Wir möchten Aimee Pugh-Bernard für ihre geistigen Input und hilfreichen Kommentare danken. Diese Arbeit war die Boettcher Stiftung Webb Waring Biomedical Research Award und Award K23-1K23AR070897 von der NIH, Elena W.Y. Hsieh unterstützt. Sie wurde auch von prämiennummer K12-HD000850 von Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health und Human Development and Lucile Packard Foundation für Kinder Gesundheit, Stanford CTSA UL1 TR001085 und Child Health Research unterstützt. Institut der Stanford University.

Alle hier beschriebene Methoden sind durch die Colorado mehrere institutionelle Review Board (COMIRB) von der University of Colorado genehmigt worden. Alle unten beschriebene Verfahren sollte in einem sterilen Gewebekultur Abzug durchgeführt werden, sofern nichts anderes mit gefilterten Pipettenspitzen und alle Reagenzien gefiltert.
1. Vorbereitung der Reagenzien für die peripheren Vollblut Verarbeitung
<ol><li>Bereiten Sie Ruxolitinib Lager Aliquote (10 – 15 μl/Vial zur Einzelnutzung) bei 10 mM durch Verdünnung der lyophilisierte Reagenz in DMSO gemäß Herstellervorschrift (Shop bei-80 ° C). Halten Sie DMSO Konzentrationen in allen Tests einschließlich unstimulierte Kontrollen unter 0,2 % (Vol/Vol).</li>
	<li>Bereiten Sie R848 (Resiquimod) Lager Aliquote (10 – 15 μl/Vial zur Einzelnutzung) bei 1 μg/μL durch Verdünnung der lyophilisierte Reagenz in sterilem Wasser als die gemäß Herstellerangaben. Shop bei-80 ° C.</li>
	<li>Bereiten Sie Lipopolysaccharid (LPS) Lager Aliquote (5 μl pro Fläschchen für einmaligen Gebrauch nur) bei 1 μg/μL durch Verdünnung der lyophilisierte Reagenz in sterilem Wasser gemäß Anweisungen des Herstellers. Shop bei-80 ° C.</li>
	<li>Bereiten Sie die Zelle Färbung Medien (CSM) mit PBS, 0,5 % BSA und 0,02 % NaN3.</li>
	<li>Erwerben Sie und halten Sie den Protein Transport-Inhibitor (PTI) Cocktail (Table of Materials) bereit.</li>
	<li>Tauen Sie auf und verdünnen Sie der Ruxolitinib Lager Ampulle (10 mM) 01:10 in sterilen PBS (1 mM). Bei Raumtemperatur in einer Gewebekultur Kapuze beiseite.</li>
	<li>Auftauen und verdünnen das R848 Lager Fläschchen (1 µg/µL) 01:10 in sterilen PBS (0,1 µg/µL). Bei Raumtemperatur in einer Gewebekultur Kapuze beiseite.</li>
	<li>Auftauen und die LPS Lager Fläschchen (1 µg/µL) 1: 100 in sterilen PBS verdünnen (0,01 µg/µL). Bei Raumtemperatur in einer Gewebekultur Kapuze beiseite.</li>
	<li>Wärmen Sie sterile RPMI (keine L-Glutamin) im Wasserbad standard 37 ° C (für mindestens 10 min vor).</li>
	<li>Verdünnen Sie die Lyse/Fix-Puffer mit 1:5 in gefilterten DdH2O (arbeiten Konzentration) auf die Tischplatte (muss nicht steril sein). Hinweis: 1 mL Vollblut benötigt 20 mL arbeiten Konzentration der lyse/Fix-Puffer.<ol>
<li>Lyse/Fix Puffer für 5 Bedingungen von 1 mL Vollblut je (mindestens 100 mL) zu machen. Aliquoten 20 mL der Arbeit Konzentration der Lyse/Fix Puffer in 50 mL konische Röhrchen pro Milliliter Vollblut (halten die Lyse/Fix-Lösung bei 37 ° C bis benötigt). Die Bedingungen auf den konischen Rohren mit lyse/Fix Puffer wie folgt zu kennzeichnen: T0 (Zeitpunkt Null), T6 + 5R (6 h mit 5 Zeit Umm Ruxolitinib), T6 + R848 (Zeitpunkt 6 h mit 1 μg/mL R848), T6 + LPS (mal 6 h mit 0,1 μg/mL LPS), T6 (Zeitpunkt 6 h).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Label Runde Unterseite sterile Polystyrol Rohre mit Kappen und 1 mL Mikrozentrifugenröhrchen mit der selben Nomenklatur wie in Schritt 1.10.</li>
</ol>2. Stimulation und Verarbeitung von peripheren Vollblut (Abbildung 1)
<ol><li>Legen Sie den beschrifteten Rundrohre unten Polystyrol aus Schritt 1.11 (T0, T6 + 5R, T6 + R848, T6 + LPS, T6) auf einem Gestell. Hinweis: Die folgenden Schritte sind bei dieser Art von Rohr durchgeführt, sofern nicht anders angegeben. Kappe die Rohre bei der Übertragung zwischen der Gewebekultur Haube und Inkubator zu Sterilität.</li>
	<li>Fügen Sie 1 mL von 37 ° C RPMI (keine L-Glutamin) für jedes der Rohre (T0, T6 + 5R, T6 + R848, T6 + LPS, T6). Das blutsammelröhrchen mehrmals zu invertieren, jedes Rohr 1 mL Vollblut hinzu, und pipette nach oben und unten mehrmals gründlich mit RPMI mischen (Verdünnung mit RPMI verhindert Verklumpung des Blutes während der Inkubationszeit von 6 h).</li>
	<li>Hinzufügen von 10 μL der 01:10 Ruxolitinib T6 + 5R. Mischen Sie gründlich, mit einer Pipette P1000. Platzieren Sie die Zahnstange von Rohren im Inkubator bei 37 ° C und beginnen mit der Zeitmessung der Inkubation (T = 0).</li>
	<li>Die T0-Probe wie folgt zu verarbeiten.<ol>
<li>Der gesamte Inhalt der T0-Röhre in einem beschrifteten konischem Rohr mit 20 mL 37 ° C arbeiten Konzentration lyse/Fix Puffer Pipette. Zur Optimierung der Zelle Erholung spülen Sie das Rohr mit Konzentration lyse/Fix Puffer arbeiten. Durch Umkehrung der konischen Röhre mischen.</li>
		<li>Inkubation bei 37 ° C für 15 min zur Lyse und Fixierung ermöglichen. Führen Sie nach Fixierung alle weiteren Schritte auf der Tischplatte. Zentrifugieren Sie Zellen bei 500 X g für 5 min bei Raumtemperatur.</li>
		<li>Den überstand abgießen. Aufschwemmen der Zellen in 1 mL Eis kaltem PBS Pellet aufzubrechen, dann füllen mit PBS kegelförmig bis 15 mL Volumen.</li>
		<li>Zentrifugieren Sie die Zellen bei 500 X g für 5 min bei Raumtemperatur. Den überstand abgießen. Wiederholen Sie die PBS waschen (Schritte 2.4.3–2.4.4), wenn Pellets rot sind. Aufzuwirbeln Sie die Zellen in 1 mL der CSM, brechen Sie die Tablette, dann übertragen auf die beschrifteten Microcentrifuge Schlauch (Schritt 1.11) für Antikörper Färbung. Nehmen Sie eine 10 µL Probe mit einem automatisierten Zelle Zähler oder Hemocytometer Zellen zu zählen. Hinweis: Da alle Zellen zu diesem Zeitpunkt fixiert sind, ist es nicht erforderlich, einen Lebensfähigkeit Fleck aufzunehmen.</li>
		<li>Zentrifugieren Sie die Zellen bei 500 X g für 5 min bei Raumtemperatur. Aspirieren Sie den überstand, so dass das Pellet in ~ 60 µL Restvolumen. Halten Sie diese Pellet auf Eis, bis Proben von anderen Erkrankungen Verarbeitung abgeschlossen haben.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bei T = 30 min nach der Gewebekultur Haube Rohr Rack (Schritt 2.3) und führen Sie die folgenden.<ol>
<li>Hinzufügen von 10 μL von 0,1 μg/μL R848 T6 + R848. Mischen Sie gründlich, mit einer Pipette P1000.</li>
		<li>T6 + LPS 10 μL von 0,01 μg/μL LPS hinzufügen. Mischen Sie gründlich, mit einer Pipette P1000.</li>
		<li>T6, T6 und T6 + 5R, LPS (aber nicht zu T6 + R848) 4 μl Protein Transport Inhibitor (bestand bei 500 X) hinzufügen und wieder die Proben in den Inkubator bis T = 6 h. Mischung gründlich mit einer Pipette P1000 alle 2 h. Hinweis: R848 ist ein endoplasmic TLR-Agonist und erfordert daher eine zeitliche Verzögerung bei der Addition von Protein Transport Inhibitor, um Zugang zu ihren Ziel-Rezeptor zu ermöglichen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bei T = 2 h, 4 μl Protein Transport Inhibitor cocktail (bestand bei 500 X) hinzufügen, die T6 + R848 Rohr. Alle Proben mit einer Pipette P1000 mischen und wieder das Rack in den Inkubator bis T = 6 h.</li>
	<li>Mischen der Proben mit einem P1000 noch einmal bei T = 4 h.</li>
	<li>Bei T = 6 h, zu verarbeiten, T6, T6 + LPS, T6 + R848 und T6 + 5R Blut Probenröhrchen wie unter Schritt 2.4 für die T0-Probe.</li>
	<li>Speichern Sie die Zelle Pellets in CSM Restvolumen bei-80 ° C zu einem späteren Zeitpunkt verarbeiten. Alternativ fahren Sie mit Barcode und Antikörper Färbung ohne zu speichern.</li>
</ol>3. Barcode der Blutkörperchen lysiert/behoben
<ol><li>Die lysiert/fixed Zellproben von-80 ° C Lagerung langsam auf Eis Auftauen; maximal 20 Proben kann mit einmaligen Barcodes beschriftet und gebündelt, mit diesem System. Verdünnen Sie die 10 X barcoding Perm Puffer von 01:10 mit PBS; machen Sie genügend Puffer für ~ 3 mL pro Probe.</li>
	<li>Füllen Sie einen unsterilen Trog mit dem CSM und eines mit 1 X barcoding Perm Puffer. Fügen Sie 1 mL Eis kalt CSM frisch aufgetauten Proben mischen mit einer Pipette, und übertragen Sie auf die jeweiligen bereits beschriftete Polypropylen Cluster-Röhren.</li>
	<li>Nehmen Sie eine 10 μl Probe mit einem automatisierten Zelle Zähler oder Hemocytometer Zellen zu zählen. Die Zellzahlen 1,5 – 2 x 106 Zellen pro Probe in jedem Cluster Röhrchen zu normalisieren: entfernen und entsorgen Sie das Volumen des überschüssigen Zellen über den 2 x 106 Zellen.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Zellen bei 600 X g für 5 min bei Raumtemperatur. Aufschwemmen der Zellen in 1 mL 1 X barcoding-Perm-Puffer mit einem Mehrkanal-Pipette und Zentrifuge bei 600 X g für 5 min bei Raumtemperatur. Aus der Überstand abgesaugt.</li>
	<li>Line-up der Cluster-Röhren auf einem Gestell in der gleichen Reihenfolge wie auf dem Barcode-Schlüssel angegeben, damit die Probe mit seinen Barcode entspricht. Fügen Sie 800 μl 1 X Barcode Perm Puffer Mehrkanal-Pipette auf alle Proben in den Cluster-Röhren ohne Berührung der Zelle Pellet mit Pipettenspitzen (keine Mischung), Zellverlust zu reduzieren. Das Gestell mit den Cluster-Rohren beiseite.</li>
	<li>Entfernen Sie 20-Plex Pd Barcoding Kit Schlauch Streifen von-20 ° C und bei Raumtemperatur Auftauen. 100 μl 1 X barcoding Perm Puffer hinzufügen, mischen und 120 μL der resuspendierte Barcode-Mischung in die entsprechende Zellenproben in den Cluster-Röhren zu übertragen.</li>
	<li>Mischen von Mehrkanal-Pipette so, dass es keine Kreuzkontamination zwischen individuell Barcode Proben. Inkubieren Sie Cluster Rohre für 30 min bei Raumtemperatur erlauben die Barcodes, die Zellen zu kennzeichnen.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie bei 600 X g für 5 min bei Raumtemperatur. Aspirieren des Überstands, dann in 1 mL der CSM aufzuwirbeln.</li>
	<li>Zentrifugieren und Aufschwemmen in CSM wieder wie in Schritt 3,8. Hinweis: Jede Probe wird nun mit einem eindeutigen Barcode beschriftet und Proben sind bereit, gebündelt werden.</li>
	<li>Zentrifugieren bei 600 X g für 5 min bei Raumtemperatur und den überstand abgesaugt. Mit einer einzigen Pipette und mit der gleichen Spitze, übertragen alle Zelle Pellets in ~ 70 – 80 μl Restvolumen, ein Polystyrol-Röhrchen. Nicht kann die PIPETTENSPITZE Auswerfen; die einzige Pipette mit diesem Tipp beiseite.</li>
	<li>Fügen Sie mit einer Mehrkanal-Pipette und neue Tipps hinzu ~ 100 μL CSM jeder ursprünglichen Cluster Tube Zelle Erholung zu maximieren. Übertragen Sie mit der einzigen Pipette mit der Spitze, die beiseite gesetzt wurde alle Zelle Pellets in ~ 100 μL Restvolumen auf das gleiche Polystyrol Rohr.</li>
	<li>Oben das Polystyrol Rohr (~ 3 mL) CSM hinzufügen. Graf und Aufzeichnung der Handynummer des gepoolten Barcodes eingestellt. Zentrifugieren bei 600 X g für 5 min bei Raumtemperatur und den überstand abgesaugt. Fahren Sie mit der Färbung der Barcode-Proben am gleichen Tag. Hinweis: Es ist normal, ~ 20 – 30 % Zellverlust Barcoding dabei zu erwarten.</li>
</ol>4. Färbung des Barcodes feste lysiert/Blutkörperchen und Vorbereitung für die Analyse auf Masse Zytometrie Instrument
Hinweis: Je 1 X Titer der Färbung Antikörper (1 μl des Antikörpers pro 100 μL Färbung Reaktion), kann in der Regel 3 – 4 x 106 Zellen färben. Daher, wenn alle Barcodes Proben in einem Rohr gebündelt sind, muss die Menge des Antikörpers hochskaliert werden. Wenn 20 Barcodes Proben belaufen sich auf 30 x 106 Zellen und jeweils 1 X Titer 3 – 4 x 106 Zellen färben kann, erfordert die Barcode-Probe nur einen 10 X-Titer, im Gegensatz zu beflecken jede Probe individuell, erfordern eine 20 X Menge des Antikörpers (1 X pro einzelne Röhre). Die Konzentration des Antikörpers zu Handynummer sollte sorgfältig für jeden einzelnen Antikörper cocktail (hier nicht behandelt) titriert werden.
<ol><li>Färben Sie die Zellen mit Antikörpern (Table of Materials) für Oberflächen Beflecken und Zytokin-Induktion.<ol>
<li>Machen die Oberfläche Färbung cocktail durch die Berechnung des Betrags, um hinzugefügt und Buchhaltung für Pipettier Fehler sein (d. h., wenn 20 Barcodes Proben von 2 x 106 Zellen in jeder Probe Färbung einem 10-fach Titer Fleck ist erforderlich; für Endvolumen Berechnungen, pipettieren Fehler von denen ein 10,5 X Finale Färbelösung auszugleichen Sie).</li>
		<li>Fügen Sie 10 X Wert der Oberfläche Volumen zum Barcode Zelle Pellet Färbung. Verringerung des zellverlustes, mit der gleichen Spitze, mischen Sie und Messen Sie die Lautstärke der Oberfläche Flecken und Zelle Pellet.</li>
		<li>Basierend auf das Volumen der Zellen und Färbung cocktail, CSM fügen Sie eine Färbung Endvolumen von 50 μL pro Anzahl der Zellproben (d. h., wenn eine Reihe von 20 Proben, 50 μL X 20 = 1 mL ausgeführt hinzu). 30 min bei 4 ° c inkubieren Schütteln Sie die Probe alle 15 min zur Förderung sogar Färbung.</li>
		<li>Während der Inkubation Oberfläche Fleck bereiten Sie Perm/Waschpuffer (Table of Materials) durch Verdünnung 01:10 mit gefilterten DdH2O. Prepare Volumen von 2 mL für Permeabilisierung und 5 mL zum Waschen. Halten Sie bei 4 ° C oder auf Eis.</li>
		<li>Die Krönung der Oberfläche Beflecken Rohr mit CSM und Zentrifuge bei 600 X g bei 4 ° C für 5 min. Überstands Aspirieren. Aufschwemmen die Barcode-Probe in 2 mL 4 ° C, 01:10 Verdünnung Perm/Waschpuffer. Bei 4 ° C für 20-30 min bis die Zellen voll permeabilize inkubieren.</li>
		<li>Bei 600 X g bei 4 ° C für 5 min zentrifugieren und den überstand abgesaugt.</li>
		<li>Für intrazelluläre Färbung, Schritte ähnliche Färbung (z. B. für Oberfläche Färbung). Jedoch verwenden die 4 ° C, 01:10 Verdünnung Perm/Waschpuffer anstelle der CSM, machen die gesamte Lautstärke Färbung, so dass die Zellen in einem permeabilizing Umfeld in die intrazelluläre Färbung bleiben.</li>
		<li>Fügen Sie der intrazelluläre Antikörper cocktail an die Oberfläche gebeizt und permeabilized Zelle Pellet (Schritte 4.1.2–4.1.17). Bringen Sie die Summe Volumen 50 μL pro Anzahl der Zellproben Färbung. 60 min bei 4 ° c inkubieren Schütteln Sie die Probe alle 15 min darauf sogar Färbung.</li>
		<li>Während die intrazelluläre Färbung, bereiten Sie die Intercalator-Lösung: 900 μl des gefilterten PBS + 100 μL des gefilterten 16 % PFA (Endkonzentration von 1,6 % PFA) + 0,2 μl 500 Umm Intercalator Farbstoff (Table of Materials).</li>
		<li>Die Krönung der Zelle Pellet + cocktail mit kalten 01:10 intrazellulären Antikörper Perm/Waschpuffer.</li>
		<li>Bei 600 X g bei 4 ° C für 5 min zentrifugieren und den überstand abgesaugt. Krönen Sie den befleckenden Schlauch mit CSM. Zählen und Erfassen der Anzahl von Zellen. Bei 600 X g bei 4 ° C für 5 min zentrifugieren und den überstand abgesaugt. Die Zellen in 1 mL Intercalator-Lösung von Schritt 4,9 aufzuwirbeln. Mindestens 20 min bei Raumtemperatur für volle Interkalation inkubieren, oder über Nacht bei 4 ° C (Proben in Intercalator Lösung bei 4 ° C für bis zu 1 Woche vor der Ausführung auf die Masse zytometrie Instrument bleiben).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereiten Sie die Zellen für die Masse zytometrie Instrument.<ol>
<li>Krönen Sie das Rohr mit 3 mL gefilterte DdH2O und Zentrifuge bei 600 X g für 5 min bei 4 ° C. Aufschwemmen der Zellen in gefilterten DdH2O. Pass 3 mL Suspension durch einen 100 μm-Filter zu entfernen Schmutz oder Aggregate, die potenziell die Masse zytometrie Instrument verstopfen könnten.</li>
		<li>Zählen Sie und erfassen Sie der Zelle Nummer nachfiltrierung. Zentrifuge bei 600 X g für 5 min bei 4 ° C</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereiten Sie die Wulst Kalibrierlösung (Table of Materials) durch Verdünnen es 01:10 in gefilterten DdH2O.</li>
	<li>Aufschwemmen der gefärbten Zellen in das erforderliche Volumen von 01:10 verdünnt Wulst Kalibrierlösung Zellkonzentration von ~ 1 x 106 Zellen/mL zu erreichen. Hinweis: Für eine CyTOF1 bei 45 µL/min ist das empfohlene Optimum 5 x 105 Zellen/mL; für Helios bei 30 µL/min, 7,5 x 105 Zellen/mL.</li>
	<li>Gehen Sie zum Ausführen des Beispiels auf die Masse zytometrie Instrument9.</li>
</ol>

<ol>
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T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Barcoding+of+live+human+peripheral+blood+mononuclear+cells+for+multiplexed+mass+cytometry.">Barcoding of live human peripheral blood mononuclear cells for multiplexed mass cytometry.</a> The Journal of Immunology. 194 (4), 2022-2031 (2015).</li><li>Finck, R., Simonds, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normalization+of+mass+cytometry+data+with+bead+standards.">Normalization of mass cytometry data with bead standards.</a> Cytometry Part A. 83 (5), 483-494 (2013).</li><li>Takahashi, C., Au-Yeung, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+cytometry+panel+optimization+through+the+designed+distribution+of+signal+interference.">Mass cytometry panel optimization through the designed distribution of signal interference.</a> Cytometry. Part A : the journal of the International Society for Analytical Cytology. 91 (1), 39-47 (2017).</li></ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Hier beschreiben wir eine neuartige, einzellige, Proteomic Ansatz für mehrere Immunzelle Arten gleichzeitig zu beurteilen und ihre verschiedenen Zytokin-Störungen im Umfeld des Patienten spezifische "pathogenen" peripheren Blutplasma zirkulierende Faktoren zu erkennen. Diese Methode setzt peripheren Vollblut sowie die analytische Fahrzeug Masse zytometrie als Instrument für die Bewertung der immunologischen zellulären phänotypische und funktionelle Veränderungen. Die Methode ist leicht anwendbar auf Menschen und Mäusen Studien21und ist kompatibel mit anderen immun Funktionsanalyse, etwa die Entdeckung Signalisierung Anomalien14.
Der Benutzer sollte bewusst eine Reihe von Variablen, die den Erfolg dieses Verfahrens beeinflussen können. Basierend auf unserer Erfahrung, sollten Blutproben innerhalb von 2 h Sammlung zu Grundlinie Induktion von intrazellulären Zytokinen (Daten nicht gezeigt) verarbeitet werden. Blutproben sollten bei Raumtemperatur (25 ° C) in Erwartung Verarbeitung bleiben. Blutproben können gesammelt werden entweder Natrium Heparin oder EDTA Röhrchen ohne Interferenzen mit dem beschriebenen Assay. Leben und Tote Zelle Diskriminierung durch Masse zytometrie mit Cisplatin22ausgewertet werden kann. Allerdings entfällt diese Auswertung im Protokoll beschriebenen vorausgesetzt, Blut sofort (oder innerhalb von 2 h) verarbeitet wird nach der Entnahme. Außerdem selbst wenn Proben in der Bearbeitung verzögert wurden, ermöglicht das Fehlen der Kryokonservierung für die Unterlassung der lebenden/Toten Diskriminierung. Wir würden, jedoch empfehlen die Verwendung von Cisplatin zur Lebensfähigkeit Diskriminierung für jede Studie in denen Zelltod führt das Ergebnis der nachfolgenden Analyse beeinträchtigen könnten.
Darüber hinaus haben wir festgestellt, dass die sorgfältige Auswahl und Titration von der anregenden Agent ist für gezielte immun Wege/Zytokin-Induktion Bewertung. Erstens, die Wahl des anregenden Agent sollte anhand der (1) das Immunsystem Bahnen engagieren/bewerten soll und 2) gezielte funktionelle auslesen (egal ob Proteine oder Cytokine Produktion Signalisierung). Zum Beispiel würde das Ziel T-Zellaktivierung und verschiedenen Untergruppen der T-Helfer-Zellen (Th) und ihre jeweiligen Zytokin-Induktion zu bewerten, wäre PMAIONO oder eine Kombination von Anti-CD3/Anti-CD28 eine entsprechende anregende Bedingung. Jedoch würde das Ziel Monocyte Teilmenge Aktivierung zu bewerten, kann einen TLR-Agonisten (oder eine Kombination davon) am besten sein. Zweitens muss die Konzentration für jede dieser stimulierenden Wirkstoffe optimiert werden, um zu entlocken Zellaktivierung und Zytokin-Induktion, ohne die Zelle oberflächenmarker stark zu verändern. Verwendung von zu wenig anregend Agent führt nicht zur Aktivierung der gewünschten Zelltypen und keine Zytokin-Induktion beobachtet werden, während die Verwendung von zu viel führt zu übermäßigen Zelltod und Änderungen in der immunen Zellen oberflächenmarker derart, dass Populationen identifiziert im unstimulierte Zustand wird nicht in den angeregten Zustand vorhanden sein. Drittens ist die Kinetik der Stimulation auch eine wichtige Variable. Während 6 Stunden zuvor als eine optimale Stimulation Zeitrahmen für maximale Induktion von Pro-inflammatorischen Zytokinen als Reaktion auf die TLR Stimulation14,23erfassen veröffentlicht worden ist, kann eine andere Stimulation Timepoint für benötigt werden andere Agenten. Die Verwendung von jedem therapeutisches Medikament in Vitro mit peripherem Blutproben sollten in ähnlicher Weise auch in der gleichen Weise wie die anregende Agent während aufmerksam auf Konzentration und Timepoint titriert werden.
In diesem Protokoll verwenden wir frische peripheren Vollblut-Proben, intrazellulären Zytokin Induktion (und Erkennung) ist robust und wirksam, wenn Sie mit kryokonservierten Proben verglichen. Wir beschreiben im Protokoll hier die Verwendung von Vollblut im Gegensatz zu PBMCs, da das Vorhandensein von Plasma zirkulierenden Faktoren, das "Wesen" der immunologischen Veränderungen im Zusammenhang mit den Krankheitsprozess beiträgt. Diese Plasma zirkulierenden Faktoren beeinträchtigen anregende Bedingungen hinzugefügt, um die peripheren Vollblut, wie die Zugabe von Anti-IgM und Anti-IgG um den B-Zell-Rezeptor zu engagieren wie sie durch Plasma zirkulierenden Antikörpern und roten Blutkörperchen gebunden sind. Daher, sorgfältiger Auswahl der die anregende Bedingungen bei der Verwendung peripheren Vollblut ist entscheidend für erfolgreiches Experiment gelesen Outs. Mit peripheren Vollblut hat seine Vorteile (in Vivo -Plattform) und Nachteile (Plasma zirkulierenden Störfaktoren). PBMCs bieten jedoch einen anderen Satz von "pro" und "kontra". Wenn frische PBMCs (im Gegensatz zu Vollblut) durchlaufen das gleichen Prozess/Protokoll und mit Stimulation mit verschiedenen TLR-Agenten, beobachten wir das gleiche "Muster" der Zytokin-Induktion, wenn auch in etwas geringerem Ausmaß14,23. Nach diesem Protokoll die Verwendung von gefrorenen PBMCs führt zu einer weniger robust Zytokin-Induktion, und daher empfehlen wir gegen direkten Vergleich Ergebnisse von Proben nach Kryokonservierung mit denen frisch verarbeitet verarbeitet.
Angesichts die Vorbehalt von frischen oder gefrorenen Proben und die Vorliebe für die Verwendung von frischen Proben für optimale Datenqualität, eignet sich das hier beschriebene Protokoll für prospektive Studien am Menschen wo Patientenproben werden über einen Zeitraum von Monaten bis Jahren gesammelt. Peripheren Blutproben können verarbeitet werden, wie beschrieben, und sobald sie die RBC-Lyse und Fixierung-Stufe erreichen, können Proben in-80 ° C gelagert und später in den Reihen gebeizt. Dieser technische Ansatz stellt zwar vorteilhaft für die meisten menschlichen Studien, auch die Herausforderung mit Antikörpern, die nach der Fixierung auf die Ziel-Epitop binden können. Die Tabelle der Werkstoffe listet die Klone für die jeweiligen Antikörper, die getestet wurden und zeigen spezifische Färbung Post-Fixierung. Barcoding mehrerer Proben (n = 20) bietet die Vorteile der 1) technische Variabilität, als mehrere Proben zusammen in eine Röhre, daher Vergleiche der Proben über Bedingungen ziemlich konsistente und zuverlässige; gefärbt sind zurückgegangen (2) Verringerung der gesamten Antikörper Verwendung (siehe Protokoll Abschnitt 4.1); und 3) das Barcoding-Schema der "6 verschiedene Palladium Isotope/wählen Sie 3" führt zum Ausschluss von Dubletten (Zellen positiv für mehr als 4 Palladium Isotope). Diese Vorteile werden im Detail in Zunder und Fick'schen Et Al. besprochen. 24 außerdem erfordert das Barcode-Verfahren, dass Zellen fixiert werden, wie sie benötigen, um milde für die Interkalation der Barcoding Reagenz (Palladium Isotope)24permeabilized werden. Daher kann nicht live Färbung durchgeführt werden nach diesem Protokoll. Es sei darauf hingewiesen, dass live Zelle Barcoding (im Gegensatz zu festen Zelle Barcoding hier beschrieben) eine Möglichkeit25,26 ist, aber im Protokoll hier Zellen fixiert sind, so sie gespeichert werden können und Batch zusammen verarbeitet.
Batch-Probe Verarbeitung, während vorteilhaft aus einem Labor und Effizienz Sicht Zeit, hat auch seine eigenen Herausforderungen. Mit Batch-Verarbeitung gibt es eine Notwendigkeit für eine sorgfältig kuratierte Normalisierungsprozess. Dieser Normalisierungsprozess kann auf verschiedenen Stufen von der Masse zytometrie Workflow behandelt werden. Erstens sollte die Konzentration der Antikörper zu Handynummer über Chargen konsistent gehalten werden. Wir haben festgestellt, dass eine effektive Möglichkeit, diese konsequente Konzentration zu erreichen ist (1) sorgfältige Titration der antikörperkonzentration, Handynummer und (2) Normalisierung der Zelle Anzahl aller Proben, die Barcodes beieinander liegen (d.h., 1 Million Zellen pro Probe für alle 20 Barcode-Proben). Zweitens um Instrument Signal Intensität Variabilität (unterschiedliche Tage tuning, Kalibrierung und Signal Zerfall über Laufzeit) berücksichtigen, sollten Proben Nukleinsäuretablette und analysiert werden auf die Masse Cytometer mit einer entsprechenden Normalisierung Wulst Lösung (Tabelle Materialien), gefolgt von Datei-Normalisierung nach Daten Akquisition27 (aber vor Debarcoding). Einzelne Proben sind Debarcoded, nachdem die gesamte Barcode-Datei mit den Werkzeugen in Zunder und Finck Et Al. beschrieben normalisiert wurde 24 drittens um manuelle Antikörper Färbung technische Variabilität Rechnung zu tragen, empfehlen wir die Aufnahme einer "Anker" Probe mit jedem Barcode-Satz, der analysiert wird, für eine einzelne Studie, d. h., eine einzelne Probe, die von einem Spender (Humanstudien) ist und wurde in die gleiche Weise wie die anderen Studie Proben bearbeitet. In diesem Beispiel sollte einmal in groß genug Menge in jedem Barcode-Satz für die Studie analysiert verteilt werden generiert werden. Diese Anker Proben von jedem Barcode werden verwendet, um einen Koeffizienten von Abweichung korrigieren Signal Variabilität über die Studie Proben für diesen Barcode generieren (d. h.Anker Probe von Barcode 8 wird zur Variabilität im Barcode 8 korrigieren).
Ein weiterer wichtiger Optimierungsschritt ist die Montage des Fensters Masse zytometrie Antikörper, die relevanten Immunzelle Teilmengen und Zytokine beurteilen wird. Die Schlüsselvariablen in der Antikörper Panel Assembly gehören die Wahl der Klone (oben angesprochen), Antikörpertiter für minimale Hintergrundsignal, Wahl der Antikörper Ziele und Isotop Kanälen basierend auf Antigen-Fülle und Kanal Sensibilität " "Kompensation" Signal Spillover basierend auf Isotop Unreinheit und Oxidation und individuellen Antikörper viel Variabilität. Diese Optimierungsschritte richten sich an anderer Stelle28 und nicht in den Geltungsbereich des Protokolls, die hier beschrieben.
Mit diesem Einzellige Proteomic Ansatz zu immunologischen Veränderungen im peripheren Blutproben zu studieren, ist es möglich, abnormale Phänotypen der Immunzelle Teilmengen zu identifizieren sei es Bevölkerung Frequenzunterschiede oder Veränderungen in der Expression von bestimmte Zelle oberflächenmarker (z. B. Marker der Zell-Aktivierung). Darüber hinaus ist es auch möglich, funktionelle Anomalien innerhalb des Teilmengen von Immunzellen, so wie unter oder Überproduktion von Zytokinen zu identifizieren. Zu guter Letzt zeigt den Prozess der Vergleich der Probenmaterials sofort behoben (T0) im Vergleich zu festen nach 6 h Inkubation ohne exogene Agent (T6) "intrinsische" pathogene Prozesse, die zu Immunzelle Typ und Zytokin Anomalien (T6-T0) führen. Dieser Ansatz könnte die Studie eine Vielzahl von systemischen immunvermittelte Prozesse und das Engagement von mehreren Immunzelle Teilmengen und Wege je nach der Stimulation Agent angepasst werden.

Autoimmunerkrankungen sind eine der Hauptursachen für Morbidität und Mortalität 3-8 % der Bevölkerung betroffen. In den Vereinigten Staaten, autoimmune-Erkrankungen gehören zu den führenden Todesursachen bei junge und Mittelalte Frauen (Alter < 65 Jahre)1,2. Autoimmune-Erkrankungen zeichnen sich durch heterogene klinische Präsentation und unterschiedlichen zugrunde liegenden immunologische Prozesse. Das Spektrum der Heterogenität ist über verschiedene Störungen, wie gemeinsame Beteiligung bei der rheumatoiden Arthritis (RA) und neurologische Erkrankung bei multipler Sklerose (MS) vertreten. Dieses Maß an Heterogenität zeigt jedoch auch innerhalb einer einzelnen Störung, wie systemischer Lupus erythematodes (SLE): bei einigen Patienten können mit renal Pathologie präsentieren, während andere leiden an hämatologischen oder gemeinsame Beteiligung3.
Die zugrunde liegenden immunpathogenese in Autoimmun-Erkrankungen spiegelt die klinische Heterogenität, mit Auto - und hyper-Aktivierung von angeborenen und der adaptiven Immunzelle Teilmengen und damit einhergehende Dysregulated Produktion von Zytokinen. Während Zytokine eine zentrale Rolle in der Pathogenese von Autoimmunkrankheiten spielen, nachweislich verstehen ihre besondere Rolle in den Mechanismus der Krankheit eine Herausforderung sein. Zytokine sind geprägt von Pleiotropie (ein Zytokin kann mehrere Effekte auf verschiedene Zelltypen haben), Redundanz (mehrere Zytokine können die gleiche Wirkung haben), Dualität (ein Zytokin kann pro- und antiinflammatorische Effekte unter verschiedenen Bedingungen haben), und Plastizität (Zytokine können in eine Rolle unterscheidet sich von der "original", je nach Umgebung geformt werden)4,5,6. Folglich können nicht Populationsebene Methoden heterogene zelluläre Reaktionen auf die gleichen "Zytokin-Milieu" unterscheiden. In ähnlicher Weise bieten Studiendesigns, die sich auf einen spezifischen Aspekt des Immunsystems (eine einzelne Zellentyp oder Cytokine), keine Gesamtbewertung aller Elemente in komplexen Autoimmunkrankheit beteiligt. Während Sera-basierten Studien Patienten wichtige Erkenntnisse zur Autoimmunität geleistet haben, bieten sie nicht die spezifische zelluläre Quelle der Dysregulated Zytokine entdeckt.
Vor kurzem haben wir einen einzelligen Proteomic Ansatz zur Bewertung gleichzeitig mehrere Arten von Immunzellen und ihre verschiedenen Zytokin-Störungen im Umfeld des Patienten spezifische "pathogenen" peripheren Blutplasma zirkulierende Faktoren zu erkennen. Die hier beschriebene Workflow zeichnet sich durch die Verwendung von intakten peripheren Vollblut-Proben, im Gegensatz zu isolierten peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs). Peripheren Blut stellt die meisten physiologisch relevante Fahrzeug immun-vermittelte systemerkrankung, einschließlich 1) nicht-mononukleären Blutzellen oft eingebunden in Autoimmunerkrankung (d.h., Neutrophilen Granulozyten und Thrombozyten) und Plasma (2) studieren zirkulierenden Faktoren wie Nukleinsäuren, Immunkomplexe und Zytokine, haben die immun aktivierende Rollen. Erfassen der "inneren pathogenen" Dysregulated Produktion von Zytokinen, peripherem Blut Proben unmittelbar nach der Blutentnahme (T0, Stunde Null), und nach 6 h Inkubation bei 37 ° C (physiologische Körpertemperatur) mit einem Protein-Transport erfolgt Inhibitor bei fehlender exogene anregende Zustand (T6, Zeit 6 h), Produktion von Zytokinen (Akkumulation, T6-T0) erkennen, die die "intrinsische" Krankheitszustandes (Abbildung 1) widerspiegeln würde. Dysregulated Prozesse, die über widerspiegeln oder unter Aktivierung der Signalwege in Immunreaktionen relevant für die Krankheit, periphere Blutproben sind zu studieren (6 h Inkubation bei 37 ° C mit einem Protein-Transport-Inhibitor) mit einer exogenen behandelt Bedingung, die Pathogenese der Krankheit, wie Toll-Like-Rezeptor (TLR) Agonisten bei SLE (T6 + R848, mal 6 h mit 1 µg/mL R848), um die Produktion von Zytokinen zu erkennen, die eine Reaktion auf Nukleinsäuren widerspiegeln würde reflektiert anregend (Vergleich T0 vs. T6 vs. T6 + R848, Abbildung 1). Um immunmodulatorische Effekte von verfügbaren Therapeutika ex Vivo, studieren, wie sie die präzise immun Dysregulated Prozesse für bestimmte Patienten betreffen, werden mit einem JAK Inhibitor bei den relevanten therapeutischen peripherem Blutproben behandelt. Konzentration (hier 5 Umm Ruxolitinib; T6 + 5R, mal 6 h mit 5 Umm Ruxolitinib), zum Erkennen von Änderungen in "intrinsische" Krankheit Staat als Reaktion auf das Medikament (T0 vs. T6 vs. T6 + 5R, Abbildung 1). Ein JAK Inhibitor wurde für diese Studie ausgewählt, weil JAK-Hemmer nachweislich erfolgreich bei der Behandlung von Autoimmun-Krankheiten wie RA
Um gleichzeitig in mehreren Immunzelle Teilmengen, periphere Blutproben von SLE beschriebenen Dysregulated-Prozesse bewerten wurden Patienten und gesunden Kontrollpersonen verarbeitet, wie oben beschrieben und analysiert durch Masse zytometrie. Masse zytometrie, auch bekannt als Zytometrie-Time-Of-Flight, bietet einzellige Analyse von über 40 Parametern ohne Probleme der spektralen7,8,9überlappen. Diese Technik nutzt seltene Erden Metall-Isotope in Form von löslichen Metall-Ionen als Tags an Antikörpern, statt Fluorophore10gebunden. Zusätzliche Details bezüglich der Masse zytometrie technological Platform (d.h., tuning und Kalibrierung, Probe Erwerb) finden Sie im Leipold Et Al. und McCarthy Et al. 11 , 12 High-Dimensionalität der Masse zytometrie ermöglicht gleichzeitige Messung mehrerer Zytokine in angeborene und adaptive Immunzellen Teilmengen mit einzelligen Granularität (Table of Materials).
Aktuelle konventionellen klinischen und Labor-Parameter sind oft nicht empfindlich oder spezifisch genug, zur Erkennung von laufenden Krankheitsaktivität oder die Reaktion auf bestimmte Immunmodulatoren13, reflektieren die Notwendigkeit, das zugrunde liegende Immunsystem besser abzugrenzen Änderungen, die Schübe zu fahren. Angesichts die Allgegenwart der Cytokine Dysregulation bei Autoimmunerkrankung, haben eine Vielzahl von Behandlungsansätzen, die Antikörper oder kleine Molekulare Inhibitoren targeting Zytokine oder signalproteinen beteiligt bei der Regulierung der Produktion von Zytokinen verwenden vor kurzem entstanden. In ihrer grundlegenden Form bietet der hier beschriebene peripherem Blut analytische Ansatz eine Plattform um patientenspezifische Dysregulated Zelle Teilmengen und ihre abnorme Zytokin-Produktion in Autoimmunerkrankung mit systemischen Manifestationen zu identifizieren. Diese Methodik ermöglicht die Personalisierung von therapeutischen Möglichkeiten wie spezifische Dysregulated Zytokine identifiziert werden können, und eine spezifische Behandlung, die Optionen Ex Vivo getestet zu ihrer Fähigkeit, Immunomodulate zu beurteilen Patienten spezifische Krankheit Prozesses.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ruxolitinib</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SC-364729A</td>
			<td>Stock Conc: 10 mM; Final Conc: 5 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R848</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>tlrl-r848-5</td>
			<td>Stock Conc: 1 &#956;g/&#956;L; Final Conc: 1 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LPS-EK</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>tlrl-eklps</td>
			<td>Stock Conc: 1 &#956;g/&#956;L; Final Conc: 0.1 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile PBS</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-516F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lyse/Fix Buffer</td>
			<td>BD biosciences</td>
			<td>558049</td>
			<td>Stock Conc: 5X; Final Conc: 1X (dilute in ddH2O)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;BD Phosflow perm/wash buffer I</td>
			<td>BD biosciences</td>
			<td>557885</td>
			<td>Stock Conc: 10X; Final Conc: 1:10 (dilute in ddH2O)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21870-076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide (NaN3)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S-8032</td>
			<td>Stock Conc: &#62;99.9%; Final Conc: 0.0002</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Transport Inhibitor (PTI)</td>
			<td>eBiosciences</td>
			<td>00-4980-93</td>
			<td>Stock Conc: 500X; Final Conc: 1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Intercalator</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>201192B</td>
			<td>Stock Conc: 500 &#956;M; Final Conc: 0.1 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Staining Media (CSM)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>PBS + 0.5% BSA, 0.02% NaN3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MaxPar Barcode Perm Buffer</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>201057</td>
			<td>Stock Conc: 10X; Final Conc: 1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20-plex Pd Barcode Set</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>S0014</td>
			<td>Stock Conc: n/a; Final Conc: n/a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EQ TM Four Element Calibration Beads</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>201078</td>
			<td>Stock Conc: 10X; Final Conc: 1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% MeOH-free Formaldehyde Solution</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>28908</td>
			<td>Stock Conc: 16% (w/v); Final Conc: 1.6% (w/v)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile round bottom polystyrene tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>60818-496</td>
			<td>Stock Conc: n/a; Final Conc: n/a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene cluster tubes</td>
			<td>Light Labs</td>
			<td>A-9001</td>
			<td>Stock Conc: n/a; Final Conc: n/a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Helios CyTOF instrument</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>Helios</td>
			<td>All solutions to be used in CyTOF analysis need to be free of metal contamination. ddH2O is used in the preparation of any solutions should have a resistivity of at least 18.0 M&#937;.cm. ddH2O and any self-prepared solutions should be stored in new plastic or glass bottles that have never been autoclaved.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibodies used for Mass Cytometry</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surface markers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD1c</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>L161</td>
			<td>Mass: 161</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3</td>
			<td>BD</td>
			<td>UCHT1</td>
			<td>Mass: 144</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD4</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>SK3</td>
			<td>Mass: 174</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD7</td>
			<td>BD</td>
			<td>M-T701</td>
			<td>Mass: 149</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD8</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>SK1</td>
			<td>Mass: 142</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11b</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>ICRF44</td>
			<td>Mass: 209</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11c</td>
			<td>BD</td>
			<td>B-ly6</td>
			<td>Mass: 152</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD15</td>
			<td>BD</td>
			<td>HI98</td>
			<td>Mass: 115</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD14</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>M5E2</td>
			<td>Mass: 154</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD16</td>
			<td>eBioscience/Thermo</td>
			<td>B73.1</td>
			<td>Mass: 165</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD19</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SJ25C1</td>
			<td>Mass: 163</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD21</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Bu32</td>
			<td>Mass: 141</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD27</td>
			<td>BD</td>
			<td>L128</td>
			<td>Mass: 155</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD38</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>HIT2</td>
			<td>Mass: 172</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45 total</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>HI30</td>
			<td>Mass: 89</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45RA</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>HI100</td>
			<td>Mass: 153</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD56</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>REA196</td>
			<td>Mass: 168</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD66</td>
			<td>BD</td>
			<td>B1.1/CD66</td>
			<td>Mass: 113</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD86</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>IT2.2</td>
			<td>Mass: 150</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD123</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>6H6</td>
			<td>Mass: 143</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD278/ICOS</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>C398.4A</td>
			<td>Mass: 156</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD179/PD1</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>EH12.2H7</td>
			<td>Mass: 162</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgD</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>IA6-2</td>
			<td>Mass: 146</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgM</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>MHM-88</td>
			<td>Mass: 151</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CXCR5</td>
			<td>BD</td>
			<td>RF8B2</td>
			<td>Mass: 173</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HLADR</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>L243</td>
			<td>Mass: 167</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytokines</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-1&#945;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>364-3B3-14</td>
			<td>Mass: 147</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-1&#946;</td>
			<td>Biolegend&#160;</td>
			<td>H1b-98</td>
			<td>Mass: 169</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-1RA</td>
			<td>Santa Cruz&#160;</td>
			<td>AS17</td>
			<td>Mass: 157</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-6</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>MQ2-13A5</td>
			<td>Mass: 164</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-8</td>
			<td>BD</td>
			<td>E8N1</td>
			<td>Mass: 160</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-12/IL-23p40</td>
			<td>Biolegend&#160;</td>
			<td>C8.6</td>
			<td>Mass: 171</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-17A</td>
			<td>Biolegend&#160;</td>
			<td>BL168</td>
			<td>Mass: 148</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL23p19</td>
			<td>eBioscience/Thermo</td>
			<td>23dcdp</td>
			<td>Mass: 176</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MIP1&#946;</td>
			<td>BD</td>
			<td>D21-1351</td>
			<td>Mass: 158</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCP1</td>
			<td>BD</td>
			<td>5D3-F7</td>
			<td>Mass: 170</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN&#945;</td>
			<td>Miltenyi&#160;</td>
			<td>LT27:295</td>
			<td>Mass: 175</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN&#947;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>4S.B3</td>
			<td>Mass: 165</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTEN</td>
			<td>BD</td>
			<td>A2B1</td>
			<td>Mass: 159</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNF&#945;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Mab11</td>
			<td>Mass: 166</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Note: If the manufacturer is stated as Fluidigm, this antibody was purchased from Fluidigm with metal pre-conjugated. If the manufacturer is stated as other than Fluidigm, this antibody was self-conjugated using the MaxPar Multi-Metal Labeling&#160; Kit (Fluidigm Cat: 201300) according to manufacturer protocol.&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-cell analysis of immunophenotype and cytokine production in peripheral whole blood via mass cytometry

Zytokine spielen eine zentrale Rolle in der Pathogenese von Autoimmunkrankheiten. Daher wurde die Messung der Zytokin Ebenen der Schwerpunkt von mehreren Studien in einem Versuch, die genauen Mechanismen zu verstehen, die zum Zusammenbruch der Selbsttoleranz und anschließende Autoimmunität führen. Ansätze bisher basieren auf der Studie einen spezifischen Aspekt des Immunsystems (Single oder paar Zelltypen oder Zytokine) und bieten keine umfassende Beurteilung der komplexen Autoimmunerkrankung. Während Sera-basierten Studien Patienten wichtige Erkenntnisse zur Autoimmunität geleistet haben, bieten sie nicht die spezifische zelluläre Quelle der Dysregulated Zytokine entdeckt. Eine einzellige Gesamtkonzept für die Produktion von Zytokinen in mehreren Immunzelle Teilmengen im Rahmen des "intrinsische" Patienten-spezifischen Plasma zirkulierenden Faktoren zu bewerten ist hier beschrieben. Dieser Ansatz ermöglicht die Überwachung des Patienten-spezifischen immun Phänotyps (oberflächenmarker) und Funktion (Zytokine), entweder in seiner Heimat "inneren pathogenen" Krankheit Staat, oder in der Gegenwart von Therapeutika (in Vivo und ex Vivo).

Abbildung 1 zeigt den Workflow für die Stimulation und Verarbeitung der peripheren Blutproben, einschließlich Zuweisung von Blut Probe Aliquote, Timing der Zusatz von Stimulation, Protein Inhibitor cocktail, und Inkubation Zeiten bis zur Lyse der Erythrozyten (RBC) und Fixierung. Die Wahl der anregenden Agenten hängt von der Signal- und Cytokine Bahnen, die für die Bewertung ausgerichtet sind. Beispielsweise werden in dem hier beschriebenen Protokoll TLR-Agonisten zur angeborene Abwehrmechanismen Fernerkundung über mehrere Zelltypen zu bewerten. Repräsentative extrazelluläre (LPS, TLR4-Agonist) und endoplasmic (R848, TLR7/8 Agonist) Agonisten wurden ausgewählt. Anderen stimulierenden Mitteln gehören Phorbol Myristate-12 13-Acetat (PMA) und Ionomycin (PMAIONO), die als T-Zell-Aktivatoren dienen können. Spezifische Zytokine kann auch verwendet werden, als anregende Agenten, zusammen mit anderen spezifischen B und T-Zell-Antigene.
Um den experimentellen Ansatz beschrieben in diesem Protokoll zu demonstrieren, Abbildung 2, Abbildung 3und Abbildung 4 zeigen repräsentative erzielten Ergebnisse mit LPS, R848 und PMAIONO als anregende Bedingungen. Während die Verwendung von PMAIONO nicht im Protokoll beschrieben wurde, sind Daten gezeigt in Abb. 3 und Abb. 4 zeigen, dass unterschiedliche (und selektive) Zelltypen und Zytokine aktiviert/induzierte Reaktion auf TLR-Agonisten (LPS und R848) im Vergleich zu einem T Zell-Aktivator (PMAIONO). Angesichts der Tatsache, dass 26 oberflächenmarker (Table of Materials) verwendet wurden, um mehrere angeborene und adaptive Immunzellen Teilmengen abzugrenzen, können verschiedene T, B, NK, Monocyte und Dendritische Zelle Teilmengen gleichzeitig innerhalb einer einzigen Probe untersucht werden. Darüber hinaus sind Markierungen von immun-Zell-Aktivierung auch enthalten, z. B. CD86 oder ICOS für B-Zellen und PD1 für T-Zellen. Ein Vertreter beschränkt Anspritzung Strategie demonstrieren die Beurteilung der CD14hi Monozyten ist in Abbildung 2dargestellt. Weitere detaillierte und erweiterte Anspritzung von T und B, NK, Monocyte, dendritische, granulocytic Zelle Teilmengen finden Sie in unserer bisher veröffentlichten Arbeit in O'Gorman und Hsieh Et Al. und O'Gorman und Kong Et al. 14 , 15 außerdem unbeaufsichtigt Analysemethoden einschließlich (und nicht beschränkt auf) Spaten16, VisNE17, Citrus18, Phenograph19und Xshift20 können verwendet werden, um Masse zytometrie Daten (nicht auswerten hier besprochen). Mit CD14hi Monozyten und CD4-T-Zellen als repräsentative angeborene und adaptive Immunzellen Teilmengen, sind Daten, die zeigen Zytokin Induktion innerhalb dieser Zelltypen in Abbildung 3dargestellt. Eine ausgewählte Anzahl von Zytokinen wurde zu zeigen, dass R848 gezielt IL-12 (p40 Untereinheit induziert) und MCP1 in CD14hi Monozyten während LPS nicht ausgewählt (Abbildung 3). PMAIONO, eine potente T-Zell-Aktivator nicht dazu veranlassen, Zytokine in CD14hi Monozyten (Abbildung 3) aber induzieren Interferon Gamma (IFNγ) und Tumor-Nekrose-Faktor Alpha (TNF) in CD4-T-Zellen (Abbildung 4). Erfolgreiche Technik im peripheren Blut Probe Stimulation und Verarbeitung zeigen Muster der Zytokin Induktion spezifisch für anregende Bedingungen und immun Teilmengen, wie in Abbildung 3 und Abbildung 4veranschaulicht. Vollständige Analyse der 14 Zytokine beschrieben hier in der Zelle Arten innerhalb der 26 oberflächenmarker erfasst finden Sie unter O'Gorman und Hsieh Et Al., und O'Gorman und Kong Et al. 14 , 15
Um zu demonstrieren, wie der experimentelle Ansatz beschrieben in diesem Protokoll die "intrinsischen" pathogenen Zustand eine systemische Autoimmunerkrankung erfasst, wie bei SLE im Vergleich zu einem gesunden Spender, Abbildung 5 zeigt die Zytokin-Induktion (Mip1β und MCP1) in CD14hi Monozyten in den erkrankten peripherem Blut Probe nur (Teil B), in Ermangelung der exogene Stimulation (T6 im Vergleich zu T0) gefunden. Diese Zytokine werden "moduliert/von JAK Hemmung Therapie Ruxolitinib (T6 + 5R im Vergleich zu T6) in die erkrankten peripherem Blut Probe nur (Teil B) verringert".
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57780/57780fig1.jpg"> Abbildung 1: Experimentelle Workflow zur Stimulation und Verarbeitung des peripheren Blutes für Masse zytometrie Analyse. Protokoll zum RBC Lyse und Fixierung der Krankheit peripherem Blut unmittelbar nach Probenentnahme (T0) oder nach 6 h Inkubation bei 37 ° C mit einem Protein-Transport-Inhibitor (PTI) in Ermangelung einer exogenen Agent (T6) oder mit LPS (T6 + LPS), R848 (T6 + R848; Protein Transport Inhibitor Inkubation für nur 4 h) oder Ruxolitinib (T6 + 5R). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57780/57780fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57780/57780fig2.jpg"> Abbildung 2: Vertreter, die Strategie für die Identifizierung von CD14hi Monozyten gating. Nach Fixierung und RBC Lyse fixiert lysiert/die einzelnen Zellproben eines gesunden Spenders Barcode, beschriftet mit 26 Antikörper gegen oberflächenmarker, permeabilized und befleckt mit 14 Antikörper gegen Zytokine (Table of Materials) waren. Die begrenzte gating Strategie vertritt die Identifizierung von CD14hi Monozyten wird angezeigt. Von links nach rechts ist jeder 2D Parzelle vertreten, dass eine Teilmenge der Bevölkerung aus, die Grundgesamtheit (Blue Box) vom 2D Grundstück sofort auf der linken Seite eingezäunt. Eine erweiterte gating Strategie finden Sie im O'Gorman und Hsieh Et Al.und O'Gorman und Kong Et al. 14 , 15 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57780/57780fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57780/57780fig3.jpg"> Abbildung 3. Beispiel der Zytokin-Induktion in CD14hi Monozyten nach Stimulation mit LPS, R848 und PMAIONO. Eine repräsentative Masse zytometrie Analyse des peripheren Blutes Proben eines gesunden Spenders zum Zeitpunkt NULL (T0), unstimulierte (T6), und nach Stimulation mit LPS (T6 + LPS), R848 (T6 + R848) und PMAIONO (T6 + PMAIONO) wird angezeigt. Ein Beispiel für die Zytokin-Induktion in CD14hi Monozyten; ausgewählte Zytokine mit Spezifität für die anregende Mittel verwendet (TLR-Agonisten vs. T-Zell-Aktivator) werden dargestellt. Erweiterte Daten für alle Zytokin-Induktion über mehrere Immunzelle Teilmengen festgestellt mit dieser Masse zytometrie Antikörper-Panel finden Sie im O'Gorman und Hsieh Et Al.und O'Gorman und Kong Et al. 14 , 15 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57780/57780fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57780/57780fig4.jpg"> Abbildung 4. Beispiel der Zytokin-Induktion in CD4-T-Zellen nach Stimulation mit LPS, R848 und PMAIONO. Eine repräsentative Masse zytometrie Analyse des peripheren Blutes Proben eines gesunden Spenders zum Zeitpunkt NULL (T0), unstimulierte (T6), und nach Stimulation mit LPS (T6 + LPS), R848 (T6 + R848) und PMAIONO (T6 + PMAIONO) wird angezeigt. Beispiel für Zytokin-Induktion in CD4-T-Zellen; ausgewählte Zytokine mit Spezifität für die anregende Mittel verwendet (TLR-Agonisten vs. T-Zell-Aktivator) werden dargestellt. Erweiterte Daten für alle Zytokin-Induktion über mehrere Immunzelle Teilmengen festgestellt mit dieser Masse zytometrie Antikörper-Panel finden Sie im O'Gorman und Hsieh Et Al.und O'Gorman und Kong Et al. 14 , 15 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57780/57780fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57780/57780fig5.jpg"> Abbildung 5. Beispiel der Zytokin-Induktion in CD14hi Monozyten aus SLE Krankheit Patient. Eine repräsentative Masse zytometrie Analyse der peripheren Blutproben von gesunden Spendern (A) und SLE Krankheit Patienten (B) gezeigt. Beispiele für die Zytokin-Induktion in CD14hi Monozyten; Zytokine mit Spezifität für den SLE Krankheit "intrinsische" pathogenen Prozess (T6) ausgewählt (d.h., Induktion von MIP1β und MCP1 nur bei SLE-Patienten), und die Wirkung der Immunmodulator Ruxolitinib (T6 + 5R) werden dargestellt. Erweiterte Daten für alle Zytokin-Induktion über mehrere Immunzelle Teilmengen festgestellt mit dieser Masse zytometrie Antikörper-Panel finden Sie im O'Gorman und Kong Et al. 15 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57780/57780fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

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Single-cell Analysis of Immunophenotype and Cytokine Production in Peripheral Whole Blood via Mass Cytometry

Einzellige Analyse der Immunophenotype und Produktion von Zytokinen im peripheren Blut über Masse Zytometrie

Hier beschreiben wir einen Einzellige Proteomic Ansatz um Immune phänotypische und funktionelle (intrazelluläre Zytokin Induktion) bewerten Veränderungen in peripheren Vollblut Proben, über Masse zytometrie analysiert.

Cytokines play a pivotal role in the pathogenesis of autoimmune diseases. Hence, the measurement of cytokine levels has been the focus of multiple studies ...

single-cell-analysis-immunophenotype-cytokine-production-peripheral

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

9.3K Aufrufe.  University of Colorado School of Medicine. Hier beschreiben wir einen Einzellige Proteomic Ansatz um Immune phänotypische und funktionelle (intrazelluläre Zytokin Induktion) bewerten Veränderungen in peripheren Vollblut Proben, über Masse zytometrie analysiert.

Serie: Single-cell Analysis of Immunophenotype and Cytokine Production in Peripheral Whole Blood via Mass Cytometry

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Biofilm formation is a general attribute to almost all bacteria 1-6. When bacteria form biofilms, cells are encased in extracellular matrix that is mostly constituted by proteins and exopolysaccharides, among other factors 7-10. The microbial community encased within the biofilm often shows the differentiation of distinct subpopulation of specialized cells 11-17. These subpopulations coexist and often show spatial and temporal organization within the biofilm 18-21.
Biofilm formation in the model organism Bacillus subtilis requires the differentiation of distinct subpopulations of specialized cells. Among them, the subpopulation of matrix producers, responsible to produce and secrete the extracellular matrix of the biofilm is essential for biofilm formation 11,19. Hence, differentiation of matrix producers is a hallmark of biofilm formation in B. subtilis.
We have used fluorescent reporters to visualize and quantify the subpopulation of matrix producers in biofilms of B. subtilis 15,19,22-24. Concretely, we have observed that the subpopulation of matrix producers differentiates in response to the presence of self-produced extracellular signal surfactin 25. Interestingly, surfactin is produced by a subpopulation of specialized cells different from the subpopulation of matrix producers 15.
We have detailed in this report the technical approach necessary to visualize and quantify the subpopulation of matrix producers and surfactin producers within the biofilms of B. subtilis. To do this, fluorescent reporters of genes required for matrix production and surfactin production are inserted into the chromosome of B. subtilis. Reporters are expressed only in a subpopulation of specialized cells. Then, the subpopulations can be monitored using fluorescence microscopy and flow cytometry (See Fig 1).
The fact that different subpopulations of specialized cells coexist within multicellular communities of bacteria gives us a different perspective about the regulation of gene expression in prokaryotes. This protocol addresses this phenomenon experimentally and it can be easily adapted to any other working model, to elucidate the molecular mechanisms underlying phenotypic heterogeneity within a microbial community.

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Microbial biofilms are generally constituted by distinct subpopulations of specialized cells. Single-cell analysis of these subpopulations requires the use of fluorescent reporters. Here we describe a protocol to visualize and monitor several subpopulationswithin B. subtilis biofilms using fluorescence microscopy and flow cytometry.

Einzel-Zell-Analyse Bacillus subtilis Biofilme mittels Fluoreszenzmikroskopie und Durchflusszytometrie

Biofilm formation is a general attribute to almost all bacteria 1-6. When bacteria form biofilms, cells are encased in extracellular matrix that is mostly ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Mass Spectrometric Analysis of Glycosphingolipid Antigens

Glycosphingolipids (GSL's) belong to the glycoconjugate class of biomacromolecules, which bear structural information for significant biological processes such as embryonic development, signal transduction, and immune receptor recognition1-2. They contain complex sugar moieties in the form of isomers, and lipid moieties with variations including fatty acyl chain length, unsaturation, and hydroxylation. Both carbohydrate and ceramide portions may be basis of biological significance. For example, tri-hexosylceramides include globotriaosylceramide (Gal&alpha;4Gal&beta;4Glc&beta;1Cer) and isoglobotriaosylceramide (Gal&alpha;3Gal&beta;4Glc&beta;1Cer), which have identical molecular masses but distinct sugar linkages of carbohydrate moiety, responsible for completely different biological functions3-4. In another example, it has been demonstrated that modification of the ceramide part of alpha-galactosylceramide, a potent agonist ligand for invariant NKT cells, changes their cytokine secretion profiles and function in animal models of cancer and auto-immune diseases5. The difficulty in performing a structural analysis of isomers in immune organs and cells serve as a barrier for determining many biological functions6.
Here, we present a visualized version of a method for relatively simple, rapid, and sensitive analysis of glycosphingolipid profiles in immune cells7-9. This method is based on extraction and chemical modification (permethylation, see below Figure 5A, all OH groups of hexose were replaced by MeO after permethylation reaction) of glycosphingolipids10-15, followed by subsequent analysis using matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF/MS) and ion trap mass spectrometry. This method requires 50 million immune cells for a complete analysis. The experiments can be completed within a week. The relative abundance of the various glycosphingolipids can be delineated by comparison to synthetic standards. This method has a sensitivity of measuring 1% iGb3 among Gb3 isomers, when 2 fmol of total iGb3/Gb3 mixture is present9.
Ion trap mass spectrometry can be used to analyze isomers. For example, to analyze the presence of globotriaosylceramide and isoglobtriaosylceramide in the same sample, one can use the fragmentation of glycosphingolipid molecules to structurally discriminate between the two (see below Figure 5). Furthermore, chemical modification of the sugar moieties (through a permethylation reaction) improves the ionization and fragmentation efficiencies for higher sensitivity and specificity, and increases the stability of sialic acid residues. The extraction and chemical modification of glycosphingolipids can be performed in a classic certified chemical hood, and the mass spectrometry can be performed by core facilities with ion trap MS instruments.

A specific and sensitive method to gain insight into the expression profile of glycosphingolipid antigens in immune organs and cells is described. The method takes advantage of the ion trap mass spectrometry allowing step-wise fragmentation of glycosphingolipid molecules for structural analysis in comparison to chemically synthesized standards.

Massenspektrometrische Analyse Glycosphingolipid Antigene

Glycosphingolipids (GSL's) belong to the glycoconjugate class of biomacromolecules, which bear structural information for significant biological processes ...

Enumeration of Major Peripheral Blood Leukocyte Populations for Multicenter Clinical Trials Using a Whole Blood Phenotyping Assay

Cryopreservation of peripheral blood leukocytes is widely used to preserve cells for immune response evaluations in clinical trials and offers many advantages for ease and standardization of immunological assessments, but detrimental effects of this process have been observed on some cell subsets, such as granulocytes, B cells, and dendritic cells 1-3. Assaying fresh leukocytes gives a more accurate picture of the in vivo state of the cells, but is often difficult to perform in the context of large clinical trials. Fresh cell assays are dependent upon volunteer commitments and timeframes and, if time-consuming, their application can be impractical due to the working hours required of laboratory personnel. In addition, when trials are conducted at multiple centers, laboratories with the resources and training necessary to perform the assays may not be located in sufficient proximity to clinical sites. To address these issues, we have developed an 11-color antibody staining panel that can be used with Trucount tubes (Becton Dickinson; San Jose, CA) to phenotype and enumerate the major leukocyte populations within the peripheral blood, yielding more robust cell-type specific information than assays such as a complete blood count (CBC) or assays with commercially-available panels designed for Trucount tubes that stain for only a few cell types. The staining procedure is simple, requires only 100 &mu;l of fresh whole blood, and takes approximately 45 minutes, making it feasible for standard blood-processing labs to perform. It is adapted from the BD Trucount tube technical data sheet (<a href="http://www.bdbiosciences.com/external_files/is/doc/tds/Package_Inserts_CE/live/web_enabled/23-3483-06_PI_Trucount tubes_CE_EN.pdf" target="_blank">version 8/2010</a>). The staining antibody cocktail can be prepared in advance in bulk at a central assay laboratory and shipped to the site processing labs. Stained tubes can be fixed and frozen for shipment to the central assay laboratory for multicolor flow cytometry analysis. The data generated from this staining panel can be used to track changes in leukocyte concentrations over time in relation to intervention and could easily be further developed to assess activation states of specific cell types of interest. In this report, we demonstrate the procedure used by blood-processing lab technicians to perform staining on fresh whole blood and the steps to analyze these stained samples at a central assay laboratory supporting a multicenter clinical trial. The video details the procedure as it is performed in the context of a clinical trial blood draw in the HIV Vaccine Trials Network (HVTN).

In this report, we demonstrate the staining and analysis steps of a phenotyping assay performed on fresh whole blood to enumerate major innate and adaptive leukocyte populations. We emphasize considerations for performing these procedures in the context of a multicenter clinical trial.

Aufzählung der wichtigsten peripheren Blut Leukozyten Populationen für Multicenter Clinical Trials mit einem Vollblut Phenotyping Assay

Cryopreservation of peripheral blood leukocytes is widely used to preserve cells for immune response evaluations in clinical trials and offers many ...

Dissecting Innate Immune Signaling in Viral Evasion of Cytokine Production

In response to a viral infection, the host innate immune response is activated to up-regulate gene expression and production of antiviral cytokines. Conversely, viruses have evolved intricate strategies to evade and exploit host immune signaling for survival and propagation. Viral immune evasion, entailing host defense and viral evasion, provides one of the most fascinating and dynamic interfaces to discern the host-virus interaction. These studies advance our understanding in innate immune regulation and pave our way to develop novel antiviral therapies.
Murine &#947;HV68 is a natural pathogen of murine rodents. &#947;HV68 infection of mice provides a tractable small animal model to examine the antiviral response to human KSHV and EBV of which perturbation of in vivo virus-host interactions is not applicable. Here we describe a protocol to determine the antiviral cytokine production. This protocol can be adapted to other viruses and signaling pathways.
Recently, we have discovered that &#947;HV68 hijacks MAVS and IKK&#946;, key innate immune signaling components downstream of the cytosolic RIG-I and MDA5, to abrogate NF&#922;B activation and antiviral cytokine production. Specifically, &#947;HV68 infection activates IKK&#946; and that activated IKK&#946; phosphorylates RelA to accelerate RelA degradation. As such, &#947;HV68 efficiently uncouples NF&#922;B activation from its upstream activated IKK&#946;, negating antiviral cytokine gene expression. This study elucidates an intricate strategy whereby the upstream innate immune activation is intercepted by a viral pathogen to nullify the immediate downstream transcriptional activation and evade antiviral cytokine production.

We describe a protocol to measure the antiviral cytokine production in mice infected with a model herpesvirus, murine gamma herpesvirus 68 (&#947;HV68) that is closely-related to human Kaposi&#8217;s sarcoma-associated herpesvirus (KSHV) and Epstein-Barr virus (EBV). Utilizing genetically modified mouse strains and mouse embryonic fibroblasts (MEFs), we assessed the antiviral cytokine production both in vivo and ex vivo. &#8220;Reconstituting&#8221; the expression of innate immune components in knockout embryonic fibroblasts by lentiviral transduction, we further pinpoint specific innate immune molecules and dissect the key signaling events that differentially regulate the antiviral cytokine production.

Zergliedern Angeborene Immunsystem Signaling in Viral Evasion von Zytokin-Produktion

In response to a viral infection, the host innate immune response is activated to up-regulate gene expression and production of antiviral cytokines. ...

Generation of Human Alloantigen-specific T Cells from Peripheral Blood

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide antigens presented by MHC (human ortholog HLA) molecules through the T cell receptor (TCR) in a highly sensitive and specific manner. While the primary function of T cells is to mediate protective immune responses to foreign antigens presented by self-MHC, T cells respond robustly to antigenic differences in allogeneic tissues. T cell responses to alloantigens can be described as either direct or indirect alloreactivity. In alloreactivity, the T cell responds through highly specific recognition of both the presented peptide and the MHC molecule. The robust oligoclonal response of T cells to allogeneic stimulation reflects the large number of potentially stimulatory alloantigens present in allogeneic tissues. While the breadth of alloreactive T cell responses is an important factor in initiating and mediating the pathology associated with biologically-relevant alloreactive responses such as graft versus host disease and allograft rejection, it can preclude analysis of T cell responses to allogeneic ligands. To this end, this protocol describes a method for generating alloreactive T cells from naive human peripheral blood leukocytes (PBL) that respond to known peptide-MHC (pMHC) alloantigens. The protocol applies pMHC multimer labeling, magnetic bead enrichment and flow cytometry to single cell in vitro culture methods for the generation of alloantigen-specific T cell clones. This enables studies of the biochemistry and function of T cells responding to allogeneic stimulation.

This article describes a method for the generation and propagation of human T cell clones that specifically respond to a defined alloantigen. This protocol can be adapted for cloning human T cells specific for a variety of peptide-MHC ligands.

Generation of Human Alloantigen-spezifischen T-Zellen aus peripherem Blut

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide ...

A Semi-automated Approach to Preparing Antibody Cocktails for Immunophenotypic Analysis of Human Peripheral Blood

Immunophenotyping of peripheral blood by flow cytometry determines changes in the frequency and activation status of peripheral leukocytes during disease and treatment. It has the potential to predict therapeutic efficacy and identify novel therapeutic targets. Whole blood staining utilizes unmanipulated blood, which minimizes artifacts that can occur during sample preparation. However, whole blood staining must also be done on freshly collected blood to ensure the integrity of the sample. Additionally, it is best to prepare antibody cocktails on the same day to avoid potential instability of tandem-dyes and prevent reagent interaction between brilliant violet dyes. Therefore, whole blood staining requires careful standardization to control for intra and inter-experimental variability.
Here, we report deployment of an automated liquid handler equipped with a two-dimensional (2D) barcode reader into a standard process of making antibody cocktails for flow cytometry. Antibodies were transferred into 2D barcoded tubes arranged in a 96 well format and their contents compiled in a database. The liquid handler could then locate the source antibody vials by referencing antibody names within the database. Our method eliminated tedious coordination for positioning of source antibody tubes. It provided versatility allowing the user to easily change any number of details in the antibody dispensing process such as specific antibody to use, volume, and destination by modifying the database without rewriting the scripting in the software method for each assay.
A proof of concept experiment achieved outstanding inter and intra- assay precision, demonstrated by replicate preparation of an 11-color, 17-antibody flow cytometry assay. These methodologies increased overall throughput for flow cytometry assays and facilitated daily preparation of the complex antibody cocktails required for the detailed phenotypic characterization of freshly collected anticoagulated peripheral blood.

Whole blood Immunophenotyping is indispensable for monitoring the human immune system. However, the number of reagents required and the instability of specific fluorochromes in premixed cocktails necessitates daily reagent preparation. Here we show that semi-automated preparation of staining antibody cocktail helps establish reliable immunophenotyping by minimizing variability in reagent dispensing.

Ein Semi-automatisierten Ansatz zur Vorbereitung Antikörper-Cocktails für immunphänotypische Analyse von menschlichem peripherem Blut

Immunophenotyping of peripheral blood by flow cytometry determines changes in the frequency and activation status of peripheral leukocytes during disease ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Glioma-infiltrating Peripheral Blood Mononuclear Cells

Our laboratory has recently demonstrated that natural killer (NK) cells are capable of eradicating orthotopically implanted mouse GL26 and rat CNS-1 malignant gliomas soon after intracranial engraftment if the cancer cells are rendered deficient in their expression of the &#946;-galactoside-binding lectin galectin-1 (gal-1). More recent work now shows that a population of Gr-1+/CD11b+ myeloid cells is critical to this effect. To better understand the mechanisms by which NK and myeloid cells cooperate to confer gal-1-deficient tumor rejection we have developed a comprehensive protocol for the isolation and analysis of glioma-infiltrating peripheral blood mononuclear cells (PBMC). The method is demonstrated here by comparing PBMC infiltration into the tumor microenvironment of gal-1-expressing GL26 gliomas with those rendered gal-1-deficient via shRNA knockdown. The protocol begins with a description of&#160;how to culture and prepare GL26 cells for inoculation into the syngeneic C57BL/6J mouse brain. It then explains the steps involved in the isolation and flow cytometric analysis of glioma-infiltrating PBMCs from the early brain tumor microenvironment. The method is adaptable to a number of in vivo experimental designs in which temporal data on immune infiltration into the brain is required. The method is sensitive and highly reproducible, as glioma-infiltrating PBMCs can be isolated from intracranial tumors as soon as 24 hr post-tumor engraftment with similar cell counts observed from time point matched tumors throughout independent experiments. A single experimentalist can perform the method from brain harvesting to flow cytometric analysis of glioma-infiltrating PBMCs in roughly 4-6 hr depending on the number of samples to be analyzed. Alternative glioma models and/or cell-specific detection antibodies may also be used at the experimentalists&#8217; discretion to assess the infiltration of several other immune cell types of interest without the need for alterations to the overall procedure.

Presented here is a straightforward method for the isolation and flow cytometric analysis of glioma-infiltrating peripheral blood mononuclear cells that yields time-dependent quantitative data on the number and activation status of immune cells entering the early brain tumor microenvironment.

Isolierung und Analyse über Durchflusszytometrie von Gliom-Infiltration peripheren mononukleären Blutzellen

Our laboratory has recently demonstrated that natural killer (NK) cells are capable of eradicating orthotopically implanted mouse GL26 and rat CNS-1 ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and reproducibility of this assay can be considered unstable, either because of user&#39;s errors or because of the sensitivity of NK cells to experimental manipulation. To eliminate these issues, a workflow that reduces them to a minimum was established and is presented here. To illustrate, we obtained blood samples, at various time points, from runners (n = 4) that were submitted to an intense bout of exercise. First, NK cells are simultaneously identified and isolated through CD56 tagging and magnetic-based sorting, directly from whole blood and from as little as one milliliter. The sorted NK cells are removed of any reagent or capping antibodies. They can be counted in order to establish an accurate NK cell count per milliliter of blood. Secondly, the sorted NK cells (effectors cells or E) can be mixed with 3,3&#39;-Diotadecyloxacarbocyanine Perchlorate (DiO) tagged K562 cells (target cells or T) at an assay-optimal 1:5 T:E ratio, and analyzed using an imaging flow-cytometer that allows for the visualization of each event and the elimination of any false positive or false negatives (such as doublets or effector cells). This workflow can be completed in about 4 h, and allows for very stable results even when working with human samples. When available, research teams can test several experimental interventions in human subjects, and compare measurements across several time points without compromising the data&#39;s integrity.

This work describes an advanced workflow for the accurate and fast determination of NK (Natural Killer) cell count and NK cell cytotoxicity in human blood samples.

Durchflusszytometrische Analyse von natürlichen Killerzellen lytische Aktivität in menschlichem Vollblut

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

Characterization of Human Monocyte Subsets by Whole Blood Flow Cytometry Analysis

Monocytes are key contributors in various inflammatory disorders and alterations to these cells, including their subset proportions and functions, can have pathological significance. An ideal method for examining alterations to monocytes is whole blood flow cytometry as the minimal handling of samples by this method limits artifactual cell activation. However, many different approaches are taken to gate the monocyte subsets leading to inconsistent identification of the subsets between studies. Here we demonstrate a method using whole blood flow cytometry to identify and characterize human monocyte subsets (classical, intermediate, and non-classical). We outline how to prepare the blood samples for flow cytometry, gate the subsets (ensure contaminating cells have been removed), and determine monocyte subset expression of surface markers &#8212; in this example M1 and M2 markers. This protocol can be extended to other studies that require a standard gating method for assessing monocyte subset proportions and monocyte subset expression of other functional markers.

Here we present a protocol for characterizing monocyte subsets by whole blood flow cytometry. This includes outlining how to gate the subsets and assess their expression of surface markers and giving an example of the assessment of the expression of M1 (inflammatory) and M2 markers (anti-inflammatory).

Charakterisierung der menschliche Monocyte Teilmengen von Vollblut Flow Cytometry Analysis

Monocytes are key contributors in various inflammatory disorders and alterations to these cells, including their subset proportions and functions, can ...

Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a myeloid-biased 39-antibody CyTOF panel to evaluate the hematopoietic system with a focus on the neutrophil-lineage cells by using this protocol. The CyTOF result was analyzed with an open-resource dimensional reduction algorithm, viSNE, and the data was presented to demonstrate the outcome of this protocol. We have discovered new neutrophil-lineage cell populations based on this protocol. This protocol of fresh whole BM preparation may be used for 1), CyTOF analysis to discover unidentified cell populations from whole BM, 2), investigating whole BM defects for patients with blood disorders such as leukemia, 3), assisting optimization of fluorescence-activated flow cytometry protocols that utilize fresh whole BM.

Here, we present a protocol to process fresh bone marrow (BM) isolated from mouse or human for high-dimensional mass cytometry (Cytometry by Time-Of-Flight, CyTOF) analysis of neutrophil-lineage cells.

Vorbereitung des ganzen Knochenmarks für die Mass Cytometry Analyse von Neutrophilen-Linienzellen

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a ...