverfahren auf die Leber eine nackte Ratte.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. postoperative Pflege
<ol><li>Unmittelbar nach der Operation, beherbergen die Ratte einzeln um Kannibalismus oder Erstickungsgefahr zu vermeiden, und überwachen sie regelmäßig (mindestens alle 15 min) bis es bewusst und vollständig ambulant.</li>
	<li>Dann bewerten Sie die Ratten täglich für 5-14 d, mindestens 5 d postoperativ, um sicherzustellen, dass es keine Komplikationen gibt. Während der täglichen Bewertung machen Sie Folgendes.<ol>
<li>Die Wunde geschlossen, und die Nähte sind intakt, ohne übermäßig fest.</li>
		<li>Es gibt keine Anzeichen einer Infektion in der Schnitt-Website, wie Hitze, übermäßige Schwellung oder eitrigen Ausfluss.</li>
		<li>Es gibt keine Anzeichen, die mit Schmerzen, wie verringerte Nahrung und Wasser-Verbrauch, Gewichtsverlust, Austrocknung, Haut zu Zelten oder schnelle und offene Mundatmung verbunden. Zu kontrollieren, die mäßige bis starke postoperative Schmerzen wenn überhaupt, injizieren Sie den Ratten subkutan mit Buprenorphin (0,01 - 0,05 mg/kg) alle 6-8 h9 für ein Minimum von 48-72 h postoperativ.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. Analyse der transplantierten Bereich
<ol><li>Einen Monat nach der Transplantation, Scarifice der Ratte und sammeln die transplantierten Bereich für histologische und immunhistochemische Analyse.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Marra, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+targets+and+oxidative+stress+biomarkers+in+hepatocellular+carcinoma:+an+overview.">Molecular targets and oxidative stress biomarkers in hepatocellular carcinoma: an overview.</a> Journal of Translational Medicine. 9, 171 (2011).</li><li>Yamada, K. M., Cukierman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+tissue+morphogenesis+and+cancer+in+3D.">Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D.</a> Cell. 130 (4), 601-610 (2007).</li><li>Kushida, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decrease+in+culture+temperature+releases+monolayer+endothelial+cell+sheets+together+with+deposited+fibronectin+matrix+from+temperature-responsive+culture+surfaces.">Decrease in culture temperature releases monolayer endothelial cell sheets together with deposited fibronectin matrix from temperature-responsive culture surfaces.</a> Journal of Biomedical Materials Research. 45 (4), 355-362 (1999).</li><li>Okano, T., Yamada, N., Sakai, H., Sakurai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+recovery+system+for+cultured+cells+using+plasma-treated+polystyrene+dishes+grafted+with+poly+(N-isopropylacrylamide).">A novel recovery system for cultured cells using plasma-treated polystyrene dishes grafted with poly (N-isopropylacrylamide).</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 27 (10), 1243-1251 (1993).</li><li>Chamberlain, G., Fox, J., Ashton, B., Middleton, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concise+review:+mesenchymal+stem+cells:+their+phenotype,+differentiation+capacity,+immunological+features,+and+potential+for+homing.">Concise review: mesenchymal stem cells: their phenotype, differentiation capacity, immunological features, and potential for homing.</a> Stem Cells. 25 (11), 2739-2749 (2007).</li><li>Waterman, R. 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K., Shimizu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+potential+of+cell+sheet+technique+on+the+development+of+hepatocellular+carcinoma+in+rat+models.">The potential of cell sheet technique on the development of hepatocellular carcinoma in rat models.</a> PLoS One. 12 (8), e0184004 (2017).</li><li>Russo, J., Russo, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atlas+and+histologic+classification+of+tumors+of+the+rat+mammary+gland.">Atlas and histologic classification of tumors of the rat mammary gland.</a> Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 5 (2), 187-200 (2000).</li><li>Lin, J. 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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Umfangreiche Forschung widmet sich der Entwicklung angemessene in-Vivo präklinischen Tiermodell, das menschliche Krebsarten ähnelt. Derzeit umfassen die wichtigsten Ansätze zur Erstellung von Krebs Tiermodellen Gentechnik und Cell Transplantation11. Gentechnisch veränderte Tiermodelle sind gute Tools zur Identifizierung und Validierung von Zielgenen, sowie das Verständnis der molekularen Mechanismen, die Medikamenten-induzierten Toxizität. Dieses Modell ist jedoch mit einigen Einschränkungen verbunden. zum Beispiel führt die Änderung eines bestimmten Gens nicht immer die erwarteten Phänotyp12. Der Cell Transplantation Ansatz wird häufiger verwendet, um Krebs bei Tieren auslösen, und es umfasst die Injektion von Krebs Zellsuspension. Jedoch hat dieser Ansatz einfach und bequem ihre eigenen Nachteile. Um eine Zellsuspension zu erzeugen, wird ein enzymatische Verdauung Schritt verwendet werden, um die Krebszellen zu ernten. Dies führt zum Verlust von einigen der Adhäsion Proteine, die Engraftment Effizienz der transplantierten Zellen verringert. Daher gibt es keine Garantie, dass die transplantierten Krebszellen Krebsgewebe, ganz zu schweigen von den Schwierigkeiten bei der Kontrolle der Größe des Tumors induzierte bilden werden. Darüber hinaus hat dieser Ansatz ein weiterer schwerwiegenden Nachteil, der den raschen Übergang von transplantierten Krebszellen in den Blutkreislauf oder Zelle Engraftment in ungezielte Organe13ist.
Die neue Zelle Blatt Technologie wurde entwickelt, um diese Nachteile zu überwinden. Suzuki Et al. 14 haben erfolgreich erstellt, Darm, Leber und Bauchspeicheldrüse Tumor-tragenden Tieren mit Krebs Zelle Blatt Transplantation Methode. Im Vergleich mit Tumoren erzeugt über den Krebs-Cell Transplantation-Methode wurden diese Tumoren größer und stabiler. Die Implantation von einem kleinen Tumor-Gewebe in ein Tier, einen Tumor induzieren ist stark abhängig von der Verwendung einer Transplantation-Methode, die keinen enzymatische Verdauung Schritt erfordert. Proteolytische Enzyme verursachen Schäden an extrazellulären Matrizen, die Zell-Zell-Interaktion betrifft. Blatt-Zelltechnologie überwindet diese Einschränkung bei der Verwendung einer invasiven Erntemethode, so dass die Sammlung eines intakten Monolage Zelle Blattes, zusammen mit seinen zugehörigen extrazellulären Matrix und Wachstumsfaktoren15. Blatt-Zelltechnologie ermöglicht auch langfristige Engraftment16,17. Dies ist von großem Wert in in-Vivo -Studien, wo Zellen in das Wirtsgewebe für den gesamten Zeitraum des Gewebes Leben17einheilungschancen muss. Darüber hinaus ermöglicht diese Technik die Entwicklung einer neuartigen Methode des Tissue Engineering, ohne den Einsatz von biologisch abbaubaren Gerüste3,15. Dieser Ansatz hat jedoch noch ein paar Einschränkungen. Wenn Sie die Zelle Blatt Technik verwenden, kann der Mittelteil des transplantierten Gewebes möglicherweise werden nekrotische wenn das Transplantat zu groß ist. Im Gegensatz dazu kann die Erfolgschance der Transplantation verringert werden, wenn das Transplantat zu klein ist. Darüber hinaus muß um das anschließende Wachstum des Tumors zu kontrollieren, die Größe des transplantierten Gewebes gleichmäßig über alle Experimente sein. Die Größe der transplantierbaren Gewebe beschränkt sich auf 2 mm3 durch die Induktion von Nekrose aufgrund schlechter Sauerstoff Umwelt18.
In dieser Studie wurde ein HCC-Tiermodell erfolgreich mit Gerüst-freie Transplantation der Zelle Blätter erstellt. Drei Arten von Zelle Platten wurden in Ratten Leber transplantiert: eine Zelle Blatt HCC Zell-Linie Zellen, eine Zelle Blatt HCC Linie Zellen und BMSCs Zellen und eine Zelle Blatt HCC Linie Zellen und UCMSCs Zellen. Die Transplantation von alle drei Zelle Blätter genügte, um Tumoren im Empfänger Ratten zu induzieren. Allerdings wurde festgestellt, dass das Blatt MSCs hinzufügen die gebildeten Tumoren verkleinert. Dies zeigt, dass die MSCs verwendet, vor allem UCMSCs, negative Auswirkungen auf die Entwicklung von Tumoren. Abschließend möchte ich sagen, bietet Krebs Zelltransplantation Blatt eine effiziente Methode zum Erstellen von einem Tiermodell mit soliden Tumoren. Solcher in-Vivo -Modelle könnten wichtige klinische Informationen mit erheblichen Anwendungen führen. Darüber hinaus, wie offensichtlich durch Reduktion der Tumor, begrenzen UCMSCs Tumorentstehung und Ausbreitung. Dies bedeutet, dass einige MSC-Subtypen in einem Zell-basierte Ansatz für die Behandlung von Krebs verwendet werden könnten.

HCC ist ein primärer Krebs der Leber, die signifikant mit einer schlechten Prognose assoziiert ist. Jährlich fast eine halbe Million neue Patienten mit HCC, was 85 % der Leberkrebs Patienten weltweit1diagnostiziert. Hepatocarcinogenesis ist keine einzelne Form Krankheit; Vielmehr ist es eine Sammlung von Krankheiten, die verschiedene histopathologische Merkmale und genetische und genomic Variabilität, zusätzlich zu haben prognostische Ergebnisse1vielfältig. Daher sind die größten Herausforderungen bei der Entwicklung einer effektiven therapeutischen Strategie für HCC die begrenzten Kenntnissen der HCC-Biologie und der Mangel an geeigneten experimentellen Tiermodell, die helfen können, diese komplexe Krankheit zu verstehen. In Vivo Tiermodell, das menschlichen Krebs nachahmt ist notwendig für die Auswahl von Kandidatengenen und Identifizierung prognostische/prädiktive Marker verwickelt in Krebs-Induktion, sowie für die Untersuchung von verschiedener Faktoren, die Krebs Antworten beeinflussen können zu Therapeutika.
In-vitro- Studien sind noch mit großen Einschränkungen verbunden. Dies ist aufgrund der Tatsache, dass Krebszellen viele ihre in Vivo -Funktionen verlieren wenn in Kultur gepflegt. Die Änderungen, die an Zellen in Vitro Ergebnis aus dem Fehlen der ganze Gewebe Physiologie in einer ex-Vivo -Umgebung auftreten. Krebs Zell-Zell-Interaktion (Stromazellen, immun-, Gefäßsystem, epithelialen, etc.) innerhalb der Tumor Mikroumgebung reflektiert stark Krebs Zelle Eigenschaften2. Der Tumor Mikroumgebung könnte Krebs Zelle gen/Protein-Expression und phänotypischen Eigenschaften, neben angiogenetischer und metastasiertem Potenziale verändern. Das zweidimensionale (2D) in-vitro- Kultur-System fehlt auch eine geeignete Gewebe-Matrix, die Tumorprogression regulieren muss. Daher sollten aufgrund dieser Einschränkungen in Vivo Modellen immer genutzt werden, um die vorläufigen Ergebnisse der in-vitro- Modelle unterstützen. In dieser Studie verwenden wir Blatt Zelltechnologie in Vivo Tiermodell zu entwickeln, die den gesamten biologischen Prozess zugrunde liegenden HCC erläutert.
Vor mehr als einem Jahrzehnt etablierte Okano Labor eine neuartige Methode des Tissue Engineering basierend auf Zelle Blatt Technologie3. Diese Technik nutzt einen Thermo-responsive Kultur Kunststoff um reversible Zelle Adhäsion/Ablösung zu ermöglichen, durch die Kontrolle der Oberfläche Hydrophobie. Diese Methode ermöglicht eine schonende Ernte von kultivierten Zellen in einem intakten dreidimensionale (3D) Format (i.e.,cell Blatt), mit einem gepflegten extrazelluläre Matrix (ECM) und Zell-Zell-Interaktionen. Die Zelle Blatt Technik erfordert vorbeschichten Kultur Gerichte mit einem Temperatur-responsive Polymer-poly(N-isopropylacrylamide) (PIPA bin), die kommerziell verfügbar und einsatzbereit. Bei einer Temperatur unter 20 ° C PIPA bin Polymere werden hydratisiert und lösen sich in wässrigen Lösungen, in der Erwägung, dass bei einer höheren Temperatur (37 ° C), Polymere dehydriert und verwandeln Sie in eine trübe Niederschlag. Das Polymer enthält hydrophilen Amid Ketten und hydrophoben Seitenketten (Isopropyl-Gruppen). Bei hohen Temperaturen wird die Brownsche Bewegung der Wassermoleküle in der Erwägung, dass bei einer niedrigen Temperatur der Wassermoleküle rund um die Isopropyl-Gruppen des Zusammenbruches hydratisiert Struktur und die Gruppen der hydrophoben Isopropyl aggregieren intensiviert, durch hydrophobe Wechselwirkungen. Daher ist die gesamte Kette des Polymers aggregiert und Ausscheidungen4.
In der vorgestellten Studie wird diese Technik eingesetzt, um ein HCC Tiermodell mit drei verschiedenen Zelle Blätter entwickeln. Das erste Blatt beschäftigt besteht aus HCC Zelle Zeile Zellen nur, während die anderen beiden Blätter aus einer Kombination von HCC Zelle Zeile Zellen und MSCs aus zwei verschiedenen Quellen besteht: Knochenmark MSCs (BMMSCs) und Nabelschnur MSCs (UCMSCs). MSCs sind nicht blutbildende Stromatumoren Zellen, die in der Lage sind Intocell Derivate der mesenchymalen-Linie, inklusive Adipozyten, Osteozyten, Chondrozyten, Myozyten5zu unterscheiden. Der Grund, warum wir diese Zellen beschäftigen, bei der Erstellung der Krebs Zelle Blatt ist die inkonsistente Berichterstattung über die Wirkung von MSCs auf Krebserkrankungen. Es wurde darauf hingewiesen, dass MSCs zwei verschiedene Phänotypen haben können: "MSC1", einem proinflammatorischen Phänotyp und "MSC2", eine immunsuppressive Phänotyp-6. MSCs express Toll-Like-Rezeptoren (TLR). TLR4 grundieren der MSCs erhöht ihre Absonderung von proinflammatorischen Faktoren, während TLR3 Grundierung ihrer Sekretion von immunsuppressiven Faktoren6erhöht. Eine in-vitro- Studie über diese zwei Phänotypen berichtet, dass ein Kokulturen MSC1 mit Krebszelllinien Wachstum von Krebszellen, gedämpft, während MSC2 kokultur die entgegengesetzte Wirkung7hatte. Das bedeutet, dass MSCs pro-Krebs oder Krebs, je nach deren Phänotyp sein können. So wollen wir neben der Entwicklung der HCC-Tiermodell mit Blatt-Zelltechnologie, die Wirkung des MSC Transplantationen auf Tumorentwicklung, erkunden und ob diese Zellen erhöhen oder verringern die Entwicklung dieses Modells.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:787px;" width="787">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:501px;">Reagents&#160;</td>
			<td></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:309px;">FBS&#160;</td>
			<td style="width:192px;">Gibco/Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">10270106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:309px;">DMEM high glucose&#160;</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D5671-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="31">
			<td height="31" style="height:31px;width:309px;">Penicillin/streptomycin&#160;</td>
			<td style="width:192px;">Life Technology</td>
			<td style="width:119px;">15070063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:309px;">Sterile physiologic saline</td>
			<td style="width:192px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">S0817-1GA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:309px;">Human HepG2 cell line</td>
			<td style="width:192px;">ATCC, USA</td>
			<td style="width:119px;">HB-8065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">Human bone marrow MSCs cell line</td>
			<td style="width:192px;">PromoCell, USA</td>
			<td>C-12974</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:309px;">human umbilical cord tissue MSCs</td>
			<td style="width:192px;">PromoCell, USA&#160;</td>
			<td style="width:119px;">C-12971</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:309px;">Ketamine 50%</td>
			<td style="width:192px;">Rompun, Bayer</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:309px;">Xylazine 2%</td>
			<td style="width:192px;">Rompun</td>
			<td style="width:119px;">23076-35-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Alphadine&#174;&#160;solution.</td>
			<td style="width:192px;">Riyadh Pharma</td>
			<td style="width:119px;">LBL0816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:501px;">Disposables:&#160;</td>
			<td></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:309px;">15mL Polypropylene High Clarity PP Centrifuge Tube</td>
			<td style="width:192px;">Falcon&#160;</td>
			<td style="width:119px;">352097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:309px;">3.5 cm sterile UpCell culture dishes with the filter paper (membrane)</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">174904-1CS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:309px;">100-1000 &#181;l &#160;Pipette Tips&#160;</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">CLS4868-1000EA&#160;&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Basic Procedure Drape</td>
			<td style="width:192px;">Thermofisher</td>
			<td style="width:119px;">PMD5293.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:501px;">Equipment&#160;</td>
			<td></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:309px;">Plus pipette, variable volume</td>
			<td style="width:192px;">Eppendorf&#174;&#160;Research&#174;</td>
			<td style="width:119px;">Z683779-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">Tissue culture incubator 37 &#176;C, 5% CO2</td>
			<td style="width:192px;">Any brand</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">Biological safety cabinet</td>
			<td style="width:192px;">Any brand</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:309px;">Tissue culture incubator 20 &#176;C, 5% CO2</td>
			<td style="width:192px;">Any brand</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td colspan="2" height="22" style="height:22px;width:501px;">Sterile surgical tools and nude rats:&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td colspan="2" height="22" style="height:22px;width:501px;">Forceps</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td colspan="2" height="22" style="height:22px;width:501px;">Scissors</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td colspan="2" height="22" style="height:22px;width:501px;">scalpel&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:309px;">&#160;Nylon Suture&#160; 5-0</td>
			<td style="width:192px;">Accutome</td>
			<td style="width:119px;">AB-3854S</td>
			<td>Monofilament, Lancet</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:309px;">1 ml Tuberculin Syringes</td>
			<td style="width:192px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">14-826-88</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:309px;">Nude rats&#160;</td>
			<td style="width:192px;">Charles river</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

exploring the potential of mesenchymal stem cell sheet on the development of hepatocellular carcinoma in vivo

In Vivo Tiermodell, das menschlichen Krebs nachahmt hätten verschiedene Anwendungen, die signifikante klinische Informationen liefern. Die derzeit verwendeten Techniken für die Entwicklung von in Vivo Krebs-Modelle haben erhebliche Einschränkungen. Daher wollen wir in dieser Studie Zelle Blatt Technologie um eine in-Vivo -Krebs-Modell zu entwickeln, zu implementieren. Das Leberzellkarzinom (HCC) ist erfolgreich in nackten Ratten mit Zelle Sheets erstellt von HCC Zelle Zeile Zellen entwickelt. Die Krebs Zelle Blätter entstehen durch intrazelluläre Adhäsion und die Bildung von eine geschichtete Struktur, durch die extrazelluläre Matrix gesteuert. Dies ermöglicht die HCC-Blatt-Transplantation in die Leber und die Schaffung einer Tumor-tragenden Tiermodell innerhalb eines Monats. Darüber hinaus ist die Rolle von mesenchymalen Stammzellen (MSC) an der Entwicklung dieses Modells Krebs untersucht. Neben dem HCC Zelle Zeile Blatt, eine andere Zelle zwei Blätter entstehen: ein Blatt HCC Zellen und Knochenmark MSCs (BMMSCs) und ein Blatt von HCC Zellen und Nabelschnur MSCs (UCMSCs). Blätter, die eine von HCC Zellen und MSCs Kombination sind auch in der Lage, eine Tumor-tragenden Tier. Aber die Zugabe von MSCs reduziert die Größe der der gebildete Tumor, und dieses negative Auswirkungen auf die Entwicklung von Tumoren variiert abhängig von der verwendeten MSCs-Quelle. Dies bedeutet, dass eine Zelle Blatt gemacht von bestimmten MSC-Subtypen bei Tumor-Verwaltung und Kontrolle genutzt werden könnte.

Tumorigenität der transplantierten Zellen Blätter bei Ratten:
Einen Monat nach der Transplantation haben alle transplantierten Zellen Blätter in Ratten Leber Tumoren (Abbildung 3) entwickelt. Die durchschnittliche Größe der entwickelten Tumoren von HepG2 HepG2/BMMSC und HepG2/UCMSC Zelle Blätter wurden 4,5 cm, 4 cm und 2,5 cm, bzw.10.
Histologischen Untersuchung der Leber Gewebe:
Hämatoxylin und Eosin (H & E) Färbung nicht transplantiert Ratten zeigten Leber mit Hepatozyten in Platten, die anastomosieren mit einander angeordnet, und die Kerne waren rund, mit ein oder zwei prominente nukleolen. Im Gegensatz dazu die Tumor-Abschnitte gesammelt zeigten Ränder der lebensfähigen entzündet und nekrotischen subkutane Hepatozyten mit unregelmäßigen Konturen der nuklearen und klare Degeneration (Abbildung 4).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57805/57805fig1.jpg"> Abbildung 1: Herstellung von einer Zelle Blatt mit einer 3,5 cm Temperatur reagierende Kulturschale. (A) dieses Panel zeigt eine Geschädigte Zelle Blatt nicht geeignet für Transplantation. (B) dieses Panel zeigt einen intakten Zelle Blatt, bereit für die Transplantation. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57805/57805fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57805/57805fig2.jpg"> Abbildung 2 : Handy-Blatt Transplantationsverfahren bei nackten Ratten. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57805/57805fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57805/57805fig3.jpg"> Abbildung 3 : Tumor auf eine Ratte-Leber nach einem Monat der Zelltransplantation Blatt entwickelt. Der Tumor wurde generiert aus (A) eine HepG2 Zelle Blatt (Größe: 4,5 cm), (B) eine HepG2 und BMMSC Zelle Blatt (Größe: 4 cm), und (C) eine HepG2 und UCMSC Zelle Blatt (Größe: 2,5 cm). Die blauen Kreise zeigen die Tumor-Bereich. Diese Zahl wurde von zuvor veröffentlichte Arbeit10geändert. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57805/57805fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57805/57805fig4.jpg"> Abbildung 4 : Histologische Analyse eine Ratte-Leber. H & E Färbung eine Ratte-Leber, vier Wochen nach Stammzelltransplantation Blatt. (A) das Panel zeigt Normal Ratte Leber Zellen. (B) dieses Panel zeigt die Leber Morphologie nach der Krebs-Zellen-Transplantation. Der schwarze Pfeil kennzeichnet Leberkrebs, die grünen Pfeile zeigen normale Hepatozyten, der blaue Pfeil zeigt die entzündete Zellen und die orangefarbene Pfeil nekrotische HCC-Zellen. Die Skala Balken zeigen 20 X Vergrößerung. Diese Zahl wurde von zuvor veröffentlichte Arbeit10geändert. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57805/57805fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

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Exploring the Potential of Mesenchymal Stem Cell Sheet on The Development of Hepatocellular Carcinoma In Vivo

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur Entwicklung eines in-Vivo Krebs-Modells mit Blatt-Zelltechnologie. Ein solches Modell könnte sehr nützlich für die Bewertung der Anti-Krebs-Therapie.

Ermittlung des Potenzials von mesenchymalen Stammzellen Blatt auf die Entwicklung des hepatozellulären Karzinoms In Vivo

An in vivo animal model that mimics human cancer could have various applications that deliver significant clinical information. The currently used ...

exploring-potential-mesenchymal-stem-cell-sheet-on-development

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Exploring the Potential of Mesenchymal Stem Cell Sheet on The Development of Hepatocellular Carcinoma In Vivo

5.8K Aufrufe.  Ministry of National Guard Health Affairs. Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur Entwicklung eines in-Vivo Krebs-Modells mit Blatt-Zelltechnologie. Ein solches Modell könnte sehr nützlich für die Bewertung der Anti-Krebs-Therapie.

Serie: Exploring the Potential of Mesenchymal Stem Cell Sheet on The Development of Hepatocellular Carcinoma In Vivo

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells (hESC) to Different Lineages

Human embryonic stem cells (hESC) are emerging as an attractive alternative source for cell replacement therapy since they can be expanded in culture indefinitely and differentiated to any cell types in the body. Various types of biomaterials have also been used in stem cell cultures to provide a microenvironment mimicking the stem cell niche1-3. The latter is important for promoting cell-to-cell interaction, cell proliferation, and differentiation into specific lineages as well as tissue organization by providing a three-dimensional (3D) environment4 such as encapsulation. The principle of cell encapsulation involves entrapment of living cells within the confines of semi-permeable membranes in 3D cultures2. These membranes allow for the exchange of nutrients, oxygen and stimuli across the membranes, whereas antibodies and immune cells from the host that are larger than the capsule pore size are excluded5. Here, we present an approach to culture and differentiate hESC DA neurons in a 3D microenvironment using alginate microcapsules. We have modified the culture conditions2 to enhance the viability of encapsulated hESC. We have previously shown that the addition of p160-Rho-associated coiled-coil kinase (ROCK) inhibitor, Y-27632 and human fetal fibroblast-conditioned serum replacement medium (hFF-CM) to the 3D platform significantly enhanced the viability of encapsulated hESC in which the cells expressed definitive endoderm marker genes1. We have now used this 3D platform for the propagation of hESC and efficient differentiation to DA neurons. Protein and gene expression analyses after the final stage of DA neuronal differentiation showed an increased expression of tyrosine hydroxylase (TH), a marker for DA neurons, &gt;100 folds after 2 weeks. We hypothesized that our 3D platform using alginate microcapsules may be useful to study the proliferation and directed differentiation of hESC to various lineages. This 3D system also allows the separation of feeder cells from hESC during the process of differentiation and also has potential for immune-isolation during transplantation in the future.

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells hESC to Different Lineages

We have optimized a microencapsulation technique as an effective 3D platform for propagation and differentiation of embryonic stem cells to endoderm and dopaminergic (DA) neurons. It also provides an opportunity for immune-isolation of cells from the host during transplantation. This platform can be adapted for other cell types.

Alginat-Mikrokapseln als 3D-Plattform für die Vermehrung und Differenzierung von humanen embryonalen Stammzellen (hES) auf verschiedenen Linien

Human embryonic stem cells (hESC) are emerging as an attractive alternative source for cell replacement therapy since they can be expanded in culture ...

Forschung

Biotechnik

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells (hESCs) and Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs)

We present a method for deriving natural killer (NK) cells from undifferentiated hESCs and iPSCs using a feeder-free approach. This method gives rise to high levels of NK cells after 4 weeks culture and can undergo further 2-log expansion with artificial antigen presenting cells. hESC- and iPSC-derived NK cells developed in this system have a mature phenotype and function. The production of large numbers of genetically modifiable NK cells is applicable for both basic mechanistic as well as anti-tumor studies. Expression of firefly luciferase in hESC-derived NK cells allows a non-invasive approach to follow NK cell engraftment, distribution, and function. We also describe a dual-imaging scheme that allows separate monitoring of two different cell populations to more distinctly characterize their interactions in vivo. This method of derivation, expansion, and dual in vivo imaging provides a reliable approach for producing NK cells and their evaluation which is necessary to improve current NK cell adoptive therapies.

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells hESCs and Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs

This protocol describes the development, expansion, and in vivo imaging of NK cells derived from hESCs and iPSCs.

Entwicklung, Erweiterung und<em&gt; In vivo</em&gt; Monitoring von humanen NK Zellen aus humanen embryonalen Stammzellen (hES-Zellen) und und induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen)

We present a method for deriving natural killer (NK) cells from undifferentiated hESCs and iPSCs using a feeder-free approach. This method gives rise to ...

Microinjection Wound Assay and In vivo Localization of Epidermal Wound Response Reporters in Drosophila Embryos.

The Drosophila embryo develops a robust epidermal layer that serves both to protect the internal cells from a harsh external environment as well as to maintain cellular homeostasis. Puncture injury with glass needles provides a direct method to trigger a rapid epidermal wound response that activates wound transcriptional reporters, which can be visualized by a localized reporter signal in living embryos or larvae. Puncture or laser injury also provides signals that promote the recruitment of hemocytes to the wound site. Surprisingly, severe (through and through) puncture injury in late stage embryos only rarely disrupts normal embryonic development, as greater than 90% of such wounded embryos survive to adulthood when embryos are injected in an oil medium that minimizes immediate leakage of hemolymph from puncture sites. The wound procedure does require micromanipulation of the Drosophila embryos, including manual alignment of the embryos on agar plates and transfer of the aligned embryos to microscope slides. The Drosophila epidermal wound response assay provides a quick system to test the genetic requirements of a variety of biological functions that promote wound healing, as well as a way to screen for potential chemical compounds that promote wound healing. The short life cycle and easy culturing routine make Drosophila a powerful model organism. Drosophila clean wound healing appears to coordinate the epidermal regenerative response, with the innate immune response, in ways that are still under investigation, which provides an excellent system to find conserved regulatory mechanisms common to Drosophila and mammalian epidermal wounding.

Microinjection Wound Assay and In vivo Localization of Epidermal Wound Response Reporters in Drosophila Embryos.

The embryonic epidermis of very late stage Drosophila embryos provides an in vivo system for rapid puncture wound response analysis and can be combined with genetic manipulations or chemical microinjection treatments to advance studies in wound healing for translation into mammalian models.

Mikroinjektion Wound Assay und<em&gt; In-vivo-</em&gt; Lokalisierung von Epidermal Wundreaktion Reporter in<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryos.

The Drosophila embryo develops a robust epidermal layer that serves both to protect the internal cells from a harsh external environment as well as to ...

Procedure for the Development of Multi-depth Circular Cross-sectional Endothelialized Microchannels-on-a-chip

Efforts have been focused on developing in vitro assays for the study of microvessels because in vivo animal studies are more time-consuming, expensive, and observation and quantification are very challenging. However, conventional in vitro microvessel assays have limitations when representing in vivo microvessels with respect to three-dimensional (3D) geometry and providing continuous fluid flow. Using a combination of photolithographic reflowable photoresist technique, soft lithography, and microfluidics, we have developed a multi-depth circular cross-sectional endothelialized microchannels-on-a-chip, which mimics the 3D geometry of in vivo microvessels and runs under controlled continuous perfusion flow. A positive reflowable photoresist was used to fabricate a master mold with a semicircular cross-sectional microchannel network. By the alignment and bonding of the two polydimethylsiloxane (PDMS) microchannels replicated from the master mold, a cylindrical microchannel network was created. The diameters of the microchannels can be well controlled. In addition, primary human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) seeded inside the chip showed that the cells lined the inner surface of the microchannels under controlled perfusion lasting for a time period between 4 days to 2 weeks.

A microchannels-on-a-chip platform was developed by the combination of photolithographic reflowable photoresist technique, soft lithography, and microfluidics. The endothelialized microchannels platform mimics the three-dimensional (3D) geometry of in vivo microvessels, runs under controlled continuous perfusion flow, allows for high-quality and real-time imaging&#160;and can be applied for microvascular research.

Verfahren für die Entwicklung von Multi-Tiefe rundem Querschnitt endothelialisierten Mikrokanäle-on-a-Chip

Efforts have been focused on developing in vitro assays for the study of microvessels because in vivo animal studies are more time-consuming, expensive, ...

Optimizing Attachment of Human Mesenchymal Stem Cells on Poly(&#949;-caprolactone) Electrospun Yarns

Research into biomaterials and tissue engineering often includes cell-based in vitro investigations, which require initial knowledge of the starting cell number. While researchers commonly reference their seeding density this does not necessarily indicate the actual number of cells that have adhered to the material in question. This is particularly the case for materials, or scaffolds, that do not cover the base of standard cell culture well plates. This study investigates the initial attachment of human mesenchymal stem cells seeded at a known number onto electrospun poly(&#949;-caprolactone) yarn after 4 hr in culture. Electrospun yarns were held within several different set-ups, including bioreactor vessels rotating at 9 rpm, cell culture inserts positioned in low binding well plates and polytetrafluoroethylene (PTFE) troughs placed within petri dishes. The latter two were subjected to either static conditions or positioned on a shaker plate (30 rpm). After 4 hr incubation at 37&#160;oC, 5% CO2, the location of seeded cells was determined by cell DNA assay. Scaffolds were removed from their containers and placed in lysis buffer. The media fraction was similarly removed and centrifuged &#8211; the supernatant discarded and pellet broken up with lysis buffer. Lysis buffer was added to each receptacle, or well, and scraped to free any cells that may be present. The cell DNA assay determined the percentage of cells present within the scaffold, media and well fractions. Cell attachment was low for all experimental set-ups, with greatest attachment (30%) for yarns held within cell culture inserts and subjected to shaking motion. This study raises awareness to the actual number of cells attaching to scaffolds irrespective of the stated cell seeding density.

This article describes a range of set-ups for seeding human mesenchymal stem cells onto materials, in this case electrospun yarns, that do not cover the base of standard culture well plates in order to maximize and quantify the number of cells that initially attach compared to the known seeding density.

Optimierung der Befestigung der humanen mesenchymalen Stammzellen auf Poly (ε-caprolacton) Elektrogesponnene Garne

Research into biomaterials and tissue engineering often includes cell-based in vitro investigations, which require initial knowledge of the starting cell ...

Construction of Defined Human Engineered Cardiac Tissues to Study Mechanisms of Cardiac Cell Therapy

Human cardiac tissue engineering can fundamentally impact therapeutic discovery through the development of new species-specific screening systems that replicate the biofidelity of three-dimensional native human myocardium, while also enabling a controlled level of biological complexity, and allowing non-destructive longitudinal monitoring of tissue contractile function. Initially, human engineered cardiac tissues (hECT) were created using the entire cell population obtained from directed differentiation of human pluripotent stem cells, which typically yielded less than 50% cardiomyocytes. However, to create reliable predictive models of human myocardium, and to elucidate mechanisms of heterocellular interaction, it is essential to accurately control the biological composition in engineered tissues. 
To address this limitation, we utilize live cell sorting for the cardiac surface marker SIRP&#945; and the fibroblast marker CD90 to create tissues containing a 3:1 ratio of these cell types, respectively, that are then mixed together and added to a collagen-based matrix solution. Resulting hECTs are, thus, completely defined in both their cellular and extracellular matrix composition.
Here we describe the construction of defined hECTs as a model system to understand mechanisms of cell-cell interactions in cell therapies, using an example of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells (hMSC) that are currently being used in human clinical trials. The defined tissue composition is imperative to understand how the hMSCs may be interacting with the endogenous cardiac cell types to enhance tissue function. A bioreactor system is also described that simultaneously cultures six hECTs in parallel, permitting more efficient use of the cells after sorting.

This manuscript describes the creation of defined engineered cardiac tissues using surface marker expression and cell sorting. The defined tissues can then be used in a multi-tissue bioreactor to investigate mechanisms of cardiac cell therapy in order to provide a functional, yet controlled, model system of the human heart.

Bau von Defined Menschen Engineered Herzgewebe zur Untersuchung Mechanismen der Herzzelltherapie

Human cardiac tissue engineering can fundamentally impact therapeutic discovery through the development of new species-specific screening systems that ...

Light-sheet Fluorescence Microscopy to Capture 4-Dimensional Images of the Effects of Modulating Shear Stress on the Developing Zebrafish Heart

The hemodynamic forces experienced by the heart influence cardiac development, especially trabeculation, which forms a network of branching outgrowths from the myocardium. Genetic program defects in the Notch signaling cascade are involved in ventricular defects such as Left Ventricular Non-Compaction Cardiomyopathy or Hypoplastic Left Heart Syndrome. Using this protocol, it can be determined that shear stress driven trabeculation and Notch signaling are related to one another. Using Light-sheet Fluorescence Microscopy, visualization of the developing zebrafish heart was possible. In this manuscript, it was assessed whether hemodynamic forces modulate the initiation of trabeculation via Notch signaling and thus, influence contractile function occurs. For qualitative and quantitative shear stress analysis, 4-D (3-D+time) images were acquired during zebrafish cardiac morphogenesis, and integrated light-sheet fluorescence microscopy with 4-D synchronization captured the ventricular motion. Blood viscosity was reduced via gata1a-morpholino oligonucleotides (MO) micro-injection to decrease shear stress, thereby, down-regulating Notch signaling and attenuating trabeculation. Co-injection of Nrg1 mRNA with gata1a MO rescued Notch-related genes to restore trabeculation. To confirm shear stress driven Notch signaling influences trabeculation, cardiomyocyte contraction was further arrested via tnnt2a-MO to reduce hemodynamic forces, thereby, down-regulating Notch target genes to develop a non-trabeculated myocardium. Finally, corroboration of the expression patterns of shear stress-responsive Notch genes was conducted by subjecting endothelial cells to pulsatile flow. Thus, the 4-D light-sheet microscopy uncovered hemodynamic forces underlying Notch signaling and trabeculation with clinical relevance to non-compaction cardiomyopathy.

Here, we present a protocol to visualize developing hearts in zebrafish in 4-Dimensions (4-D). 4-D imaging, via light-sheet fluorescence microscopy (LSFM), takes 3-Dimensional (3-D) images over time, to reconstruct developing hearts. We show qualitatively and quantitatively that shear stress activates endocardial Notch signaling during chamber development, which promotes cardiac trabeculation.

Licht-Blatt Fluoreszenz-Mikroskopie, 4-dimensionale Bilder über die Auswirkungen der modulierende Schubspannung auf entwickelnden Zebrafisches Herzen erfassen

The hemodynamic forces experienced by the heart influence cardiac development, especially trabeculation, which forms a network of branching outgrowths ...

Construction of a Multilayered Mesenchymal Stem Cell Sheet with a 3D Dynamic Culture System

Stem cell therapy shows a promising future in regenerating injured organ and tissues, and the cell sheet technique has been developed to improve the low cell retention and poor survival within the target zone. However, during the in vitro construction process, a solution for maintaining stem cell bioactivity and increasing the cell amount within the cell sheet is urgently needed. Here, this protocol presents a method for constructing a multilayered cell sheet with favorable stem cell bioactivity and optimal operability. Decellularized porcine pericardium (DPP) is prepared by phospholipase A2 (PLA2) decellularization method as the cell sheet scaffold, and rat bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) are isolated and expanded as the seeded cells. The temporary multilayered cell sheet structure is constructed by using RAD16-I peptide hydrogel. Finally, the cell sheet is cultured with a dynamic perfusion system to stabilize the three-dimensional (3D) structure, and the cell sheet could be obtained following a 48-hour culture in vitro. This protocol provides an efficient and feasible method for constructing a multilayered stem cell sheet, and the cell sheet could be developed as a favorable stem cell therapy product in the future.

This article provides an efficient and feasible method for constructing multilayered stem cell sheets with favorable stem cell property.

Bau eines vielschichtigen mesenchymale Stammzellen-Blatt mit einem 3D dynamische Kultursystem

Stem cell therapy shows a promising future in regenerating injured organ and tissues, and the cell sheet technique has been developed to improve the low ...

Patterning the Geometry of Human Embryonic Stem Cell Colonies on Compliant Substrates to Control Tissue-Level Mechanics

Human embryonic stem cells demonstrate a unique ability to respond to morphogens in vitro by self-organizing patterns of cell fate specification that correspond to primary germ layer formation during embryogenesis. Thus, these cells represent a powerful tool with which to examine the mechanisms that drive early human development. We have developed a method to culture human embryonic stem cells in confined colonies on compliant substrates that provides control over both the geometry of the colonies and their mechanical environment in order to recapitulate the physical parameters that underlie embryogenesis. The key feature of this method is the ability to generate polyacrylamide hydrogels with defined patterns of extracellular matrix ligand at the surface to promote cell attachment. This is achieved by fabricating stencils with the desired geometric patterns, using these stencils to create patterns of extracellular matrix ligand on glass coverslips, and transferring these patterns to polyacrylamide hydrogels during polymerization. This method is also compatible with traction force microscopy, allowing the user to measure and map the distribution of cell-generated forces within the confined colonies. In combination with standard biochemical assays, these measurements can be used to examine the role mechanical cues play in fate specification and morphogenesis during early human development.

Extracellular matrix ligands can be patterned onto polyacrylamide hydrogels to enable the culture of human embryonic stem cells in confined colonies on compliant substrates. This method can be combined with traction force microscopy and biochemical assays to examine the interplay between tissue geometry, cell-generated forces, and fate specification.

Musterung der Geometrie menschlicher embryonaler Stammzellkolonien auf konformen Substraten zur Kontrolle der Gewebe-Level-Mechanik

Human embryonic stem cells demonstrate a unique ability to respond to morphogens in vitro by self-organizing patterns of cell fate specification that ...

Isolation, Expansion, and Differentiation of Mesenchymal Stem Cells from the Infrapatellar Fat Pad of the Goat Stifle Joint

The IFP, present in the knee joint, serves as a promising source of MSCs. The IFP is an easily accessible tissue as it is routinely resected and discarded during arthroscopic procedures and knee replacement surgeries. Additionally, its removal is associated with minimal donor site morbidity. Recent studies have demonstrated that IFP-MSCs do not lose their proliferation capacity during in vitro expansion and have age-independent osteogenic differentiation potential. IFP-MSCs possess superior chondrogenic differentiation potential compared to bone marrow-derived MSCs (BMSCs) and adipose-derived stem cells (ADSCs). Although these cells are easily obtainable from aged and diseased patients, their effectiveness is limited. Hence, using IFP-MSCs from healthy donors is important to determine their efficacy in biomedical applications. As access to a healthy human donor is challenging, animal models could be a better alternative to enable fundamental understanding. Large animals such as dogs, horses, sheep, and goats play a crucial role in translational research. Amongst these, the goat could be a preferred model since the stifle joint of the goat has the closest anatomy to the human knee joint. Moreover, goat-IFP can fulfill the higher MSC numbers needed for tissue regeneration applications. Furthermore, low cost, availability, and compliance with the 3R principles for animal research make them an attractive model. This study demonstrates a simple protocol for isolating IFP-MSCs from the stifle joint of goats and in vitro culture conditions for their expansion and differentiation. The aseptically isolated IFP from the goat was washed, minced, and digested enzymatically. After filtration and centrifugation, the collected cells were cultured. These cells were adherent, had MSCs-like morphology, and demonstrated remarkable clonogenic ability. Further, they differentiated into adipogenic, chondrogenic, and osteogenic lineages, demonstrating their multipotency. In conclusion, the study demonstrates the isolation and expansion of MSCs, which show potential in tissue engineering and regenerative medicine applications.

Infrapatellar fat pad mesenchymal&#160;stem cells (IFP-MSCs) can be isolated easily from the infrapatellar fat pad of the knee joint. They proliferate well in vitro, form CFU-F colonies, and differentiate into adipogenic, chondrogenic, and osteogenic lineages. Herein, the methodology for the isolation, expansion, and differentiation of IFP-MSCs from goat stifle joint is provided.

Isolierung, Expansion und Differenzierung von mesenchymalen Stammzellen aus dem infrapatellaren Fettpolster des Ziegenwürgegelenks

The IFP, present in the knee joint, serves as a promising source of MSCs. The IFP is an easily accessible tissue as it is routinely resected and discarded ...