Wir würden gerne anerkennen, Anthony Bowen deren Folien als einen zweiten menschlichen Side-by-Side-Vergleich dienten als auch Sabrina Nolan deren Folien als dritte menschliche Side-by-Side und zweite Mikroskop Vergleich verwendet wurden.

1. Vorbereitung der Tusche Folie
<ol><li>Pipette 10 µL Cryptococcus Probe auf eine Folie. Jede Runde Hefestamm funktioniert aber für dieses Experiment H99 war die einzige Sorte verwendet. Hinweis: Wenn die Probe direkt aus Kultur, Medien, Verdünnung 1:2 mit PBS oder Wasser helfen Verklumpung der Tusche zu verhindern.</li>
	<li>Pipette 2 µL Indien Tintenfleck auf die Probe und mischen, indem Sie körperlich schieben die Pipettenspitze auf die Probe und in einer kreisförmigen Bewegung verschieben, bis die Tusche gleichmäßig verteilte erscheint.</li>
	<li>Platzieren Sie ein Deckglas über der Probe durch Gedrückthalten der linken Kante des Deckglases gegen die Oberfläche der Folie, dann sanft und gleichmäßig Absenken der Gegenseite das Deckglas über die Probe.</li>
	<li>Lassen Sie die Folie an der Luft trocknen für 5 min.</li>
	<li>Wenden Sie eine dünne Schicht des Nagellacks sanft auf Deckgläschen Grenze bilden eine Dichtung und bewahren die Tuschefleck an</li>
</ol>(2) Imaging-Folie
<ol><li>Platzieren Sie Folien in einem Hellfeld-Mikroskop mit einer Kamera Aufsatz und bekannten Pixel-µm-Konvertierung. Einstellen Sie Filter, Ziele und Kontrast so, dass Zelle Kapseln klar sind und Zellkörper konzentriert, dunkle Bänder sind. Hinweis: Verschiedene Filter, Ziele und Kontrasteinstellungen funktioniert, aber ein 20 x Ziel, Ph1 Filter und 2 x 2 binning wird empfohlen.</li>
	<li>Sicherstellen Sie, dass das Sichtfeld ist dicht aber nicht überbevölkerten mit Cryptococcus Zellen mit deutlichen Kontrast zwischen Zelle Kapsel und Hintergrund, und richtig fokussiert mit den Zellkörper als ein dunkles Band visualisiert. Hinweis: Die genaue Anzahl der Zellen für ein optimales Bild variiert je nach Probe und Ziel verwendet wird. Wichtige Aspekte sind, um sicherzustellen, dass die Zellen nicht gruppierten oder überlappende sind, dass die Zelle fokale Flugzeuge nicht signifikant unterscheiden, und dass es bedeutende Tusche Flecken deutlich sichtbar im Hintergrund (mindestens 25 % des Feldes).</li>
	<li>Speichern Sie Bilder in einem einzelnen Verzeichnis mit klaren Titel, wie die Messung-Algorithmus auf Bilder in einem einzigen Verzeichnis ausgeführt werden wird und die Ausgabe von Daten nach dem Namen der Image-Dateien organisiert werden.</li>
</ol>(3) Algorithmus Setup
<ol><li>Installieren Sie Python Version 2.7 von</li>
	<li>Weitere Python-Bibliotheken durch Ausführen der Befehle "Pip installieren Kissen" und "Pip installieren Openpyxl".</li>
	<li>MATLAB zu installieren, indem Sie die Anweisungen auf</li>
	<li>Build die MATLAB-Python-Bibliothek anhand der Anweisungen auf https://www.mathworks.com/help/matlab/matlab_external/install-the-matlab-engine-for-python.html zur Verfügung gestellt.</li>
	<li>Laden Sie die drei benötigten Dateien in dieser Handschrift Zusatzmaterialien ("QCA.py", "Analysis2.m" und "TestRun.m") enthalten. Hinweis: Diese Dateien können an einem beliebigen Speicherort extrahiert werden, aber alle drei müssen im selben Verzeichnis sein.</li>
</ol>4. Verwendung des Algorithmus
<ol><li>Führen Sie die Anwendung durch einen Doppelklick auf QCA.py. Hinweis: Die Anwendung kann mehrere Minuten zum starten dauern. Die "QCA.py"-Datei enthält die Programmstruktur, die die "m-" Dateien zum Ausführen des eigentlichen Algorithmus aufruft.</li>
	<li>Führen Sie die Schritte im Programm.<ol>
<li>Eingabe der Erweiterungstyp Bilddateien zeitlich vorangestellt und durch Semikolons getrennt (ex. ". TIF;. JPEG") dann klicken Sie auf die Enter -Taste.</li>
		<li>Wählen Sie das Verzeichnis, in dem die Bilddateien befinden, durch Klicken der Schaltfläche " Verzeichnis auswählen " und wählen Sie den Ordner, der die Bilder enthält.</li>
		<li>Erstellen Sie die Liste der Image-Dateien im Verzeichnis durch Anklicken des Buttons Generieren Bildliste . Die Bilder werden in das Textfeld auf der rechten Seite aufgelistet. Zu überprüfen Sie und sicherzustellen Sie, dass die Liste korrekt und vollständig sind.</li>
		<li>Wählen Sie ein zufälliges Bild aus der Liste als Vorschau klickst du Zufällige Bild auswählen . Achtung: Wenn das Bild nicht in der Lage, durch ein "falsches Bild Modus Fehler" zu öffnen, wird der Algorithmus noch richtig funktionieren trotz das Bild nicht angezeigt. Nach Schritt 4.2.7 zeigt noch das Testbild.</li>
		<li>Geben Sie Mikroskopobjektiv und binning Einstellungen ein. Wenn die Standardeinstellungen nicht übereinstimmen das Mikroskop verwendet, wählen Sie "Custom Pixel Konvertierung" und geben Sie die Pixel-auf-um Konvertierung für die Image-Dateien. Einmal ausgewählt, klicken Sie auf Berechnen, Konvertierung und sicherzustellen Sie, dass die Konvertierung richtig laut das Textfeld auf der rechten Seite ist. Hinweis: Repräsentative in Abbildung 1 gezeigten Bilder wurden mit 40 x Vergrößerung und 2 x 2 binning ausgewählt berechnet.</li>
		<li>Eingabeparameter für die Kreis-Erkennung Algorithmus.<ol>
<li>Geben Sie den minimalen und maximalen Radius nachweisbar für die äußeren Kapsel Erkennung als Min und Max Kapsel Radius Einträge. Eine geringere Reichweite ermöglicht genauere Ergebnisse.</li>
			<li>Geben Sie den minimalen und maximalen Radius nachweisbar für die Zellkörper Erkennung als Min und Max Zellkörper Radius Einträge. Hinweis: Alle vier dieser Einträge sollte zahlen für ihre jeweiligen Werte in Pixel, nach der Quellbilder.</li>
			<li>Bewegen Sie die Kapsel und Zellkörper Empfindlichkeit Schieberegler die Sensibilitätsschwelle des Algorithmus anpassen. Eine geringe Empfindlichkeit wird streng sein und falsche positive Kreis Erkennung reduzieren, sondern auch weniger echte Kreise erkennen kann. Im Gegensatz dazu eine hohe Empfindlichkeit erhöht die Erkennungsrate aber auch unter Umständen falsche positive Kreise. Hinweis: Repräsentative Ergebnisse wurden mit einer Kapsel Mindestradius von 7, Kapsel Maximalradius von 45, minimale Körper Radius von 4, maximale Körper Radius von 30, Kapsel Empfindlichkeit von 87 und Körper Empfindlichkeit von 87.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Prüfparameter auf zufällig ausgewählten Bild durch Anklicken der Schaltfläche Testen . Das Ergebnis erscheint oben in der Mitte des Programms, das ursprüngliche Bild zu ersetzen. Wenn die Ergebnisse genauer betrachten, empfiehlt es sich, wählen ein zusätzliche zufällige Bild, als auch zu versuchen, um sicherzustellen, dass die ausgewählten Parameter werden alle ausgewählten Bilder passen.<ol>
<li>Maximieren Sie die Anzahl der Körper und Kapseln erkannt und visuell zu kontrollieren, ob die Kreise scheinen richtig passen. Die Anzahl der Körper in Kapseln erkannt wird in das Textfeld auf der rechten Seite angezeigt. Anderweitig, die Algorithmus-Parameter zu bearbeiten, bis die Ergebnisse genau sind. Hinweis: Die dicken farbigen Kreise sollen nur mit Visualisierung helfen. Die tatsächliche Kreise erzeugt für die Messung ist eine mathematische Kurve, die durch die HCT-Algorithmus berechnet.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Führen Sie des Erkennungsalgorithmus auf das gesamte Verzeichnis von Image-Dateien durch Klicken auf die Schaltfläche Beginnen Analyse . Jedes Bild analysiert werden und das Programm zeigt "fertig" in das Textfeld auf der rechten Seite wenn alle Bilder analysiert wurden.</li>
		<li>Klicken Sie auf Spiel und Bereinigung . Dies wird entsprechen erkannten Zellkörper, die erkannten Kapseln, die, denen Sie Ihren Wohnsitz, und den wahre Kapsel Radius durch Subtraktion Körper von Kapsel zu berechnen. Hinweis: Wenn der Algorithmus verwendet wird, um Fluoreszenz erkennen oder eine andere Situation, in denen nur ein Kreis ist, dieser Schritt erkannt ist unnötig. Stattdessen klicken Sie Nur ziehen Körper oder die Schaltfläche " Nur ziehen Kapseln " zum Sammeln der Daten für nur blau oder nur die grüne Kreise, beziehungsweise. Es ist wichtig zu beachten, dass wenn nur die Kapsel Daten abgerufen werden der Radius der Gesamtradius des der Zelle wird als Referenz der Radius der Zellkörper nicht abgezogen werden könnte.</li>
		<li>Suchen Sie die fertigen Daten in der Datei "CleanedOuput.csv" im Bildverzeichnis. Wenn nur ein Datenelement ausgewählt wurde, wird die Datei "CleanedBodies.csv" oder "CleanedCapsules.csv" beschriftet.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Park, B. J., Wannemuehler, K. A., Marston, B. J., Govender, N., Pappas, P. G., Chiller, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimation+of+the+current+global+burden+of+cryptococcal+meningitis+among+persons+living+with+HIV/AIDS.">Estimation of the current global burden of cryptococcal meningitis among persons living with HIV/AIDS.</a> AIDS. 23 (4), 525-530 (2009).</li><li>Kwon-Chung, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryptococcus+neoformans+and+Cryptococcus+gattii,+the+etiologic+agents+of+cryptococcosis.">Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii, the etiologic agents of cryptococcosis.</a> Cold Spring Harb Perspect Med. 4 (7), 019760 (2014).</li><li>Granger, D. L., Perfect, J. 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Regulation of capsule synthesis by carbon dioxide.</a> J Clin Invest. 76 (2), 508 (1985).</li><li>Rumbaugh, J., Pool, A., Gainey, L., Forrester, K., Wu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+Cryptococcal+Capsule+in+Pathogenesis+of+Cryptococcal+Meningitis.">The Role of Cryptococcal Capsule in Pathogenesis of Cryptococcal Meningitis.</a> Neurology. 80 (7), 007 (2013).</li><li>Bojarczuk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryptococcus+neoformans+Intracellular+Proliferation+and+Capsule+Size+Determines+Early+Macrophage+Control+of+Infection.">Cryptococcus neoformans Intracellular Proliferation and Capsule Size Determines Early Macrophage Control of Infection.</a> Sci Rep. 6, (2016).</li><li>Robertson, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryptococcus+neoformans+Ex+Vivo+Capsule+Size+Is+Associated+With+Intracranial+Pressure+and+Host+Immune+Response+in+HIV-associated+Cryptococcal+Meningitis.">Cryptococcus neoformans Ex Vivo Capsule Size Is Associated With Intracranial Pressure and Host Immune Response in HIV-associated Cryptococcal Meningitis.</a> J Infect Dis. 209 (1), 74-82 (2014).</li><li>Araujo, G. d. e. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capsules+from+Pathogenic+and+Non-Pathogenic+Cryptococcus+spp.+Manifest+Significant+Differences+in+Structure+and+Ability+to+Protect+against+Phagocytic+Cells.">Capsules from Pathogenic and Non-Pathogenic Cryptococcus spp. Manifest Significant Differences in Structure and Ability to Protect against Phagocytic Cells.</a> PLoS One. 7 (1), 29561 (2012).</li><li>Garc&#237;a-Rivera, J., Chang, Y. C., Kwon-Chung, K. J., Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryptococcus+neoformans+CAP59+(or+Cap59p)+Is+Involved+in+the+Extracellular+Trafficking+of+Capsular+Glucuronoxylomannan.">Cryptococcus neoformans CAP59 (or Cap59p) Is Involved in the Extracellular Trafficking of Capsular Glucuronoxylomannan.</a> Eukaryot Cell. 3 (2), 385-392 (2004).</li><li>Guimar&#227;es, A. J., Frases, S., Cordero, R. J. B., Nimrichter, L., Casadevall, A., Nosanchuk, J. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+Resistance+to+Fluconazole+on+Virulence+and+Morphological+Aspects+of+Cryptococcus+neoformans+and+Cryptococcus+gattii+Isolates.">Impact of Resistance to Fluconazole on Virulence and Morphological Aspects of Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii Isolates.</a> Front Microbiol. 7, (2016).</li></ol>

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenlegen.

Die entscheidenden Schritte dieser Technik bereiten die Tusche Folie und die Mikroskopbilder zu erwerben. Während der Algorithmus erfolgreich, mit einer Vielzahl von Folie und Bild Techniken getestet wurde wird die empfohlene Protokoll in diesem Manuskript beschrieben. Die Polysaccharid-Kapsel wird erkannt, basierend auf den Ausschluss von Indien Tintenpartikel aus der Domäne der Kapsel, da diese Teilchen zu groß sind, um das Polysaccharid Fibrille Netzwerk eindringen. Tusche Ausgrenzung führt zu einem hellen Kreis auf einem dunklen Hintergrund. Der Algorithmus erkennt Kreise basierend auf wie gut sie mit ihren Hintergrund kontrastieren. So führt eine schwere Indien Tintenfleck höheren Kontrast zwischen Polysaccharid-Kapsel und Hintergrund, Erhöhung Signal-Rausch-Verhältnis und die Verbesserung der Ergebnisqualität. Im Gegensatz dazu ist der Zellkörper als einen dunklen Kreis auf einem hellen Hintergrund erkannt. Die Zellkörper wechselt aussehen basierend auf die Brennebene des Mikroskops eingestellt ist, erscheint als eine diffuse graue Kreis oben oder unten der Zelle und als eine verkürzte dunkles Band in der Mitte. Aus den gleichen Gründen bereits besprochen sollte die Brennebene, wo die Zellkörper als kondensierte, dunkle Band erscheint, für die Bildaufnahme verwendet werden, da dies in der genauesten Kreis Erkennung führt.
Die Methode hier berichtet ist durch mehrere Änderungen und Runden der Fehlersuche vorangekommen. Der Algorithmus wurde zunächst codierten erwartet, dass Zellen nicht kleiner als 4 oder größer als 60 Pixel basierend auf das Mikroskop, das verwendet wurde. Erweitern Sie die Anwendung dieses Algorithmus auf verschiedenen Vergrößerungen und Zellgrößen, die diese Grenzen durch die Benutzer Eingabefelder im Protokoll beschrieben stattdessen ersetzt wurden. Benutzer können jetzt Parameter spezifisch für jedes Experiment für maximale Genauigkeit geben. Wenn dieser Algorithmus auf eine Situation außerhalb Cryptococcus Kapsel Messung angewendet wird empfiehlt es zuerst Einrichten einer Reihe von Dosisfindung Bedingungen zu bestimmen, wie Muster erzeugt und abgebildet werden.
Die wichtigste Einschränkung dieser Technik ist, dass es mit einer bestimmten Anwendung im Auge, nämlich die Messung von Cryptococcus Kapsel entwickelt wurde. Während es leicht geändert werden kann, um zusätzliche Anwendungen zu passen, ist dieses Skript nur direkt auf die Kapsel Messprotokoll skizzierten anwendbar. Jedoch beschreibt diese Einschränkung auch die Bedeutung dieser Methode in Bezug auf seinem Gebiet und zu den bestehenden Methoden. Darüber hinaus angehende Hefezellen können ein Problem für die Ermittler, die wollen nur übergeordnete Zellgrößen Messen präsentieren. Dieser Algorithmus ist in der Lage erkennen Knospen als einzigartige Zellen (Abbildung S2A). Erstens kann dies ein Problem sein, wenn die Ermittler in welchem Fall sie Knospe Messungen zu entfernen, oder beide Zellen zu entfernen, wenn sie nicht möchten bestimmt die erkannten Kreis die Knospe ist und die das übergeordnete Element ist. Zweitens kann dadurch ein weiteres Problem Wenn die Knospe als Zelle Körper noch innerhalb der Grenzen der elterlichen Kapsel (Abbildung S2B) erkannt wird in dem Fall der Algorithmus die Knospe in Bezug auf die elterliche Kapsel messen wird. In diesem Beispiel wird jede Zelle gezählt werden, zweimal, weil jede Zelle Körper in zwei Kapseln wohnt. Eines dieser Probleme können leicht angegangen werden, sobald das Protokoll fertig ist. Der letzte Datensatz erscheint wie eine Tabellenkalkulation erkannt wo jeder einzelne Zelle ist mit der Bezeichnung nach der Image-Datei aus, und die x und y-Koordinaten der Zellkörper (Abbildung S3). Ermittler können einfach finden und die Daten, die die Knospe entspricht ausschließen. Trotz Kapsel Größe wird eine wichtige und stark studierte Virulenzfaktor Cryptococcus -Bereich bisher noch Standardprotokolle für Kapsel Messung oder Bild Erwerb zu etablieren. Diese Technik wurde entwickelt, um eine präzise und komfortable Art und Weise frei verfügbar für Labors mit minimalen Voraussetzungen diese Rollen ausfüllen.
Zukünftige Anwendungen dieser Technik sind weitgehend auf andere Experimente anwenden. Alle Image-basierte Erkennung oder Messung von kreisförmigen Objekten sollte durch diesen Algorithmus analysierbar. Fluoreszenz-Mikroskopie-Bilder können durch Anwendung des Algorithmus zu einzelnen Laserkanäle analysiert werden. Bakterielle Koloniezahlbestimmung erreicht werden kann, und mit zusätzlichen Modifikationen konnte unterscheiden zwischen Galaktose Reporter. Hefe-Kolonie-Wachstum-Assays konnte auch ausgewertet werden, mit diesem Algorithmus, um Kolonie Bereichsgröße zu schätzen.

Cryptococcus Neoformans ist eine Pathogene Hefe gefunden ubiquitär rund um den Globus, der menschliche Krankheit in erster Linie bei immunsupprimierten Populationen zugeordnet ist. C. Neoformans macht vor allem eine wesentliche Ursache der Gesamtzahl der jährlichen Todesfälle im subsaharischen Afrika aufgrund von Infektionskrankheiten1. Die großen klinische Manifestation der Cryptococcus-Infektion ist Meningoenzephalitis, die Invasion des zentralen Nervensystems mit Verkehrsmitteln in infizierten Makrophagen (Trojanisches Pferd Weise) folgt oder direkte Kreuzung der Blut - Hirn-Schranke. C. Neoformans drückt verschiedene Virulenzfaktoren, einschließlich der Fähigkeit, an der Temperatur des menschlichen Körpers, Urease-Aktivität, Melanization und Bildung eines Polysaccharid Kapsel2zu replizieren. Die Polysaccharid-Kapsel besteht aus Glucuronoxylomannan und Glucoronoxylomannangalactan Polymeren und Funktionen als Schutzbarriere gegen Faktoren wie Umweltbelastung und Host Immunantworten2zu wiederholen.
Obwohl die Größe der Cryptococcus Polysaccharid Kapsel nicht konsequent Virulenz zugeordnet wurde, gibt es Hinweise darauf, dass es ein Faktor bei der Pathogenese2,3,4,5, 6,7. Kapsel Größe Meningitis Pathologie6zugeordnet ist, kann Makrophagen Möglichkeit Cryptococcus -Infektion5Steuern beeinflussen und wenn abwesend8Verlust der Virulenz führen kann. Folglich, Kapsel Größenmessungen sind häufig in der Cryptococcus Forschung jedoch gibt es keine Fieldwide für eine Kapsel Messmethode.
Derzeit, C. Neoformans Polysaccharid Kapsel Messung basiert auf manuelle Messungen von Mikroskopie-Bildern, und die genauen Methoden der Übernahmen von Bild und Messung unterschiedlich Labors9,10, 11. Ein unmittelbares Anliegen dieser Methode ist, dass einige Studien den Erwerb von Tausenden von Einzelmessungen, der was die Genauigkeit und Zuverlässigkeit erschwert. Außerdem, auch wenn die Ergebnisse veröffentlicht werden, gibt es oft unzureichende Beschreibung des Messverfahrens. Viele Publikationen nicht erklären, wie ihre Messungen gewonnen wurden, welche Brennebene verwendet wurde, wie sie den Schwellenwert für die Kapsel Identifikation bestimmt, ob sie Radius oder Durchmesser, verwendet, ob sie eine Messung oder im Durchschnitt mehrere oder andere Details. Einige Publikationen einzige Staat ihre Methode als welches Programm verwendet wurde, z. B. "Adobe Photoshop CS3 diente, die Zellen zu messen"11. Dieser Mangel an Standardisierung und reporting-Detail kann Reproduzierbarkeit schwierig wenn nicht gar unmöglich machen. Unterschiede in der menschlichen Sehvermögen, Computer Helligkeit, Mikroskop-Einstellungen, schieben Sie Beleuchtung und andere Faktoren können variieren zwischen Einzelpersonen, aber auch zwischen Proben, während Berechnungen anhand der Kennzahlen der Pixelwerte Intensität konstant bleibt und zwischen Proben anwendbar. Diese Technik wurde im Zusammenhang mit der Bereitstellung einer standardisierten, genauen, schnelle und einfachen Technik um Kapseln Größen für ein Feld zu messen, in denen gab es vorher keine, generiert.
Wie bereits erwähnt der CHT-Algorithmus ist seit langem etablierte und Skripts zur automatischen Erkennung Kreise vor geschrieben worden. Diese Methode verbessert in zwei Bereichen, wo andere Skripte kurz fallen würde. Erstens ist einfach Kreise erkennen nicht genug, da zwei verschiedene Kreise mit Cryptococcus Zellen zueinander erkannt werden müssen. Diese Methode speziell erkennt Zellkörper in Kapseln, unterscheidet zwischen den beiden und Berechnungen nur auf die entsprechenden Körper-Kapsel-Paare. Zweitens erworben auch als Anschluss an das gleiche Protokoll, verschiedenen Forschern mit verschiedenen landet Bilder. Dadurch, dass die Ermittler Kontrolle über jeden Algorithmus-Parameter, kann dieses Tool auf verschiedenste Akquisemethoden angepasst werden. Es gibt keine Notwendigkeit für eine standardisierte Umfang, Zielsetzung, Filter und So weiter.
Diese Technik kann leicht auf jede Situation angewendet werden, in denen der Prüfer Kreise innerhalb eines Bildes, dass Kontrast mit ihrer Herkunft zu erkennen muss. Beide Kreise heller und dunkler als ihre Hintergrund erkannt werden kann, gezählt und gemessen, mit dieser Technik.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:875px;" width="875">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:213px;">India Ink</td>
			<td style="width:99px;">Becton, Dickinson and Co.</td>
			<td style="width:119px;">261194</td>
			<td style="width:444px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:213px;">Fisherbrand Superfrost Microscope Slides</td>
			<td style="width:99px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">12-550-143</td>
			<td>25x75x1</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:213px;">Fisherfinest Premium Cover Glass</td>
			<td style="width:99px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">12-548-B</td>
			<td>22x22-1</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:213px;">Sally Hansen HardasNails Xtreme Wear Nail Polish</td>
			<td style="width:99px;">Sally Hansen</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>109 invisible</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:213px;">SAB Media</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S3306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:213px;">Cryptotoccus neoformans</td>
			<td style="width:99px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">208821</td>
			<td>H99 strain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:213px;">Olympus AX70 Microscope</td>
			<td style="width:99px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;">AX70TRF</td>
			<td>Discontinued ; Bright Field Microscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:213px;">Qimaging Retiga 1300</td>
			<td style="width:99px;">Qimaging</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>Discontinued ; Camera Microscope Attachment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:213px;">MATLAB</td>
			<td style="width:99px;">MathWorks</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>Most recent version recommended</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:213px;">Python Programming Language</td>
			<td style="width:99px;">Python</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>Version 2 necessary ; 2.7 recommended</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:213px;">Microsoft Excel</td>
			<td style="width:99px;">Microsoft</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>Most recent version recommended</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:213px;">Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P3813</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automated measurement of cryptococcal species polysaccharide capsule and cell body

Diese Technik soll einen konsistente, präzise und überschaubaren Prozess für eine große Anzahl von Polysaccharid Kapsel Messungen zur Verfügung zu stellen.
Zunächst wird eine Schwelle Bild basierend auf Intensitätswerte eindeutig berechnet für jedes Bild generiert. Dann Kreise basierend auf Kontrast zwischen Objekt und Hintergrund mit dem etablierten Kreis Hough-Transformation (CHT)-Algorithmus erkannt. Schließlich erkannten Zelle Kapseln und Einrichtungen sind je nach Zentrum koordiniert und Radius Größe abgestimmt, und Daten werden dem Benutzer in einer überschaubaren Tabelle exportiert.
Die Vorteile dieser Technik sind einfache, aber wichtige. Erstens, weil diese Berechnungen durch einen Algorithmus anstatt ein Mensch Genauigkeit und Zuverlässigkeit erhöht. Es ist kein Rückgang der Genauigkeit oder Zuverlässigkeit unabhängig davon, wie viele Proben analysiert werden. Zweitens stellt dieser Ansatz eine potenzielle Betriebsanweisung für das Cryptococcus -Feld statt der aktuellen Situation wo Kapsel Messung variiert nach Labor je. Drittens manuelle Kapsel Messungen sind langsam und monoton, ermöglicht Automatisierung schnelle Messungen auf große Zahlen von Hefezellen, die wiederum Hochdurchsatz-Datenanalyse und immer leistungsfähigere Statistiken erleichtert.
Die wesentlichen Einschränkungen dieser Technik stammen wie die Algorithmus-Funktionen. Zuerst wird der Algorithmus nur Kreise erzeugen. Während Cryptococcus -Zellen und ihre Kapseln auf eine kreisförmige Morphologie nehmen, wäre es schwierig, diese Technik auf unrunde Objekterkennung anzuwenden. Zweitens wegen wie Kreisen erkannt werden kann der CHT-Algorithmus enorme Pseudo-Kreise, die basierend auf den äußeren Rändern der mehreren gruppierten Kreise erkennen. Jedoch kann jeder falsch Zellkörpern gefangen innerhalb des Pseudo-Kreises leicht erkannt und aus den daraus resultierenden Datensätzen entfernt.
Diese Technik dient zur Messung der kreisförmigen Polysaccharid-Kapseln Cryptococcus Arten basierend auf Tusche Hellfeld Mikroskopieren; Obwohl es auf angewendet werden könnte basiert anderen Kontrast kreisförmiges Objekt Messungen.

Bilder werden zuerst durch Mikroskopie von Tusche Dias mit einem Hellfeld-Mikroskop gekoppelt mit einer Kamera (Abb. 1A) gewonnen. Es ist wichtig, Zellen getrennt und in ausreichend niedrigen Dichte nicht um das Blickfeld, als auch zu überwältigen, genügend Fleck zu verwenden, um Kontrast zwischen Zellen und Hintergrund zu schaffen haben. Wie im Protokoll erwähnt, variiert die genaue Anzahl der Zellen für ein optimales Bild je nach der Probe, Mikroskop und Ziel verwendet wird. Wichtige Aspekte sind, um sicherzustellen, dass die Zellen nicht gruppierten oder überlappende sind, dass die Zelle fokale Flugzeuge nicht signifikant unterscheiden, und dass es bedeutende Tusche Flecken deutlich sichtbar im Hintergrund (mindestens 25 % des Feldes). Diese Richtungen erlauben den Algorithmus, um einzigartig zu jedem Bild einen Schwellenwert zu bestimmen, indem man die durchschnittliche Intensität Pixelwert und die Standardabweichung hinzufügen. Alle Pixel mit einem Intensitätswert höher als dieser Grenzwert gilt weiß und mit einer geringeren Intensitätswert gilt als schwarz. Das resultierende Bild ermöglicht eine klare und scharfe Unterscheidung der wo die Kapsel (Abbildung 1B) endet. Der Algorithmus hat dann einen robusten weiß-auf-schwarz-Kontrast basierend Kreis für die Kapsel zu erkennen und das Originalbild bietet einen robuste schwarz-auf-weiß-Kreis für Zellkörper. Eine repräsentative Visualisierung der erkannten Kreise entsteht im Rahmen des Programms (Abbildung 1C). Dies ermöglicht dem Benutzer, schnell durch die verarbeiteten Bilder analysieren und sicherstellen, dass die Ergebnisse korrekt angezeigt werden.
Es ist wichtig, die genaue Protokoll um optimale Bilder zu erwerben. Suboptimale Bildern führen in der Regel aus einem Mangel an Kontrast zwischen Kapsel und Tinte (Abb. 2A). Optimalen Kontrast und Erwerb Parameter variiert je nach Probe, Experiment, Kamera und Mikroskop-Modelle, etc.. Ein optimales Bild gehört zu dem Hefezellen wenn möglich getrennt in den äußeren Rand der Kapsel deutlichen Kontrast zu der Tuschefleck hat und wo Zellkörper ausgerichtet ist, als ein dunkles Band erscheinen die scharf mit dem Hintergrund kontrastiert. Wenn zu viele Zellen in das Blickfeld sind oder wenn der Fleck zu hell ist, werden die Pixelwerte Intensität cluster und das Programm wird möglicherweise nicht in der Lage, verdeutlichend Kapsel Größe (Abbildung 2B) einen Grenzwert festzulegen. Wenn Sub-optimale Bilder verwendet werden kann das Programm Kreise falsche Größen zu erkennen, keine Kreise erkennen oder erkennen mehrere Pseudo-Kreise basierend auf Artefakte im Bild Schwelle (Abbildung 2C).
Erkennung von Zellkörpern stellt ein ähnliches Problem, dass die Zellkörper als einem robusten schwarzen Kreis auf dem weißen Hintergrund der Kapsel visualisiert werden müssen. Dieses Problem wird im Protokoll angesprochen, wenn die gewünschte Brennebene für die Bildaufnahme beschreiben. Die besten Brennebene zu verwenden ist eine in der Zellkörper als dunkle, konzentrierte Band(Abbildung 3)angezeigt wird. Dieses Brennebene ist akzeptabel als Standard, da er die Zelle richtig konzentriert. Dies wurde bestätigt durch die Visualisierung der Zellwand mit Uvitex, einen Chitin-Fleck (Abbildung 3B). Die Uvitex Fleck zeigt deutlich eine gestochen scharfe, konzentriert Zellwand mit schwachem Signal in der Mitte (wo die oberen und unteren Rand der Zellkörper, unscharf befleckt werden würde).
Bei der Entwicklung dieser Methode war es auch wichtig, sicherzustellen, dass kann dieser Algorithmus genau bestimmen, Kapsel und Zellkörper Messungen. Während die repräsentative Kreise in den obigen Abbildungen vielversprechend sind, wurden die tatsächliche Messungen zwischen Computer und menschlichen Messungen verglichen. Wenn das Protokoll genau befolgt und optimale Bilder stammen, der Algorithmus ist genau und zuverlässig (Abb. 4A). Jedoch wenn das Protokoll nicht korrekt befolgt ist und suboptimale Bildern sich aufgrund von schlechten Färbung, Überfüllung oder anderen zuvor genannten Parameter ergeben, der Algorithmus verliert Genauigkeit und kann nicht rekapitulieren menschliche Messungen (Abbildung 4B ). Da diese Technik ursprünglich für eine bestimmte Person entwickelt wurde (Erstautor), eine andere Person wurde gebeten, es zu benutzen, um festzustellen, ob Unterschiede zwischen Färbung und Messung Stile Genauigkeit trotz folgendes Protokoll auswirken würde. Die Ergebnisse zeigten, dass diese Technik überall anwendbar, solange das Protokoll als Beauftragte (Abb. 4C) folgte. Ebenso kann diese Technik mit jedes Mikroskop erwerben Phase kontrastreiche Bilder der unterschiedliche Musterpräparate Tusche verwendet werden. Um sicherzustellen, dass der Algorithmus korrekt mit anderen Mikroskop-Setups bleibt, die um ein Drittel dieses Experiment wiederholt wurde Ermittler mit einem unterschiedlichen Hellfeld-Mikroskop gekoppelt mit einer Kamera und erkannten Kapsel Durchmesser mit manuell gemessene Kapsel im Vergleich Durchmesser. Kein signifikanter Unterschied wurde zwischen Computer und menschlichen Messungen (Abbildung 4D) beobachtet.
Zu guter Letzt wurden zukünftige Anwendungen dieses Algorithmus im Zusammenhang mit der Fluoreszenz Färbung erkundet. Da Fluoreszenz-Bildgebung noch auf Signal-Rausch-Verhältnis der Pixelwerte Intensität basiert sollte der Algorithmus leicht auf Fluoreszenzbilder anwendbar, solange der Fleck kreisförmig in der Natur ist. Diese Anwendung wurde bestätigt, als der Algorithmus konnte erfolgreich nachweisen, dass Uvitex Zellkörpern aus den zuvor beschriebenen Bildern (Abbildung 5A, 5 b) gebeizt. Benutzer sollten darauf achten, den Algorithmus-Parameter für ihr Experiment zu optimieren, und standardisierte Protokolle sollten in Zukunft für neuen Anwendungen entwickelt werden.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56957/56957fig1.jpg"> Abbildung 1 : Repräsentative Ergebnisse Bildbereiche optimal erhalten. A. das ursprüngliche Bild von Hellfeld-Mikroskopie eine Tusche Folie erworben. B. die binäre Bild erstellt mit einer Schwelle aus der durchschnittliche Intensität Pixelwert hinzugefügt, um die Standardabweichung berechnet. Alle Werte oberhalb dieser Schwelle gelten weiß und alle folgenden gelten als schwarz. C. eine Visualisierung der Kapseln (grün) und Zellkörper (blau) vom Algorithmus erkannt. Alle Bilder wurden bei 40 X Vergrößerung mit 2 x 2 binning erhalten. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56957/56957fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56957/56957fig2.jpg"> Abbildung 2 : Repräsentative Ergebnisse von einem Bild suboptimal erzielt. A. der ersten Tusche Folie über Hellfeld Mikroskopieren erworben. Uneben und unzureichende Färbung führt zu einem besonders hellen Hintergrund mit Steigungen von Intensität. B. die resultierende binäres Bild, in dem Kapseln aufgrund hoher Hintergrundsignal klar unterschieden werden können. C. mehrere Kapseln sind nicht nachweisbar. Alle Bilder wurden bei 40 X Vergrößerung mit 2 x 2 binning erhalten. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56957/56957fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56957/56957fig3.jpg"> Abbildung 3: Detecting Zellkörper. A. Hellfeld Bild der Kapsel an die bevorzugte Brennebene zentriert. B. Uvitex Fluoreszenzbild aus dem Zellkörper an der bevorzugten Brennebene. Bilder wurden bei 100 X Vergrößerung mit 2 x 2 binning erhalten. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56957/56957fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56957/56957fig4.jpg"> Abbildung 4: Vergleiche der Ergebnisse für Algorithmus (schwarz) und Mensch (grau) Analysen. A. wenn Folien laut Protokoll vorbereitet sind und optimale Bilder stammen gibt es keinen nennenswerter Unterschied zwischen den Messungen. B. wenn das Protokoll nicht gefolgt ist der Algorithmus nicht genau identifizieren und Kapseln zu messen. Hier entsprach nicht speziell der Hintergrund und es gab Kontrast zwischen Kapseln und Hintergrund nicht klar. Erhebliche Abweichungen über t-Test berechnet wird als gemerkt * für P < 0,05 Werte. C. ein unabhängiger Ermittler wurde gebeten, das Protokoll zu folgen und ihre Analysen mit dem Algorithmus zu vergleichen. Zuverlässigkeit ist über Beobachter aufrechterhalten, solange die Bilder richtig erworben werden. D. Eine zweite unabhängige Ermittler mit einem zweiten Mikroskop wurde verwendet, um zu bestätigen, dass der Algorithmus Genauigkeit über Einzelpersonen und Hardware behält. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56957/56957fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56957/56957fig5.jpg"> Abbildung 5 : Eine mögliche alternative Anwendung des Algorithmus: Identifizierung und Messung der Fluoreszenz-Mikroskopie. Zellkörper wurden gebeizt und mit Uvitex abgebildet, dann durch Algorithmus identifiziert. Die erkannten Kreis erstreckt sich vorbei an was als die Zellwand bezeichnet werden würde, denn die Erkennung auf das Fluoreszenzsignal basiert. Der Erkennungsalgorithmus kann zugeschnitten werden speziell die hellsten Anhäufung des Signals (Zellwand) identifizieren durch Ändern der Schwellenwerts zur Erzeugung von der anfänglichen binären Bildes in Zahlen 1 b und 2 bdargestellt. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56957/56957fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Supplemental Figure 1" src="/files/ftp_upload/56957/56957supfig1.jpg"> Ergänzende Abbildung1: ein repräsentativer Screenshot der Anwendung in einer Windows-Umgebung ausgeführt. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56957/56957supfig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Supplemental Figure 2" src="/files/ftp_upload/56957/56957supfig2.jpg"> Ergänzende Abbildung2: Darstellungen der erkannten angehende Hefezellen. Maßstabsleiste stellt 10 µm. A. Eine Mutterzelle und Knospe als getrennte Zellen innerhalb ihrer eigenen Kapsel gezählt. B. A Mutterzelle und Bud zählt zweimal, einmal für ihren eigenen Kapsel und einmal für die andere Zelle Kapsel, wodurch insgesamt vier Zellen aus einem Elternteil und eine Knospe erkannt. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56957/56957supfig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Supplemental Figure 3" src="/files/ftp_upload/56957/56957supfig3.jpg"> Ergänzende Abbildung 3: eine Darstellung der endgültigen Angaben nach Zelle Erkennung und Messung. Image-Datei verweist auf den Namen des ursprünglichen Bildes. Gesamtradius bezieht sich auf den Radius der repräsentativen grüne Kreise, Kapsel und Zellkörper kombiniert. Kapsel x und y Kapsel beziehen sich auf die Koordinaten der Kapsel, wofür diese Daten zu gelten. Körper-Radius bezieht sich auf den Radius der repräsentativen blaue Kreise. Kapsel Radius bezieht sich auf den Gesamtradius abzüglich der Körper Radius, was im Umkreis von nur die Kapsel. Diese Werte werden in Mikron, solange der Benutzer eine Pixel-µm-Umtauschverhältnis in Schritt 3.2.5 enthalten. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56957/56957supfig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

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Automated Measurement of Cryptococcal Species Polysaccharide Capsule and Cell Body

Automatisierte Messung von Cryptococcus Arten Polysaccharid-Kapsel und Zellkörper

Dieses Verfahren beschreibt eine automatisierte Batch-Bildprozessor Polysaccharid Kapsel und Körper Radien messen soll. Während ursprünglich für Cryptococcus Neoformans Kapsel Messungen entwickelt, die automatisierte Bildverarbeitung auch auf andere Grundlage Kontrasterkennung kreisförmigen Objekte angewendet werden kann.

The purpose of this technique is to provide a consistent, accurate, and manageable process for large numbers of polysaccharide capsule measurements.
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automated-measurement-cryptococcal-species-polysaccharide-capsule

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Automated Measurement of Cryptococcal Species Polysaccharide Capsule and Cell Body

7.2K Aufrufe.  Johns Hopkins Bloomberg School of Public Health. Dieses Verfahren beschreibt eine automatisierte Batch-Bildprozessor Polysaccharid Kapsel und Körper Radien messen soll. Während ursprünglich für Cryptococcus Neoformans Kapsel Messungen entwickelt, die automatisierte Bildverarbeitung auch auf andere Grundlage Kontrasterkennung kreisförmigen Objekte angewendet werden kann.

Serie: Automated Measurement of Cryptococcal Species Polysaccharide Capsule and Cell Body

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

During the last few years scientists became increasingly aware that average data obtained from microbial population based experiments are not representative of the behavior, status or phenotype of single cells. Due to this new insight the number of single cell studies rises continuously (for recent reviews see 1,2,3). However, many of the single cell techniques applied do not allow monitoring the development and behavior of one specific single cell in time (e.g. flow cytometry or standard microscopy).
Here, we provide a detailed description of a microscopy method used in several recent studies 4, 5, 6, 7, which allows following and recording (fluorescence of) individual bacterial cells of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae through growth and division for many generations. The resulting movies can be used to construct phylogenetic lineage trees by tracing back the history of a single cell within a population that originated from one common ancestor. This time-lapse fluorescence microscopy method cannot only be used to investigate growth, division and differentiation of individual cells, but also to analyze the effect of cell history and ancestry on specific cellular behavior. Furthermore, time-lapse microscopy is ideally suited to examine gene expression dynamics and protein localization during the bacterial cell cycle. The method explains how to prepare the bacterial cells and construct the microscope slide to enable the outgrowth of single cells into a microcolony. In short, single cells are spotted on a semi-solid surface consisting of growth medium supplemented with agarose on which they grow and divide under a fluorescence microscope within a temperature controlled environmental chamber. Images are captured at specific intervals and are later analyzed using the open source software ImageJ.

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

This protocol provides a step-by-step procedure to monitor single cell behavior of different bacteria in time using automated fluorescence time-lapse microscopy. Furthermore, we provide guidelines how to analyze the microscopy images.

Live Cell Imaging von Bacillus subtilis Und Streptococcus pneumoniae Verwendung von Automated Zeitraffer-Mikroskopie

During the last few years scientists became increasingly aware that average data obtained from microbial population based experiments are not ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Measurement of &#947;HV68 Infection in Mice

&gamma;-Herpesviruses (&gamma;-HVs) are notable for their ability to establish latent infections of lymphoid cells1. The narrow host range of human &gamma;-HVs, such as EBV and KSHV, has severely hindered detailed pathogenic studies. Murine &gamma;-herpesvirus 68 (&gamma;HV68) shares extensive genetic and biological similarities with human &gamma;-HVs and is a natural pathogen of murid rodents2. As such, evaluation of &gamma;HV68 infection of mice inbred strains at different stages of viral infection provides an important model for understanding viral lifecycle and pathogenesis during &gamma;-HVs infection.
Upon intranasal inoculation, &gamma;HV68 infection results in acute viremia in the lung that is later resolved into a latent infection of splenocytes and other cells, which may be reactivated throughout the life of the host3,4. In this protocol, we will describe how to use the plaque assay to assess infectious virus titer in the lung homogenates on Vero cell monolayers at the early stage (5 - 7 days) of post-intranasal infection (dpi). While acute infection is largely cleared 2 - 3 weeks postinfection, a latent infection of &gamma;HV68 is established around 14 dpi and maintained later on in the spleen of the mice. Latent infection usually affects a very small population of cells in the infected tissues, whereby the virus stays dormant and shuts off most of its gene expression. Latently-infected splenocytes spontaneously reactivate virus upon explanting into tissue culture, which can be recapitulated by an infectious center (IC) assay to determine the viral latent load. To further estimate the amount of viral genome copies in the acutely and/or latently infected tissues, quantitative real-time PCR (qPCR) is used for its maximal sensitivity and accuracy. The combined analyses of the results of qPCR and plaque assay, and/or IC assay will reveal the spatiotemporal profiles of viral replication and infectivity in vivo.

&#947;-Herpesviruses (&#947;-HVs) establish life-long persistency in their host. Infection of mice with &#947;-HV68 provides a genetically tractable in vivo model for the characterization of the lifecycle/pathogenesis of &#947;HVs. This protocol describes the detection and quantitation of &#947;HV68 infection at acute and latent stages following infection by plaque-forming, infectious center, and qPCR assays.

Die Messung der γHV68 Infektion bei Mäusen

&gamma;-Herpesviruses (&gamma;-HVs) are notable for their ability to establish latent infections of lymphoid cells1. The narrow host range of human ...

Automated Cell Enrichment of Cytomegalovirus-specific T cells for Clinical Applications using the Cytokine-capture System

The adoptive transfer of pathogen-specific T cells can be used to prevent and treat opportunistic infections such as cytomegalovirus (CMV) infection occurring after allogeneic hematopoietic stem-cell transplantation. Viral-specific T cells from allogeneic donors, including third party donors, can be propagated ex vivo in compliance with current good manufacturing practice (cGMP), employing repeated rounds of antigen-driven stimulation to selectively propagate desired T cells. The identification and isolation of antigen-specific T cells can also be undertaken based upon the cytokine capture system of T cells that have been activated to secrete gamma-interferon (IFN-&#947;). However, widespread human application of the cytokine capture system (CCS) to help restore immunity has been limited as the production process is time-consuming and requires a skilled operator. The development of a second-generation cell enrichment device such as CliniMACS Prodigy now enables investigators to generate viral-specific T cells using an automated, less labor-intensive system. This device separates magnetically labeled cells from unlabeled cells using magnetic activated cell sorting technology to generate clinical-grade products, is engineered as a closed system and can be accessed and operated on the benchtop. We demonstrate the operation of this new automated cell enrichment device to manufacture CMV pp65-specific T cells obtained from a steady-state apheresis product obtained from a CMV seropositive donor. These isolated T cells can then be directly infused into a patient under institutional and federal regulatory supervision. All the bio-processing steps including removal of red blood cells, stimulation of T cells, separation of antigen-specific T cells, purification, and washing are fully automated. Devices such as this raise the possibility that T cells for human application can be manufactured outside of dedicated good manufacturing practice (GMP) facilities and instead be produced in blood banking facilities where staff can supervise automated protocols to produce multiple products.

The goal of this protocol is to manufacture pathogen-specific clinical-grade T cells using a bench-top, automated, second generation cell enrichment device that incorporates a closed cytokine capture system and does not require dedicated staff or use of a GMP facility. The cytomegalovirus pp65-specific-T cells generated can be directly administered to patients.

Automatisierte Zellanreicherung des Cytomegalovirus-spezifischen T-Zellen für die klinische Anwendung mit der Zytokin-Capture-System

The adoptive transfer of pathogen-specific T cells can be used to prevent and treat opportunistic infections such as cytomegalovirus (CMV) infection ...

Highly Sensitive Assay for Measurement of Arenavirus-cell Attachment

Arenaviruses are a family of enveloped RNA viruses that cause severe human disease. The first step in the arenavirus life cycle is attachment of viral particles to host cells. While virus-cell attachment can be measured through the use of virions labeled with biotin, radioactive isotopes, or fluorescent dyes, these approaches typically require high multiplicities of infection (MOI) to enable detection of bound virus. We describe a quantitative (q)RT-PCR-based assay that measures Junin virus strain Candid 1 attachment via quantitation of virion-packaged viral genomic RNA. This assay has several advantages including its extreme sensitivity and ability to measure attachment over a large dynamic range of MOIs without the need to purify or label input virus. Importantly, this approach can be easily tailored for use with other viruses through the use of virus-specific qRT-PCR reagents. Further, this assay can be modified to permit measurement of particle endocytosis and genome uncoating. In conclusion, we describe a simple, yet robust assay for highly sensitive measurement of arenavirus-cell attachment.

The first step in the arenavirus life cycle is attachment of viral particles to host cells. We report a quantitative (q)RT-PCR-based assay for ultrasensitive detection and quantitation of arenavirus attachment events.

Hochempfindliches Verfahren zur Messung von Arenavirus-Zell-Anlage

Arenaviruses are a family of enveloped RNA viruses that cause severe human disease. The first step in the arenavirus life cycle is attachment of viral ...

Measurement of T Cell Alloreactivity Using Imaging Flow Cytometry

The measurement of immunological reactivity to donor antigens in transplant recipients is likely to be crucial for the successful reduction or withdrawal of immunosuppression. The mixed leukocyte reaction (MLR), limiting dilution assays, and trans-vivo delayed-type hypersensitivity (DTH) assay have all been applied to this question, but these methods have limited predictive ability and/or significant practical limitations that reduce their usefulness. Imaging flow cytometry is a technique that combines the multiparametric quantitative powers of flow cytometry with the imaging capabilities of fluorescent microscopy. We recently made use of an imaging flow cytometry approach to define the proportion of recipient T cells capable of forming mature immune synapses with donor antigen-presenting cells (APCs). Using a well-characterized mouse heart transplant model, we have shown that the frequency of in vitro immune synapses among T-APC membrane contact events strongly predicted allograft outcome in rejection, tolerance, and a situation where transplant survival depends on induced regulatory T cells. The frequency of T-APC contacts increased with T cells from mice during acute rejection and decreased with T cells from mice rendered unresponsive to alloantigen. The addition of regulatory T cells to the in vitro system reduced prolonged T-APC contacts. Critically, this effect was also seen with human polyclonally expanded, naturally occurring regulatory T cells, which are known to control the rejection of human tissues in humanized mouse models. Further development of this approach may allow for a deeper characterization of the alloreactive T-cell compartment in transplant recipients. In the future, further development and evaluation of this method using human cells may form the basis for assays used to select patients for immunosuppression minimization, and it can be used to measure the impact of tolerogenic therapies in the clinic.

This paper describes a method for measuring alloreactivity in a mixed population of T cells using imaging flow cytometry.

Die Messung der T-Zell-Alloreaktivität Mit Imaging Durchflusszytometrie

The measurement of immunological reactivity to donor antigens in transplant recipients is likely to be crucial for the successful reduction or withdrawal ...

Cell-free Biochemical Fluorometric Enzymatic Assay for High-throughput Measurement of Lipid Peroxidation in High Density Lipoprotein

Low high-density lipoprotein cholesterol (HDL-C) levels are one of the most powerful independent negative predictors of atherosclerotic cardiovascular disease (CVD). The structure and function of HDL rather than HDL-C may more accurately predict atherosclerosis. Several HDL protein and lipid compositional changes that impair HDL function occur in inflammatory states such as atherosclerosis. HDL function is usually determined by cell based assays such as cholesterol efflux assay but these assays have numerous drawbacks lack of standardization. Cell-free assays may give more robust measures of HDL function compared to cell-based assays. HDL oxidation impairs HDL function. HDL has a major role in lipid peroxide transport and high amount of lipid peroxides is related to abnormal HDL function. Lipid-probe interactions should be considered when interpreting the results of non-enzymatic fluorescence assays for measuring the lipid oxidative state. This motivated us to develop a cell-free biochemical enzymatic method to assess HDL lipid peroxide content (HDLox) that contributes to HDL dysfunction. This method is based on the enzyme horseradish peroxidase (HRP) and the fluorochrome Amplex Red that can quantify (without cholesterol oxidase) the lipid peroxide content per mg of HDL-C. Here a protocol is describedfor determination of HDL-lipid peroxidation using the fluorochrome reagent. Assay variability can be reduced by strict standardization of experimental conditions. Higher HDLox values are associated with reduced HDL antioxidant function. The readout of this assay is associated with readouts of validated cell-based assays, surrogate measures of cardiovascular disease, systemic inflammation, immune dysfunction, and associated cardiovascular and metabolic risk phenotypes. This technical approach is a robust method to assess HDL function in human disease where systemic inflammation, oxidative stress and oxidized lipids have a key role (such as atherosclerosis).

We describe here a fluorometric cell-free biochemical assay for determination of HDL-lipid peroxidation. This rapid and reproducible assay can be used to determine HDL function in large scale studies and can contribute to our understanding of HDL function in human disease.

Zellfreie biochemische fluorometrisch enzymatische Assays für Hochdurchsatz-Messung der Lipidperoxidation in High-Density Lipoprotein

Low high-density lipoprotein cholesterol (HDL-C) levels are one of the most powerful independent negative predictors of atherosclerotic cardiovascular ...

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

Candida albicans is the most common fungal pathogen of humans, causing about 15% of hospital-acquired sepsis cases. A major virulence attribute of C. albicans is its ability to form biofilms, structured communities of cells attached to biotic and abiotic surfaces. C. albicans biofilms can form on host tissues, such as mucosal layers, and on medical devices, such as catheters, pacemakers, dentures, and joint prostheses. Biofilms pose significant clinical challenges because they are highly resistant to physical and chemical perturbations, and can act as reservoirs to seed disseminated infections. Various in vitro assays have been utilized to study C. albicans biofilm formation, such as microtiter plate assays, dry weight measurements, cell viability assays, and confocal scanning laser microscopy. All of these assays are single end-point assays, where biofilm formation is assessed at a specific time point. Here, we describe a protocol to study biofilm formation in real-time using an automated microfluidic device under laminar flow conditions. This method allows for the observation of biofilm formation as the biofilm develops over time, using customizable conditions that mimic those of the host, such as those encountered in vascular catheters. This protocol can be used to assess the biofilm defects of genetic mutants as well as the inhibitory effects of antimicrobial agents on biofilm development in real-time.

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

This protocol describes the use of a customizable automated microfluidic device to visualize biofilm formation in Candida albicans under host physiological conditions.

Visualisierung der Biofilmbildung in Candida Albicans ein automatisiertes mikrofluidischen Gerät

Candida albicans is the most common fungal pathogen of humans, causing about 15% of hospital-acquired sepsis cases. A major virulence attribute of C. ...

Size Matters: Measurement of Capsule Diameter in Cryptococcus neoformans

The polysaccharide capsule of Cryptococcus neoformans is the primary virulence factor and one of the most commonly studied aspects of this pathogenic yeast. Capsule size can vary widely between strains, has the ability to grow rapidly when introduced to stressful or low nutrient conditions, and has been positively correlated with strain virulence. For these reasons, the size of the capsule is of great interest to C. neoformans researchers. The growth of the C. neoformans capsule is induced during phenotypic testing to help understand the effects of different treatments on the yeast or size differences between strains. Here we describe one of the standard methods of capsule induction and compare two accepted methods of staining and measuring capsule diameter: (i) India ink, a negative stain, used in conjunction with conventional light microscopy and (ii) co-staining with fluorescent dyes of both the cell wall and capsule followed by confocal microscopy. Finally, we show how measurement of capsule diameter from India ink-stained samples can be automated using computational image analysis.

Size Matters: Measurement of Capsule Diameter in Cryptococcus neoformans

The polysaccharide capsule is the primary virulence factor in Cryptococcus neoformans, and its size correlates with strain virulence. Capsule diameter measurements are used in phenotypic testing and to gauge therapeutic efficacy. Here a standard method of capsule induction is presented, and two methods of staining and measuring diameter are compared.

Size Matters: Messung des Durchmessers der Kapsel in Cryptococcus neoformans

The polysaccharide capsule of Cryptococcus neoformans is the primary virulence factor and one of the most commonly studied aspects of this pathogenic ...

Mouse Body Temperature Measurement Using Infrared Thermometer During Passive Systemic Anaphylaxis and Food Allergy Evaluation

Mouse body temperature measurement is of paramount importance for investigating allergies and anaphylactic symptoms. Rectal probes for temperature readings is common, and they have been proven to be accurate and invaluable in this regard. However, this method of temperature measurement requires the mice to be anesthetized in order to insert the probe without injury to the animal. This limits the ability to observe other phenotypes of the mouse simultaneously. In order to investigate other phenotypes while measuring temperatures, rectal probes are not ideal, and another method is desired. Here, we introduce a noninvasive method of temperature measurement that foregoes the requirement for mouse anesthesia while maintaining equal reliability to rectal probes in measuring body temperature. We use an infrared thermometer that detects body surface temperatures at ranges between 2 and 150 mm. This method of body temperature measurement is successful in reliably replicating temperature change trends during passive system anaphylaxis experiments in mice. We show that body surface temperatures are about 2.0 &#176;C lower than rectal probe measurements, but the degree of temperature drop follows the same trend. Furthermore, we use the same technique to observe mice in a food allergy model to evaluate temperature and activity levels simultaneously.

Here we present a new method to accurately measure body temperature differences in passive systemic anaphylaxis (PSA) and food allergy mouse models using an infrared thermometer. This procedure has been accurately duplicated in previous PSA results.

Maus-Körper-Temperaturmessung mit Infrarot-Thermometer während Passive systemische Anaphylaxie und Essen Allergieabklärung

Mouse body temperature measurement is of paramount importance for investigating allergies and anaphylactic symptoms. Rectal probes for temperature ...

In Vivo Imaging of Reactive Oxygen Species in a Murine Wound Model

The generation of reactive oxygen species (ROS) is a hallmark of inflammatory processes, but in excess, oxidative stress is widely implicated in various pathologies such as cancer, atherosclerosis and diabetes. We have previously shown that dysfunction of the Nuclear factor (erythroid-derived 2)-like 2 (Nrf2)/ Kelch-like erythroid cell-derived protein 1 (Keap1) signaling pathway leads to extreme ROS imbalance during cutaneous wound healing in diabetes. Since ROS levels are an important indicator of progression of wound healing, specific and accurate quantification techniques are valuable. Several in vitro assays to measure ROS in cells and tissues have been described; however, they only provide a single cumulative measurement per sample. More recently, the development of protein-based indicators and imaging modalities have allowed for unique spatiotemporal analyses. L-012 (C13H8ClN4NaO2) is a luminol derivative that can be used for both in vivo and in vitro chemiluminescent detection of ROS generated by NAPDH oxidase. L-012 emits a stronger signal than other fluorescent probes and has been shown to be both sensitive and reliable for detecting ROS. The time lapse applicability of L-012-facilitated imaging provides valuable information about inflammatory processes while reducing the need for sacrifice and overall reducing the number of study animals. Here, we describe a protocol utilizing L-012-facilitated in vivo imaging to quantify oxidative stress in a model of excisional wound healing using diabetic mice with locally dysfunctional Nrf2/Keap1.

In Vivo Imaging of Reactive Oxygen Species in a Murine Wound Model

We describe a non-invasive in vivo imaging protocol that is streamlined and cost-effective, utilizing L-012, a chemiluminescent luminol-analog, to visualize and quantify reactive oxygen species (ROS) generated in a mouse excisional wound model.

In Vivo Bildgebung von reaktiven Sauerstoffspezies in einem Murine Wunde Modell

The generation of reactive oxygen species (ROS) is a hallmark of inflammatory processes, but in excess, oxidative stress is widely implicated in various ...