FG ist durch Associazione Italiana per la Ricerca Sul Ariete (IG 2016Id.18842), Cariplo Foundation (Grant 2014-0655) und Fondazione Regionale per la Ricerca Biomedica (FRRB) unterstützt. IZ stützt sich auf NIH Grant 1R01AI121066-01A1, 1R01DK115217, HDDC P30 DK034854 Grant, Harvard Medizinische Schule Milton gefunden, EKFF Senior Research Award (412708), die Eleanor und Meilen Küste 50. Jahrestag-Fellowship-Programm, und die Cariplo Foundation ( 2014-0859).

Die Verfahren wurden alle unter den institutionellen Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) genehmigt und unter der Aufsicht des Department of Animal Resources bei Kindern betrieben's Hospital (Bogen) am Krankenhaus Boston der Kinder oder wurden von den italienischen genehmigt Ministerium für Gesundheit und unter institutionellen Animal Care Committee der Universität Mailand-Bicocca durchgeführt.
1. C. Albicans Vorbereitung
<ol><li>Kultur C. Albicans, Stamm CAF3-113, in Röhrchen mit reichen Medium (Hefe-Extrakt Pepton Traubenzucker (YEPD), 1 % (w/V) Hefeextrakt, 2 % (w/V) von Bacto Pepton, 2 % (w/V) Glukose) ergänzt mit Uridin (50 mg/L) bei 25 ° C. Unter diesen Bedingungen wächst C. Albicans als eine Hefe. Hinweis: Andere C. Albicans -Stämme können verwendet werden, wie z. B. die klinische C. Albicans Stamm SC531413isolieren. Da wir vor kurzem gezeigt haben, dass die Colitis Prozess durch die Aktivierung des angeborenen Immunsystems14, theoretisch jede C. Albicans Belastung induziert wird, die ihre Zellwand-Komponenten und Struktur beibehält sowie die Fähigkeit, stammen von bodenaggregaten Projektionen genutzt werden.</li>
	<li>Überwachen Sie die Kultur durch die zelluläre Konzentration mit einer Zelle Zähler Analyzer zählen.</li>
	<li>Ernten Sie die Kultur, wenn es eine Konzentration von etwa 8 x 106 Zellen/mL erreicht. Alternativ können Sie ein Spektralphotometer um OD600zu messen. Hinweis: In der Regel einen Wert von OD600 = 1 entspricht einer Hefe-Konzentration von 3 x 107 Zellen/mL, Titration wird jedoch empfohlen.</li>
	<li>Aufschwemmen der Kulturkreis in YEPD-Uridin Medium, mit HEPES (50 mM, pH 7,5) als ein Puffer-Agent und inkubieren Sie die Kultur bei 37 ° C, Hyphen Bildung zu induzieren. Überprüfen Sie bodenaggregaten Bildung unter dem Mikroskop bei 100 X Vergrößerung. Bodenaggregaten Formation ist sichtbar 5 h nach Kultivierung bei 37 ° C; jedoch verwenden Sie die Zellen 16 h nach der Inkubation bei 37 ° C erreicht der bodenaggregaten Anteil fast 95 % der gesamten Kultur.</li>
	<li>Um die Vorbereitung in bodenaggregaten Konzentration weiter zu bereichern, Zentrifuge Aliquote der Kultur bei 3.300 x g für 5 min. überstand verwerfen und das Pellet in sterilen PBS in einer Konzentration von 1 x 108 Hyphen/mL Aufschwemmen.</li>
</ol>2. tief dermalen Injektion
<ol><li>24 h vor der Infektion-Verfahren, die Mäuse mit einer intraperitonealen Injektion von Ketamin (80-100 mg/kg) und Xylazin (10 mg/kg) zu betäuben und dann die Flanke der Mäuse mit einer elektrischen Haarschneidemaschine rasieren. Hinweis: Nach jedem Eingriff mit Narkose, legen Sie die Mäuse unter einer Wärmelampe bis sie effizient erholt haben.</li>
	<li>Ruhen Sie die Mäuse für 24 h, eine Entzündung durch die Rasur-Prozess zu vermeiden.</li>
	<li>24 h nach dem Eingriff rasieren zu betäuben die Mäuse mit einer intraperitonealen Injektion von Ketamin (80-100 mg/kg) und Xylazin (10 mg/kg).</li>
	<li>Überprüfen Sie die Pfote Reflex um sicherzustellen, dass die Mäuse tief betäubt sind. Beurteilen Sie die Pfote Reflex fest Kneifen die Pfote. Wenn die Narkose erreicht ist, wird das Tier keine Schmerzen empfinden und bewegt sich nicht.</li>
	<li>Spritzen Sie C. Albicans hyphen in die Tiefe Derma mit einer 0,3 mL Insulin Spritze mit einer Nadel 30 x 8 mm in einem Endvolumen von 50 µL/Injektion, entspricht 5 x 106 Hyphen/Injektion.<ol>
<li>Ziehen Sie die Haut der rasierte Flanke straff mit zwei Fingern um die Lautstärke direkt in die Tiefe Derma zu injizieren. Stechen Sie die Nadel mit einem Winkel von 10-15° mit der schräge der Nadel nach oben.</li>
		<li>Mit diesem Winkel wird der Erreger mit einer Tiefe von etwa 300-500 µm injiziert werden. Um sicherzustellen, dass die Injektion gut ausgeführt wird, überprüfen Sie, dass das injizierte Volumen bildet eine Beule, die ist wenige Minuten nach der Injektion absorbiert. Hinweis: Die Beule gebildet nach die Injektion von ca. 1 cm2sein wird. Dies ist der Bereich, der zum festgelegten Zeitpunkt für Molekulare oder histologische Analyse entfernt wird.</li>
		<li>Markieren Sie für Zeitpunkte von weniger als 24 Stunden (empfohlen) den Bereich der Infektion mit einem Marker, da die Beule gebildet mit der Injektion für ein paar Minuten bleibt nach dem es absorbiert wird. Für Zeitpunkte von 24 h oder mehr ist dieser Schritt nicht erforderlich, da ein Geschwür oder eine Zyste deutlich sichtbar ist.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Probieren Sie Sammlung und Aufbereitung für histologische Färbung
<ol><li>Die Mäuse nach institutionellen Verfahren einschläfern.</li>
	<li>Chirurgische Pinzette verwenden, ziehen Sie die Haut an der Grenze des Standortes injiziert, zuvor mit dem Filzstift markiert. Mit Chirurgische Schere, Verbrauchsteuern der infizierten Webseite durch Schneiden der Haut nach der markierten Zeile. Hinweis: Achten Sie darauf, die Haut von das Bauchfell mit Rundspitze Schere zu trennen.</li>
	<li>Tauchen Sie die Haut in einer Einweg-base Form gefüllt mit optimale Arbeitstemperatur (OCT) Verbindung, mit der Innenseite der Haut nach oben. Einfrieren der Probenmaterials in flüssigem Stickstoff, bis die Masse weiß wird. Nicht lassen Sie den flüssigen Stickstoff die Probe zu decken, bevor es vollständig gefroren ist, da dies die Probe beschädigen würde. Hinweis: Vorsicht! Während Schritt 3.3 tragen Sie einen Gesichtsschutz für Schutz von flüssigem Stickstoff.</li>
	<li>Wenn die Proben nicht sofort für die Vorbereitung der Folie verwendet werden, speichern sie schnell bei-80 ° C. Hinweis: Proben können bei-80 ° C auf unbestimmte Zeit gespeichert werden.</li>
</ol>4. Vorbereitung der Folien
<ol><li>Halbieren Sie die Probe vorzubereiten die Scheiben für Histologie, ausgehend von der Mitte der Probe.</li>
	<li>Schneiden Sie mit einem Kryostat 5 µm dicke Scheiben. Hinweis: Für Hautproben, sollte die Temperatur des Kryostaten nicht höher als-25 ° c werden Eine höhere Temperatur würde dazu führen, ein partielles Schmelzen des H-OAT und daher die Proben nicht aufrechterhalten würden in der richtigen Position während der Schneidvorgang.</li>
	<li>Verwenden Sie positiv geladene Objektträger, um die Scheiben zu sammeln.</li>
	<li>Wenn die gesammelten Scheiben nicht bald nach der Zubereitung verwendet werden, bewahren Sie sie bei-20 ° C. An dieser Stelle können die Scheiben bei-20 ° C auf unbestimmte Zeit gespeichert werden.</li>
</ol>5. Hämatoxylin und Eosin Färbung
<ol><li>Färben Sie den Folien durch Eintauchen in Gills Hämatoxylin für 4 min. Waschen Folien in fließendem Leitungswasser für 5 min.</li>
	<li>Färben Sie den Folien durch Eintauchen in Eosin Y-Lösung für 1 min. Waschen Folien in fließendem Leitungswasser für 5 min. Spülen die Folien mit destilliertem Wasser, bevor Sie fortfahren des Protokolls.</li>
	<li>Trocknen Sie durch Eintauchen in seriell steigenden Konzentrationen von Ethanol-Lösungen (50 %, 70 %, 80 %, 95 %, 100 % aus). Tauchen Sie die Folien für 15 s in jeder Ethanol-Lösung.</li>
	<li>Deaktivieren Sie die Folien für mindestens 2 min durch Eintauchen in eine histologische Clearing Agent.</li>
	<li>Montieren Sie die Folien mit Eindeckmittel und Deckel rutscht.</li>
	<li>Abrufen von Bildern von Dias mit einem Diascanner Mikroskop bei 40 X Vergrößerung.</li>
</ol>6. Perjodsäure-Schiff (PAS) Färbung
<ol><li>Befestigen Sie den Folien mit ≥99.5 % Aceton bei Raumtemperatur für 1 min. Waschen Folien in fließendem Leitungswasser für 1 min.</li>
	<li>Färben Sie den Folien durch Eintauchen in Perjodsäure Lösung (1 g/dL) für 5 min. Waschen Folien in 3 Änderungen von destilliertem Wasser.</li>
	<li>Färben Sie den Folien durch Untertauchen im Schiff's Reagenz für 15 min. Waschen Folien in fließendem Leitungswasser für 5 min.</li>
	<li>Die Folien durch Eintauchen in Gills Hämatoxylin zu beflecken, für 5 min. Waschen Sie die Folien in fließendem Leitungswasser für 30 s.</li>
	<li>Entwässern Sie die Folien durch Eintauchen in 3 Änderungen von 100 % Ethanol. Tauchen Sie die Folien für 15 s jedes Mal.</li>
	<li>Deaktivieren Sie die Folien für mindestens 2 min durch Eintauchen in eine histologische Clearing Agent.</li>
	<li>Montieren Sie die Folien mit Eindeckmittel und Deckel rutscht.</li>
	<li>Abrufen von Bildern der Folien mit einem Mikroskop-Dia-Scanner.</li>
</ol>7. Probieren Sie Sammlung und Aufbereitung für die RNA-Extraktion
<ol><li>Die Mäuse nach institutionellen Verfahren einschläfern. Die Hautproben wie in Schritt 3.2 zu entfernen.</li>
	<li>Tauchen Sie die Proben in einem 2 mL Snap-Cap Röhrchen mit 1 mL Reagenz für saure Guanidinium-Thiocyanat-Phenol-Chloroform-Extraktion. Hinweis: Das Protokoll kann hier angehalten und die Proben bei-80 ° c gelagert werden</li>
	<li>Schneiden Sie die Probe in Stücke von ca. 0,2 cm2 mit chirurgischer Pinzette. Hinweis: Vorsicht! Die meisten der Reagenzien zur RNA-Isolierung sind toxisch und mutagen. 7.3 und 7.4 Schritte müssen werden unter einem Abzug durchgeführt.</li>
	<li>Die Probe mit einem Rührwerksmühle mit einer Geschwindigkeit von 20 Schwingungen/s für 20 min. Alternativ zu zerschlagen, mechanische Töpfer kann verwendet werden.</li>
	<li>Überprüfen Sie die effektive Homogenisierung der Proben durch einen Blick auf das Vorhandensein von intakten Teile der Haut. Wiederholen Sie diesen Schritt, wenn die Proben nicht vollständig homogenisiert werden.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Proben bei 16.000 x g für 1 min. halten die Überstände für RNA-Extraktion und entsorgen Sie die Tablette. Dieser Schritt wird durchgeführt, um zu beseitigen, Haare und Schmutz, die die extraktionskolonnen blockieren könnten.</li>
	<li>Gehen Sie mit RNA-Extraktion mittels RNA Reinigung Spalten14.</li>
	<li>Verwenden Sie ein Spektralphotometer, um RNA-Reinigung und Konzentration zu beurteilen. Wenn RNA Extrakte für die cDNA-Vorbereitung nicht sofort verwendet werden, speichern Sie die Proben bei-80 ° C.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Belkaid, Y., Segre, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dialogue+between+skin+microbiota+and+immunity.">Dialogue between skin microbiota and immunity.</a> Science. 346 (6212), 954-959 (2014).</li><li>Kashem, S. W., Kaplan, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+Immunity+to+Candida+albicans.">Skin Immunity to Candida albicans.</a> Trends Immunol. 37 (7), 440-450 (2016).</li><li>Havlickova, B., Czaika, V. A., Friedrich, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiological+trends+in+skin+mycoses+worldwide.">Epidemiological trends in skin mycoses worldwide.</a> Mycoses. 51, 2-15 (2008).</li><li>Wisplinghoff, H., Bischoff, T., Tallent, S. M., Seifert, H., Wenzel, R. 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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+of+Candida+infections.">Pathogenesis of Candida infections.</a> J Am Acad Dermatol. 31 (3), S2-S5 (1994).</li><li>MacCallum, D. M., Odds, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+events+in+the+intravenous+challenge+model+for+experimental+Candida+albicans+infections+in+female+mice.">Temporal events in the intravenous challenge model for experimental Candida albicans infections in female mice.</a> Mycoses. 48 (3), 151-161 (2005).</li><li>Dai, T., Kharkwal, G. B., Tanaka, M., Huang, Y. -. Y., Bil de Arce, V. J., Hamblin, M. 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Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+models+of+Candida+gastrointestinal+colonization+and+dissemination.">Murine models of Candida gastrointestinal colonization and dissemination.</a> Eukaryot Cell. 12 (11), 1416-1422 (2013).</li><li>Mear, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+albicans+Airway+Exposure+Primes+the+Lung+Innate+Immune+Response+against+Pseudomonas+aeruginosa+Infection+through+Innate+Lymphoid+Cell+Recruitment+and+Interleukin-22-Associated+Mucosal+Response.">Candida albicans Airway Exposure Primes the Lung Innate Immune Response against Pseudomonas aeruginosa Infection through Innate Lymphoid Cell Recruitment and Interleukin-22-Associated Mucosal Response.</a> Infect Immun. 82 (1), 306-315 (2014).</li><li>Leoni, G., Neumann, P. -. 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Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isogenic+strain+construction+and+gene+mapping+in+Candida+albicans.">Isogenic strain construction and gene mapping in Candida albicans.</a> Genetics. 134 (3), 717-728 (1993).</li><li>Santus, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+infections+are+eliminated+by+cooperation+of+the+fibrinolytic+and+innate+immune+systems.">Skin infections are eliminated by cooperation of the fibrinolytic and innate immune systems.</a> Sci Immunol. 2 (15), (2017).</li><li>Florescu, D. F., Brostrom, S. E., Dumitru, I., Kalil, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+albicans+Skin+Abscess+in+a+Heart+Transplant+Recipient.">Candida albicans Skin Abscess in a Heart Transplant Recipient.</a> Infect Dis Clin Pract. 18 (4), 243-246 (2010).</li><li>Pradeu, T., Cooper, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+danger+theory:+20+years+later.">The danger theory: 20 years later.</a> Front Immunol. 3, 287 (2012).</li><li>Cheng, A. G., DeDent, A. C., Schneewind, O., Missiakas, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+play+in+four+acts:+Staphylococcus+aureus+abscess+formation.">A play in four acts: Staphylococcus aureus abscess formation.</a> Trends Microbiol. 19 (5), 225-232 (2011).</li></ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Hier haben wir eine Methode von C. Albicans -Infektion des entzündlichen Prozesses zu studieren, die auf Pilz Eingang in die Tiefe Derma initiiert wird.
Obwohl Haut Abszessbildung ein relativ seltenes Ereignis bei C. Albicans Infektion15 ist, Injektion des Pilzes direkt in die Tiefe Derma ermöglicht es, nicht nur das Studium der Pilz-driven Abszessbildung, sondern auch die Analyse der spezifischen Immunantwort Zellen, die teilnehmen, um Pilz Ausbreit...

Der menschliche Körper ist mit einer extrem hohen Anzahl von Mikroorganismen bedeckt. Die Hautoberfläche ist der Lebensraum von fast 1 Million Bakterien pro Quadratzentimeter1. Diese Zahl spiegelt jedoch nicht die ganze Vielfalt der Mikroorganismen, die die Haut kolonisiert. Neben Bakterien ist der menschliche Körper kolonisiert durch viele Pilzarten, darunter C. Albicans, die in der Lage, sowohl auf die Schleimhaut und die Haut Ebene2überleben.
Der Anteil der Menschen mit der Diagnose mit Pilzinfektionen sind in den letzten Jahren enorm gestiegen. Dies ist vor allem aufgrund der höheren Anzahl von immungeschwächten Personen, d. h., HIV-positiven Patienten und Patienten, die entweder durch Chemotherapie oder Immunsuppressiva nach Transplantation3gegangen. In einer Überwachung Studie in den Vereinigten Staaten zeigten Wisplinghoff Et Al. , dass 9,5 % der Blutbahn Nosokomialinfektionen durch Candida Spezies4verursacht wurden. Durch das vermehrte Auftreten von Pilzinfektionen und vor allem wegen der erhöhten Anteil der Candida -Spezies bei Infektionen der Blutbahn gefunden wird verstehen, wie diese Erreger die Steuerung des Immunsystems entkommt extrem wichtig.
C. Albicans ist ein dimorphen Pilz, der in verschiedenen morphologischen Formen wie Hefe, Blastospores, Pseudohyphae und Hyphen abhängig von den Umgebungsbedingungen5wächst. In seiner bodenaggregaten Form C. Albicans zeigt seine höchste Kapazität der Invasivität und hat die Fähigkeit, das Epithel6durchdringen.
C. Albicans Infektionen sind mit mehreren experimentellen Ansätzen untersucht worden. Das häufigste Modell der Infektion ist die intravenöse Injektion von C. Albicans Hefe7. Jedoch wird dieses Modell nicht alle Prozesse, die passieren berücksichtigt bevor der Pilz schafft es in die Blutbahn zu verbreiten. Ein weiteres Modell nutzt die Fähigkeit von C. Albicans , das Epithel einzudringen. Diese Methode, auch bekannt als das Schleifpapier Model8, wurde von Gaspari Et Al. 19989entwickelt und besteht aus die Haut, wodurch das Stratum Corneum vor dem Auftragen von C. AlbicansSchleifen mit Schleifpapier. Dieses Verfahren ermöglicht den Pilz, das Epithel, so dass die Analyse der invasiven Fähigkeiten des Erregers zu durchdringen. Zu guter Letzt wurden andere Modelle von Infektionen für die Magen-Darm-10 und Atemwege11 in verschiedenen Studien verwendet.
Die Bildung einer Wunde (wie im Sand Papiermodell) bewirkt die Aktivierung von mehreren wegen, einschließlich Immunzelle Rekrutierung und Aktivierung, um den heilenden Prozess-12zu fördern. Dies kann entweder ändern oder maskieren der Immunantwort, die speziell gegen den Erreger, wodurch verwirrende Ergebnisse ausgelöst.
Hier beschreiben wir eine Methode der Infektion der Haut, die ursprüngliche Wunde Bildung vermeidet und die Induktion einer basalen entzündlichen Umgebung. Um die intakte epitheliale Struktur beizubehalten, injizieren wir direkt C. Albicans in seiner bodenaggregaten Form in die Tiefe Derma. Obwohl eine einzelne Injektion leichte Entzündung hervorrufen kann, ist die Menge der Entzündung begrenzt und eingeschränkt im Vergleich zur Bildung einer offenen Wunde wie Schleifpapier-Modell. Der Ansatz, den wir hier beschreiben ermöglicht die Untersuchung der Immunantwort auf Pilzinfektion und Ausbreitung die übermäßige und bereits vorhandene entzündliche Umwelt durch mechanische Beschädigungen zu vermeiden.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECB4053L</td>
			<td>warm in 37 &#176;C bath before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H-OCT compound</td>
			<td>histo-line laboratories</td>
			<td>R0030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gill&#39;s Hematoxilyn</td>
			<td>histo-line laboratories</td>
			<td>09-178-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin Y solution, alcoholic</td>
			<td>histo-line laboratories</td>
			<td>09-209-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol absolute</td>
			<td>scharlau</td>
			<td>ET00232500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citro-HISTOCLEAR</td>
			<td>histo-line laboratories</td>
			<td>R0050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eukitt, mounting medium</td>
			<td>bio-optica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>sigma-aldrich</td>
			<td>179124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAS staining system</td>
			<td>sigma-aldrich</td>
			<td>395B-1KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Peptone</td>
			<td>BD</td>
			<td>211677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Yeast Extract</td>
			<td>BD</td>
			<td>212750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D(+)-Glucose anhydrous for molecular biology</td>
			<td>Applichem PanReac</td>
			<td>50-99-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uridine</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>8451</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Applichem PanReac</td>
			<td>A1070,0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe-Lock tubes 2 mL</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>30121597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol Reagent</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15596018</td>
			<td>Toxic, corrosive and mutagen. Use all precaution needed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rneasy Mini Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>74104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>liquid nitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Wear eye protection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instrument</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coulter Counter-Particle Count</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5415 R</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MC 3000 Microtome Cryostat</td>
			<td>histo-line laboratories</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TissueLiser</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.3 ml Insulin Syringe with a 30G x 8mm needle&#160;</td>
			<td>BD</td>
			<td>324826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Base mould disposable</td>
			<td>histo-line laboratories</td>
			<td>2781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Positively charged bio microscope slides</td>
			<td>bio-optica</td>
			<td>09-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover slips 24 x 50 mm</td>
			<td>thermo scientific</td>
			<td>11911998</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

deep dermal injection as a model of candida albicans skin infection for histological analyses

Die Haut ist ein extrem erweiterten Organ des Körpers, und durch diese große Oberfläche ist es kontinuierlich Mikroorganismen ausgesetzt. Hautschäden kann leicht zu Infektionen in der Dermis führen, was wiederum bei der Verbreitung von Krankheitserregern in die Blutbahn führen kann. Verstehen, wie das Immunsystem bekämpft Infektionen im sehr frühen Stadium und wie der Host die Erreger beseitigen kann, ist ein wichtiger Schritt um die Basis für zukünftige therapeutische Interventionen gesetzt. Hier beschreiben wir ein Modell der Candida Albicans -Infektion, die die Prozesse zu, die früh während einer Infektion visualisieren, auch wenn der Erreger ist die epitheliale Barriere sowie die Immunantwort ausgelöst durch die C. Albicans vergangen auftreten Invasion. Diese Infektionsmodell verwendet, histologische Analysen durchzuführen, die die Immunzellen zu zeigen, die die Haut sowie die Präsenz und die Lokalisation des Erregers zu infiltrieren. Proben gesammelt, nachdem die Infektion für die RNA-Extraktion verarbeitet werden kann.

Durch die Injektion des Krankheitserregers direkt in die Tiefe Derma bleibt die strukturelle Morphologie des Gewebes intakt (Abbildung 1A).
Die Aufrechterhaltung der strukturellen Integrität der Haut ermöglicht die Erkennung von Immunzellen und ihre Lokalisation am Ort der Infektion. Die höhere Vergrößerung dargestellt in Abbildung 1 b zeigt, dass der Abszess ist v...

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Deep Dermal Injection As a Model of Candida albicans Skin Infection for Histological Analyses

Tief dermalen Injektion als ein Modell von Candida Albicans Infektion der Haut für histologische Analysen

Hier beschreiben wir ein Protokoll, histologische und molekulare Analyse von Hautproben nach Candida Albicans intradermale Injektion ermöglicht. Dieses Protokoll hält die strukturelle Integrität der Haut und erlaubt die Lokalisierung von Gewebe-Resident oder neu rekrutierten Immunzellen sowie die Verteilung der Erreger.

The skin is an extremely extended organ of the body and, due to this large surface, it is continuously exposed to microorganisms. Skin damage can easily ...

deep-dermal-injection-as-model-candida-albicans-skin-infection-for

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Deep Dermal Injection As a Model of Candida albicans Skin Infection for Histological Analyses

10.6K Aufrufe.  University of Milano-Bicocca. Hier beschreiben wir ein Protokoll, histologische und molekulare Analyse von Hautproben nach Candida Albicans intradermale Injektion ermöglicht. Dieses Protokoll hält die strukturelle Integrität der Haut und erlaubt die Lokalisierung von Gewebe-Resident oder neu rekrutierten Immunzellen sowie die Verteilung der Erreger.

Serie: Deep Dermal Injection As a Model of Candida albicans Skin Infection for Histological Analyses

A 96 Well Microtiter Plate-based Method for Monitoring Formation and Antifungal Susceptibility Testing of Candida albicans Biofilms

Candida albicans remains the most frequent cause of fungal infections in an expanding population of compromised patients and candidiasis is now the third most common infection in US hospitals. Different manifestations of candidiasis are associated with biofilm formation, both on host tissues and/or medical devices (i.e. catheters). Biofilm formation carries negative clinical implications, as cells within the biofilms are protected from host immune responses and from the action of antifungals. We have developed a simple, fast and robust in vitro model for the formation of C. albicans biofilms using 96 well microtiter-plates, which can also be used for biofilm antifungal susceptibility testing. The readout of this assay is colorimetric, based on the reduction of XTT (a tetrazolium salt) by metabolically active fungal biofilm cells. A typical experiment takes approximately 24 h for biofilm formation, with an additional 24 h for antifungal susceptibility testing. Because of its simplicity and the use of commonly available laboratory materials and equipment, this technique democratizes biofilm research and represents an important step towards the standardization of antifungal susceptibility testing of fungal biofilms.

A 96 Well Microtiter Plate-based Method for Monitoring Formation and Antifungal Susceptibility Testing of Candida albicans Biofilms

We describe a simple, rapid and robust method for the formation of Candida albicans biofilms using 96 well microtiter plates and its utility in antifungal susceptibility testing of cells within biofilms.

Ein 96-well Mikrotiterplatte-basierten Methode zur Überwachung der Formation und antimykotische Empfindlichkeitsprüfung von Candida albicans Biofilme

Candida albicans remains the most frequent cause of fungal infections in an expanding population of compromised patients and candidiasis is now the third ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the initial and determining step of the pathogenesis. Although experimentally adhesion is mostly studied in static conditions adhesion actually takes place in the presence of flowing liquid. First encounters between bacteria and their host often occur at the mucosal level, mouth, lung, gut, eye, etc. where mucus flows along the surface of epithelial cells. Later in infection, pathogens occasionally access the blood circulation causing life-threatening illnesses such as septicemia, sepsis and meningitis. A defining feature of these infections is the ability of these pathogens to interact with endothelial cells in presence of circulating blood. The presence of flowing liquid, mucus or blood for instance, determines adhesion because it generates a mechanical force on the pathogen. To characterize the effect of flowing liquid one usually refers to the notion of shear stress, which is the tangential force exerted per unit area by a fluid moving near a stationary wall, expressed in dynes/cm2. Intensities of shear stress vary widely according to the different vessels type, size, organ, location etc. (0-100 dynes/cm2). Circulation in capillaries can reach very low shear stress values and even temporarily stop during periods ranging between a few seconds to several minutes 1. On the other end of the spectrum shear stress in arterioles can reach 100 dynes/cm2 2. The impact of shear stress on different biological processes has been clearly demonstrated as for instance during the interaction of leukocytes with the endothelium 3. To take into account this mechanical parameter in the process of bacterial adhesion we took advantage of an experimental procedure based on the use of a disposable flow chamber 4. Host cells are grown in the flow chamber and fluorescent bacteria are introduced in the flow controlled by a syringe pump. We initially focused our investigations on the bacterial pathogen Neisseria meningitidis, a Gram-negative bacterium responsible for septicemia and meningitis. The procedure described here allowed us to study the impact of shear stress on the ability of the bacteria to: adhere to cells 1, to proliferate on the cell surface 5and to detach to colonize new sites 6 (Figure 1). Complementary technical information can be found in reference 7. Shear stress values presented here were chosen based on our previous experience1 and to represent values found in the literature. The protocol should be applicable to a wide range of pathogens with specific adjustments depending on the objectives of the study.

During the infection process, a key step is the adhesion of pathogens with host cells. In most instances this adhesion step occurs in the presence of mechanical stress generated by flowing liquid. We describe a technique that introduces shear stress as an important parameter in the study of bacterial adhesion.

Introducing Schubspannung in der Studie der bakteriellen Adhäsion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection

Legionella pneumophila, the causative agent of a severe pneumonia named Legionnaires&#39; disease, is an important human pathogen that infects and replicates within alveolar macrophages. Its virulence depends on the Dot/Icm type IV secretion system (T4SS), which is essential to establish a replication permissive vacuole known as the Legionella containing vacuole (LCV). L. pneumophila infection can be modeled in mice however most mouse strains are not permissive, leading to the search for novel infection models. We have recently shown that the larvae of the wax moth Galleria mellonella are suitable for investigation of L. pneumophila infection. G. mellonella is increasingly used as an infection model for human pathogens and a good correlation exists between virulence of several bacterial species in the insect and in mammalian models. A key component of the larvae&#39;s immune defenses are hemocytes, professional phagocytes, which take up and destroy invaders. L. pneumophila is able to infect, form a LCV and replicate within these cells. Here we demonstrate protocols for analyzing L. pneumophila virulence in the G. mellonella model, including how to grow infectious L. pneumophila, pretreat the larvae with inhibitors, infect the larvae and how to extract infected cells for quantification and immunofluorescence microscopy. We also describe how to quantify bacterial replication and fitness in competition assays. These approaches allow for the rapid screening of mutants to determine factors important in L. pneumophila virulence, describing a new tool to aid our understanding of this complex pathogen.

Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection

The larva of the wax moth Galleria mellonella was recently established as an in vivo model to study Legionella pneumophila infection. Here, we demonstrate fundamental techniques to characterize the pathogenesis of Legionella in the larvae, including inoculation, measurement of bacterial virulence and replication as well as extraction and analysis of infected hemocytes.

Die Verwendung von<em&gt; Galleria mellon</em&gt; Als Modellorganismus zum Studium<em&gt; Legionella pneumophila</em&gt; Infektion

Legionella pneumophila, the causative agent of a severe pneumonia named Legionnaires&#39; disease, is an important human pathogen that infects and ...

Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

Studying host-pathogen interaction enables us to understand the underlying mechanisms of the pathogenicity during microbial infection. The prognosis of the host depends on the involvement of an adapted immune response against the pathogen1. Immune response is complex and results from interaction of the pathogens and several immune or non-immune cellular types2. In vitro studies cannot characterise these interactions and focus on cell-pathogen interactions. Moreover, in the airway3, particularly in patients with suppurative chronic lung disease or in mechanically ventilated patients, polymicrobial communities are present and complicate host-pathogen interaction. Pseudomonas aeruginosa and Candida albicans are both problem pathogens4, frequently isolated from tracheobronchial samples, and associated to severe infections, especially in intensive care unit5. Microbial interactions have been reported between these pathogens in vitro but the clinical impact of these interactions remains unclear6. To study the interactions between C. albicans and P. aeruginosa, a murine model of C. albicans airways colonization, followed by a P. aeruginosa-mediated acute lung infection was performed.

Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

While in vitro study of host-pathogen interactions allow the characterization of specific immune responses, in vivo models are required to observe the effects of complex responses. Using Candida albicans exposure followed by Pseudomonas aeruginosa-mediated lung infection, we established a murine model of microbial interactions involved in ventilator-associated pneumonia pathogenicity.

Studieren Mikrobielle Gemeinschaften<em&gt; In-vivo-</em&gt;: Ein Modell von Host-vermittelte Interaktion zwischen<em&gt; Candida albicans</em&gt; Und<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; In den Atemwegen

Studying host-pathogen interaction enables us to understand the underlying mechanisms of the pathogenicity during microbial infection. The prognosis of ...

Stenosis of the Inferior Vena Cava: A Murine Model of Deep Vein Thrombosis

Deep vein thrombosis (DVT) and its devastating complication, pulmonary embolism, are a severe health problem with high mortality. Mechanisms of thrombus formation in veins remain obscure. Lack of mobility (e.g., after surgery or long-haul flights) is one of the main factors leading to DVT. The pathophysiological consequence of the lack of mobility is blood flow stagnation in venous valves. Here, a model is described that mimics such flow disturbance as a thrombosis-driving factor. In this model, partial flow restriction (stenosis) in the inferior vena cava (IVC) is created. Closure of about 90% of the IVC lumen for 48 h results in development of thrombi structurally similar to those in humans. The similarities are: i) most of the thrombus volume is red, i.e., consists of red blood cells and fibrin, ii) presence of a white part (lines of Zahn), iii) non-denuded endothelial monolayer, iv) elevated plasma D-Dimer levels, and v) possibility to prevent thrombosis by low molecular weight heparin. Limitations include variable size of thrombi and the fact that a certain percentage of wild-type mice (0 - 35%) may not produce a thrombus. In addition to visual observation and measurement, thrombi may be visualized by non-invasive technologies, such as ultrasonography, which allows for monitoring the dynamics of thrombus development. At shorter time points (1 - 6 h), intravital microscopy may be applied to directly observe events (e.g., recruitment of cells to the vessel wall) preceding thrombus formation. Use of this method by several teams around the world has made it possible to uncover basic mechanisms of DVT initiation and identify potential targets that might be beneficial for its prevention.

We describe here stenosis in the inferior vena cava as a murine model of deep vein thrombosis. This model recapitulates blood flow restriction, one of the major triggers of venous thrombosis in humans.

Stenose der minderwertigen Vena Cava: ein Mausmodell der tiefen Venenthrombose

Deep vein thrombosis (DVT) and its devastating complication, pulmonary embolism, are a severe health problem with high mortality. Mechanisms of thrombus ...

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

Candida albicans is the most common fungal pathogen of humans, causing about 15% of hospital-acquired sepsis cases. A major virulence attribute of C. albicans is its ability to form biofilms, structured communities of cells attached to biotic and abiotic surfaces. C. albicans biofilms can form on host tissues, such as mucosal layers, and on medical devices, such as catheters, pacemakers, dentures, and joint prostheses. Biofilms pose significant clinical challenges because they are highly resistant to physical and chemical perturbations, and can act as reservoirs to seed disseminated infections. Various in vitro assays have been utilized to study C. albicans biofilm formation, such as microtiter plate assays, dry weight measurements, cell viability assays, and confocal scanning laser microscopy. All of these assays are single end-point assays, where biofilm formation is assessed at a specific time point. Here, we describe a protocol to study biofilm formation in real-time using an automated microfluidic device under laminar flow conditions. This method allows for the observation of biofilm formation as the biofilm develops over time, using customizable conditions that mimic those of the host, such as those encountered in vascular catheters. This protocol can be used to assess the biofilm defects of genetic mutants as well as the inhibitory effects of antimicrobial agents on biofilm development in real-time.

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

This protocol describes the use of a customizable automated microfluidic device to visualize biofilm formation in Candida albicans under host physiological conditions.

Visualisierung der Biofilmbildung in Candida Albicans ein automatisiertes mikrofluidischen Gerät

Candida albicans is the most common fungal pathogen of humans, causing about 15% of hospital-acquired sepsis cases. A major virulence attribute of C. ...

Using Robotic Systems to Process and Embed Colonic Murine Samples for Histological Analyses

The understanding of human diseases has been greatly expanded thanks to the study of animal models. Nonetheless, histopathological evaluation of experimental models needs to be as rigorous as that applied for human samples. Indeed, drawing reliable and accurate conclusions is critically influenced by the quality of tissue section preparation. Here, we describe a protocol for histopathological analysis of murine tissues that implements several automated steps during the procedure, from the initial preparation to the paraffin embedding of the murine samples. The reduction of methodological variables through rigorous protocol standardization from automated procedures contributes to increased overall reliability of murine pathological analysis. Specifically, this protocol describes the utilization of automated processing and embedding robotic systems, routinely used for the tissue processing and paraffin embedding of human samples, to process murine specimens of intestinal inflammation. We conclude that the reliability of histopathological examination of murine tissues is significantly increased upon introduction of standardized and automated techniques.

Lack of standardization for murine tissue processing reduces the quality of murine histopathological analysis as compared to human specimens. Here, we present a protocol to perform histopathological examination of murine inflamed and uninflamed colonic tissues to show the feasibility of robotic systems routinely used for processing and embedding&#160;human samples.

Verwendung von Robotersystemen zu verarbeiten und Embed-Kolon Murine Proben für histologische Analysen

The understanding of human diseases has been greatly expanded thanks to the study of animal models. Nonetheless, histopathological evaluation of ...

Daily Phototherapy with Red Light to Regulate Candida albicans Biofilm Growth

Here, we present a protocol to assess the outcomes of per diem red light treatment on the growth of Candida albicans biofilm. To increase the planktonic growth of C. albicans SN425, the inoculums grew on Yeast Nitrogen Base media. For biofilm formation, RPMI 1640 media, which have high concentrations of amino acids, were applied to help biofilm growth. Biofilms of 48 h were treated twice a day for a period of 1 min with a non-coherent light device (red light; wavelength = 635 nm; energy density = 87.6 J&#183;cm-2). As a positive control (PC), 0.12% chlorhexidine (CHX) was applied, and as a negative control (NC), 0.89% NaCl was applied to the biofilms. Colony forming units (CFU), dry-weight, soluble and insoluble exopolysaccharides were quantified after treatments. Briefly, the protocol presented here is simple, reproducible and provides answers regarding viability, dry-weight and extracellular polysaccharide amounts after red light treatment.

Daily Phototherapy with Red Light to Regulate Candida albicans Biofilm Growth

Here, we present a protocol to assess the outcome of red light application on the growth of Candida albicans biofilm. A non-coherent red light device with the wavelength of 635 nm and energy density of 87.6 J&#183;cm-2 was applied throughout the growth of Candida albicans biofilms for 48 h.

Tägliche Phototherapie mit rotem Licht zu regulieren Candida Albicans Biofilm Wachstum

Here, we present a protocol to assess the outcomes of per diem red light treatment on the growth of Candida albicans biofilm. To increase the planktonic ...

Visualization of Candida albicans in the Murine Gastrointestinal Tract Using Fluorescent In Situ Hybridization

Candida albicans is a fungal component of the gut microbiota in humans and many other mammals. Although C. albicans does not cause symptoms in most colonized hosts, the commensal reservoir does serve as a repository for infectious disease, and the presence of high fungal titers in the gut is associated with inflammatory bowel disease. Here, we describe a method to visualize C. albicans cell morphology and localization in a mouse model of stable gastrointestinal colonization. Colonization is established using a single dose of C. albicans in animals that have been treated with oral antibiotics. Segments of gut tissue are fixed in a manner that preserves the architecture of luminal contents (microorganisms and mucus) as well as the host mucosa. Finally, fluorescent in situ hybridization is performed using probes against fungal rRNA to stain for C. albicans and hyphae. A key advantage of this protocol is that it allows for simultaneous observation of C. albicans cell morphology and its spatial association with host structures during gastrointestinal colonization.

Visualization of Candida albicans in the Murine Gastrointestinal Tract Using Fluorescent In Situ Hybridization

The purpose of this protocol is to visualize Candida albicans cell shape and localization in the mammalian gastrointestinal tract.

Visualisierung von Candida albicans im Murine Gastrointestinal Tract mit fluoreszierender In-Situ-Hybridisierung

Candida albicans is a fungal component of the gut microbiota in humans and many other mammals. Although C. albicans does not cause symptoms in most ...

Clarifying and Imaging Candida albicans Biofilms

The microbial fungus Candida albicans can undergo a change from commensal colonization to virulence that is strongly correlated with its ability to switch from yeast-form growth to hyphal growth. Cells initiating this process become adherent to surfaces as well as to each other, with the resulting development of a biofilm colony. This commonly occurs not only on mucosal tissue surfaces in yeast infections, but also on medical implants such as catheters. It is well known that biofilm cells are resistant to antifungal drugs, and that cells that shed from the biofilm can lead to dangerous systemic infections. Biofilms range from heavily translucent to opaque due to refractive heterogeneity. Therefore, fungal biofilms are difficult to study by optical microscopy. To visualize internal structural, cellular, and subcellular features, we clarify fixed intact biofilms by stepwise solvent exchange to a point of optimal refractive index matching. For C. albicans biofilms, sufficient clarification is attained with methyl salicylate (n = 1.537) to enable confocal microscopy from apex to base in 600 &#181;m biofilms with little attenuation. In this visualization protocol we outline phase contrast refractometry, the growth of laboratory biofilms, fixation, staining, solvent exchange, the setup for confocal fluorescence microscopy, and representative results.

Clarifying and Imaging Candida albicans Biofilms

To view and quantify the internal features of Candida albicans biofilms, we prepare fixed intact specimens that are clarified by refractive index matching. Then, optical sectioning microscopy can be used to obtain three-dimensional image data though the full thickness of the biofilm.

Klärende und Bildgebung Candida albicans Biofilme

The microbial fungus Candida albicans can undergo a change from commensal colonization to virulence that is strongly correlated with its ability to switch ...