Z.C. erkennt die Unterstützung von Dartmouth Gründerfonds und Branco Weiss - Gesellschaft für Wissenschaft Gemeinschaft, verwaltet von der ETH Zürich. Die Autoren danken Dr. Larry A. Taber, Benjamen A. Filas, Qiaohang Guo, sowie Yunfei Shi für hilfreiche Gespräche und die anonyme Gutachter für Kommentare. Dieses Material basiert auf Arbeit, unterstützt von der National Science Foundation Graduate Research Fellowship unter Grant Nr. DGE-1313911. Jede Meinung, Erkenntnisse und Schlussfolgerungen oder Empfehlungen ausgedrückt in diesem Material sind diejenigen der Autoren (s) und spiegeln nicht unbedingt die Ansichten von der National Science Foundation.

1. Vorbereitung des Gewebes Nährmedien
<ol><li>Verwenden Sie eine 0,5 L Flasche von Dulbeccos geändert Eagle Medium (DMEM) mit 4,5 g/L Glukose, Natriumbicarbonat und L-Glutamin als Basis für die Nährmedien.</li>
	<li>Fügen Sie in einem sterilen Laminar-Flow-Haube 10 mL von Antibiotika bis 0,5 L von DMEM hinzu</li>
	<li>Mit einer sterilen Pipette, 50 mL DMEM-Antibiotika-Lösung auf einem sterilen 50 mL konische Rohr übertragen.</li>
	<li>Die restliche DMEM-Antibiotika-Lösung in der 0,5 L Flasche in der sterilen Haube Küken Serum 50 mL hinzufügen.</li>
	<li>Speichern Sie die endgültige Lösung (genannt jenseits Küken Nährmedien [CCM]) in 50 mL konische Rohr Aliquote bei-20 ° C.</li>
</ol>2. Ei Ausbrüten
<ol><li>Verwendung zarte wischt mit 70 % Ethanol befruchteten bestimmten Pathogen-freies weiße Leghorn Hühnereier zu reinigen. Eier in einer longitudinalen Ausrichtung auf Inhaber zu arrangieren.</li>
	<li>Schalten Sie eine eibrutkasten eine Solltemperatur von 37,5 ° C und die Luftfeuchtigkeit bei 48-55 %. Die Luftfeuchtigkeit wird gesteuert, indem man eine entsprechende Menge an Wasser in den Inkubator.</li>
	<li>Brüten Sie die Eier, HH11-13, ca. 40-44 h.</li>
	<li>Lassen Sie die Eier bei Raumtemperatur für ca. 15-30 min vor dem Sprühen/Reinigung mit 70 % Ethanol abkühlen.</li>
</ol>3. ziehen Sie Glaskapillaren
<ol><li>Montieren Sie eine 10 cm lange Glas-Kapillarröhrchen mit einem äußeren Durchmesser von 1,0 mm und einem Innendurchmesser von 0,5 mm auf einer Mikropipette Abzieher.</li>
	<li>Hitze und Parameter bzw. 750 und 400, zu ziehen. Das Kapillarrohr in dünne Nadeln ziehen mit der Taste ziehen.</li>
</ol>(4) Filterpapier Carrier Methode
<ol><li>Schneiden Sie die Kreise von ca. 3 cm Durchmesser aus Filterpapier.</li>
	<li>Schneiden Sie ein Rechteck etwa 1 cm x 2 cm aus dem Kreis mit einem Loch-Puncher. Achten Sie darauf, entfernen alle hervorstehenden oder scharfe Ecken.</li>
</ol>5. Embryo Ernte und Vorbereitung
<ol><li>Eier von unten, ziehen Sie die Schale vorsichtig auseinander und Zahlen Sie Inhalt sorgfältig auf eine 150 x 15 mm Petrischale ein. Um sicherzustellen, dass der Embryo-Seite nach oben zeigt, halten Sie die Eier in der gleichen Ausrichtung, die sie beim knacken sie inkubiert wurden.</li>
	<li>Entfernen Sie die dünnen Albumin mit einer Einweg-Pasteurpipette.</li>
	<li>Trennen Sie die dicken Albumin aus dem Dotter mit stumpfen Pinzette endete. Sicherstellen Sie, dass die dicken Albumin durch kratzen leicht oben auf das Eigelb mit der stumpfen endete Pinzette entfernt wurde.</li>
	<li>Verwenden Sie feine Spitzen Pinzette zu zentrieren und legen einen Filterpapier Ring über dem Embryo, Abgleich der Längsachse des Ringes mit der Längsachse des Embryos.</li>
	<li>Schneiden Sie das Eigelb, die rund um das Filterpapier-Ring mit einer Schere.</li>
	<li>Ziehen Sie den Ring und Embryo aus dem Eigelb in eine schräge Richtung der Website wo das Eigelb zuerst geschnitten wurde.</li>
	<li>Spülen Sie die Embryonen in zwei sequentielle 100-mm-Gerichte mit Raumtemperatur 1 x Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS).</li>
	<li>Legen Sie einen Filterpapier Ring in einer 35-mm-Petrischale zunächst. Dann stellen Sie die Embryo dorsale Seite nach oben auf das Filterpapier bereits in 35-mm-Petrischale.</li>
	<li>Legen Sie einen Edelstahl-Ring auf das Filterpapier Sandwich. Achten Sie darauf, nicht den Embryo schädigen.</li>
	<li>Jede Petrischale 3 mL der vorbereiteten CCM hinzufügen.</li>
	<li>Entfernen Sie die VM von jedem Embryo durch leicht überfliegen die gezogene Kapillare Nadel am oberen Rand der Embryo und peeling entfernt die VM, ab dem vorderen Ende (rechts oben das Vorderhirn) und Sie fortfahren, um die Chorda (Abbildung 1A).</li>
	<li>Legen Sie acht 35 mm Petrischalen in einer 150 mm-Gericht, das mit Wasser gesättigt heikle Aufgabe Tücher (um die Feuchtigkeit zu erhalten) ausgekleidet war.</li>
	<li>Ort der 150-mm-Petrischale in einem verschließbaren Plastikbeutel füllen Sie den Beutel mit einem Gasgemisch, bestehend aus 95 % O2 und 5 % CO2.</li>
	<li>Den Beutel und legen Sie es in einem Inkubator 37,5 ° C.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Embryonen für weitere 27 h bis HH15-HH16 (Abbildung 1 b).</li>
</ol>(6) induzieren Oberflächenspannung
<ol><li>Entfernen Sie die Embryonen aus dem Inkubator und verwenden Sie eine optische Kohärenz Tomographie (OCT) System, um sie Bild. Verwendung OCT Verdrehwinkel des Neuralrohrs (NT) (Abbildung 2) zu bestimmen.</li>
	<li>Transfer der Embryonen zu einem Lichtmikroskop und visualisieren Sie bei 10-facher Vergrößerung. Verwenden Sie eine 200 Mikroliter-Pipette, um inkrementell 0,2 mL von Medien aus der Petrischale zu entfernen.</li>
	<li>Nehmen Sie Hellfeld Bilder bei jedem Intervall, die Auswirkungen der Medien-Luftschnittstelle auf den Embryo zu beobachten.</li>
	<li>Medien zu entfernen, bis die Oberflächenspannung in den Embryo Torsion (Abbildung 1) induziert.</li>
	<li>Bild des Embryos mit dem OCT-System wieder herstellen einer endgültigen Verdrehwinkel zum Vergleich, Embryonen zu kontrollieren.  Hinweis: Die Bright-Field-Bilder wurden mit einem sezierenden Mikroskop erworben. Eine optische Kohärenz Tomographie System mit einem angehängten Mikroskop wurde verwendet, um Cross-Sectional Bild Stapel von live Embryonen zu erwerben. Bilder waren in einer 3 x 10 x 3 mm3 Scan Domäne erhalten, dann in eine imaging-Software verarbeitet. Zu guter Letzt wurden die physikalischen modelbilder mit einer digitalen Spiegelreflexkamera aufgenommen.</li>
</ol>(7) physikalische Modellierung der Oberflächenspannung/VM Kräfte
<ol><li>Entwickeln Sie eine vereinfachte 3D Geometrie, die einen Embryo zwischen HH14-17 in kommerziellen Modellierungssoftware (Abbildung 3A) ähnelt.</li>
	<li>Die Negativform der 3D-Geometrie in kommerziellen 3D Computer-Grafik-Software zu entwerfen.</li>
	<li>Verwendung ein 3D-Druckers mit 1,75 mm Acrylnitril Butadien Styrol Filament zu 3D geladen Drucken die Form, in köraform (STL) Format.</li>
	<li>Um die Form gegossen, mischen Sie Silikon-Kautschuk-Elastomer-Komponenten A und B zu gleichen Teilen und Gießen Sie die Mischung in die Form sofort; Legen Sie die Gussform, bei Raumtemperatur für 12 h (Abb. 3 b) zu heilen.</li>
	<li>Markieren Sie das physikalische Modell des Embryos entlang der NT an der dorsalen Seite Torsion zu visualisieren.</li>
	<li>Verwenden Sie ein Deckglas Replizieren der Krafteinwirkung auf das physische 3D-Modell der VM oder Oberflächenspannung (Abbildung 3D) nachahmt.</li>
	<li>Legen Sie eine Reihe von starren Drähte gleichlang auf die Seite des physikalischen Modells. Nachdem das Deckglas eine externe Kraft auf das Gehirn Modell ausübt, werden die Drähte in einem Winkel geneigt, die von der Lage abhängt. Bestimmen Sie den Drehwinkel von Arctan die projizierte Länge über die ursprüngliche Länge jedes Drahtes (Abbildung 3E).</li>
</ol>8. ändern die Richtung der Herz-Schleife
<ol><li>Folgen Sie den Schritten in 3.1 und 3.2, zog Kapillarrohr zu erhalten.</li>
	<li>Folgen Sie den Schritten in 5.1 durch 5.10 Embryos vorzubereiten.</li>
	<li>Verwenden Sie ein paar der Zange, um das Filterpapier zu kippen, so dass der Embryo Ventral-Side-Up wird.</li>
	<li>Verwenden Sie zog Kapillarrohr einen Schlitz in der Splanchnopleure (SPL) Membran aufzuschneiden.</li>
	<li>Verwenden Sie das Kapillarrohr, um eine mechanische Kraft, das Herz von der rechten Seite auf die linke Seite schieben.</li>
	<li>Folgen Sie den Schritten in 5.12 durch 5.15, die Veränderung der Torsion zu beobachten.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Taber, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomechanics+of+Growth,+Remodeling,+and+Morphogenesis.">Biomechanics of Growth, Remodeling, and Morphogenesis.</a> Appl. Mech. Rev. 48, 487-545 (1995).</li><li>Wyczalkowski, M. A., Chen, Z., Filas, B. A., Varner, V. D., Taber, L. 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Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.

Während physikalische Phänomene eine wesentliche Rolle in Morphogenese26,27,28,29,30, die spezifischen mechanische Mechanismen sowie die Koordination von mechanischen spielen und Molekulare Mechanismen bleiben weitgehend unerforscht. Es ist bekannt, dass die ventrale Biegung und rechts Torsion des primitiven Gehirns sind zwei zentrale Prozesse, die zur frühen embryonalen Morphogenese18,31,32,33beitragen, 34, aber keine vorherige Studien behandelt die mechanische Ursprünge des Gehirns Torsion, eine der frühesten ORGANEBENE links-rechts-Asymmetrie.
Die wichtigsten Schritte des Protokolls gehören die Entfernung der VM, die mechanische Triebkraft für Gehirn Torsion zu identifizieren und die Anwendung der flüssigen Oberflächenspannung um die Ergebnisse zu bestätigen. Die Problembehandlung von dieser Technik fand in der Anfangsphase zu identifizieren, an der die VM entfernt werden sollte, um bedeutende Veränderungen im Torsion zu bewirken.
Die nach unten passive Kraft der VM wurde gezeigt, zu einer grundlegenden mechanischen Grenzen für die wachsenden embryonalen Gehirn-Röhre. Wenn die VM des Embryos entfernt wurde, das Gehirn nicht mehr Wendungen auf ein normales Maß aber ließe sich an die Steuerungsebene durch die anschließende Anwendung der Oberflächenspannung durch Absenken des Flüssigkeitsspiegels zu verdrehen. Die bekannten Oberflächenspannung von Wasser bei Raumtemperatur ist 72.01 ± 0,1 mN/m, und die Kontaktlänge des Ordens Millimeter ist, die Kraft kann dann berechnet werden. Dabei schätzten wir, dass die VM eine Kraft von ca. 10 Minuten auf die HH 14-17 Embryo12ausgeübt.
Unter Verwendung dieses Protokolls, konnten wir feststellen, dass die VM im embryonalen Gehirn Torsion mechanische eine Schlüsselrolle spielt. Die erzielten Ergebnisse mit diesem neuen Protokoll legt nahe, dass die VM eine wichtige Struktur für das Fortschreiten der normalen Gehirn Torsion während der embryonalen Morphogenese, als es die geometrische Abhängigkeiten und notwendig für die Verdrehung der mechanischen Belastung liefert die Gehirn-35. Die Ergebnisse zeigten auch, dass die Position des Herzens die Richtung des Gehirns Torsion bestimmt. L-R Asymmetrie des Embryos während der Entwicklung führt zu einer Recht geloopt Form des Herzens, die wiederum treibt nach rechts Verdrehen des Gehirns36,37,38,39. Es ist erwähnenswert, dass die mechanische Methode der Verdrängung des Herzens Position unterscheidet sich von anderen Forschern13 entwickelte chemische Methode und besser ist für die Abgrenzung der Rolle der Mechanik in Morphogenese. Unsere Ergebnisse zeigen insgesamt, die fundamentale Rolle der Mechanik beim fahren Torsionssteifigkeit Gehirn Morphogenese in der Küken-Embryos.
In Zukunft kann das Protokoll angewendet werden, um wie genetische und mechanische Faktoren zu identifizieren, gemeinsam regelmäßige embryonalen Torsion und enthüllen, wie diese verschiedenen Faktoren um entsprechende Morphogenese sicherzustellen arbeiten.

Modernen Entwicklungsbiologie Forschung konzentriert sich weitgehend auf Verständnis Entwicklung aus der Perspektive der Molekulargenetik1,2,3,4,5,6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. es ist bekannt, dass physikalische Phänomene eine zentrale Rolle in der Morphogenese spielen oder die Generation von biologischen14,15,16,17 bilden; spezielle mechanische Mechanismen der Entwicklung bleiben jedoch weitgehend unerforschte. 19,20ändern ventrale Biegung und rechts Torsion des primitiven Gehirn Rohres nach dem Hamburger-Hamilton Stufe 11 (HH 11)18 sind die zwei wichtigsten Prozesse, die embryonale Form beitragen. Insbesondere bleibt der physikalische Mechanismus zugrunde liegt die Torsionssteifigkeit Entwicklung im embryonalen Gehirn unvollständig verstanden.
Die embryonale Torsion Küken Embryos gehört zu den frühesten morphogenetischen Ereignissen des Links-Rechts (L-R) Asymmetrie in der Entwicklung. Wenn der Prozess der L-R Asymmetrie gestört ist, treten Geburtsschäden wie Situs Inversus, Isomerieoder Heterotaxie 21. Hier präsentieren wir ein Protokoll verbindet Ex Ovo Experimente22,23 mit physical-Modeling, mechanische Kräfte während der frühen Entwicklung des embryonalen Gehirns zu charakterisieren. Vorgestellte Methode soll die mechanischen Kräfte verantwortlich für Gehirn Torsion und die Faktoren, die Einfluss auf den Grad der Torsion während der frühen Entwicklung12zu identifizieren. Basierend auf den experimentellen Beobachtung, dass die dotterhäutchen Membran (VM) die dorsale Seite des Embryos einschränkt, vermutet wir, dass die VM liefert die Kraft für das sich entwickelnde Gehirn Torsion unabdingbar. Daher bei dieser Methode entfernt wir den Teil des virtuellen Computers, der den Bereich des Gehirns um herauszufinden, die Auswirkungen auf Gehirn Torsion abdeckt. Darüber hinaus wurde die Methode zur Anwendung von flüssigen Oberflächenspannung zur mechanischen Rolle des virtuellen Computers zu bestätigen und eine Schätzung von der Kraftaufwand für Gehirn Torsion, die zuvor nicht getan haben. Messung der Kräfte während der embryonalen Morphogenese ist eine anspruchsvolle Aufgabe. Vor allem in einer bahnbrechenden Studie entwickelt Campàs und Mitarbeiter24 eine neuartige Methode zur Quantifizierung der zellulären betont mit eingespritzten Microdroplets. Dennoch war diese Methode beschränkt sich auf Kräfte auf zellulärer Ebene, daher gilt nicht für Kräfte auf Gewebe oder Organismus-Ebene Sonde messen. Das Protokoll in diesem Papier präsentiert wurde entwickelt, um diese Lücke teilweise zu füllen.

<table><tbody><tr><td>Fertilized Specific pathogen-free White Leghorn chicken eggs</td><td>Charles River</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Optical Coherent Tomography Microscope</td><td>Thorlabs</td><td>GAN220C1</td><td></td></tr><tr><td>Silicone elastomer</td><td>Smooth-On, Inc.</td><td>EcoFlex 00-50</td><td></td></tr><tr><td>Dissecting microscope</td><td>Leica</td><td>MZ8</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Modified Eagle&amp;rsquo;s Medium (DMEM)</td><td>Lonza</td><td>12-604F</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotics</td><td>Sigma</td><td>P4083</td><td></td></tr><tr><td>Chick serum</td><td>Sigma</td><td>C5405</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette puller</td><td>Sutter Instrument</td><td>Model P-30</td><td></td></tr><tr><td>Filter paper</td><td>Whatman</td><td>5202-110</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline (PBS)</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Comsol MultiPhysics</td><td>Comsol</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3D computer graphics software</td><td>Rhino 5</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscope attached with OCT</td><td>Nikon&amp;nbsp;</td><td>FN1</td><td></td></tr><tr><td>Digital single-lens reflex camera</td><td>EOS&amp;nbsp;</td><td>Rebel T3i</td><td></td></tr></tbody></table>

probing the roles of physical forces in early chick embryonic morphogenesis

Embryonalentwicklung ist traditionell aus der Perspektive der biomolekularen Genetik studiert, aber die grundlegende Bedeutung der Mechanik in Morphogenese wird zunehmend anerkannt zu werden. Insbesondere die embryonalen Küken Herz und Hirn-Schlauch, der morphologische Veränderungen unterziehen, wie sie sich entwickeln, gehören zu den Hauptkandidaten zur Untersuchung der Rolle von physikalischen Kräfte in Morphogenese. Progressive ventrale biegen und rechts Torsion des Gehirns rohrförmige embryonale Küken passieren in der frühesten Phase der ORGANEBENE links-rechts-Asymmetrie in Küken Embryonalentwicklung. Die dotterhäutchen Membran (VM) schränkt die dorsale Seite des Embryos und hat dabei die Kraft für das sich entwickelnde Gehirn Torsion unabdingbar in Verbindung gebracht. Hier präsentieren wir Ihnen eine Kombination aus neuen Ex-Ovo -Experimente und physikalische Modellierung, um die Mechanik des Gehirns Torsion zu identifizieren. Hamburger-Hamilton Zeitpunkt 11, Embryonen werden geerntet und kultivierten ex Ovo (in den Medien). Die VM ist anschließend mit einer gezogenen Kapillarrohr entfernt. Durch die Steuerung des Niveau der Flüssigkeit und den Embryo eine Flüssigkeit-Luftschnittstelle zu unterwerfen, kann die Flüssigkeit Oberflächenspannung der Medien, die mechanische Rolle des virtuellen Computers zu ersetzen verwendet werden. Mikrochirurgie Experimente wurden auch durchgeführt, um die Position des Herzens die resultierende Änderung in die Chiralität des Gehirns Torsion zu verändern. Ergebnisse aus diesem Protokoll veranschaulichen die grundlegenden Aufgaben der Mechanik in Morphogenese fahren.

In dieser Studie wurde die VM des Embryos bei HH11 an der thorakalen Biegung vom vorderen Ende entfernt. Die Embryonen wurden durch ein OCT-System abgebildet. In diesem Stadium ist die Torsion des Gehirns Rohr (Abbildung 1A) nicht gestartet. Nach HH15-16 inkubiert werden, stellte Embryonen mit ihrer VM entfernt reduzierte Gehirn Rohr Torsion, ca. 35 Grad (Abbildung 1 b) im Vergleich zur Steuerung von Embryonen, die Torsion von rund 90 Grad aufweisen. Wenn die Medien gesenkt wurde induzieren Oberflächenspannung auf der dorsalen Ende von Embryonen mit ihre VMs entfernt, verdreht die Gehirne auf ein Niveau vergleichbar mit denen in Kontrolle Embryonen (Abbildung 1). Abbildung 2 zeigt ein repräsentatives OCT-Bild eines Embryos HH 13 mit thorakalen Lagewinkel und cranial Lagewinkel gekennzeichnet (Abbildung 2A). Die Winkel werden aus einer senkrechten Position des Querschnitts des NT (Abb. 2 b, C) gemessen. Ergebnisse aus unseren Experimenten vorgeschlagen, dass normale Gehirn Rohr Torsion von äußeren Belastungen auf der dorsalen Ende des Embryos angetrieben wird und dass diese wesentliche Belastung durch die VM20,25versorgt wird. Darüber hinaus folgende Umdrehungen nach links in einen normalen Embryo das Gehirn dreht sich nach rechts, wie die Herz-Schleife auf der rechten Seite geht, während in einem Embryo mit dem Herzen Schleife auf der linken Seite in einem frühen Stadium (d. h.vor HH Stufe 12), das Gehirn auch geschoben ein weiterer 20 h Inkubation (Abbildung 3 c im Ref [12]), darauf hindeutet, dass die Position des Herzens in der Asymmetrie im Gehirn Torsion geführt.
In Experimenten gewonnenen Daten konnten wir eine vereinfachte Geometrie des Küken Embryos ohne VM HH14-17 (Abbildung 3A) zu rekonstruieren. In diesem Rechenmodell wurden richtige geschlungene Herz und als gebogene Stäbe modelliert. Ein Block, der die Splanchnopleure (SPL) Membran darstellt wurde Kontakt mit der Herz-Rute. Durch die Gestaltung einer Negativform aus diesem Rechenmodell, fabriziert 3D Drucken diese Form und die Form mit einem Silikon-Elastomer Gießen, wir ein physikalisches Modell aus der vereinfachten Algorithmische Geometrie (Abb. 3 b-D). Ein Deckglas auf der dorsalen Ende des physikalischen Modells nach unten gedrückt repliziert die mechanische Belastung, die von der VM oder Oberflächenspannung aus unseren Experimenten (Abbildung 3D) zur Verfügung gestellt. Das Modell Exponate vergleichbaren Geometrie und Gehirn Torsion mit einem tatsächlichen Embryo, kultivierten Ex Ovo HH14-17 (Abbildung 3E).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57150/57150fig1.jpg"> Abbildung 1: Morphologie des Embryos mit VM entfernt und Auswirkungen äußerer Kräfte auf rechts Gehirn Rohr Torsion. (A) Harvested Embryo mit VM bei HH11 entfernt. (B) der gleichen Embryo für 27 h Post VM Entfernung zeigen reduziert Torsion inkubiert. (C) der gleichen Embryo unterzog sich Gehirn Torsion auf Antrag des flüssigen Oberflächenspannung. (D) Kontrolle Embryo mit normalen Gehirn Torsion zu einem vergleichbaren Zeitpunkt. Maßstabsbalken, (A-C) 1 mm, (D) 1 mm. Bilder wurden bei 10 X Vergrößerung gefangen genommen. Adaptiert von Ref [12] mit Erlaubnis. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57150/57150fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57150/57150fig2.jpg"> Abbildung 2: OCT-Bild eines Embryos HH13. (A) die Figur hat seine thorakalen Lagewinkel gekennzeichnet (a) und der kranialen Lagewinkel bei (b) gemessen. (B), (C) Einen Querschnitt des NT an Positionen (a) und (b). Winkel werden aus einer senkrechten Position gemessen. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57150/57150fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57150/57150fig3.jpg"> Abbildung 3: ein physikalisches Modell des Embryos Gehirn Torsion zu demonstrieren. (A) eine vereinfachte Geometrie eines Küken-Embryos ohne VM bei HH14-17 (B) Silikon-Elastomer physikalisches Modell eines Küken-Embryos. (C) dorsale Ansicht des Modells mit dem Herzen auf der rechten Seite. (D) dorsale Ansicht des Modells unter einer externen Kraft angewendet durch ein Deckglas, erste rechts Gehirn Torsion zu zeigen. (E) Chick Embryo kultiviert Ex Ovo beginnen, drehen Sie nach rechts auf HH14 zum Vergleich. Maßstabsbalken, (B-D) 1 cm, (E) 1 mm. Adapted von Ref [12] mit Genehmigung. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57150/57150fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

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Probing the Roles of Physical Forces in Early Chick Embryonic Morphogenesis

Die Rollen der physikalischen Kräfte in frühen Küken embryonalen Morphogenese sondieren

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll eine Reihe von neuen Ex-Ovo -Experimente und physical-Modeling-Ansätze für das Studium der Mechanik der Morphogenese während frühen Küken embryonalen Gehirn Torsion.

Embryonic development is traditionally studied from the perspective of biomolecular genetics, but the fundamental importance of mechanics in morphogenesis ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

7.2K Aufrufe.  Dartmouth College. Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll eine Reihe von neuen Ex-Ovo -Experimente und physical-Modeling-Ansätze für das Studium der Mechanik der Morphogenese während frühen Küken embryonalen Gehirn Torsion.

Serie: Probing the Roles of Physical Forces in Early Chick Embryonic Morphogenesis

Grafting of Beads into Developing Chicken Embryo Limbs to Identify Signal Transduction Pathways Affecting Gene Expression

Using chicken embryos it is possible to test directly the effects of either growth factors or specific inhibitors of signaling pathways on gene expression and activation of signal transduction pathways. This technique allows the delivery of signaling molecules at precisely defined developmental stages for specific times. After this embryos can be harvested and gene expression examined, for example by in situ hybridization, or activation of signal transduction pathways observed with immunostaining.
In this video heparin beads soaked in FGF18 or AG 1-X2 beads soaked in U0126, a MEK inhibitor, are grafted into the limb bud in ovo. This shows that FGF18 induces expression of MyoD and ERK phosphorylation and both endogenous and FGF18 induced MyoD expression is inhibited by U0126. Beads soaked in a retinoic acid antagonist can potentiate premature MyoD induction by FGF18.
This approach can be used with a wide range of different growth factors and inhibitors and is easily adapted to other tissues in the developing embryo.

By grafting beads soaked in growth factors or specific inhibitors of signaling pathways into developing embryos it is possible to directly test their effects in vivo. In this protocol beads are grafted into the limb bud to determine the effects of these molecules on gene expression and signal transduction.

Pfropfen von Beads in die Entwicklung von Hühnerembryo-Glieder zu identifizieren Signaltransduktionswegen Beeinflussung der Genexpression

Using chicken embryos it is possible to test directly the effects of either growth factors or specific inhibitors of signaling pathways on gene expression ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Application of Impermeable Barriers Combined with Candidate Factor Soaked Beads to Study Inductive Signals in the Chick

The chick embryo provides a superb vertebrate model that can be used to dissect developmental questions in a direct way. Its accessibility and robustness following surgical intervention are key experimental strengths. Mica plates were the first barriers used to prevent chick limb bud initiation1. Protocols that use aluminum foil as an impermeable barrier to wing bud or leg bud induction and or initiation are described. We combine this technique with bead placement lateral to the barrier to exogenously supply candidate endogenous factors that have been blocked by the barrier. The results are analyzed using in situ hybridization of subsequent gene expression. Our main focus is on the role of retinoic acid signaling in the induction and later initiation of the chick embryo fore and hindlimb. We use BMS 493 (an inverse agonist of retinoic acid receptors (RAR)) soaked beads implanted in the lateral plate mesoderm (LPM) to mimic the effect of a barrier placed between the somites (a source of retinoic acid (RA)) and the LPM from which limb buds grow. Modified versions of these protocols could also be used to address other questions on the origin and timing of inductive cues. Provided the region of the chick embryo is accessible at the relevant developmental stage, a barrier could be placed between the two tissues and consequent changes in development studied. Examples may be found in the developing brain, axis extension and in organ development, such as liver or kidney induction.

Protocols using impermeable barriers to block induction events between tissues of the main body axis and flank in the chick embryo required for limb formation are described. Beads soaked in candidate inductive signals are used to overcome the effect of barrier placement and analysis of gene expression confirms this.

Die Anwendung der undurchlässige Barrieren In Kombination mit Candidate Factor Soaked Beads zu studieren Induktive Signale im Küken

The chick embryo provides a superb vertebrate model that can be used to dissect developmental questions in a direct way. Its accessibility and robustness ...

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  gene expression in brain, neural tube, somite and heart primordia formation. This video demonstrates the different steps in 2-color whole mount in situ hybridization; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, the embryo is processed for prehybridization. The embryo is then hybridized with two different probes, one coupled to DIG, and one coupled to FITC.  Following overnight hybridization, the embryo is incubated with DIG coupled antibody. Color reaction for DIG substrate is performed, and the region of interest appears blue. The embryo is then incubated with FITC coupled antibody. The embryo is processed for color reaction with FITC, and the region of interest appears red. Finally, the embryo is fixed and processed for phtograph and sectioning. A troubleshooting guide is also presented.

This video demonstrates 2-color whole mount in situ hybridization, a method by which the spatial and temporal expression pattern of 2 different genes can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by David Wilkinson, Domingos Henrique, Phil Ingham and David Ish -Horowicz.

Doppel Whole Mount in situ Hybridisierung von Anfang Hühnerembryonen

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Biologie

Assay for Neural Induction in the Chick Embryo

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying the formation and initial patterning of the nervous system. This video demonstrates how to graft organizer tissue into a host, a method by which Hensen s node (the organizer in the chick embryo) is grafted to a host competent ectoderm. The organizer graft instructs overlying na ve tissue to adopt a neural fate via neural inducing signals. This mechanism is referred to as neural induction, and constitutes the initial step in the formation of brain and spinal cord in amniotes. This method is essentially used for the characterization of putative neural inducing molecules in chick. This video demonstrates the different steps in the assay for neural induction; First, the donnor embryo is explanted and pinned on a dish. Then, the host embryo is prepared for New culture. The graft is excised and transplanted to the host area pellucida margin. The host is cultured for 18-22 hrs. The assembly is fixed and processed for further applications (e.g. in situ hybridization). This method was originally devised by Waddington 1,2 and Gallera 3,4.

Neural induction is the first step in the formation of the brain. It is a mechanism by which Hensen's node (organizer), instructs adjacent tissue to adopt a neural fate, i.e. to give rise to the nervous system. This video demonstrates an assay for neural induction in chick embryo.

Assay für Neural Induction im Hühnerembryo

Organotypic Culture Method to Study the Development Of Embryonic Chicken Tissues

The embryonic chicken is commonly used as a reliable model organism for vertebrate development. Its accessibility and short incubation period makes it ideal for experimentation. Currently, the study of these developmental pathways in the chicken embryo is conducted by applying inhibitors and drugs at localized sites and at low concentrations using a variety of methods. In vitro tissue&#160;culturing is a technique that enables the study of tissues separated from the host organism, while simultaneously bypassing many of the physical limitations present when working with whole embryos, such as the susceptibility of embryos to high doses of potentially lethal chemicals. Here, we present an organotypic culturing protocol for culturing the embryonic chicken half head in vitro, which presents new opportunities for the examination of developmental processes beyond the currently established methods.

Here, we present an organotypic culturing protocol to grow embryonic chicken organs in vitro. Using this method, the development of embryonic chicken tissue can be studied, while maintaining a high degree of control over the culture environment.

Organotypischen Kultur-Methode, die Entwicklung der embryonalen Gewebe zu studieren

The embryonic chicken is commonly used as a reliable model organism for vertebrate development. Its accessibility and short incubation period makes it ...

Chicken Recombinant Limbs Assay to Understand Morphogenesis, Patterning, and Early Steps in Cell Differentiation

Cell differentiation is the fine-tuned process of cell commitment leading to the formation of different specialized cell types during the establishment of developing tissues and organs. This process is actively maintained in adulthood. Cell differentiation is an ongoing process during the development and homeostasis of organs. Understanding the early steps of cell differentiation is essential to know other complex processes such as morphogenesis. Thus, recombinant chicken limbs are an experimental model that allows the study of cell differentiation and pattern generation under embryonic patterning signals. This experimental model imitates an in vivo environment; it assembles reaggregated cells into an ectodermal cover obtained from an early limb bud. Later, ectoderms are transferred and implanted in a chick embryo receptor to allow its development. This assay was mainly used to evaluate mesodermal limb bud cells; however, it can be applied to other stem or progenitor cells from other organisms.

Recombinant limbs are a powerful experimental model that allows for studying the process of cell differentiation and the generation of patterns under the influence of embryonic signals. This protocol presents a detailed method for generating recombinant limbs with chicken limb-mesodermal cells, adaptable to other cell types obtained from different organisms.

Chicken Recombinant Limbs Assay, um Morphogenese, Musterung und frühe Schritte in der Zelldifferenzierung zu verstehen

Cell differentiation is the fine-tuned process of cell commitment leading to the formation of different specialized cell types during the establishment of ...

Analysis of Cell Differentiation, Morphogenesis, and Patterning During Chicken Embryogenesis Using the Soaked-Bead Assay

A multitude of genetic programs is activated during embryonic development that orchestrates cell differentiation to generate an astounding diversity of somatic cells, tissues, and organs. The precise activation of these genetic programs is regulated by morphogens, diffusible molecules that direct cell fate at different thresholds. Understanding how genetic activation coordinates morphogenesis requires the study of local interactions triggered by morphogens during development. The use of beads soaked in proteins or drugs implanted into distinct regions of the embryo enables studying the role of specific molecules in the establishment of digits and other developmental processes. This experimental technique provides information on the control of cell induction, cell fate, and pattern formation. Thus, this soaked bead assay is an extremely powerful and valuable experimental tool applicable to other embryonic models.

The soaked bead assay involves targeted delivery of test reagent at any developmental time point to study the regulation of cell differentiation and morphogenesis. A detailed protocol, applicable to any experimental animal model, for preparing three different types of soaked beads and implanting these in the interdigit of a chicken embryo is presented.

Analyse der Zelldifferenzierung, Morphogenese und Musterung während der Hühnerembryogenese mit dem Soaked-Bead-Assay

A multitude of genetic programs is activated during embryonic development that orchestrates cell differentiation to generate an astounding diversity of ...

Ein umfassender Überblick über die Protokolle für embryonale Hautexplantatkulturen von Vögeln

Using Avian Skin Explants to Study Tissue Patterning and Organogenesis

The developing avian skin during embryogenesis is a unique model that can provide valuable insights into tissue patterning. Here three variations on skin explant cultures to examine different aspects of skin development are described. First, ex vivo organ cultures and manipulations offer researchers opportunities to observe and study the development of feather buds directly. Skin explant culture can grow for 7 days enabling direct analysis of cellular behavior and 4D imaging at intervals during this growth period. This also allows for physical and molecular manipulations of culture conditions to visualize tissue response. For example, growth factor-coated beads can be applied locally to induce changes in feather patterning in a limited area. Alternatively, viral transduction can be delivered globally in the culture media to up or downregulate gene expression. Second, the skin recombination protocol allows researchers to investigate tissue interactions between the epidermis and mesenchyme that are derived from different skin regions, different life stages, or different species. This affords an opportunity to test the time window in which the epithelium is competent to respond to signals and its ability to form different skin appendages in response to signals from different mesenchymal sources. Third, skin reconstitution using dissociated dermal cells overlaid with intact epithelium resets skin development and enables the study of the initial processes of periodic patterning. This approach also enhances our ability to manipulate gene expression among the dissociated cells before creating the reconstituted skin explant. This paper provides the three culture protocols and exemplary experiments to demonstrate their utility.

Autor im Rampenlicht: Einblick in die aktuellen experimentellen Explantationsmethoden für Vogelhaut

Here we describe protocols for three types of avian embryonic skin explant cultures that can be used to examine tissue interactions, 4D imaging timelapse movie (3D plus time), global or local perturbation of molecular function, and systems biology characterization.

Verwendung von Vogelhautexplantaten zur Untersuchung der Gewebemusterung und Organogenese

The developing avian skin during embryogenesis is a unique model that can provide valuable insights into tissue patterning. Here three variations on skin ...

Die Rollen der physikalischen Kräfte in frühen Küken embryonalen Morphogenese sondieren

Zusammenfassung

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Kapitel in diesem Video

Pfropfen von Beads in die Entwicklung von Hühnerembryo-Glieder zu identifizieren Signaltransduktionswegen Beeinflussung der Genexpression

Die Anwendung der undurchlässige Barrieren In Kombination mit Candidate Factor Soaked Beads zu studieren Induktive Signale im Küken

Doppel Whole Mount in situ Hybridisierung von Anfang Hühnerembryonen

Assay für Neural Induction im Hühnerembryo

Organotypischen Kultur-Methode, die Entwicklung der embryonalen Gewebe zu studieren

Chicken Recombinant Limbs Assay, um Morphogenese, Musterung und frühe Schritte in der Zelldifferenzierung zu verstehen

Analyse der Zelldifferenzierung, Morphogenese und Musterung während der Hühnerembryogenese mit dem Soaked-Bead-Assay

Verwendung von Vogelhautexplantaten zur Untersuchung der Gewebemusterung und Organogenese

Verwendung von Vogelhautexplantaten zur Untersuchung der Gewebemusterung und Organogenese

Verwendung von Vogelhautexplantaten zur Untersuchung der Gewebemusterung und Organogenese