Wir danken Jozsef Storch, Mitchel Richmond, Jarrad Gollihue und Andrea Sanchez für konstruktive und kritische Diskussion. Dr. Sharyn Perry für die phänotypische Fotografien. Dieses Material basiert auf Arbeit von der National Science Foundation unter Genossenschaft Vereinbarung Nr. 1355438 unterstützt.

1. Erstellen einer Verdünnung-Bibliothek
<ol><li>Beschriften Sie 625 Verdünnung Bibliothek Platten von hand um sicherzustellen, dass sie auf die entsprechende Platte aus der chemischen Bibliothek übereinstimmen. Darüber hinaus verbinden im Fluss und Schläuchen, die Multichannel-Tipp Wash automatisiert Labware Positionierer (ALP) indem sie durch das Laufwerk der Konsole an den 5-Gallonen-Behälter (siehe Tabelle der Materialien).</li>
	<li>Auf zugreifen Sie den Computer und die Waschpumpe durch die Verbindung von der Gerätesteuerung bis zur Multichannel-Tipp Wash ALP schalten Sie ein, damit Wasser zirkulieren. Dies schaltet automatisch am Ende des Protokolls.</li>
	<li>Last, befestigt mit der Hand, den Stapler 10 zum Stapler-Karussell in der folgenden Reihenfolge in Hotels A - D (Abbildung 4, Stapler); eine Schachtel AP96 P20 Pipettenspitzen in Saal 1, vier 96-Well-V-Bodenplatten in Zimmer 2-5 mit den beiden oberen Platten, Lager Konzentrationen aus der bestellten Bibliothek und die beiden unteren Platten leer (Abbildung 5, Stapler). Darüber hinaus laden eine Schachtel AP96 P20 Pipettenspitzen in Raum 6 und vier 96-Well-V-Bodenplatten in Zimmer 7-9 mit den beiden oberen Platten, Lager Konzentrationen der bestellten Bibliothek und die beiden unteren Platten leer (Abbildung 5, Stapler).</li>
	<li>Eingestellt von hand, bis das Deck mit einer 300 mL Wasser-Reservoir auf P3, 300 mL 70 % EtOH Badewanne auf P7, Tipp Loader ALP (TL1) und Mehrkanal-Tipp Wash ALP (TW1) (Abbildung 4und Abbildung 5, Deck Deck).</li>
	<li>Mit der Betriebssoftware, präsentieren Sie AP96 P20 Pipettenspitzen aus den Stapler 10 und verschieben Sie sie in die Tipp-Loader-ALP. Hinweis: 1,5 bis 1.12 alle sind mit der Flüssigkeit, die Handhabung des Roboters Betriebssoftware durchgeführt; siehe Tabelle der Materialien.</li>
	<li>2 Zimmer von Hotel A zu präsentieren und trennen Sie alle vier 96-Well-V-Boden Platten auf dem Deck, Platzierung der Unterseite zwei auf P4 und P8 und die beiden oberen auf P5 und P9 (Abbildung 4).</li>
	<li>Laden Sie AP96 P20 Pipettenspitzen mit dem Loader Tipp ALP auf den 96-Kanal 200 µL Kopf. Aspirieren 90 µL aus 300 mL Wasser-Reservoir und verzichten in der 96-Well-V-Verdünnung Bodenplatte auf P4. Wiederholen Sie diesen Schritt für die Platte auf P8.</li>
	<li>Mischen Sie die chemische Bibliothek Platte auf P5 wiederholt Absaugen und 15 µL dreimal. Darüber hinaus Aspirieren Sie 10 µL aus der chemischen Bibliothek Platte auf P5 und verzichten Sie 10 µL in die Verdünnung Platte auf P4 zu.</li>
	<li>Mischen Sie den Lösungen der Platte auf P4 wiederholt Absaugen und 50 µL insgesamt drei Mal. Einmal gemischt, saubere Zeiten der AP96 P20 Pipettenspitzen durch Absaugen und Verzicht auf 70 µL 70 % EtOH von P7, dann waschen in der Multichannel-Tipp Wash ALP durch Absaugen und Verzicht auf eine Volumen von 110 % des Wassers vier.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Schritte 1,8-1,9 für das zweite paar Platten auf P8 und P9. Beim Erstellen der zweiten 96-Well-V-Verdünnung Bodenplatte, Stapel die Platten in der folgenden Reihenfolge von unten nach oben: P4, P9, P5 und P8. Legen Sie den Stapel auf einem leeren statischen ALP; P1, P2, P6, P10, P11, P12 oder P13.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Schritte 1.6-1.10 bis 5 Zimmer im Hotel A leer ist. Wiederholen Sie Schritt 1.5 auf Raum 6 erreichen, Umzug neue AP96 P20 Pipettenspitzen in der Tipp-Loader-ALP und Platzierung der verwendeten AP96 P20 Pipettenspitzen auf einer leeren statischen Alm.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Schritte 1.6-1.10 bis Zimmer 9 Hotels A leer ist. Jedoch müssen um zur Hotel B zu gelangen, die Platten und Tipps auf dem Deck in Hotel A. zurückgeladen werden</li>
	<li>Nachfüllen Sie, Handarbeit, 300 mL Wasser-Reservoir. Dieser Schritt ist entscheidend, und das Computerprogramm übernehmen eine Pause über diese Nachricht, dass der Benutzer drücken Sie "weiter", vor dem nächsten Schritt fort.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Schritte 1,5-1.13 für die restlichen Hotels, gewährleistet eine volle 300 mL Wasser-Reservoir jedes Mal vor dem Fortfahren zum nächsten Hotel.</li>
</ol>2. Hinzufügen von Medien-Saatgut-Mischung zu Platten Screening
<ol><li>½ Murashige und Skoog (MS) Medien machen mit 0,1 % Agar durch Zugabe von 4,3 g MS Salts, 0,50 g MES, 1,0 g Agar, 1 L DI H2O. einstellen den pH-Wert 5,7 aber die Zugabe von 5 M Kaliumhydroxid während der Überwachung mit einer pH-Elektrode.</li>
	<li>Sterilisieren Sie Samen durch Schütteln sie in 1 % Bleichmittel und SDS zwischen 15 und 30 min., und spülen Sie dann 4 mal mit einem gleichen Volumen Wasser durch Zentrifugation. Sobald die Samen steril sind, legen Sie sie bei 4 ° C bis zu 24 Stunden, 7 Tage für Vernilization. Das Arabidopsis Biological Resource Center beschreibt zusätzliche Methoden der Sterilisation, Vernilization und Wachstum22.</li>
	<li>Fügen Sie Samen auf Medien von hand bei einer Dichte von 0,1 g/100 mL. Diese Dichte führt zu einem Durchschnitt von 3-10 Samen pro Bohrloch einer 96-Well-Platte.</li>
	<li>Ort, von Hand, vier 96-Well-Wohnung-Bodenplatten in Zimmer 1 und 2 des Hotel A (Abbildung 6, Hotel A). Legen Sie eine Schachtel mit AP96 P250 Pipettenspitzen auf der Tipp-Loader-ALP, 300 mL Reservoir gefüllt mit der Medien-Saatgut-Mischung in Schritten erstellte 2,1-2,3 auf P3 und 300 mL Reservoir gefüllt mit 70 % EtOH auf P7 (Abbildung 4, Deck und Abbildung 6 Deck). Hinweis: 2,5 bis 2,8 erfolgen mit der Betriebssoftware.</li>
	<li>Präsentieren Sie Zimmer 1 und 2 im Hotel A zu, und trennen Sie die Stapel von vier Platten. Setzen Sie eine Platte auf jede der leeren statischen Alpen (P4, P5, P6, P8, P9, P10, P11 und P12). Laden Sie AP96 P250 Pipettenspitzen auf 96-Kanal 200 µL Kopf.</li>
	<li>Aspirieren 90 µL aus 300 mL Medien-Samen Reservoir auf P3 und verzichten in den ersten 96-Well-Wohnung-Bodenplatte. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis alle acht Platten der Medien-Saatgut-Mischung enthalten.</li>
	<li>Reinigen der AP96 P250 Pipettenspitzen durch Absaugen und Verzicht auf 70 µL aus dem 300 mL Behälter gefüllt mit 70 % EtOH auf P7. Waschen Sie die Tipps in Multichannel Tipp waschen ALP durch Absaugen und Verzicht auf eine 110 % Volumen Wasser viermal, entladen Sie die Tipps bei TL1 und sammeln Sie die Platten mit der hand.</li>
</ol>3. Hinzufügen von kleinen Molekülen zu Platten Screening
<ol><li>Last, von Hand, eine Schachtel mit AP96 P250 Pipettenspitzen in Zimmer 1 des Hotel A, zwei 96-Well-V-Verdünnung Bibliothek Bodenplatten in Zimmer 2, 4, 6 und 8 und zwei 96 gut flach-Screening Bodenplatten in Zimmer 3, 5, 7 und 9 (Abbildung 4 Stapler und Abbildung 7, Hotel A). Verbinden Sie Schläuche darüber hinaus zum und vom Multichannel Tipp Wash ALP auf den 5-Gallonen-Tank. Hinweis: 3.2 bis 3.10 erfolgen mit der Betriebssoftware.</li>
	<li>Konfigurieren Sie das Deck um 300 mL 70 % EtOH Wash Reservoir an P7 enthalten; Das Medien-Samen Reservoir kann auf dem Deck auf P3 gelassen werden (Abbildung 4, Deck und Abbildung 7, Deck). Darüber hinaus schalten Sie die Konsole Fahrt durch Verbindung von der Gerätesteuerung Wasser durch Multichannel Tipp Wash ALP zirkulieren. Dies schaltet automatisch am Ende des Protokolls.</li>
	<li>Präsentieren Sie die AP96 P250 Pipette Tip Box von Hotel A und verschieben Sie es an der Spitze Loader ALP.</li>
	<li>Präsentieren die 96-Well-V-Verdünnung Bibliothek Bodenplatten aus Zimmer 2 Hotels A Deck und Platz eins auf statische ALP P4 und auf P8. Die 96-Well-Wohnung zu präsentieren-Screening Bodenplatten aus Zimmer 3 Hotel a auf das Deck und legen Sie eine statische ALP P5 und eine auf P9.</li>
	<li>Laden Sie AP96 P250 Pipettenspitzen mit dem Loader Tipp ALP auf den 96-Kanal 200 µL Kopf.</li>
	<li>Mischen die 96-Well-V-Verdünnung Bodenplatte auf P4 durch Absaugen und Verzicht auf 50 µL dreimal. Im Anschluss daran Aspirieren 10 µL von dieser Platte und verzichten in der 96-Well-Wohnung-Screening Bodenplatte auf P5.</li>
	<li>Mischen Sie die Lösungen in die Platte bei P5 Absaugen und 50 µL dreimal. Reinigen der AP96 P250 Pipettenspitzen mit Ethanol durch Absaugen und Verzicht auf 70 µL 70 % EtOH aus dem Reservoir auf P7 und dann waschen Sie die Tipps in Multichannel Tipp Wash ALP durch Absaugen und Verzicht auf ein Volumen von 110 % des Wasser viermal.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Schritte 3.5 und 3.6 für die zweite 96-Well-V-Verdünnung Bibliothek Bodenplatte (P8) und 96-Well-flach-Screening Bodenplatte (P9).</li>
	<li>Stapel die beiden 96-Well V-Verdünnung Bibliothek Bodenplatten zusammen und die beiden 96-Well flache Unterseite Screening Platten zusammen. Verschieben Sie die Platten an statischen Alpen P1, P2, P6, P10, P11, P12 oder P13.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Schritte 3,4-3,9 dreimal, insgesamt acht Mal Platten Screening verdünnte Chemikalien hinzufügen. Zu guter Letzt überprüfen Sie die Anzahl der Samen in jede Vertiefung der Screening-Platten durch visuelle Konformation und ergänzen Sie diesen Brunnen mit weniger als drei Samen durch zusätzliche sterilisiert und vernalized Samen.</li>
</ol>(4) Inkubation und Visualisierung von Screening-Platten
<ol><li>Inkubieren Sie 96-Well flach-Boden Screening-Platten für vier Tage in einer Klimakammer bei 22 ° C auf einem 16/8 Hell-Dunkel-Zyklus in ein Behältnis Austrocknung. 96-Well flach-Boden Screening-Platten unter dem sezierenden Mikroskop zu visualisieren. Notieren Sie alle abweichende Phänotypen zur weiteren Untersuchung.</li>
</ol>

<ol>
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Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessenkonflikte.

Dieses Protokoll soll Forscher helfen bei der Bewältigung einer vorwärts Chemische Genetik-Bildschirms auf Arabidopsis. Wir bieten repräsentative Ergebnisse von einem Bildschirm von 50.000 Verbindungen (Abbildung 2 und Abbildung 3), einer der größten vorwärts Chemische Genetik Bildschirme auf Arabidopsis9,13,23bisher durchgeführt. Die Verwendung von einem liquid Handling-Roboter aktiviert eine effizientere Verdünnung Bibliothek und screening-Bibliothek-Generation, Verbesserung der Geschwindigkeit und Effizienz der Identifizierung der neuartige Substanzen. Erhöhung der Kapazität auf Leinwand in einer Hochdurchsatz-Natur wurde durch eine Verringerung der Arbeit im Namen der Forscher begleitet. Diese Technik wurde entwickelt, um mit 96-Well-Platten verwendet werden, die kleinen Samen oder Pflanzen unter dem sezierenden Mikroskop sichtbar unterbringen können. Verwendung von Platten mit größeren Brunnen um größere Samen passen würde Änderungen an den Durchsatz und die Gestaltung erfordern.
Zusätzliche Einschränkungen dieser Technik umfassen die Schwierigkeit dieses Stück der Ausrüstung mit aseptischen Techniken zu verwenden; Allerdings sind wir nicht hohe Prozentsätze einer Kontamination durch ½ MS Medien fehlt Saccharose gestoßen. Man könnte jede Kontamination Problem umgehen, indem Sie Platzierung des Roboters in einem sterilen Raum, ermöglicht für sterilen Bedingungen und Zellkultur oder mithilfe eines liquid Handling-Roboters mit einer sterilen Kammer24,25. Eine weitere Einschränkung ist Spitzengröße und Samen Aspiration. Eine kleine PIPETTENSPITZE wie AP96 P20 würde mit Samen verstopfen; Daher muss eine größere PIPETTENSPITZE für Saatgut zu dosieren und Mischen von Lösung verwendet werden.
Wichtige Schritte innerhalb dieses Protokolls gehören die sorgfältige Beschriftung von alle Platten in der Verdünnung Bibliothek und Screening-Bibliothek, sicherzustellen, dass sie in der richtigen Ausrichtung zusammen mit der richtigen Reihenfolge sind, wenn den Roboter füttern. Klare Kennzeichnung und systematische Verarbeitung ist unkompliziert und kann dieses Problem überwunden. Ein weiterer entscheidender Schritt besteht darin, die richtige Ausrüstung an der richtigen Stelle ist, bevor das Experiment in den Stapler 10 und auf dem Deck. Wenn das Gerät nicht richtig auf dem Deck platziert ist, könnte der 96-Kanal 200 µL Kopf abstürzen das Gerät beschädigen und Wartung erfordern. Ein weiterer wichtiger Schritt ist sicherzustellen, dass die korrekte Menge der Flüssigkeit innerhalb der 300 mL-Behälter befindet und dieser Betrag korrekt in die Software eingegeben wird. Wenn die Zahlen nicht übereinstimmen, die Tipps erreichen nicht die Flüssigkeit und streben wird nicht auftreten.
Es ist auch notwendig, Maßnahmen ergreifen, um sicherzustellen, dass die Ergebnisse korrekt sind. Ein Fehler, die wir bemerkt während der Entwicklung des Protokolls wurde verknüpft, um Leben zu kippen. Nach aufeinanderfolgenden be- und Entladen verlieren die Spitzen ihre Fähigkeit, Aspirieren und genau dosieren. Es ist daher unerlässlich, dass jeder Satz von 96 Tipps verwendet wird bis zu vier Mal. Es ist auch wichtig, das Waschwasser regelmäßig, um zu vermeiden, das Potenzial für Chemikalien, versehentlich hinzugefügt werden, um die Platten screening zu ändern. Schließlich haben einige Chemikalien eine Tendenz zur Lösung26auszufällen. Um sicherzustellen, dass jede Chemikalie in der richtigen Konzentration hinzugefügt wird, fließen mischen Schritte in der Verdünnung und Screening Protokoll. Mischen Sie kann in geringen Mengen von Chemikalien wird von Bibliothek zu Bibliothek hinzugefügt, anspruchsvolle Interpretation des chemischen Potentials induzierte Phänotypen Nichtbeachtung.
Mit der richtigen Platten für jeden Teil des Protokolls ist auch sehr wichtig. V-Boden Platten sollen sicherstellen, dass kleine Mengen an Flüssigkeit abgesaugt werden können und sind für den Einsatz bei der Erstellung der Bibliothek Verdünnung empfohlen. Diese Platten eignen sich jedoch nicht für das Screening Teil des Protokolls, da ihre Reflexion von Licht zu schlechten Visualisierung der Phänotypen führt. Um die Phänotypen der 3-4 Tage alte Sämlinge beobachten, muss der Bildschirm in flach-Boden Platten durchgeführt werden.
Sobald die siebungplatten erstellt wurden, wird die Visualisierung benötigt. flach-Boden 96-Well-Platten ermöglichen einfache Visualisierung unter Mikroskopen zu sezieren. Es ist zwingend notwendig, dass die Platten in Austrocknung-Behältern zur Verringerung der Verdunstung der Medien gespeichert sind. Eine Alternative zur mikroskopischen Visualisierung ist einen hochauflösende Scanner verwenden. Bilder mit hoher Auflösung zeigen die Mehrheit der Phänotypen, die in diesem Bildschirm beobachtet und bieten ein Archiv mit den Ergebnissen, die in der Zukunft revidiert werden können. Sobald Visualisierung abgeschlossen ist, und die Bibliothek Ihrer Wahl gezeigt, könnte diese Methode dann auf verschiedene Organismen oder durch eine andere chemische Bibliothek durchgeführt werden. Modifikationen am Gerät können für die sterile Kultur, so dass Ventures in das Reich der Stammzellen, Pilze, Insekten und kleine Pflanzen2,18,25,27.

In den vergangenen 20 Jahren haben Forscher auf dem Gebiet der Pflanzenbiologie große Fortschritte mit Hilfe chemischer Genetik Ansätze, sowohl vorwärts als auch rückwärts, gemacht, ein besseres Verständnis der Zellwand Biosynthese, Zellskelett, Hormon-Biosynthese und Signalisierung, Gravitropismus, Pathogenese, Purin-Biosynthese und Endomembrane Handel mit1,2,3,4,5. Einsatz nach vorne Chemische Genetik Techniken ermöglicht die Identifizierung von Phänotypen von Interesse und erlaubt es den Forschern, die genotypischen Grundlagen für bestimmte Prozesse zu verstehen. Im Gegensatz dazu sucht reverse Chemische Genetik Chemikalien, die mit einer vorher festgelegten Protein Ziel6interagieren. Arabidopsis hat an der Spitze dieser Entdeckungen in Pflanzenbiologie, weil sein Genom klein abgebildet und kommentiert. Es hat eine kurze Generationszeit, und es gibt mehrere Mutant/Reporter Zeilen zur Verfügung, um die Identifizierung von aberranten subzelluläre Maschinen7zu erleichtern.
Es gibt zwei große Engpässe, die verlangsamen den Fortschritt der vorwärts chemische genetische Bildschirme, die ersten screening-Prozess und bestimmen das Ziel der Verbindung von Interesse8. Eine große Hilfe bei der Erhöhung der Geschwindigkeit des kleinen Molekül-Auswahl ist die Verwendung von Automatisierung und automatisierte Anlagen9. Liquid Handling-Roboter sind ein hervorragendes Instrument für den Umgang mit großen Bibliotheken von kleinen Molekülen und maßgeblich voran in den biologischen Wissenschaften10gewesen. Die hier vorgestellten Protokoll wurde entwickelt, um den Engpass zugeordneten Screening-Verfahren ermöglicht die Identifizierung von bioaktiven kleine Moleküle mit einer schnellen Rate. zu lindern Diese Technik verringert die Last der Arbeit und Zeit im Auftrag des Betreibers und auch gleichzeitig die wirtschaftliche Kosten für die Prinzip-Ermittler.
Bisher haben die meisten chemische Bibliotheken analysiert zwischen 10.000 und 20.000 Verbindungen, einige mit mehr als 150.000 andere mit nur 709,11,12,13,14, statt. 15 , 16. das Protokoll hier eingeführt wurde auf einer kleinen Molekül-Bibliothek von 50.000 Verbindungen (siehe Tabelle der Materialien) umgesetzt, die größeren vorwärts Chemische Genetik Bildschirme durchgeführt auf Arabidopsis bis heute. Dieses Protokoll passt mit dem aktuellen Trend zu mehr Effizienz und Geschwindigkeit betreffend vorwärts Chemische Genetik, zumal es bezieht sich auf Fungizid, Herbizid Entdeckung, Insektizid Entdeckung entdecken, drug Discovery und Krebsbiologie17 ,18,19,20,21. Obwohl hier mit Arabidopsis implementiert, könnte dieses Protokoll leicht angepasst werden Zellkulturen, Sporen und möglicherweise sogar Insekten im flüssigen Medium innerhalb 96, 384 oder 1536-Well Platten. Aufgrund seiner geringen Größe ist Arabidopsis zugänglicher Screening in 96-well-Platten. Verteilung von Saatgut gleichmäßig auf alle Brunnen ist jedoch eine Herausforderung. Aussaat von Hand genau, aber arbeitsintensiv ist, und zwar gibt es Geräte, die Samen in 96-Well Platten zu verzichten, sie sind teuer in der Anschaffung. Hier zeigen wir, wie dieser Schritt mit nur einem kleinen Verlust an Genauigkeit umgangen werden kann.
Das übergeordnete Ziel dieser Methode war eine große chemische Bibliothek gegen Arabidopsis mehr überschaubar, ohne Kompromisse bei der Genauigkeit, über die Verwendung von einem liquid Handling-Roboter screening zu machen. Die Verwendung dieser Methode verbessert die Effizienz des Forschers durch verringern den Zeitaufwand für die anfängliche Verdünnung Serie Management und nachfolgenden phänotypischen Bildschirmen ermöglicht schnelle Visualisierung der Proben unter dem sezierenden Mikroskop und schnelle Runden Identifizierung neuer bioaktiver kleiner Moleküle. Abbildung 1 zeigt die wichtigsten Ergebnisse dieses Protokolls in 4 Schritten.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57393/57393fig1.jpg"> Abbildung 1: allgemeine Workflow des Bildschirms nach vorne Chemische Genetik. Einen Überblick über das Protokoll für jedes der 4 wichtigsten Schritte mit einigen Details beschrieben werden. 1: Erhalt der chemischen Bibliothek, 2: die Verdünnung Bibliothek, 3: macht die Screening-Platten und 4: Inkubation und Visualisierung der Screening-Platten. <a href="/files/ftp_upload/57393/57393fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Keyboard</td>
			<td>Local Provider</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Used for protocol design and operating the Biomek FX</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse</td>
			<td>Local Provider</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Used for protocol design and operating the Biomek FX</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer Screen</td>
			<td>Local Provider</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Used for protocol design and operating the Biomek FX</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer</td>
			<td>Local Provider</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Used for protocol design and operating the Biomek FX</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DIVERSet Diverse Screening Library</td>
			<td>ChemBridge</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Chemical library</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biomek Software</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Runs and designs the Biomek FX</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Device Controller</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>719366</td>
			<td>Operates the water pump/tip washing station</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stacker Carousel Pendent</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>148240</td>
			<td>Manual operation of Biomek Stacker Carousel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biomek Stacker Carousel</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>148520</td>
			<td>Rotary unit that houses all FX Stacker 10&#39;s</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FX Stacker 10</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>148522</td>
			<td>Elevator unit that houses components for screen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FX Stacker 10</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>148522</td>
			<td>Elevator unit that houses components for screen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FX Stacker 10</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>148522</td>
			<td>Elevator unit that houses components for screen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FX Stacker 10</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>148522</td>
			<td>Elevator unit that houses components for screen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biomek FX</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>https://www.beckman.com/liquid-handlers</td>
			<td>Robot that performs the desired operations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accuframe</td>
			<td>Artisan Technology Group</td>
			<td>76853-4</td>
			<td>Frames arm to place components corretly</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Framing Fixture</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>719415</td>
			<td>Centers arm in the Accuframe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multichannel Tip Wash ALP</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>719662</td>
			<td>Washes the tips after the ethanol bath</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tip Loader ALP</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>719356</td>
			<td>Pneumatically loads tips onto the arm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Air Compressor</td>
			<td>Local Provider</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Provides air for pneumatic tip loading</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MasterFlex Console Drive</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>77200-65</td>
			<td>Pump used to circulate water through the Multichannel Tip Washer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Air Hose</td>
			<td>Local Provider</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Provides air from air compressor to Tip Loader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Hose</td>
			<td>Local Provider</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Provides water from 5 Gallon Reserviour to Tip Washer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Static ALP&#39;s</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Comes with Biomek FX</td>
			<td>Supports equipment for the Screen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 Gallon Reserviour</td>
			<td>Local Provider</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Recirculates the dirty water from cleaning the tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grippers</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Comes with Biomek FX</td>
			<td>Grabs and moves the equipment to the correct places</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-Channel 200 &#181;L Head</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Comes with Biomek FX</td>
			<td>Holds the 96 tips used within the screen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AP96 P200 Pipette Tips</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>717251</td>
			<td>Used to make the screening library</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 Well Flat Bottom Plate</td>
			<td>Costar</td>
			<td>9018</td>
			<td>Aids in visulization of screen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 Well V-Bottom Plate</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3897</td>
			<td>Aids in storing of dilution library</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlumaSeal 96 Sealing Film</td>
			<td>MedSci</td>
			<td>F-96-100</td>
			<td>Seals for storage both the chemicle library and dilution library</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic ziplock sandwich bags</td>
			<td>Local Provider</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Used to ensure a humid environment for screen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AP96 P20 Pipette Tips</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>717254</td>
			<td>Used in the dilution library creation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth Chamber</td>
			<td>Percival</td>
			<td>AR36L3</td>
			<td>Germinates seeds for phenotypic visulization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatula</td>
			<td>Local Provider</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Holds seeds to add into wells where liquid seeding failed seed adequatly</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toothpick</td>
			<td>Local Provider</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Pushes seeds from spatula to wells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murashige and Skoog Basal Salt Mixture</td>
			<td>PhytoTechnology Laboratories</td>
			<td>M524</td>
			<td>Add to MS media mixture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES Free Acid Monohydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>ICN19483580</td>
			<td>Added to MS media to decrease pH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar Powder</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>9002-18-0</td>
			<td>Increases thickness of media to support seed suspension</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5M KOH</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>484016</td>
			<td>Increases pH to adequate levels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1L Media Storage Bottle</td>
			<td>Corning</td>
			<td>1395-1L</td>
			<td>Holds enough media for a screen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene Centrifuge Tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431470</td>
			<td>Sterilizes seeds prior to vernilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH Probe</td>
			<td>Davis Instruments</td>
			<td>YX-58825-26</td>
			<td>Used for making media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ALPs (Automated Labware Positioners) Users Manual</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>PN 987836</td>
			<td>Aids in setting up the accompaning equipment for the Biomek FX</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biomek 2000 Stacker Carousel Users Guide</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>609862-AA</td>
			<td>Aids in setting up the Stacker Carousel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biomek FX and FXP Laboratory Automation Workstations Users Manual</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>PN 987834</td>
			<td>Used to frame the Multichannel Pod</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biomek FXP Laboratory Automation Workstation Customer Startup Guide</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>PN B32335AB</td>
			<td>Used to aid in setting up the Biomek FX</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biomek Software User&#39;s Manual</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>PN 987835</td>
			<td>Used to set up and understand the Software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optimizing the use of a liquid handling robot to conduct a high throughput forward chemical genetics screen of arabidopsis thaliana

Chemischer Genetik wird zunehmend Züge in Pflanzen zu entschlüsseln, die widerspenstigen zu traditionellen Genetik durch gen-Redundanz oder Letalität möglicherweise eingesetzt. Allerdings ist die Wahrscheinlichkeit eines synthetischen kleinen Moleküls als bioaktive gering; Daher müssen Tausende von Molekülen getestet werden, um diejenigen von Interesse finden. Liquid handling Roboter Systeme sind entworfen, um große Anzahl von Proben, die Erhöhung der Geschwindigkeit, mit der eine chemische Bibliothek untersucht werden kann, zusätzlich minimieren/Standardisierung Fehler, zu behandeln. Erreichung einen Hochdurchsatz-vorwärts Chemische Genetik-Bildschirm aus einer Bibliothek von 50.000 kleine Moleküle auf Arabidopsis Thaliana (Arabidopsis), Protokolle mit einer Benchtop-Mehrkanal-Flüssigkeit handling-Roboter entwickelt, die minimale erfordern Techniker-Beteiligung. Mit diesen Protokollen wurden 3.271 kleine Moleküle entdeckt, dass sichtbare phänotypische Veränderungen verursacht. 1.563 Verbindungen induziert kurze Wurzeln, 1.148 Verbindungen verändert Färbung, 383 Verbindungen verursacht Wurzelhaare und andere, nicht kategorisiert, Änderungen und 177 Verbindungen gehemmt Keimung.

Die Fähigkeit, genau und effizient charakterisieren Phänotypen basierend auf die Zugabe von kleinen Molekülen bei screening-Konzentrationen unter dem sezierenden Mikroskop ist das Endziel dieser Methode der vorwärts Chemische Genetik auf Arabidopsis. Die Phänotypen beobachtet, wenn alle 50.000 Verbindungen gezeigt hatte war vielfältig und kann in mehrere unterschiedliche Klassen (Abbildung 2) aufgeteilt werden. Abbildung 3A -F zeigt Beispiele der Phänotypen, die bei kleiner Vergrößerung unter dem sezierenden Mikroskop beobachtet wurden. Einige Phänotypen bereitgestellten eindeutigen Ergebnisse (Abbildung 3, H). Diese mussten erneut getestet werden, bei niedrigeren Konzentrationen um sicherzustellen, dass die Chemikalie keinen anderen Phänotyp bei einer niedrigeren Dosis bieten.
Schlechte Ergebnisse können aus vielen Gründen entstehen. Schlechte Keimrate der Samen ist. Dadurch kann eine Screening-Platte, überwiegend weisen keine Keimung oder unvollständige Keimung Phänotypen (Abbildung 3, H), die irreführend sein können. Um dies zu überwinden, vor dem test Keimrate für alle Samen verwendet. Sobald Keimrate sich etabliert haben und sind mehr als 95 % für Arabidopsis, ist Vernalisation von Saatgut vor chemischen Zusatz ein wichtiger Schritt, die gleichzeitige Keimung zu gewährleisten. Mangel an gleichzeitigen Keimung kann zu Fehlalarmen in Phänotypisierung führen. Darüber hinaus können schlechte Ergebnisse entstehen, wenn Medien erlaubt ist, während der Inkubation verdunsten. Diese mangelnde Flüssigkeitszufuhr verhindert, dass Samen keimen und kann durch den Einsatz von Austrocknung-Behältern vermieden werden. Darüber hinaus DMSO und Medien-Lösungen sind in den beiden externen Spalten jede Platte, Sicherstellung der ordnungsgemäßen Mikroklimata und Keimrate erzielt werden.
Befriedigende experimentelle Ergebnisse werden erzielt, wenn Keimungsraten sind > 95 %, Samen sind vor der Zugabe in 96-Well flach-Boden-Platten, Gewährleistung gleichzeitige Keimung, vernalized und Medien verdampft nicht während der Inkubation. Im Idealfall würden Chemikalien getestet werden, in einer Konzentration, die alle Samen zu keimen und Phänotypen genau beurteilt werden kann (Abb. 3A-F). Die Mehrheit der Behandlungen produziert Sämlinge mit Phänotypen, die optisch nicht zu unterscheiden von mock Steuerelemente mit keine morphologischen Phänotypen (Abbildung 3A), mit der überwiegenden Mehrheit der abweichende Phänotypen bestehend aus wurden gebleicht und stark verkümmerte Wurzeln (Abbildung 2).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57393/57393fig2v2.jpg"> Abbildung 2: die häufigsten Phänotypen beobachtet und der Anteil des einzelnen Phänotyps beobachtet. (A) insgesamt 3.271 kleine Moleküle erwiesen sich bei 100 µM bioaktiven nach vier Tagen Inkubationszeit. Die Farbe gibt den Schweregrad des Phänotyps (schwarz = schweren, weißen = weniger stark). Die am häufigsten beobachteten Phänotyp bezogen sich auf Wurzel Morphologie, mit mehr als 1.500 Verbindungen induzierende verkümmerte Wurzeln unterschiedlichen Schweregrades. Färbung wirkte auch häufig durch die Verbindungen in dieser Bibliothek mit 1.148 Sämlinge als vollkommen gebleicht oder teilweise verfärbt. Knapp 400 Mischungen produziert charakteristische Wurzelhaare Phänotypen – entweder verkümmert oder beide verkümmert und bunt. Schließlich war die Keimung von knapp 200 Verbindungen betroffen. In diesen Fällen Samen keimen nicht abgeschlossen oder nicht einmal ansatzweise zu keimen. (B) Sämlinge ausstellenden Anomalien in der Wurzel Morphologie, entweder verkümmert oder stark verkümmert, fast die Hälfte aller phänotypisch aberranten Sämlinge konstituiert. Die nächste größte Gruppe waren diejenigen, die in gebleichtem oder verfärbte Sämlinge geführt. Phänotypen, die Wurzelhaare Anomalien auch besteht ein beträchtlicher Teil, während die Hemmung der Keimung, entweder keine Keimung oder unvollständige Keimung betrafen, trat nur bei einem kleinen Prozentsatz aller bioaktiven Verbindungen. Schließlich gab es eine Reihe von Phänotypen, die bei solch einer niedrigen Frequenz aufgetreten, sie waren in der Kategorie "Sonstige", zum, die Beispiel, die Produktion von grünem Schleim, in Abbildung 3zu sehen war gruppiert. <a href="/files/ftp_upload/57393/57393fig2v2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57393/57393fig3.jpg"> Abbildung 3: Bilder der repräsentativen Phänotypen beobachtet, während der Bildschirm nach vorne Chemische Genetik. Keine sichtbaren morphologischen Anomalien (A), Braun (B), verkümmert (C) Root, stark verkümmert Wurzelhaare root (D), gebleicht (E), grüner Schleim (F), unvollständige Keimung (G) und keine Keimung (H). <a href="/files/ftp_upload/57393/57393fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57393/57393fig4.jpg"> Abbildung 4: Übersicht der Stapler 10 und Deck vor Einleitung des Protokolls eingerichtet. Die Stapler-Karussell besteht aus vier Stapler 10 (Hotels A - D) die jeweils zehn Zimmern untergebracht werden. Das Deck bietet eine Vielzahl an Alpen: Tipp-Loader, der Stapler-Shuttle, Multichannel-Tipp waschen und 13 statische Alpen. <a href="/files/ftp_upload/57393/57393fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57393/57393fig5.jpg"> Abbildung 5: Stapler 10 und Deck eingerichtet zum Erstellen einer Bibliothek Verdünnung erforderlich. Die vier Stapler 10 sind voller Kisten mit AP96 P20 Pipettenspitzen in Zimmer 1 und 6 des Hotels A - D und Stapeln von vier 96-Well-V-Bodenplatten in 2-5 und Zimmer 7-9 Zimmer des Hotels A - D. Das Deckslayout besteht aus zwei 300 mL Reservoirs auf statische Alpen P3 und P7. <a href="/files/ftp_upload/57393/57393fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57393/57393fig6.jpg"> Abbildung 6: Stapler 10 und Deck eingerichtet für Hinzufügen von Medien-Saatgut Mischung zu Screening Platten. Die Stapler-10 ist mit vier 96-Well-Wohnung geladen-Bodenplatten in Zimmer 1 und 2 des Hotel A. Das Deckslayout besteht aus zwei 300 mL Reservoirs auf statische Alpen P3 und P7 und eine Schachtel mit AP96 P250 Pipettenspitzen auf TL1. <a href="/files/ftp_upload/57393/57393fig6large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57393/57393fig7.jpg"> Abbildung 7: Stapler 10 und Deck eingerichtet für Hinzufügen von kleinen Molekülen zu Screening Platten. Die Stapler-10 ist mit einer Schachtel AP96 P250 Pipettenspitzen in Saal 1, einen Stapel von zwei 96-Well-V geladen-Verdünnung der unteren Platten in Zimmer 2, 4, 6, und 8 und einen Stapel von zwei 96-Well-Wohnung-Bodenplatten gefüllt mit der Medien-Saatgut-Mischung in Zimmer 3 , 5, 7 und 9. Das Deckslayout besteht aus zwei 300 mL Reservoirs auf statische Alpen P3 und P7. <a href="/files/ftp_upload/57393/57393fig7large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

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Optimizing the Use of a Liquid Handling Robot to Conduct a High Throughput Forward Chemical Genetics Screen of Arabidopsis thaliana

Optimierung der Nutzung eines Liquid Handling Roboters, einen hohen Durchsatz nach vorn Chemische Genetik Bildschirm von Arabidopsis Thaliana durchzuführen

Ein hoher Durchsatz-Bildschirm synthetische kleiner Moleküle wurde auf der Modell-Pflanzenart Arabidopsis Thalianadurchgeführt. Dieses Protokoll, entwickelt für eine liquid Handling-Roboter, erhöht die Geschwindigkeit des vorwärts Chemische Genetik Bildschirme, die Entdeckung der neuartigen kleine Moleküle, die Auswirkungen auf die Physiologie der Pflanzen zu beschleunigen.

Chemical genetics is increasingly being employed to decode traits in plants that may be recalcitrant to traditional genetics due to gene redundancy or ...

optimizing-use-liquid-handling-robot-to-conduct-high-throughput

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Optimizing the Use of a Liquid Handling Robot to Conduct a High Throughput Forward Chemical Genetics Screen of Arabidopsis thaliana

6.6K Aufrufe.  University of Kentucky. Ein hoher Durchsatz-Bildschirm synthetische kleiner Moleküle wurde auf der Modell-Pflanzenart Arabidopsis Thalianadurchgeführt. Dieses Protokoll, entwickelt für eine liquid Handling-Roboter, erhöht die Geschwindigkeit des vorwärts Chemische Genetik Bildschirme, die Entdeckung der neuartigen kleine Moleküle, die Auswirkungen auf die Physiologie der Pflanzen zu beschleunigen.

Serie: Optimizing the Use of a Liquid Handling Robot to Conduct a High Throughput Forward Chemical Genetics Screen of Arabidopsis thaliana

Adaptation of a Haptic Robot in a 3T fMRI

Functional magnetic resonance imaging (fMRI) provides excellent functional brain imaging via the BOLD signal 1 with advantages including non-ionizing radiation, millimeter spatial accuracy of anatomical and functional data 2, and nearly real-time analyses 3. Haptic robots provide precise measurement and control of position and force of a cursor in a reasonably confined space. Here we combine these two technologies to allow precision experiments involving motor control with haptic/tactile environment interaction such as reaching or grasping. The basic idea is to attach an 8 foot end effecter supported in the center to the robot 4 allowing the subject to use the robot, but shielding it and keeping it out of the most extreme part of the magnetic field from the fMRI machine (Figure 1).
The Phantom Premium 3.0, 6DoF, high-force robot (SensAble Technologies, Inc.) is an excellent choice for providing force-feedback in virtual reality experiments 5, 6, but it is inherently non-MR safe, introduces significant noise to the sensitive fMRI equipment, and its electric motors may be affected by the fMRI's strongly varying magnetic field. We have constructed a table and shielding system that allows the robot to be safely introduced into the fMRI environment and limits both the degradation of the fMRI signal by the electrically noisy motors and the degradation of the electric motor performance by the strongly varying magnetic field of the fMRI. With the shield, the signal to noise ratio (SNR: mean signal/noise standard deviation) of the fMRI goes from a baseline of &tilde;380 to &tilde;330, and &tilde;250 without the shielding. The remaining noise appears to be uncorrelated and does not add artifacts to the fMRI of a test sphere (Figure 2). The long, stiff handle allows placement of the robot out of range of the most strongly varying parts of the magnetic field so there is no significant effect of the fMRI on the robot. The effect of the handle on the robot's kinematics is minimal since it is lightweight (&tilde;2.6 lbs) but extremely stiff 3/4" graphite and well balanced on the 3DoF joint in the middle. The end result is an fMRI compatible, haptic system with about 1 cubic foot of working space, and, when combined with virtual reality, it allows for a new set of experiments to be performed in the fMRI environment including naturalistic reaching, passive displacement of the limb and haptic perception, adaptation learning in varying force fields, or texture identification 5, 6.

The adaptation and use of a haptic robot in a 3T fMRI is described.

Anpassung eines Haptic Robot in einem 3T fMRT

Functional magnetic resonance imaging (fMRI) provides excellent functional brain imaging via the BOLD signal 1 with advantages including non-ionizing ...

Forschung

Biotechnik

High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and high-fidelity measurements of large systems. Microfluidics promises to fulfill many of these requirements, such as performing high-throughput screening experiments on-chip, encompassing biochemical, biophysical, and cell-based assays1. Since the early days of microfluidics devices, this field has drastically evolved, leading to the development of microfluidic large-scale integration2,3. This technology allows for the integration of thousands of micromechanical valves on a single device with a postage-sized footprint (Figure 1). We have developed a high-throughput microfluidic platform for generating in vitro expression of protein arrays (Figure 2) named PING (Protein Interaction Network Generator). These arrays can serve as a template for many experiments such as protein-protein 4, protein-RNA5 or protein-DNA6 interactions.
The device consist of thousands of reaction chambers, which are individually programmed using a microarrayer. Aligning of these printed microarrays to microfluidics devices programs each chamber with a single spot eliminating potential contamination or cross-reactivity Moreover, generating microarrays using standard microarray spotting techniques is also very modular, allowing for the arraying of proteins7, DNA8, small molecules, and even colloidal suspensions. The potential impact of microfluidics on biological sciences is significant. A number of microfluidics based assays have already provided novel insights into the structure and function of biological systems, and the field of microfluidics will continue to impact biology.

We present a microfluidic approach for the expression of protein arrays. The device consists of thousands of reaction chambers controlled by micro-mechanical valves. The microfluidic device is mated to a microarray-printed gene library. These genes are then transcribed and translated on-chip, resulting in a protein array ready for experimental use.

High-throughput Protein Expression Generator mit einem mikrofluidischen Plattform

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and ...

High-throughput Synthesis of Carbohydrates and Functionalization of Polyanhydride Nanoparticles

Transdisciplinary approaches involving areas such as material design, nanotechnology, chemistry, and immunology have to be utilized to rationally design efficacious vaccines carriers. Nanoparticle-based platforms can prolong the persistence of vaccine antigens, which could improve vaccine immunogenicity1. Several biodegradable polymers have been studied as vaccine delivery vehicles1; in particular, polyanhydride particles have demonstrated the ability to provide sustained release of stable protein antigens and to activate antigen presenting cells and modulate immune responses2-12.
The molecular design of these vaccine carriers needs to integrate the rational selection of polymer properties as well as the incorporation of appropriate targeting agents. High throughput automated fabrication of targeting ligands and functionalized particles is a powerful tool that will enhance the ability to study a wide range of properties and will lead to the design of reproducible vaccine delivery devices.
The addition of targeting ligands capable of being recognized by specific receptors on immune cells has been shown to modulate and tailor immune responses10,11,13 C-type lectin receptors (CLRs) are pattern recognition receptors (PRRs) that recognize carbohydrates present on the surface of pathogens. The stimulation of immune cells via CLRs allows for enhanced internalization of antigen and subsequent presentation for further T cell activation14,15. Therefore, carbohydrate molecules play an important role in the study of immune responses; however, the use of these biomolecules often suffers from the lack of availability of structurally well-defined and pure carbohydrates. An automation platform based on iterative solution-phase reactions can enable rapid and controlled synthesis of these synthetically challenging molecules using significantly lower building block quantities than traditional solid-phase methods16,17.
Herein we report a protocol for the automated solution-phase synthesis of oligosaccharides such as mannose-based targeting ligands with fluorous solid-phase extraction for intermediate purification. After development of automated methods to make the carbohydrate-based targeting agent, we describe methods for their attachment on the surface of polyanhydride nanoparticles employing an automated robotic set up operated by LabVIEW as previously described10. Surface functionalization with carbohydrates has shown efficacy in targeting CLRs10,11 and increasing the throughput of the fabrication method to unearth the complexities associated with a multi-parametric system will be of great value (Figure 1a).

In this article, a high throughput method is presented for the synthesis of oligosaccharides and their attachment to the surface of polyanhydride nanoparticles for further use in targeting specific receptors on antigen presenting cells.

Hochdurchsatz-Synthese von Kohlenhydraten und Funktionalisierung von Nanopartikeln Polyanhydrid

Transdisciplinary approaches involving areas such as material design, nanotechnology, chemistry, and immunology have to be utilized to rationally design ...

Designing a Bio-responsive Robot from DNA Origami

Nucleic acids are astonishingly versatile. In addition to their natural role as storage medium for biological information1, they can be utilized in parallel computing2,3 , recognize and bind molecular or cellular targets4,5 , catalyze chemical reactions6,7 , and generate calculated responses in a biological system8,9. Importantly, nucleic acids can be programmed to self-assemble into 2D and 3D structures10-12, enabling the integration of all these remarkable features in a single robot linking the sensing of biological cues to a preset response in order to exert a desired effect.
Creating shapes from nucleic acids was first proposed by Seeman13, and several variations on this theme have since been realized using various techniques11,12,14,15 . However, the most significant is perhaps the one proposed by Rothemund, termed scaffolded DNA origami16. In this technique, the folding of a long (&gt;7,000 bases) single-stranded DNA 'scaffold' is directed to a desired shape by hundreds of short complementary strands termed 'staples'. Folding is carried out by temperature annealing ramp. This technique was successfully demonstrated in the creation of a diverse array of 2D shapes with remarkable precision and robustness. DNA origami was later extended to 3D as well17,18 .
 
The current paper will focus on the caDNAno 2.0 software19 developed by Douglas and colleagues. caDNAno is a robust, user-friendly CAD tool enabling the design of 2D and 3D DNA origami shapes with versatile features. The design process relies on a systematic and accurate abstraction scheme for DNA structures, making it relatively straightforward and efficient.
In this paper we demonstrate the design of a DNA origami nanorobot that has been recently described20. This robot is 'robotic' in the sense that it links sensing to actuation, in order to perform a task. We explain how various sensing schemes can be integrated into the structure, and how this can be relayed to a desired effect. Finally we use Cando21 to simulate the mechanical properties of the designed shape. The concept we discuss can be adapted to multiple tasks and settings.

DNA origami is a powerful method for fabricating precise nanoscale objects by programming the self-assembly of DNA molecules. Here, we describe how DNA origami can be utilized to design a robotic robot capable of sensing biological cues and responding by shape shifting, subsequently relayed to a desired effect.

Entwerfen einer Bio-responsive Robot von DNA Origami

Nucleic acids are astonishingly versatile. In addition to their natural role as storage medium for biological information1, they can be utilized in ...

High-throughput, Automated Extraction of DNA and RNA from Clinical Samples using TruTip Technology on Common Liquid Handling Robots

TruTip is a simple nucleic acid extraction technology whereby a porous, monolithic binding matrix is inserted into a pipette tip. The geometry of the monolith can be adapted for specific pipette tips ranging in volume from 1.0 to 5.0 ml. The large porosity of the monolith enables viscous or complex samples to readily pass through it with minimal fluidic backpressure. Bi-directional flow maximizes residence time between the monolith and sample, and enables large sample volumes to be processed within a single TruTip. The fundamental steps, irrespective of sample volume or TruTip geometry, include cell lysis, nucleic acid binding to the inner pores of the TruTip monolith, washing away unbound sample components and lysis buffers, and eluting purified and concentrated nucleic acids into an appropriate buffer. The attributes and adaptability of TruTip are demonstrated in three automated clinical sample processing protocols using an Eppendorf epMotion 5070, Hamilton STAR and STARplus liquid handling robots, including RNA isolation from nasopharyngeal aspirate, genomic DNA isolation from whole blood, and fetal DNA extraction and enrichment from large volumes of maternal plasma (respectively).

TruTip is a simple nucleic acid extraction technology whereby a porous, monolithic binding matrix is inserted into a pipette tip. Consequently, the sample preparation format is compatible with most liquid handling instruments, and can be used for many medium to high-throughput clinical applications and sample types.

Hochdurchsatz-, Automated Extraktion von DNA und RNA aus klinischen Proben mit TruTip Technologie Gemeinsames Liquid Handling Robots

TruTip is a simple nucleic acid extraction  technology whereby a porous, monolithic binding matrix is inserted into a  pipette tip. The geometry of the ...

Optimizing Attachment of Human Mesenchymal Stem Cells on Poly(&#949;-caprolactone) Electrospun Yarns

Research into biomaterials and tissue engineering often includes cell-based in vitro investigations, which require initial knowledge of the starting cell number. While researchers commonly reference their seeding density this does not necessarily indicate the actual number of cells that have adhered to the material in question. This is particularly the case for materials, or scaffolds, that do not cover the base of standard cell culture well plates. This study investigates the initial attachment of human mesenchymal stem cells seeded at a known number onto electrospun poly(&#949;-caprolactone) yarn after 4 hr in culture. Electrospun yarns were held within several different set-ups, including bioreactor vessels rotating at 9 rpm, cell culture inserts positioned in low binding well plates and polytetrafluoroethylene (PTFE) troughs placed within petri dishes. The latter two were subjected to either static conditions or positioned on a shaker plate (30 rpm). After 4 hr incubation at 37&#160;oC, 5% CO2, the location of seeded cells was determined by cell DNA assay. Scaffolds were removed from their containers and placed in lysis buffer. The media fraction was similarly removed and centrifuged &#8211; the supernatant discarded and pellet broken up with lysis buffer. Lysis buffer was added to each receptacle, or well, and scraped to free any cells that may be present. The cell DNA assay determined the percentage of cells present within the scaffold, media and well fractions. Cell attachment was low for all experimental set-ups, with greatest attachment (30%) for yarns held within cell culture inserts and subjected to shaking motion. This study raises awareness to the actual number of cells attaching to scaffolds irrespective of the stated cell seeding density.

This article describes a range of set-ups for seeding human mesenchymal stem cells onto materials, in this case electrospun yarns, that do not cover the base of standard culture well plates in order to maximize and quantify the number of cells that initially attach compared to the known seeding density.

Optimierung der Befestigung der humanen mesenchymalen Stammzellen auf Poly (ε-caprolacton) Elektrogesponnene Garne

Research into biomaterials and tissue engineering often includes cell-based in vitro investigations, which require initial knowledge of the starting cell ...

Use of a High-throughput In Vitro Microfluidic System to Develop Oral Multi-species Biofilms

There are few high-throughput in vitro systems which facilitate the development of multi-species biofilms that contain numerous species commonly detected within in vivo oral biofilms. Furthermore, a system that uses natural human saliva as the nutrient source, instead of artificial media, is particularly desirable in order to support the expression of cellular and biofilm-specific properties that mimic the in vivo communities. We describe a method for the development of multi-species oral biofilms that are comparable, with respect to species composition, to supragingival dental plaque, under conditions similar to the human oral cavity. Specifically, this methods article will describe how a commercially available microfluidic system can be adapted to facilitate the development of multi-species oral biofilms derived from and grown within pooled saliva. Furthermore, a description of how the system can be used in conjunction with a confocal laser scanning microscope to generate 3-D biofilm reconstructions for architectural and viability analyses will be presented. Given the broad diversity of microorganisms that grow within biofilms in the microfluidic system (including Streptococcus, Neisseria, Veillonella, Gemella, and Porphyromonas), a protocol will also be presented describing how to harvest the biofilm cells for further subculture&#160;or DNA extraction and analysis. The limits of both the microfluidic biofilm system and the current state-of-the-art data analyses will be addressed. Ultimately, it is envisioned that this article will provide a baseline technique that will improve the study of oral biofilms and aid in the development of additional technologies that can be integrated with the microfluidic platform.

Use of a High-throughput In Vitro Microfluidic System to Develop Oral Multi-species Biofilms

The goal of this methods paper is to describe the use of a microfluidic system for the development of multi-species biofilms that contain species typically identified in human supragingival dental plaque.&#160;Methods to describe biofilm architecture, biofilm viability, and an approach to harvest biofilm for culture-dependent or culture-independent analyses are highlighted.

Verwendung eines Hochdurchsatz-<em&gt; In-vitro-</em&gt; Mikrofluidik-System auf die mündliche Multi-Spezies-Biofilme entwickeln

There are few high-throughput in vitro systems which facilitate the development of multi-species biofilms that contain numerous species commonly detected ...

Generation of Scalable, Metallic High-Aspect Ratio Nanocomposites in a Biological Liquid Medium

The goal of this protocol is to describe the synthesis of two novel biocomposites with high-aspect ratio structures. The biocomposites consist of copper and cystine, with either copper nanoparticles (CNPs) or copper sulfate contributing the metallic component. Synthesis is carried out in liquid under biological conditions (37 &#176;C) and the self-assembled composites form after 24 hr. Once formed, these composites are highly stable in both liquid media and in a dried form. The composites scale from the nano- to micro- range in length, and from a few microns to 25 nm in diameter. Field emission scanning electron microscopy with energy dispersive X-ray spectroscopy (EDX) demonstrated that sulfur was present in the NP-derived linear structures, while it was absent from the starting CNP material, thus confirming cystine as the source of sulfur in the final nanocomposites. During synthesis of these linear nano- and micro-composites, a diverse range of lengths of structures is formed in the synthesis vessel. Sonication of the liquid mixture after synthesis was demonstrated to assist in controlling average size of the structures by diminishing the average length with increased time of sonication. Since the formed structures are highly stable, do not agglomerate, and are formed in liquid phase, centrifugation may also be used to assist in concentrating and segregating formed composites.

Here we present a protocol to synthesize novel, high-aspect ratio biocomposites under biological conditions and in liquid media. The biocomposites scale from nanometers to micrometers in diameter and length, respectively. Copper nanoparticles (CNPs) and copper sulfate combined with cystine are the key components for the synthesis.

Generation skalierbar, Metallic Hochseitenverhältnis Nanokomposite in einer biologischen Flüssigmedium

The goal of this protocol is to describe the synthesis of two novel biocomposites with high-aspect ratio structures. The biocomposites consist of copper ...

Automated Robotic Liquid Handling Assembly of Modular DNA Devices

Recent advances in modular DNA assembly techniques have enabled synthetic biologists to test significantly more of the available &#34;design space&#34; represented by &#34;devices&#34; created as combinations of individual genetic components. However, manual assembly of such large numbers of devices is time-intensive, error-prone, and costly. The increasing sophistication and scale of synthetic biology research necessitates an efficient, reproducible way to accommodate large-scale, complex, and high throughput device construction.
Here, a DNA assembly protocol using the Type-IIS restriction endonuclease based Modular Cloning (MoClo) technique is automated on two liquid-handling robotic platforms. Automated liquid-handling robots require careful, often times tedious optimization of pipetting parameters for liquids of different viscosities (e.g. enzymes, DNA, water, buffers), as well as explicit programming to ensure correct aspiration and dispensing of DNA parts and reagents. This makes manual script writing for complex assemblies just as problematic as manual DNA assembly, and necessitates a software tool that can automate script generation. To this end, we have developed a web-based software tool, http://mocloassembly.com, for generating combinatorial DNA device libraries from basic DNA parts uploaded as Genbank files. We provide access to the tool, and an export file from our liquid handler software which includes optimized liquid classes, labware parameters, and deck layout. All DNA parts used are available through Addgene, and their digital maps can be accessed via the Boston University BDC ICE Registry. Together, these elements provide a foundation for other organizations to automate modular cloning experiments and similar protocols.
The automated DNA assembly workflow presented here enables the repeatable, automated, high-throughput production of DNA devices, and reduces the risk of human error arising from repetitive manual pipetting. Sequencing data show the automated DNA assembly reactions generated from this workflow are ~95% correct and require as little as 4% as much hands-on time, compared to manual reaction preparation.

Here, an automated workflow to perform modular DNA &#34;device&#34; assembly using a modular cloning DNA assembly method on liquid-handling robots is presented. The protocol uses an intuitive software tool for generating liquid handler picklists for combinatorial DNA device library generation, which we demonstrate using two liquid handling platforms.

Automatisierte Roboter Liquid Handling Versammlung Modular DNA-Geräte

Recent advances in modular DNA assembly techniques have enabled synthetic biologists to test significantly more of the available &#34;design space&#34; ...

Synthesis of Biocompatible Liquid Crystal Elastomer Foams as Cell Scaffolds for 3D Spatial Cell Cultures

Here, we present a step-by-step preparation of a 3D, biodegradable, foam-like cell scaffold. These scaffolds were prepared by cross-linking star block co-polymers featuring cholesterol units as side-chain pendant groups, resulting in smectic-A (SmA) liquid crystal elastomers (LCEs). Foam-like scaffolds, prepared using metal templates, feature interconnected microchannels, making them suitable as 3D cell culture scaffolds. The combined properties of the regular structure of the metal foam and of the elastomer result in a 3D cell scaffold that promotes not only higher cell proliferation compared to conventional porous templated films, but also better management of mass transport (i.e., nutrients, gases, waste, etc.). The nature of the metal template allows for the easy manipulation of foam shapes (i.e., rolls or films) and for the preparation of scaffolds of different pore sizes for different cell studies while preserving the interconnected porous nature of the template. The etching process does not affect the chemistry of the elastomers, preserving their biocompatible and biodegradable nature. We show that these smectic LCEs, when grown for extensive time periods, enable the study of clinically relevant and complex tissue constructs while promoting the growth and proliferation of cells.

This study presents a methodology to prepare 3D, biodegradable, foam-like cell scaffolds based on biocompatible side-chain liquid crystal elastomers (LCEs). Confocal microscopy experiments show that foam-like LCEs allow for cell attachment, proliferation, and the spontaneous alignment of C2C12s myoblasts.

Synthese von biokompatiblen Liquid Crystal Elastomerschäume als Zellgerüste für 3D Spatial Zellkulturen

Here, we present a step-by-step preparation of a 3D, biodegradable, foam-like cell scaffold. These scaffolds were prepared by cross-linking star block ...