Alle Mikroskopie erfolgte in der W. M. Keck Mikroskopie Mitte mit Unterstützung von Nathaniel Peters und mit Unterstützung des NIH Award S10OD016240. S.L.F. wird von NIH K08AI119142 und R21AI130281 unterstützt. Wir danken Dr. Richard Flavell und Dr. Brad Cookson Caspase-1/11 mangelhaft Mäuse und Dr. Brad Cookson für den Austausch von Laboreinrichtungen und Geräte.

Alle tierische Verfahren geprüft und bei der Universität von Washington institutionelle Animal Care und Use Committee Richtlinien durchgeführt.
(1) die Ernte des Knochenmarks
<ol><li>Aseptisch Femur und Tibia aus einer Maus herausnehmen und Reinigen der Knochen mit sterilen Instrumenten. Legen Sie die gereinigten Knochen in Dulbecco geändert Eagle Medium (DMEM) + 5 mM HEPES + 0,2 mg/mL L-Glutamin + 0,05 mM 2-Mercaptoethanol + 50 mg/mL Gentamicin Sulfat + 10.000 U/mL Penicillin/Streptomycin + 10 % fetalen bovine Serum (FBS, DMEM-10 komplette) und inkubieren Sie die Rohr für 15 min auf Eis.</li>
	<li>Entfernen Sie die proximalen und distalen Kugelgelenke mit einer Schere. Nadel 25 G an eine 10 mL Spritze gefüllt mit Medium in den Hohlraum der Knochen befestigt. Spülen Sie das Knochenmark mit DMEM-10 abgeschlossen. Aufzuwirbeln Sie jeder Klumpen durch das Medium sanft auf und ab pipettieren.</li>
	<li>Die Zellen für 10 min bei 300 X g zentrifugieren und die Anzahl der Zellen unter Verwendung einer Hemocytometer. An dieser Stelle entweder Einfrieren der Zellen mit 90 % FBS + 10 % Dimethyl Sulfoxid (DMSO) oder Platte Zellen in einem 15 cm Petrischale Makrophagen mit L929 konditioniert Medium (Schritt 2.1) zu unterscheiden.</li>
</ol>(2) Differenzierung von Makrophagen Knochenmark abgeleitet
<ol><li>Verwenden vorgewärmte Differenzierung Medium (21 mL DMEM-10 abgeschlossen und L929 Zellen bedingt Medium wie von Swanson Et Al. beschrieben 9 mL ( 18), habe Knochenmarkzellen in einem 15 cm nicht Gewebekultur Petrischale (1,2-1,5 x 107 Zellen) behandelt. 7 Tage inkubieren Sie die Platte bei 37 ° C und 5 % CO2 . Fügen Sie eine zusätzliche 30 mL Differenzierung Medium auf den Teller am Tag 3 oder 4. Hinweis: Es ist wichtig nicht zu Gewebekultur behandelt Platten verwenden wie Makrophagen schwierig werden zu lösen und zu ernten.</li>
	<li>Makrophagen zu sammeln, waschen Sie die Platte mit Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) und 20 mL kaltem PBS + 1 mM Ethylenediaminetetraacetic Säure (EDTA). Brüten Sie der Platte bei 4 ° C für 10 min. Ernte der Zellen durch pipettieren der PBS + EDTA über die Zellen und waschen Sie die Platte mit 10 mL PBS. Kombinieren Sie beide Waschgänge in zwei 15 mL konische Röhrchen.</li>
	<li>Die Zellen bei 300 X g für 10 min zentrifugieren und Aufschwemmen der Zellen in 10 mL von Phenol-rot frei DMEM + 5 mM HEPES + 0,2 mg/mL L-Glutamin + 0,05 mM 2-Mercaptoethanol + 5 % FBS (DMEM-5) und die Zellen, die entweder ein Hemocytometer oder ein Coulter Counter zählen. Halten Sie die Zellen auf dem Eis während der Auszählung.</li>
	<li>Samen der Makrophagen in Gewebekultur beschichtete Platten 2 x 105 Zellen/ml. Samen Sie für Mikroskopie-Experimente 1 mL der Zellen auf Deckgläsern in 24-well-Platten. Samen Sie für LDH Release Assays 100 µL der Zellen in einer 96-well-Platte. Samen Sie für die LDH-Assay 9 Brunnen (3 Brunnen unbehandelt, 3 Brunnen mit 100 % Lyse Kontrollen und 3 Brunnen für den experimentellen Stimulus).</li>
	<li>Zentrifugieren der 96-well-Platte für 5 min bei 300 X g, stellen Sie sicher, dass die Zellen gleichmäßig über die gut verteilt sind.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Platte über Nacht bei 37 ° C + 5 % CO2 vor der Grundierung beginnen.</li>
</ol>3. grundieren
<ol><li>Ersetzen Sie das Medium mit frischem Medium (DMEM-5) mit 100 ng/mL LPS (500 μL für die 24 gut Platte oder 50 μL für die 96 gut Platte). Hinweis: Es gibt eine Vielzahl von strukturellen Variationen in LPS, die Einfluss auf die Fähigkeit, TLR4-vermittelten Priming19zu stimulieren. LPS von Salmonella Minnesota R595 (Re) ist von mehreren Herstellern erhältlich und wird empfohlen.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Platte für 3 h bei 37 ° C und 5 % CO2.</li>
</ol>(4) Aktivierung des NLRP3-Inflammasome mit Nigericin und Etikettierung mit FAM-YVAD-FMK
<ol><li>Entfernen Sie das Medium zu und ersetzen Sie es mit 290 μL DMEM-5, 5 μM Nigericin und 5 mM Glycin enthält. Glycin wird hinzugefügt, um die Reduzierung der Lyse der Zelle bei der Aktivierung von Caspase-15. 60 min bei 37 ° C und 5 % CO2inkubieren. Verwenden Sie Wildtyp und Caspase-1 mangelhafte Makrophagen, um sicherzustellen, dass die beobachteten Beschriftung spezifisch für Caspase-1 ist.</li>
	<li>Während die letzten 45 min hinzufügen 10 μL 30 x FAM-YVAD-FMK, zubereitet nach den Anweisungen des Herstellers.</li>
	<li>Entfernen Sie nach 60 min das Medium und waschen Sie die Zellen dreimal für jeweils 5 min. mit 1 mL kaltem PBS.</li>
	<li>Fügen Sie 250 μL von 2 % Paraformaldehyd in jede Vertiefung und auf Eis bedeckt mit Alu-Folie für 30 min inkubieren.</li>
	<li>Fügen Sie während der letzten 5 min 4 μl 0,2 mM dunkelrote fluoreszierende Nukleinsäure Fleck um die Kerne zu beschriften. 4', 6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) oder andere Farbstoffe können auch Label DNA verwendet werden.</li>
	<li>Die Zellen dreimal mit 1 mL kaltem PBS waschen und Deckgläsern auf Objektträger mit 7 μl Anti-Fade Eindeckmittel zu montieren. Lassen Sie die Montage Medium über Nacht vor dem Versiegeln das Deckglas auf den Objektträger mit Nagellack Härten.</li>
	<li>Bild der Makrophagen durch konfokale Mikroskopie. Ex / Em für FAM-YVAD-FMK ist 492/520nm und 642/661 für dunkelrote fluoreszierende Nukleinsäure-Fleck. Achten Sie darauf, das Mikroskop einrichten, so dass unbehandelte Zellen nicht jeden beliebigen Hintergrund Färbung in den 488 Kanal angezeigt werden. Andernfalls wird die Hintergrundfärbung FAM-YVAD-FMK erkannt und nicht die tatsächliche aktive Caspase-1 sein. Hinweis: Mikroskop-Set-up ist in Abschnitt 6 beschrieben.</li>
</ol>5. Antikörper Färbung
Hinweis: Um die Zellen mit Antikörpern gegen ASC erkennen zu beschriften, Saatgut, prime und setzen Sie die Zellen, die Nigericin identisch mit dem vorherigen Abschnitt. Die Verarbeitung ist danach wie folgt:
<ol><li>Waschen Sie die Zellen dreimal für jeweils 5 min. mit 1 mL kaltem PBS. Fügen Sie 250 μL der Fixierung und Permeabilisierung Lösung. Brüten die Zellen auf Eis, und für 30 min abgedeckt.</li>
	<li>Waschen Sie die Makrophagen dreimal für jeweils 5 min. mit 1 mL der Waschpuffer.</li>
	<li>Fügen Sie 250 μl Primärantikörper gegen ASC 1: 500 in Waschpuffer verdünnt und 1 h auf dem Eis inkubieren. Gehören Sie ein deckgläschen, der erhält keiner primären Antikörper, sondern erhält nur die sekundäre. Das Deckglas wird während des Setups Mikroskop verwendet werden, um den richtigen Abstand vom Koordinatenursprung.</li>
	<li>Waschen Sie die Zellen dreimal für jeweils 5 min. mit 1 mL Waschpuffer.</li>
	<li>Fügen Sie 250 μL der Sekundärantikörper (Fluoreszenzfarbstoff konjugierten Ziege-Anti-Maus) 1: 500 in Waschpuffer verdünnt und 1 h auf dem Eis inkubieren. Label-Kerne 4 μl 0,2 mM dunkelrote fluoreszierende Nukleinsäure Fleck für die letzten 5 min diese Inkubation hinzufügen.</li>
	<li>Waschen Sie die Zellen 3 X mit 1 mL kalte Waschpuffer und Mount Deckgläsern auf Mikroskop Folien mit 7 μl Anti-Fade Eindeckmedium. Lassen Sie die Montage Medium über Nacht vor dem Versiegeln das Deckglas auf den Objektträger mit klaren Nagellack Härten.</li>
	<li>Bild Makrophagen konfokalen Mikroskopie. Ex / Em für den sekundären Antikörper ist 555/580 nm und 642/661 für dunkelrote fluoreszierende Nukleinsäure Fleck (wie unten beschrieben). Hinweis: Mit FAM-YVAD-FMK und Antikörper Beschriftung Beschriftung kann kombiniert werden um Co Lokalisierung von aktive Caspase-1 und ASC zeigen. Hierzu folgen Sie die Bedingungen für die FAM-YVAD-FMK Kennzeichnung und wechseln Sie dann in der Antikörper labeling Protokoll zur weiteren Verarbeitung.</li>
</ol>6. Bildgebung von beschrifteten Makrophagen durch konfokale Mikroskopie
Hinweis: Die gefärbten Zellen können nach der Deckgläsern erlaubt haben, über Nacht zu heilen und wurde auf dem Objektträger mit Nagellack versiegelt angesehen werden. Hier ist die Bildgebung mit einem konfokalen Mikroskop beschrieben. Zellen können auch durch standard Fluoreszenzmikroskopie beobachtet werden.
<ol><li>Legen Sie die Folie mit den unbehandelten Zellen auf den Mikroskoptisch und konzentrieren Sie das Mikroskop auf die Zellen zu.</li>
	<li>Das Mikroskop Look Up Table (LUT) einstellen Einstellungen, Versatz, so dass es keine positiven FAM-YVAD-FMK Färbung in den unbehandelten Zellen. Dieser Vorgang kann auch mit mangelhaft Makrophagen Caspase-1 durchgeführt werden. Hinweis: Der Offset hat für jeden Kanal in das Experiment verwendet angepasst werden, aber einstellen den korrekten Offset ist kritischste für die FAM-YVAD-FMK Kanal und fluoreszierende Antikörper Kanäle. Der Offset für die DNA-Kanal ist weniger kritisch. Sobald der Offset festgelegt wurde, stellen Sie diese Einstellung für den Rest des Experiments nicht.</li>
	<li>Wechseln Sie die Folie zum Beispiel Nigericin behandelt. Finden Sie ein Feld, beide Zellen, die positiv und negativ enthält für die FAM-YVAD-FMK Färbung sind. Passen Sie die Abbildungsebene des FAM-YVAD-FMK Kanals auf das Flugzeug, das die höchste Intensität der positive Färbung hat. Normalerweise werden dies im Flugzeug, wo das Zentrum des Inflammasome Fokus abgebildet ist.</li>
	<li>Passen Sie die Verstärkung so dass Brennpunkte in den Zellen sichtbar sind, die verdichteten Kerne haben. Lassen Sie nach der Einstellung von Gain und Offset diese Einstellungen für den Rest der bildgebenden Sitzung. Hinweis: Eine einfache Möglichkeit, festzustellen, ob eine Zelle Pyroptotic ist durch das nukleare Morphologie betrachten. Zellen mit aktiven Caspase-1 haben abgerundete und verdichteten Kerne, während nukleolen in Zellen ohne Aktivierung der Caspase-1 und die nukleare Morphologie sichtbar sind ist ähnlich denen von unbehandelten Zellen.</li>
	<li>Sammeln Sie Bilder von 5 zufällig ausgewählten Felder bei 100 X Gesamtvergrößerung. Dies führt normalerweise ca. 40 Zellen pro Bild. Wiederholen Sie diesen Vorgang für jede Probe.</li>
	<li>Die Anzahl der Zellen in jedem Bild mit Bildanalyse-Software. Dann die Anzahl der Zellen, die positive FAM-YVAD-FMK Färbung haben. Vertreten Sie die Aktivierung der Caspase-1 als der Anteil der FAM-YVAD-FMK positive Zellen.</li>
</ol>(7) LDH-Release-Assay
Hinweis: Für die LDH-Release-Assay verwenden Saatgut und Prime, was die Zellen wie im vorherigen Abschnitt beschrieben, außer einer 96-well-Platte. Entfernen Sie das Medium nicht nach dem grundieren.
<ol><li>Fügen Sie 50 μL DMEM-5 mit 10 μM Nigericin in die experimentelle Vertiefungen und 50 μL DMEM-5, die spontanen und 100 % Lyse-Kontroll-Vertiefungen. Fügen Sie keine Glycin in diesem Experiment, da die Zelle Lysis messen soll. 60 min bei 37 ° C und 5 % CO2inkubieren.</li>
	<li>Nach 30 min 10 μl 10 X Lyse Puffer zu 100 % Lyse Kontroll-Vertiefungen und fügen Sie 10 μL DMEM-5 hinzu, die weiteren Bohrungen. Während diese Inkubation 1 Durchstechflasche Substrat-Mix (1,5 mL gefriergetrocknete Substrat) und 1 aliquoten testpuffer (~ 12 mL) aus der Tiefkühltruhe zu entfernen und lichtgeschützt auf Zimmertemperatur auftauen lassen. Hinweis: Die Substrat-Mischung enthält eine Tetrazolium Salz (Iodonitro-tetrazoliumsalz violett), die zu einem roten Formazan Produkt umgewandelt wird.</li>
	<li>Nach insgesamt 60 min Inkubation Zentrifugieren der Platte für 5 min bei 500 X g bei 10 ° C. Übertragen Sie 50 μl des Überstands auf eine klare flach-Boden-Platte. Während dieser Zeit das Fläschchen des Substrat-Mix 12 mL testpuffer hinzu und Inkubation bei Raumtemperatur für 5 min vor der Verwendung.</li>
	<li>Fügen Sie 50 μL des Substrats in jede Vertiefung und 30 Minuten im Dunkeln inkubieren. Enthalten Sie mittlere nur Brunnen für leere Werte. Überprüfen Sie die Platte nach 15 min um sicherzustellen, dass das Signal die Nachweisgrenze des Lesers Platte nicht überschreiten wird.</li>
	<li>Fügen Sie nach 30 min 50 μL Stopp-Lösung (1 M Essigsäure hinzu) und Messen Sie OD490 mit einem Teller-Reader.</li>
	<li>Berechnen Sie den Anteil der Lyse der Zelle mit Hilfe der folgenden Formel: % Cytoxicity = ((Experimental-Spontaneous) / (maximale-spontane)) × 100 Experimentelle: Nigericin behandelt Zellen; spontane: unbehandelten Zellen; maximal: Zellen, Lyse-Puffer</li>
</ol>

<ol>
	<li>Jorgensen, I., Miao, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyroptotic+cell+death+defends+against+intracellular+pathogens.">Pyroptotic cell death defends against intracellular pathogens.</a> Immunol Rev. 265 (1), 130-142 (2015).</li><li>Guo, H., Callaway, J. B., Ting, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammasomes:+mechanism+of+action,+role+in+disease,+and+therapeutics.">Inflammasomes: mechanism of action, role in disease, and therapeutics.</a> Nat Med. 21 (7), 677-687 (2015).</li><li>Bergsbaken, T., Fink, S. L., Cookson, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyroptosis:+host+cell+death+and+inflammation.">Pyroptosis: host cell death and inflammation.</a> Nat Rev Microbiol. 7 (2), 99-109 (2009).</li><li>Martinon, F., Burns, K., Tschopp, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+inflammasome:+a+molecular+platform+triggering+activation+of+inflammatory+caspases+and+processing+of+proIL-beta.">The inflammasome: a molecular platform triggering activation of inflammatory caspases and processing of proIL-beta.</a> Mol Cell. 10 (2), 417-426 (2002).</li><li>Fink, S. L., Cookson, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspase-1-dependent+pore+formation+during+pyroptosis+leads+to+osmotic+lysis+of+infected+host+macrophages.">Caspase-1-dependent pore formation during pyroptosis leads to osmotic lysis of infected host macrophages.</a> Cell Microbiol. 8 (11), 1812-1825 (2006).</li><li>Bergsbaken, T., Fink, S. L., den Hartigh, A. B., Loomis, W. P., Cookson, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinated+host+responses+during+pyroptosis:+caspase-1-dependent+lysosome+exocytosis+and+inflammatory+cytokine+maturation.">Coordinated host responses during pyroptosis: caspase-1-dependent lysosome exocytosis and inflammatory cytokine maturation.</a> J Immunol. 187 (5), 2748-2754 (2011).</li><li>Shi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavage+of+GSDMD+by+inflammatory+caspases+determines+pyroptotic+cell+death.">Cleavage of GSDMD by inflammatory caspases determines pyroptotic cell death.</a> Nature. 526 (7575), 660-665 (2015).</li><li>Sutterwala, F. S., Haasken, S., Cassel, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+NLRP3+inflammasome+activation.">Mechanism of NLRP3 inflammasome activation.</a> Ann N Y Acad Sci. 1319, 82-95 (2014).</li><li>Juliana, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-transcriptional+priming+and+deubiquitination+regulate+NLRP3+inflammasome+activation.">Non-transcriptional priming and deubiquitination regulate NLRP3 inflammasome activation.</a> J Biol Chem. 287 (43), 36617-36622 (2012).</li><li>Py, B. F., Kim, M. S., Vakifahmetoglu-Norberg, H., Yuan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deubiquitination+of+NLRP3+by+BRCC3+critically+regulates+inflammasome+activity.">Deubiquitination of NLRP3 by BRCC3 critically regulates inflammasome activity.</a> Mol Cell. 49 (2), 331-338 (2013).</li><li>Song, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NLRP3+Phosphorylation+Is+an+Essential+Priming+Event+for+Inflammasome+Activation.">NLRP3 Phosphorylation Is an Essential Priming Event for Inflammasome Activation.</a> Mol Cell. 68 (1), 185-197 (2017).</li><li>Stutz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NLRP3+inflammasome+assembly+is+regulated+by+phosphorylation+of+the+pyrin+domain.">NLRP3 inflammasome assembly is regulated by phosphorylation of the pyrin domain.</a> J Exp Med. 214 (6), 1725-1736 (2017).</li><li>Broz, P., Dixit, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammasomes:+mechanism+of+assembly,+regulation+and+signalling.">Inflammasomes: mechanism of assembly, regulation and signalling.</a> Nat Rev Immunol. 16 (7), 407-420 (2016).</li><li>Masumoto, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ASC,+a+novel+22-kDa+protein,+aggregates+during+apoptosis+of+human+promyelocytic+leukemia+HL-60+cells.">ASC, a novel 22-kDa protein, aggregates during apoptosis of human promyelocytic leukemia HL-60 cells.</a> J Biol Chem. 274 (48), 33835-33838 (1999).</li><li>Yamamoto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ASC+is+essential+for+LPS-induced+activation+of+procaspase-1+independently+of+TLR-associated+signal+adaptor+molecules.">ASC is essential for LPS-induced activation of procaspase-1 independently of TLR-associated signal adaptor molecules.</a> Genes Cells. 9 (11), 1055-1067 (2004).</li><li>Miao, E. A., Rajan, J. V., Aderem, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspase-1-induced+pyroptotic+cell+death.">Caspase-1-induced pyroptotic cell death.</a> Immunol Rev. 243 (1), 206-214 (2011).</li><li>LaRock, C. N., Cookson, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Yersinia+virulence+effector+YopM+binds+caspase-1+to+arrest+inflammasome+assembly+and+processing.">The Yersinia virulence effector YopM binds caspase-1 to arrest inflammasome assembly and processing.</a> Cell Host Microbe. 12 (6), 799-805 (2012).</li><li>Swanson, M. S., Isberg, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+Legionella+pneumophila+with+the+macrophage+endoplasmic+reticulum.">Association of Legionella pneumophila with the macrophage endoplasmic reticulum.</a> Infect Immun. 63 (9), 3609-3620 (1995).</li><li>Miller, S. I., Ernst, R. K., Bader, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LPS,+TLR4+and+infectious+disease+diversity.">LPS, TLR4 and infectious disease diversity.</a> Nat Rev Microbiol. 3 (1), 36-46 (2005).</li><li>Sester, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+flow+cytometric+method+to+assess+inflammasome+formation.">A novel flow cytometric method to assess inflammasome formation.</a> J Immunol. 194 (1), 455-462 (2015).</li><li>Sester, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+Inflammasome+Formation+by+Flow+Cytometry.">Assessment of Inflammasome Formation by Flow Cytometry.</a> Curr Protoc Immunol. , (2016).</li><li>DiPeso, L., Ji, D. X., Vance, R. E., Price, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+death+and+cell+lysis+are+separable+events+during+pyroptosis.">Cell death and cell lysis are separable events during pyroptosis.</a> Cell Death Discov. , (2017).</li><li>Russo, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+Caspase-1+Induces+Plasma+Membrane+Pores+That+Precede+Pyroptotic+Lysis+and+Are+Blocked+by+Lanthanides.">Active Caspase-1 Induces Plasma Membrane Pores That Precede Pyroptotic Lysis and Are Blocked by Lanthanides.</a> J Immunol. 197 (4), 1353-1367 (2016).</li><li>Evavold, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Pore-Forming+Protein+Gasdermin+D+Regulates+Interleukin-1+Secretion+from+Living+Macrophages.">The Pore-Forming Protein Gasdermin D Regulates Interleukin-1 Secretion from Living Macrophages.</a> Immunity. , (2017).</li></ol>

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenlegen

In dieser Handschrift haben wir zwei Techniken untersuchen Inflammasome Aktivierung und die Folge der Aktivierung der Caspase-1 nach NLRP3 Stimulation in murinen Makrophagen Knochenmark abgeleitet vorgestellt. Die erste Technik ermöglicht den Forscher, die Aktivierung der Caspase-1 auf einer zellulären Basis mit fluoreszierenden Reporter FAM-YVAD-FMK bestimmen. Dieser Reporter ist hochspezifisch für die Bindung der Caspase-1-Familie von Enzymen, wie durch das Fehlen der Färbung in Caspase-1/11 mangelhaft Makrophagen ...

Inflammasome-vermittelte Entzündung zugrunde liegt auch die Ursache von vielen Krankheiten2ist ein wesentlicher Bestandteil der Abwehr pathogener Organismen1 Die entzündliche Reaktion auf eine Vielzahl von Infektionen ausgelöst durch cytosolische Nachweis des Erregers verbunden molekulare Muster (PAMPs) oder Schäden verbunden molekulare Muster (DAMPs). Muster-Anerkennung-Rezeptoren (PRR), einschließlich derjenigen der NOD-Like-Rezeptor (NLR) Familienmitglieder oligomerize auf den Nachweis dieser PAMPs und DAMPs. Dies löst die Bildung eines Multi-Protein-Komplex bezeichnet die Inflammasome, die die PRR, Adapter Protein Apoptose-assoziierten Speck-Like Protein mit einer C-terminalen Caspase Recruitment Domain (Karte) (ASC) und pro-Form enthält Caspase-13,4. Diese Anlage ermöglicht Nähe-induzierte Auto-Aktivierung von Caspase-1. Aktive Caspase-1 führt dann zu einer Reihe von Ereignissen, die charakteristisch für die entzündliche Zelle Tod Weg Pyroptosis. Zu diesen Ereignissen gehören: die Spaltung und die Freisetzung von inflammatorischen Zytokinen IL-1β und IL-18, Lysosomen Exozytose mit Freisetzung von lysosomalen Inhalts in den Extrazellulärraum, nukleare Kondensation und Gasdermin D Dekolleté. Die freigesetzte N-terminale Domäne des Gasdermin D fügt in der Plasmamembran, Bildung von Poren, die dazu führen, dass die Plasmamembran Bruch und Freisetzung von entzündlichen Inhalt, zusätzlich eine schützende Nische für Erreger Replikation5, wegnehmen 6 , 7.
Hier konzentrieren wir uns auf den gut untersuchten NLRP3-Inflammasome. Die Aktivierung des NLRP3-Inflammasome erfolgt durch einen zweistufigen Prozess8. Der erste "Priming" Schritt erfolgt durch die Anerkennung von Toll-Like-Rezeptoren (TLR) eines mikrobiellen Produkts. Dies wird in der Laborumgebung repliziert, mithilfe von LPS, um TLR4 zu stimulieren. Diese Stimulation reguliert NLRP3 und Pro-IL-1β durch NF-κB-Signalisierung. Grundierung zusätzlich Lizenzen NLRP3 durch nicht-transcriptional Mechanismen durch Induktion der Deubiquitination9,10 und Phosphorylierung oder Dephosphorylation bestimmte Rückstände11,12.
Das zweite Signal für NLRP3 Aktivierung wird gedacht, um mitochondrialen Faktoren, reaktive Sauerstoffspezies, Kalium Ausfluss und Kalzium-Signalisierung, beinhalten ein einheitlicher Mechanismus für NLRP3 Aktivierung schwer fassbaren8bleibt. Aktivierte NLRP3 durch Interaktionen zwischen seinen NACHT-Domains oligomerizes und ASC über Bindung von Pyrin (PYD) Domänen13Rekruten. In jeder Zelle bilden diese makromolekulare Komplexe einen einzigen mikroskopisch sichtbaren Fokus. ASC wurde ursprünglich als ein 22 KDa-Protein, das einen "Fleck" während der Apoptose von menschlichen Leukämie-Zellen bildet und benannte Apoptose-assoziierten Speck-Like Protein enthält eine Karte14identifiziert. Es wurde später festgestellt, dass ASC Pro-Caspase-1 durch das Zusammenspiel der Karte des ASC mit der Karte von Pro-Caspase-1, bilden die Inflammasome15Rekruten.
Nicht alle NLRs erfordern das Vorhandensein der ASC induzieren Caspase-1 Aktivierung. Im Gegensatz zu NLRP3 NLRC4 und NLRP1b Karte Domänen und Pro-Caspase-1 über Karte Interaktionen induzieren Caspase-1 Aktivierung direkt einstellen können. In Ermangelung von ASC aktive Caspase-1 bleibt diffus in die Zellflüssigkeit und bildet keinen einzigen Fokus. Diese diffuse aktive Caspase-1 ist ausreichend, um Pyroptotic Zelltod induzieren, aber ist nicht in der Lage, Pro-IL-1β13,16zu verarbeiten.
In diesem Manuskript besprechen wir zwei Möglichkeiten zur Aktivierung der Inflammasome zu beurteilen. Die erste verwendet die fluoreszierende Aktivität Sonde, FAM-YVAD-FMK, die die Caspase-1-Familie von Proteasen bindet. Diese Familie umfasst Caspase-1, aber auch Maus Caspase-11 und menschlichen Caspase-4 und Caspase-5. Makrophagen von Caspase-1/11 mangelhaft Mäuse in allen Experimenten verwenden, wird die Spezifität dieser Sonde angesprochen werden. Diese Methode kann kombiniert werden mit Antikörper Kennzeichnung von Inflammasome Komponenten, die wir auch beschreiben. Mikroskopische Visualisierung ermöglicht die Identifizierung von einzelnen Zellen, die aktive Caspase-1 und oligomerized ASC. Forscher werden mit dieser Methode feststellen, wo in der Inflammasome-Bildung-Kaskade ihren Manipulationen der Wirtszelle oder pathogener Organismus unter Studie auswirken. Zum Beispiel kann man unterscheiden, ob eine bestimmte Intervention verhindert, die Rekrutierung von ASC, komplexe NLRP3 dass oder richtet sich an die nachfolgenden Rekrutierung und Aktivierung von Caspase-117. Ergebnisse der Caspase-1 Aktivierung wie IL-1β-Sekretion zu prüfen wäre nicht in der Lage sein, zwischen diesen beiden Möglichkeiten zu unterscheiden. Auch, könnte die Sekretion von IL-1β geändert werden, ohne dass die Fähigkeit der Zellen zur Aktivierung der Caspase-1 und Pyroptotic Zelle Tod16zu unterziehen.
Die zweite Methode misst die Freisetzung von Laktat-Dehydrogenase (LDH) in die Zelle überstand, die auftritt, während Pyroptotic Makrophagen Lyse nach Aktivierung der Caspase-1, wie oben beschrieben. Diese zweite Methode ist eine bevölkerungsbezogene Ansatz wie die Freisetzung von LDH im gesamten gut gemessen wird. Dieser einfache Ansatz ermöglicht die schnelle Analyse von Proben (30 min Inkubation Zeit) um festzustellen, ob es Caspase-1-vermittelte Zelltod gibt und kann in einem 96-Well-Plattenformat durchgeführt werden.
Diese Methoden sind komplementär, jeweils mit verschiedenen Vorteilen, und beide sind Modifikationen leicht zugänglich. Beispielsweise kann Makrophagen Behandlung mit gezielten kleinen Molekulargewicht Verbindungen vor Inflammasome Stimulation verwendet werden, untersuchen die Rolle sicher, dass Proteine auf Entzündungsreaktionen Steuern haben können.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>E-MEM</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>30-2003</td>
			<td>For growing L929 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NCRC clone 929 (L929)&#160;</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixation/Permeabilization Kit</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>554714</td>
			<td>Includes fixation and permeabilization solution, and wash buffer.&#160; Proprietary formulations. Contains 4.2% formaldehyde</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>161-0718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytotox96 Nonradioactive cytotoxicity assay</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>PR-G1780</td>
			<td>Includes Substrate Mix and Assay Buffer; Proprietary formulations. Stop solution is 1 M Acetic acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FAM-YVAD-FMK</td>
			<td>Immunocytochemistry Technologies</td>
			<td>98</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose, no glutamine</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11960044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose, no glutamine, no phenol red</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>31053028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s PBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, qualified, US origin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>26140079</td>
			<td>Heat inactivated at 55&#176;C for 50 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15750060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Mounting Medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>p36934</td>
			<td>Proprietary formulation. Curing mounting medium. Hardens to refractory index of 1.46</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>goat anti-mouse ALEXA555</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (Ultra Pure)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11344041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>21051024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TO-PRO-3 Iodide</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>T3605</td>
			<td>far-red fluorescent nucleic acid stain&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J mouse</td>
			<td>Jackson Laboratoy</td>
			<td>000664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>caspase-1/11-/- mouse</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>016621</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica SP8X Confocal Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure LPS from Salmonella minnesota R595 (Re)</td>
			<td>List Biologicals</td>
			<td>434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-ASC clone 2EI-7</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>04-417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>beta-mercapto-ethanol</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>M6250-10ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>D2650-5X10ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>E5391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectramax M3 plate reader</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>5000414</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of inflammasome activation and pyroptotic cell death in murine bone marrow-derived macrophages

Inflammasomes sind angeborene immun Signalisierung Plattformen, die für die erfolgreiche Bekämpfung vieler pathogenen Organismen sind erforderlich, sondern auch fördern entzündliche und Autoimmun-Krankheiten. Inflammasomes werden durch cytosolische Muster Anerkennung Rezeptoren, einschließlich derjenigen der NOD-Like-Rezeptor (NLR) Familienmitglieder aktiviert. Diese Rezeptoren oligomerize auf den Nachweis der mikrobiellen oder Schäden verbundenen Reize. Nachträgliche Einstellung des Adapter-Proteins ASC bildet eine mikroskopisch sichtbaren Inflammasome Komplex, die Caspase-1 durch Nähe-induzierte Auto-Aktivierung aktiviert. Nach der Aktivierung spaltet Caspase-1 Pro-IL-1β und Pro-IL-18, zur Aktivierung und Sekretion dieser Pro-inflammatorische Zytokine. Caspase-1 vermittelt auch entzündliche Form des Zelltods bezeichnet Pyroptosis, verfügt über den Verlust der Membran Integrität und Zell-Lyse. Caspase-1 spaltet Gasdermin D, die N-terminale Fragment, das Plasmamembran Poren bildet die Freigabe zu osmotische Lyse.
In Vitro, die Aktivierung von Caspase-1 kann durch Knochenmark stammenden Makrophagen mit der Caspase-1 Aktivität Sonde FAM-YVAD-FMK Kennzeichnung und Etikettierung der Zellen mit Antikörpern gegen das Adapter-Protein ASC ermittelt werden. Diese Technik ermöglicht die Identifikation von Inflammasome Bildung und Aktivierung der Caspase-1 in einzelnen Zellen mittels Fluoreszenzmikroskopie. Pyroptotic Zelltod kann durch Messung der Veröffentlichung der cytosolischen Laktat-Dehydrogenase in das Medium erkannt werden. Dieses Verfahren ist einfach, kostengünstig und in einer 96-Well-Platte-Format, so dass die Anpassung für das Screening durchgeführt. In dieser Handschrift zeigen wir, dass die Aktivierung des NLRP3-Inflammasome von Nigericin bis zur Co Lokalisierung der Adapter Protein ASC und aktive Caspase-1, führt zu Pyroptosis.

Um Caspase-1 Aktivierung nach der Exposition gegenüber Nigericin zu erkennen, wurden die Zellen verarbeitet, wie im Abschnitt Protokoll beschrieben. Wir kombinierten FAM-YVAD-FMK und ASC Etikettieren Antikörper um zu zeigen, dass ASC und aktive Caspase-1 Co lokalisieren nach Aktivierung des NLRP3-vermittelten Inflammasome. Abbildung 1A zeigt, dass Wildtyp Makrophagen ausgesetzt 5 μM Nigericin Bildung von einer ASC-Fokus in der perinukleären Region. Diese ...

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Inflammasome Activation and Pyroptotic Cell Death in Murine Bone Marrow-derived Macrophages at JoVE.com

Detection of Inflammasome Activation and Pyroptotic Cell Death in Murine Bone Marrow-derived Macrophages

Wir beschreiben die Erkennung des NLRP3-Inflammasome-Aktivierung auf zellulärer Basis mit Fluoreszenz-Mikroskopie und Färbung für aktive Caspase-1 und den Adapter, ASC. Ein Laktat-Dehydrogenase-Release-Assay wird vorgestellt, um Pyroptotic Lyse auf Basis einer Bevölkerung zu erkennen. Diese Techniken können angepasst werden, um viele Aspekte der Inflammasome Biologie zu studieren.

Erkennung von Inflammasome Aktivierung und Pyroptotic Zelltod in murinen Makrophagen Knochenmark abgeleitet

Inflammasomes are innate immune signaling platforms that are required for the successful control of many pathogenic organisms, but also promote ...

detection-inflammasome-activation-pyroptotic-cell-death-murine-bone

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

10.5K Aufrufe.  University of Washington. Wir beschreiben die Erkennung des NLRP3-Inflammasome-Aktivierung auf zellulärer Basis mit Fluoreszenz-Mikroskopie und Färbung für aktive Caspase-1 und den Adapter, ASC. Ein Laktat-Dehydrogenase-Release-Assay wird vorgestellt, um Pyroptotic Lyse auf Basis einer Bevölkerung zu erkennen. Diese Techniken können angepasst werden, um viele Aspekte der Inflammasome Biologie zu studieren.

Serie: Detection of Inflammasome Activation and Pyroptotic Cell Death in Murine Bone Marrow-derived Macrophages

Toxoplasma gondii Cyst Wall Formation in Activated Bone Marrow-derived Macrophages and Bradyzoite Conditions

Toxoplasma gondii is an obligate intracellular parasite that can invade any nucleated cell of warm-blooded animals. During infection, T. gondii disseminates as a fast replicating form called the tachyzoite. Tachyzoites convert into a slow-growing encysted form called the bradyzoite by a signaling process that is not well characterized. Within animals, bradyzoite cysts are found in the central nervous system and muscle tissue and represent the chronic stage of infection. Conversion to bradyzoites can be simulated in tissue culture by CO2 starvation, using medium with high a pH, or the addition of interferon gamma (IFN&gamma;). Bradyzoites are characterized by the presence of a cyst wall, to which the lectin Dolichos biflorus agglutinin (DBA) binds. Fluorescently labeled DBA is used to visualize the cyst wall in parasites grown in human foreskin fibroblasts (HFFs) that have been exposed to low CO2 and high pH medium. Similarly, parasites residing in murine bone marrow-derived macrophages (BMMs) display a cyst wall detectable by DBA after the BMMs are activated with IFN&gamma; and lipopolysaccharide (LPS). This protocol will demonstrate how to induce conversion of T. gondii to bradyzoites using a high pH growth medium with low CO2 and activation of BMMs. Host cells will be cultured on coverslips, infected with tachyzoites and either activated with addition of IFN&gamma; and LPS (BMMs) or exposed to a high pH growth medium (HFFs) for three days. Upon completion of infections, host cells will be fixed, permeabilized, and blocked. Cyst walls will be visualized using rhodamine DBA with fluorescence microscopy.

Toxoplasma gondii Cyst Wall Formation in Activated Bone Marrow-derived Macrophages and Bradyzoite Conditions

Toxoplasma gondii converts to a cyst form in response to environmental stresses, which can be mimicked in tissue culture models. This video demonstrates techniques to examine cyst wall formation by activating bone marrow-derived macrophages or changing growth medium pH in fibroblast cells.

Toxoplasma gondii Zystenwand Formation in Activated Knochenmark abgeleiteten Makrophagen und Bradyzoite AGB

Toxoplasma gondii is an obligate intracellular parasite that can invade any nucleated cell of warm-blooded animals. During infection, T. gondii ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Generation and Labeling of Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells with Qdot Nanocrystals for Tracking Studies

Dendritic cells (DCs) are professional antigen presenting cells (APCs) found in peripheral tissues and in immunological organs such as thymus, bone marrow, spleen, lymph nodes and Peyer's patches 1-3. DCs present in peripheral tissues sample the organism for the presence of antigens, which they take up, process and present in their surface in the context of major histocompatibility molecules (MHC). Then, antigen-loaded DCs migrate to immunological organs where they present the processed antigen to T lymphocytes triggering specific immune responses. One way to evaluate the migratory capabilities of DCs is to label them with fluorescent dyes 4.
Herewith we demonstrate the use of Qdot fluorescent nanocrystals to label murine bone marrow-derived DC. The advantage of this labeling is that Qdot nanocrystals possess stable and long lasting fluorescence that make them ideal for detecting labeled cells in recovered tissues. To accomplish this, first cells will be recovered from murine bone marrows and cultured for 8 days in the presence of granulocyte macrophage-colony stimulating factor in order to induce DC differentiation. These cells will be then labeled with fluorescent Qdots by short in vitro incubation. Stained cells can be visualized with a fluorescent microscopy. Cells can be injected into experimental animals at this point or can be into mature cells upon in vitro incubation with inflammatory stimuli. In our hands, DC maturation did not determine loss of fluorescent signal nor does Qdot staining affect the biological properties of DCs. Upon injection, these cells can be identified in immune organs by fluorescent microscopy following typical dissection and fixation procedures.

Dendritic cells uptake antigens and migrate towards immune organs to present processed antigens to T cells. Qdot nanocrystal labeling provides a long-lasting and stable fluorescent signal. This allows tracking of dendritic cells to different organs by fluorescent microscopy.

Erzeugung und Kennzeichnung von Murine Knochenmark gewonnenen dendritischen Zellen mit Qdot Nanokristalle für Tracking-Studien

Dendritic cells (DCs) are professional antigen presenting cells (APCs) found in peripheral tissues and in immunological organs such as thymus, bone ...

Investigation of Macrophage Polarization Using Bone Marrow Derived Macrophages

The article describes a readily easy adaptive in vitro model to investigate macrophage polarization. In the presence of GM-CSF/M-CSF, hematopoietic stem/progenitor cells from the bone marrow are directed into monocytic differentiation, followed by M1 or M2 stimulation. The activation status can be tracked by changes in cell surface antigens, gene expression and cell signaling pathways.

The article describes a readily easy adaptive in vitro model to investigate macrophage polarization. In the presence of GM-CSF/M-CSF, hematopoietic stem/progenitor cells from the bone marrow are directed into monocytic differentiation, followed by M1 or M2 stimulation. The activation status can be tracked by changes in cell surface antigens, gene expression and cell signaling pathways.

Untersuchung von Makrophagen-Polarisation mit Knochenmark-Makrophagen

The article describes a readily easy adaptive in vitro model to investigate macrophage polarization. In the presence of GM-CSF/M-CSF, hematopoietic ...

Bone Marrow-derived Macrophage Production

Macrophages are critical components of the innate and adaptive immune responses, and they are the first line of defense against foreign invaders because of their powerful microbicidal activities. Macrophages are widely distributed throughout the body and are present in the lymphoid organs, liver, lungs, gastrointestinal tract, central nervous system, bone, and skin. Because of their repartition, they participate in a wide range of physiological and pathological processes. Macrophages are highly versatile cells that are able to recognize microenvironmental alterations and to maintain tissue homeostasis. Numerous pathogens have evolved mechanisms to use macrophages as Trojan horses to survive, replicate in, and infect both humans and animals and to propagate throughout the body. The recent explosion of interest in evolutionary, genetic, and biochemical aspects of host-pathogen interactions has renewed scientific attention regarding macrophages. Here, we describe a procedure to isolate and cultivate macrophages from murine bone marrow that will provide large numbers of macrophages for studying host-pathogen interactions as well as other processes.

Macrophages have long been recognized as a critical component of the innate and adaptive immune responses. The recent explosion of knowledge pertaining to evolutionary, genetic, and biochemical aspects of the interaction between macrophages and microbes has renewed scientific attention to macrophages. This article describes a method to differentiate macrophages from mouse bone marrow.

Knochenmark-abgeleiteten Makrophagen-Produktion

Macrophages are critical components of the innate and adaptive immune responses, and they are the first line of defense against foreign invaders because ...

Activation and Measurement of NLRP3 Inflammasome Activity Using IL-1&#946; in Human Monocyte-derived Dendritic Cells

Inflammatory processes resulting from the secretion of Interleukin (IL)-1 family cytokines by immune cells lead to local or systemic inflammation, tissue remodeling and repair, and virologic control1,2 . Interleukin-1&#946; is an essential element of the innate immune response and contributes to eliminate invading pathogens while preventing the establishment of persistent infection1-5.
Inflammasomes are the key signaling platform for the activation of interleukin 1 converting enzyme (ICE or Caspase-1). The NLRP3 inflammasome requires at least two signals in DCs to cause IL-1&#946; secretion6. Pro-IL-1&#946; protein expression is limited in resting cells; therefore a priming signal is required for IL-1&#946; transcription and protein expression. A second signal sensed by NLRP3 results in the formation of the multi-protein NLRP3 inflammasome. The ability of dendritic cells to respond to the signals required for IL-1&#946; secretion can be tested using a synthetic purine, R848, which is sensed by TLR8 in human monocyte derived dendritic cells&#160;(moDCs) to prime cells, followed by activation of the NLRP3 inflammasome with the bacterial toxin and potassium ionophore, nigericin.
Monocyte derived DCs&#160;are easily produced in culture and provide significantly more cells than purified human myeloid DCs. The method presented here differs from other inflammasome assays in that it uses in vitro human, instead of mouse derived, DCs thus allowing for the study of the inflammasome in human disease and infection.

Dendritic cells (DCs)&#160;secrete IL-1&#946; in response to TLR8 recognition of synthetic purine, R848, followed by NLRP3 inflammasome activation with nigericin, therefore, IL-1&#946; can be used to measure NLRP3 inflammasome activity. Intracellular cytokine staining, immunoblotting, and ELISA are used to accurately measure NLRP3 inflammasome priming and activation via IL-1&#946; expression.

Aktivierung und Messung der NLRP3 Inflammasom Aktivität mit IL-1β in humanen Monozyten-abgeleiteten dendritischen Zellen

Inflammatory processes resulting from the secretion of Interleukin (IL)-1 family cytokines by immune cells lead to local or systemic inflammation, tissue ...

Isolation and Intravenous Injection of Murine Bone Marrow Derived Monocytes

As a subtype of leukocytes and progenitors of macrophages, monocytes are involved in many important processes of organisms and are often the subject of various fields in biomedical science. The method described below is a simple and effective way to isolate murine monocytes from heterogeneous bone marrow.
Bone marrow from the femur and tibia of Balb/c mice is harvested by flushing with phosphate buffered saline (PBS). Cell suspension is supplemented with macrophage-colony stimulating factor (M-CSF) and cultured on ultra-low attachment surfaces to avoid adhesion-triggered differentiation of monocytes. The properties and differentiation of monocytes are characterized at various intervals. Fluorescence activated cell sorting (FACS), with markers like CD11b, CD115, and F4/80, is used for phenotyping. At the end of cultivation, the suspension consists of 45%&#177; 12% monocytes. By removing adhesive macrophages, the purity can be raised up to 86%&#177; 6%. After the isolation, monocytes can be utilized in various ways, and one of the most effective and common methods for in vivo delivery is intravenous tail vein injection. 
This technique of isolation and application is important for mouse model studies, especially in the fields of inflammation or immunology. Monocytes can also be used therapeutically in mouse disease models.

Here we present a protocol that generates large amounts of murine monocytes from heterogeneous bone marrow for translational applications. In comparison to others, this new method helps reduce the number of sacrificed animals and lowers costs by avoiding expensive methods such as high gradient magnetic cell separation (MACS).

Isolierung und intravenöse Injektion von Maus-Knochenmark stammenden Monozyten

As a subtype of leukocytes and progenitors of macrophages, monocytes are involved in many important processes of organisms and are often the subject of ...

Metabolic Characterization of Polarized M1 and M2 Bone Marrow-derived Macrophages Using Real-time Extracellular Flux Analysis

Specific metabolic pathways are increasingly being recognized as critical hallmarks of macrophage subsets. While LPS-induced classically activated M1 or M(LPS) macrophages are pro-inflammatory, IL-4 induces alternative macrophage activation and these so-called M2 or M(IL-4) support resolution of inflammation and wound healing. Recent evidence shows the crucial role of metabolic reprogramming in the regulation of M1 and M2 macrophage polarization. 
In this manuscript, an extracellular flux analyzer is applied to assess the metabolic characteristics of naive, M1 and M2 polarized mouse bone marrow-derived macrophages. This instrument uses pH and oxygen sensors to measure the extracellular acidification rate (ECAR) and oxygen consumption rate (OCR), which can be related to glycolytic and mitochondrial oxidative metabolism. As such, both glycolysis and mitochondrial oxidative metabolism can be measured in real-time in one single assay.
Using this technique, we demonstrate here that inflammatory M1 macrophages display enhanced glycolytic metabolism and reduced mitochondrial activity. Conversely, anti-inflammatory M2 macrophages show high mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) and are characterized by an enhanced spare respiratory capacity (SRC). 
The presented functional assay serves as a framework to investigate how particular cytokines, pharmacological compounds, gene knock outs or other interventions affect the macrophage&#8217;s metabolic phenotype and inflammatory status.

Metabolic reprogramming is a characteristic and prerequisite for M1 and M2 macrophage polarization. This manuscript describes an assay for the measurement of fundamental parameters of glycolysis and mitochondrial function in mouse bone marrow-derived macrophages. This tool can be applied to investigate how particular factors affect the macrophage&#8217;s metabolism and phenotype.

Metabolische Charakterisierung Polarized M1 und M2-Knochenmark-Makrophagen über die Echtzeit-Extrazelluläre Flußanalyse

Specific metabolic pathways are increasingly being recognized as critical hallmarks of macrophage subsets. While LPS-induced classically activated M1 or ...

Isolation and Activation of Murine Lymphocytes

B and T cells, with their extremely diverse antigen-receptor repertoires, have the ability to mount specific immune responses against almost any invading pathogen1,2. Understandably, such intricate abilities are controlled by a large number of molecules involved in various cellular processes to ensure timely and spatially regulated immune responses3. Here, we describe experimental procedures that allow rapid isolation of highly purified murine lymphocytes using magnetic cell sorting technology. The resulting purified lymphocytes can then be subjected to various in vitro or in vivo functional assays, such as the determination of lymphocyte signaling capacity upon stimulation by immunoblotting4 and the investigation of proliferative abilities by 3H-thymidine incorporation or carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) labeling5-7. In addition to comparing the functional capacities of control and genetically modified lymphocytes, we can also determine the T cell stimulatory capacity of antigen-presenting cells (APCs) in vivo, as shown in our representative results using transplanted CFSE-labeled OT-I T cells.

Lymphocytes are the major players in adaptive immune responses. Here, we present a lymphocyte purification protocol to determine the physiological functions of the desired molecules in lymphocyte activation in vitro and in vivo. The described experimental procedures are suitable for comparing functional capacities between control and genetically modified lymphocytes.

Isolation und Aktivierung von murinen Lymphozyten

B and T cells, with their extremely diverse antigen-receptor repertoires, have the ability to mount specific immune responses against almost any invading ...

Assessment of Antibody-based Drugs Effects on Murine Bone Marrow and Peritoneal Macrophage Activation

Macrophages are phagocytic innate immune cells, which initiate immune responses to pathogens and contribute to healing and tissue restitution. Macrophages are equally important in turning off inflammatory responses. We have shown that macrophages stimulated with intravenous immunoglobulin (IVIg) can produce high amounts of the anti-inflammatory cytokine, interleukin 10 (IL-10), and low levels of pro-inflammatory cytokines in response to bacterial lipopolysaccharides (LPS). IVIg is a polyvalent antibody, primarily immunoglobulin Gs (IgGs), pooled from the plasma of more than 1,000 blood donors. It is used to supplement antibodies in patients with immune deficiencies or to suppress immune responses in patients with autoimmune or inflammatory conditions. Infliximab, a therapeutic anti-tumor necrosis factor alpha (TNF&#945;) antibody, has also been shown to activate macrophages to produce IL-10 in response to inflammatory stimuli. IVIg and other antibody-based biologics can be tested to determine their effects on macrophage activation. This paper describes methods for derivation, stimulation, and assessment of murine bone marrow macrophages activated by antibodies in vitro and murine peritoneal macrophages activated with antibodies in vivo. Finally, we demonstrate the use of western blotting to determine the contribution of specific cell signaling pathways to anti-inflammatory macrophage activity. These protocols can be used with genetically modified mice, to determine the effect of a specific protein(s) on anti-inflammatory macrophage activation. These techniques can also be used to assess whether specific biologics may act by changing macrophages to an IL-10-producing anti-inflammatory activation state that reduces inflammatory responses in vivo. This can provide information on the role of macrophage activation in the efficacy of biologics during disease models in mice, and provide insight into a potential new mechanism of action in people. Conversely, this may caution against the use of specific antibody-based biologics to treat infectious disease, particularly if macrophages play an important role in host defense against that infection.

Antibody-based drugs have revolutionized treatment for inflammatory diseases. In addition to having direct effects on specific targets, antibodies can activate macrophages to become anti-inflammatory. This protocol describes how anti-inflammatory macrophage activation can be assessed in vitro, using mouse bone marrow macrophages, and in vivo, using peritoneal macrophages.

Bewertung der Antikörper-basierte Medikamente Auswirkungen auf murinen Knochenmark und peritonealen Makrophagen Aktivierung

Macrophages are phagocytic innate immune cells, which initiate immune responses to pathogens and contribute to healing and tissue restitution. Macrophages ...

An In Vivo Mouse Model to Measure Na&#239;ve CD4 T Cell Activation, Proliferation and Th1 Differentiation Induced by Bone Marrow-derived Dendritic Cells

Quantification of na&#239;ve CD4 T cell activation, proliferation, and differentiation to T helper 1 (Th1) cells is a useful way to assess the role played by T cells in an immune response. This protocol describes the in vitro differentiation of bone marrow (BM) progenitors to obtain granulocyte macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) derived-dendritic cells (DCs). The protocol also describes the adoptive transfer of ovalbumin peptide (OVAp)-loaded GM-CSF-derived DCs and na&#239;ve CD4 T cells from OTII transgenic mice in order to analyze the in vivo activation, proliferation, and Th1 differentiation of the transferred CD4 T cells. This protocol circumvents the limitation of purely in vivo methods imposed by the inability to specifically manipulate or select the studied cell population. Moreover, this protocol allows studies in an in vivo environment, thus avoiding alterations to functional factors that may occur in vitro and including the influence of cell types and other factors only found in intact organs. The protocol is a useful tool for generating changes in DCs and T cells that modify adaptive immune responses, potentially providing important results to understand the origin or development of numerous immune associated diseases.

Here, we present a protocol for the in vivo determination of na&#239;ve CD4 T cell (T cell) activation, proliferation, and Th1 differentiation induced by GM-CSF bone marrow (BM)-derived dendritic cells (DCs). In addition, this protocol describes BM and T-cell isolation, DC generation, and DC and T-cell adoptive transfer.

Eine In Vivo Mausmodell Maßnahme naive CD4-T-Zell-Aktivierung, Proliferation und Th1 Differenzierung induziert durch Knochenmark-abgeleitete Dendritische Zellen

Quantification of na&#239;ve CD4 T cell activation, proliferation, and differentiation to T helper 1 (Th1) cells is a useful way to assess the role played ...