Die Autoren ChiLab, Materialien und Microsystems Labor - Politecnico di Torino - DISAT, in der Person von Prof. C F Pirri, Dr. M Cocuzza und Dr. S L Marasso, bestätigen möchten für ihre wertvolle Unterstützung bei der Prozessentwicklung und Gerät Herstellung. Wir danken Victor Racine von Quantacell für Diskussion und Unterstützung in der Bildverarbeitung. Wir sind dankbar, Isabelle Grandjean und Manon Chartier von Animal Facility des Institut Curie für ihre Unterstützung für Mäuse, und Pablo Vargas und Ana-Maria Lennon (Institut Curie) für die Bereitstellung von uns mit der GFP LifeAct Mäusen. Wir sind dankbar, Olivier Thouvenin vom Institut Langevin und Clotilde Cadart, Larisa Venkova und Matthieu Piel vom Institut Curie - UMR 144, für ihre Hilfe für das Verständnis der Fluoreszenz unter Ausschluss Methode. Zu guter Letzt danken wir die technologische Plattform der Institut Pierre-Gilles de Gennes (CNRS UMS 3750) für ihre Unterstützung in Microfabrication. Diese Arbeit wurde teilweise unterstützt von der europäischen Forschung Rat Advanced Grant Nr. 321107 "CellO" PSL Université (SwithNeuroTrails Projekt), ANR Investissement Avenir und IPGG Labex und Equipex.

<ol>
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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+graphene+based+nanocomposite+for+application+in+3D+flexible+micro-supercapacitors.">A novel graphene based nanocomposite for application in 3D flexible micro-supercapacitors.</a> Materials Research Express. 3 (6), 065001 (2016).</li><li>Welch, C. C., Goodyear, A. L., Wahlbrink, T., Lemme, M. C., Mollenhauer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silicon+etch+process+options+for+micro-and+nanotechnology+using+inductively+coupled+plasmas.">Silicon etch process options for micro-and nanotechnology using inductively coupled plasmas.</a> Microelectronic Engineering. 83 (4), 1170-1173 (2006).</li><li>Fath, T., Ke, Y. D., Gunning, P., G&#246;tz, J., Ittner, L. 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Die Autoren erklären keinen Interessenskonflikt.

Volumen-Bildgebung von Neuronen stellt eine Herausforderung für die FXm-Technik durch die langen und dünnen Erweiterungen dieser Zellen. Dieses Protokoll beschreibt Varianten des gleichen Typs von mikrofluidischen Gerät Neuron Bildgebung gewidmet.
Neben den Aspekten von mikrofluidischen Design die Wahl des Ziels ist von grundlegender Bedeutung für die Fluoreszenz Ausgrenzung Bildgebung und impliziert einen Kompromiss zwischen Ortsauflösung und die Bildschärfe. Es hat 13 gezeigt, dass eine hohe NA führt zu einer Tiefenschärfe kleiner als die Höhe der Kammer war nicht nachteilig für die Präzision der Volumenmessung, wenn Bildgebung mit Schwerpunkt durchgeführt wurde und wenn ein ausreichender Spielraum zwischen die Kontur des Objekts der ich gelassen wird Geschäftsgelegenheiten und die Grenzen der Integration Oberfläche. Allerdings beeinträchtigt die Verwendung einer Kammer deutlich höher als die Schärfentiefe der Bildschärfe durch Photon Diffusion, welche glättet die Kanten der Objekte von Interesse. Die Herstellung einer hohen Kammer mit 3 µm reduziert das seitliche Weichzeichnen und lieferte außergewöhnlich gut definierten fluoreszierende Ausgrenzung Bilder auch mit hohen NA (0,8) 40 X Ziele neuronale Verzweigungen mit hoher Ortsauflösung zu visualisieren.
Chip-Montage ist ein entscheidender Schritt, insbesondere bei 3 µm hohen Kammern, aber vorsichtig Manipulation wie unter 4.1.2 vermeidet den Zusammenbruch des Daches. Die hohe Fläche zum Volumenverhältnis, diese dünnen Kammern zugeordnet Frage auch die der Stabilität der Dextran Konzentration im Laufe der Zeit. Wir haben überprüft, ob die Oberflächenabsorption der Dextran nach einer Nacht der Inkubation unbedeutend war: nach Dextran durch PBS ersetzt, der Unterschied der Intensität zwischen der Säule und der Hintergrund war etwa 1 pro 1000 der Anfangsintensität Kontrast zwischen Diese beiden Regionen in Anwesenheit von Dextran. Beachten Sie, dass Neuronen auf der Unterseite Deckglas und auf dem Dach des PDMS halten können. Dieser Effekt verschwindet, wenn mit gemusterten Deckgläsern (d. h. wenn wir nicht anhaftende Moleküle innerhalb der PDMS-Kammer inkubieren), wie die Beschichtung auf der Unterseite der Kammer daher streng lokalisiert.
Abgesehen von ihrer anspruchsvollen Morphologie Neuronen eignen sich eher für FXm aufgrund der Tatsache, dass eine erhebliche Einschränkung der Methode, d. h. Dextran Endozytose, sehr begrenzt ist in diesen Zellen. Wir wählen eine 10 kDa Formulierung langfristig unterdrücken reichen (in Stunden) sichtbaren Endozytose Phänomene.
Zusammenfassend ist die konzeptionelle Einfachheit der FXm durch eine Reihe von experimentellen Probleme ausgeglichen, die durch dieses Protokoll, z. B. nanometrischen PDMS Rauheit und mikrometrische Kammer Höhe oder Untergrundkorrektur für die Unebenheiten korrigieren gelöst wurden die PDMS Decke zwischen Säulen. Die Verwendung einer engen mikrofluidischen Kammer zu beschränken, das fluoreszierende Medium führt jedoch ein paar spezifische Einschränkungen wie die Notwendigkeit der Unterstützung Säulen, die die wirksame Oberfläche für Zelladhäsion oder die Notwendigkeit der zentralen Soma ausschließen senkt Kammer, neuronale Erweiterungen mit der höchsten Klarheit zu beobachten, die Regionen der Zelle für hochauflösende Beobachtung zugänglich einschränkt. Eine mögliche Weiterentwicklung dieser Methode wäre get rid of dieser physischen Entbindung durch eine optische ersetzt werden. Die Neuentwicklung des Lichtblattmikroskopie könnte in Zukunft vorteilhaft mit FXm kombiniert werden.

Die genaue Kenntnis der zellulären Volumen hat erhöhte Aufmerksamkeit in den letzten Jahren angezogen, angetrieben von der Frage der Zelle Größe Homöostase in einzelnen-celled Mikroorganismen 1 und ganz allgemein in der mitotischen Zellen 2. Allerdings ist die Frage des Zellvolumens relevant auch für Post-mitotischen Zellen, für die Neuronen ein Paradebeispiel dar.
Volumen ist in der Tat eine wichtige Unterschrift der physiologischen und pathologischen Veranstaltungen auf verschiedenen Skalen und Zeitpunkten im neuronalen Leben von transienten axonalen Verformung elektrische Aktivität (Millisekunden Skala) 3 , die irreversible zugeordnet neuronale Schwellung auftreten während der asymptomatischen Phase der neurodegenerativen Erkrankungen (über Jahre beim Menschen) 4. Allerdings tritt die größte Volumenänderung in Zwischenzeit Maßstab von Tagen oder Wochen (abhängig von der betrachteten Organismus) während des neuronalen Wachstums. Die ausgedehnte und komplexe Morphologie der Neuronen wirft Fragen auf ein Vielfaches, unter denen die Regulierung der Zellengröße. Axonalen Länge und Durchmesser sind in der Tat streng regulierten in Vivo, mit Werten spezifisch für jedes neuronaler Typ 5,6.
Diese Fragen, komplex, um in Vivo, Adresse können auch in vereinfachter Form angesprochen werden in-vitro-. In diesem Ziel eine Methode gewidmet Volumenmessung schnell genug Wachstumsdynamik (d. h. in einer Zeitskala von Minuten) und kompatibel mit Beobachtung über Stunden oder Tage zu folgen ist erforderlich. Verschiedene Methoden wurden im Laufe der Jahre zu einer direkten oder indirekten Zugriff auf zelluläre Volumen in Vitroentwickelt. Zelle Rekonstruktion von confocal Imaging ist einer von ihnen, aber diese Methode impliziert Etikettierung und wiederholten Expositionen gegenüber Licht und zeigt eine begrenzte axiale Auflösung von ca. 500 nm 7. Beachten Sie, dass diese zwei letzten Nachteile durch eine anspruchsvolle und aktuelle Methode namens Gitter Licht-Blatt Mikroskopie 8teilweise überwunden werden. Atomic Force Microscopy hat gebrauchte 9 aber diese Scan-Methode ist durch Wesen langsam und mühsam. Darüber hinaus kann der Körperkontakt, die, den es mit der Zelle erfordert, die Messung, wenn man bedenkt die extreme Weichheit der Neuronen 10beeinträchtigen. Indirekte Methode mittels Impedanz oder Resonanz haben für verschiedene Zelltypen 11, aber sind nicht ausreichend für erweitert anhaftende Zellen wie Neuronen eingesetzt.
Eine der vielversprechendsten Methoden basiert auf das Maß der ausgeschlossenen Volumen von Zellen in einer engen Kammer gefüllt mit einem Fluoreszenzfarbstoff. Die Fluoreszenz-Ausschluss-Methode (FXm) ist einfach in seinem Prinzip, da es erfordert keine Kennzeichnung und eignet sich für schnelle, langfristige optische Bildgebung der Zell-Populationen mit einer potenziell Sub optische axiale Auflösung. Genauer gesagt, hängt die Auflösung in z die maximale Fluoreszenzintensität in der Kultur-Kammer (d. h. in Region frei von Zellen) geteilt durch den Dynamikbereich der Kamera, obwohl mehrere Schallquellen dieser ultimative Auflösung begrenzen. Diese Methode ist sehr mächtig, das Volumen der Migration von adhärenten Zellen 12 folgen oder Volumenänderung während der Mitose von Säugerzellen, wie gründlich in 13beschrieben zu studieren gewesen. Neuronen bilden jedoch eine methodische Herausforderung für FXm unter Berücksichtigung ihrer umfangreichen Verzweigung in Sub mikrometrische Prozesse.
Wir stellen Ihnen hier eine Methode führt zur Herstellung von glatten FXm Kammern zugänglich mit hoher Präzision die Lautstärke und Höhe des neuronalen Verzweigungen und dynamische Strukturen neuronale Wachstum wie Wachstum Kegel beteiligt.
Kammern müssen ähnliche Höhen als das Objekt zu messen, um axiale Auflösung optimieren. Daher haben wir verschiedene FXm-Geräte zeichnen sich durch zentrale Messung Kammern mit drei verschiedenen Höhen entwickelt. Die dünnste (3 µm in der Höhe) widmet sich der Neurit Messung: dieser niedrigen Höhe schließt Soma, die bleiben in der in der Nähe von 15 µm hohen Zwischenkammer. Dickere zentrale Kammern (10 und 12 µm) sind hoch genug, um die ganze Zelle Wachstum folgen. Das Gerät beinhaltet auch zwei Reservoirs befindet sich auf beiden Seiten der zentralen Kammer. Vier Löcher in Injektion (IH) sind so umgesetzt und werden wie folgt bezeichnet: den Einlass und Auslass einzuführen die zellulären Suspensionen in den Chip dienen, während die beiden anderen Stauseen ernähren.
Wir haben erste fabrizierten Kalibrierung Deckgläsern für Höhenmessungen mit Fotolack Strukturen der bekannter Geometrie. Wir haben dann frei wachsenden Neuronen, sondern auch morphologisch abhängigen Neuronen in Micropatterns der Adhäsion abgebildet.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Equipments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmalab System 100</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td></td>
			<td>To perform DRIE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MJB4 mask aligner</td>
			<td>SUSS MicroTec</td>
			<td></td>
			<td>SU-8 photolithography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NXQ 4006 Mask aligner</td>
			<td>Neutronix Quintel</td>
			<td></td>
			<td>Photolithography associated to DRIE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma cleaner</td>
			<td>Diener Electronic</td>
			<td>Pico PCCE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture hood</td>
			<td>ADS Laminaire</td>
			<td>Optimale 12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Heraeus Multifuge X1R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator 37 &#176;C 5% CO2</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>MCO-170AICUVH-PE IncuSafe CO2 Incubator</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epifluorescence microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMi8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS Oven between 65 and 80 &#176;C</td>
			<td>Memmert</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mechanical profilometer</td>
			<td>Veeco</td>
			<td>Dektak 6M Stylus Profiler</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical profilometer</td>
			<td>Veeco</td>
			<td>Wyko NT9100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum desiccator</td>
			<td>Verrerie Villeurbanaise (Kartel Labware)</td>
			<td>230KAR</td>
			<td>Diameter 200 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic bath sonicator</td>
			<td>Labo Moderne</td>
			<td>SHE1000</td>
			<td>Volume of the bath: 0.8 liter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hotplate</td>
			<td>Stuart SD162</td>
			<td>SD162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masks</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DRIE</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Supplementary data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Su8 Mask 1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Supplementary data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Su8 Mask 2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Supplementary data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Su8 Mask 3</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Supplementary data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S1805 calibration stripes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Supplementary data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small laboratory equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mm hole puncher</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>29002519 (US reference)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel or razor blade</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9&#34; Stainless Steel Flat Spatula with Spoon</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>82027-532</td>
			<td>To demold PDMS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Top Lip Wafer Handling</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>63042-096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved tweezer</td>
			<td>FST</td>
			<td>Dumont #7 Forceps - Standard / Dumoxel</td>
			<td>To manipulate glass coverslips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Substrates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafer</td>
			<td>Prolog Semicor Ltd</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24x24 mm glass coverslips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-0127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photoresists and developpers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AZ 1518 positive photoresist</td>
			<td>Microchemicals GmbH</td>
			<td></td>
			<td>Before DRIE process, thicknes 1.8 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AZ 351B developer</td>
			<td>Microchemicals GmbH</td>
			<td></td>
			<td>To develop positive AZ 1518 photoresist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 2007</td>
			<td>MicroChem</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 2025</td>
			<td>MicroChem</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 2050</td>
			<td>MicroChem</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PGMA developer</td>
			<td>Technic</td>
			<td></td>
			<td>To develop SU-8 negative photoresist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microposit S1805 resist</td>
			<td>Chimie Tech Services</td>
			<td></td>
			<td>Positive photoresist used to obtain 0.5&#181;m high structures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MF 26A developer</td>
			<td>Chimie Tech Services</td>
			<td></td>
			<td>To develop positive S1805 photoresist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory consumables</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable plastic pipette 3 mL</td>
			<td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P100 Petri dishes</td>
			<td>TPP</td>
			<td>93100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL syringe</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>SS+20ES1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transparent scotch tape</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Square wipes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>115-2148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>DUTSCHER</td>
			<td>90260</td>
			<td>Plastic paraffin film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(3-Methacryloxypropyl)trichlorosilane</td>
			<td>abcr</td>
			<td>AB 109004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS and curing agent Sylgard 184</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>761036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isopropanol</td>
			<td></td>
			<td>W292907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>poly-ornithine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4957 - 50 mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol absolute</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>02865</td>
			<td>99.8%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-methacryloxypropyl-trimethoxysilane</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>M6514-25ML</td>
			<td>(C4H5O2)-(CH2)3- Si(OCH3)3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>acetic acid</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>71251-5ML-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran 10kW conjugated with Alexa488</td>
			<td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td>
			<td>D22910</td>
			<td>Absoprtion at 488 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran 10kW conjugated with Alexa647</td>
			<td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td>
			<td>D22914</td>
			<td>Absoprtion at 647 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM</td>
			<td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td>
			<td>21090-022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum</td>
			<td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td>
			<td>26050088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td>
			<td>12587-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax 200 mM</td>
			<td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate GIBCO 100 mM</td>
			<td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td>
			<td>11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td>
			<td>15710-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS 10x</td>
			<td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td>
			<td>14180-046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes 1M</td>
			<td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td>
			<td>15630-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trypsin-EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>59418C-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal</td>
			<td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td>
			<td>21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal without phenol red</td>
			<td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td>
			<td>12348-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Softwares</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Routine in Matlab for background normalization</td>
			<td>Quantacell</td>
			<td>Contact Victor Racine: victor.racine@quantacell.com</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To select specific ROI for image analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Routine</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td>Supplementary data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Routine</td>
			<td>Matlab</td>
			<td></td>
			<td>Supplementary data</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-resolution volume imaging of neurons by the use of fluorescence exclusion method and dedicated microfluidic devices

Volumen ist ein wichtiger Parameter zur physiologischen und pathologischen Eigenschaften der Neuronen auf unterschiedlichen Zeitskalen. Neuronen sind ziemlich einzigartig Zellen über ihre erweiterte verzweigten Morphologien und erhöhen folglich mehrere methodische Herausforderungen für Volumen-Messung. Im besonderen Fall von in-vitro- neuronale Wachstum sollte die gewählte Methodik Sub mikrometrische axiale Auflösung, kombiniert mit Vollfeld Beobachtung auf Zeitskalen von Minuten, Stunden oder Tage umfassen. Im Gegensatz zu anderen Methoden wie Zelle Form Wiederaufbau mit konfokale Bildgebung, elektrisch-basierten Messungen oder Atomic Force Microscopy hat die neu entwickelte Fluoreszenz-Ausschluss-Methode (FXm) das Potenzial, diese Herausforderungen zu erfüllen. Obwohl es einfach in seinem Prinzip, erfordert jedoch Umsetzung einer hochauflösenden FXm für Neuronen, mehrere Anpassungen und eine spezielle Methodik. Wir stellen Ihnen hier eine Methode basiert auf der Kombination von Fluoreszenz Ausgrenzung, niedrig-Rauhigkeit Multi-Fächer mikrofluidischen Geräten und schließlich Micropatterning, in-vitro- Messung der lokalen neuronalen Volumen zu erreichen. Die hohe Auflösung zur Verfügung gestellt vom Gerät konnten wir messen das lokale Laufwerk von neuronalen Prozessen (Neuriten) und die Lautstärke etwas spezifischer Strukturen neuronale Wachstum, wie Wachstum Kegel (GCs) beteiligt.

Das Ergebnis des Prozesses der Herstellung in den Abschnitten 1 und 2 beschrieben wird anhand der Bilder der Figur 1A-1 b und die Kurve der Abbildung 1. Die Tabelle der Abb. 1 zeigt die Rauheitskennwerte von zwei verschiedenen repräsentativen Bereichen der PDMS-Chip, d. h. in den Mittel-und 20 µm hoch nächste Zwischenkammer. Eine Abnahme der Rauheit um einen Faktor von etwa 7 eingeholt wurde mit geätzten Si-Wafer statt SU-8 Fotolack. FXm wurde dann zuerst auf ein Photoresist Streifen aus bekannter Geometrie (Abbildung 2A) innerhalb einer 10 µm hohe Kammer angewendet. Nach der Bildverarbeitung und Intensität zur Höhe Umkehr (siehe das Diagramm der Abbildung 2 b), FXm Profile durchgeführt auf Querschnitte entlang dieser Streifen (Abbildung 2) bieten die gewünschte Höhenprofile (Abb. 2D). Abb. 2D zeigt den Vergleich zwischen den Profilen mit mechanischen Profilometry und FXm Methoden erzielt. Diese Profile, einschließlich Rand und Plateau, sind sehr ähnlich, Validierung der Methode. Beachten Sie, dass die Streuung der FXm Daten nicht repräsentativ für die ultimative Auflösung der Methode, wie in Abbildung 3 und Abbildung 4, beurteilt, sondern ergibt sich aus der geringen Intensität eingesetzt, um eine mögliche Wirkung von dem sehr schwachen zu vermeiden Auto-Fluoreszenz von Photolack in der GFP-Kanal.
Dann beobachteten wir Neuriten in 3 µm und 10 µm hohen Kammern (Abbildung 3). Die Standardabweichung der Hintergrundgeräusche ist etwa 18 nm nach Intensität, Höhe-Konvertierung und Hintergrund-Korrektur. Dieser Wert ist etwas höher als der physische Rauheit des PDMS Flächen gegossen auf Silizium-Oberflächen (12 nm, siehe Abbildung 1) aber viel niedriger als die Rauheit auf PDMS gemessen von SU-8 Formen erhalten. Diese Ergebnisse zeigen den Mehrwert der Bohren von Brunnen in Silizium-Wafer, anstatt Löcher in SU-8 Photoresist Säulen werfen zu öffnen. Ein niedriger Wert erlaubt ein high-Signal zu Rauschverhältnis und sehr klare Bilder in Volumen wie die in Abbildung 3Aangezeigt. Als ein Beispiel für die Daten, die aus solchen Bildern abgerufen werden können, berechnet das Volumen von 1,6 µm (d.h. 10 Pixel) breite Neuriten (siehe das Diagramm der Abbildung 3 b) in Scheiben schneiden. Verwendung in erster Näherung eine lineare Anpassung dieser Daten bietet einen mittlere Neuriten Höhenwert von etwa 400 nm, verglichen mit z.B. der axonale Durchmesser 500 nm in 10 Tage alten Welpen innerhalb der Corpus Callosum- 5 gefunden. Wir haben auch FXm mit Micropatterns Adhäsion bestehend aus seriell verschweißten 2 µm und 6 µm breite Streifen von 30 µm Länge kombiniert. Unser Ziel war die Untersuchung des Einflusses der Neurit Breite auf die 3D-Form. Abbildung 3 zeigt eine 3D Darstellung in der falschen Farbe eine ganze Neuron Bild in einer großen Kammer 10 µm. Neuriten verbreiten auf 2 µm und 6 µm breite Streifen, während die Soma auf die Extremität der größte Streifen befindet. Höhenprofile wurden in drei verschiedenen Querschnitten gezogen. In Übereinstimmung mit der Grafik in Abbildung 3Aangezeigt die Oberfläche über die Erhöhung der Querschnitte mit der Neurit Breite (Abbildung 3D) integriert.
Wir weiters Wachstum Kegel (GC) 3D-Strukturen. Abbildung 4 A-B zeigt zwei verschiedene GC Profile erhalten in einer 3 µm hohe Kammer, die ihre verzweigten Unterkonstruktion hervorheben. Darüber hinaus führten wir Zeitraffer Experimente durchführen, um die Dynamik des Volumens der GCs in einer 12 µm hohe Kammer zu folgen. Abbildung 4 zeigt einen Zyklus der schrumpfenden und Reaktivierung einer bestimmten GC innerhalb einer Zeitskala von ein paar Dutzend Minuten. Durch den Einsatz von GFP-Lifeact Mäusen waren Wachstum Kegel in der GFP Emissionswellenlänge lokalisiert (510 nm) von ihrer hohen Aktin-Konzentration. Die Oberfläche bei der Wellenlänge identifiziert wurde verwendet, um über die Dextran Emissionswellenlänge bei 647 integrieren nm um GC Volumen zu berechnen. Abbildung 4 zeigt die Verteilung der GC Volumen an Ort zu verschiedenen Zeitpunkten schließlich auf drei verschiedene Neuronen, zentriert auf einen Wert von ca. 6 µm3.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56923/56923fig1v2.jpg"> Abbildung 1: FXm PDMS Kammern. (A) Regelungen der vier verschiedenen wichtigsten Schritte der Mikrofabrikation führt in die endgültige Form. Die Lage der Einlass, Auslass und Stauseen sind angegeben. Skalieren Sie Bars: 1 mm. (B) Bild der PDMS FXm Kammer unter Verwendung einer optische Profilometer. Dieses Bild zeigt die zentrale Kammer mit 3 Reihen von 10 µm hohen Säulen und die Mittelstufen Kammern von 20, 50 und 90 µm in der Höhe. Maßstabsleiste: 500 µm. (C) Querschnittsansicht des Chips an die beiden gestrichelten Linien gezeichnet (B). Gelb/Gold: Querschnitt entlang Säulen, blau: Querschnitt zwischen den Säulen. (D) bedeuten die PDMS Rauheit Messwerte auf 50 × 50 µm-2 -Gebieten auf Silizium und auf 20 µm hohen SU-8 Zwischenkammer geformt (siehe Pfeile für den Standort dieser Bereiche). Mittelwerte wurden aus den Messungen von drei verschiedenen Bereichen erhalten. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56923/56923fig1v2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56923/56923fig2.jpg"> Abbildung 2: Kalibrierung der FXm-Methode mit einem Fotolack Streifen als das Objekt des Interesses. (A) GLP-Fluoreszenz-Aufnahme in einer 10 µm hohe Kammer gefüllt mit 10.000 MW Dextran absorbierende bei 488 nm bei 1 mg/mL. (B: Hintergrund, P: Säule). Beobachtung mit einem trockenen 40 X NA 0,8 Ziel. Maßstabsleiste: 50 µm. (B) lineare Kalibrierung Recht entnommen die mittlere Intensität der beiden farbigen Rechtecke dargestellt in A. (C) Fluoreszenz Intensität Profil bezogen auf der Ebene der blau gestrichelten Linie dargestellt (A), überqueren den Fotolack Streifen (0,45 µm hohen positiven Photoresist). (D) Vergleich der gewonnenen mechanischen Profilometer (schwarze Punkte) und FXm nach Intensität, Höhe Konvertierung der Daten (b) (blaue Punkte) Profile. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56923/56923fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56923/56923fig3.jpg"> Abbildung 3: Neurit Volume Imaging. (A) Neurit erstreckt sich in die zentrale 3 µm hohe Kammer von Soma befindet sich in den nächsten 15 µm Zwischenkammer. Bildgebung durchgeführt mit 10.000 MW Dextran absorbierende bei 488 nm und 40 X, NA 0,8 trocknen Ziel. Der Inset erhalten nach dem Gebrauch den Hintergrund Reduktion Routine Highlights die beiden Neuriten und gewählt, um das Diagramm auf der rechten Seite zu plotten. Skalieren Sie Bars: 30 µm. (B) Neurit Slice Volumen als Funktion der Neurit breite gewonnenen 22 Profile (Durchschnitt auf 10 Pixel, d. h. auf einem 1,6 µm "Neurit Slice") in (A) gezeigt. Die durchgezogene Linie stellt eine lineare Anpassung der Neigung 0,4 µm durch den Ursprung. (C) Falschfarbenbild eines gemusterten Neurons auf einen selbstklebenden Streifen hergestellt aus aufeinanderfolgenden 2 µm und 6 µm breite Stümpfe (in weiß dargestellt). Messungen wurden in einer 10 µm hohe Kammer gefüllt mit 10.000 MW Dextran absorbierende bei 647 nm und mit einer 40 X NA 0,8 trocknen Ziel. (D) Höhenprofilen entsprechend farbige Striche angezeigt (c), halten die gleiche Farbcode. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56923/56923fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56923/56923fig4.jpg"> Abbildung 4: statische und dynamische Wachstum Kegel Bildgebung. (A-B) Wachstum Kegel Höhenprofile erhalten in einer großen Kammer 3 µm nach Intensität zur Umkehr Höhe entlang der gelben Linien im zugehörigen Bilder angezeigt. Beobachtung durchgeführt, mit einer Füllung mit 10.000 MW Dextran absorbierende bei 488 nm und 40 X, NA 0,8 trocknen Ziel. (C) ganze Neuron Bildgebung in einer 12 µm hohe Kammer gefüllt mit 10.000 MW Dextran absorbierende bei 647 nm. Beobachtungen wurden in zwei fluoreszierende Kanäle: GFP für Wachstum Kegel Lokalisierung (gelb gestrichelt) und CY5 um GC Volumen von Fluoreszenz Ausgrenzung zu berechnen. Die Oberfläche enthalten gelb gestrichelt wurde zur GC Volumen zu berechnen. Die Grafik zeigt die Variation des GC Volumen über Zeit und damit verbundenen Morphologien in GLP und CY5 Kanäle zu zwei repräsentative unterschiedlichen Zeitpunkten. Alle Daten wurden übernommen, mit einer 40 X NA 0,8 trocknen Ziel alle 3 min. Maßstabsleisten: 10 µm. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56923/56923fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Schritt</td>
			<td>1:8 µm Schicht Maske</td>
			<td>Maske 02:30 µm Schicht</td>
			<td>Maske 03:40 µm Schicht</td>
		</tr>
<tr>
<td>SU-8 Typ</td>
			<td>2007</td>
			<td>2025</td>
			<td>2050</td>
		</tr>
<tr>
<td>Spincoating</td>
			<td>30 s @ 2000 u/min</td>
			<td>30 s @ 3050 u/min</td>
			<td>30 s bei 3250 u/min</td>
		</tr>
<tr>
<td>Weiche Backen</td>
			<td>3 min @ 95 ° C</td>
			<td>2 min @ 65 ° C + 6 min. @ 95 ° C</td>
			<td>3 min @ 65 ° C + 7 min. @ 95 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Exposition-Energie</td>
			<td>110 mJ/cm2
</td>
			<td>155 mJ/cm2
</td>
			<td>170 mJ/cm2
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nach Exposition Backen</td>
			<td>4 min @ 95 ° C</td>
			<td>1 min @ 65 ° C + 6 min. @ 95 ° C</td>
			<td>2 min @ 65 ° C + 7 min. @ 95 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Entwicklung</td>
			<td>2 min 30 s</td>
			<td>5 min</td>
			<td>6 min</td>
		</tr>
<tr>
<td>Harte Backen (optional)</td>
			<td>3-5 min. @ 200 ° C</td>
			<td>3-5 min. @ 200 ° C</td>
			<td>3-5 min. @ 200 ° C</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 1: Photolithographie Schritte durchgeführt, ein Gerät mit einer zentralen Kammer 12 μm Höhe bauen. Höhen der Mittelstufen Kammern: 20, 50 und 90 µm.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Schritt</td>
			<td>Maske 01:10 µm Schicht</td>
			<td>Maske 02:30 µm Schicht</td>
			<td>Maske 03:40 µm Schicht</td>
		</tr>
<tr>
<td>SU-8 Typ</td>
			<td>2007</td>
			<td>2025</td>
			<td>2050</td>
		</tr>
<tr>
<td>Spincoating</td>
			<td>30 s @ 1500 u/min</td>
			<td>30 s @ 3050 u/min</td>
			<td>30 s bei 3250 u/min</td>
		</tr>
<tr>
<td>Weiche Backen</td>
			<td>3 min @ 95 ° C</td>
			<td>2 min @ 65 ° C + 6 min. @ 95 ° C</td>
			<td>3 min @ 65 ° C + 7 min. @ 95 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Exposition-Energie</td>
			<td>125 mJ/cm2
</td>
			<td>155 mJ/cm2
</td>
			<td>170 mJ/cm2
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nach Exposition Backen</td>
			<td>4 min @ 95 ° C</td>
			<td>1 min @ 65 ° C + 6 min. @ 95 ° C</td>
			<td>2 min @ 65 ° C + 7 min. @ 95 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Entwicklung</td>
			<td>2 min 30 s</td>
			<td>5 min</td>
			<td>6 min</td>
		</tr>
<tr>
<td>Harte Backen (optional)</td>
			<td>3-5 min. @ 200 ° C</td>
			<td>3-5 min. @ 200 ° C</td>
			<td>3-5 min. @ 200 ° C</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 2: Photolithographie Schritte durchgeführt, ein Gerät mit einer zentralen Kammer von 10 μm Höhe bauen. Höhen der Mittelstufen Kammern: 20, 50 und 90 µm.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Schritt</td>
			<td>Maske 01:12 µm Schicht</td>
			<td>Maske 02:32 µm Schicht</td>
			<td>Maske 03:40 µm Schicht</td>
		</tr>
<tr>
<td>SU-8 Typ</td>
			<td>2015</td>
			<td>2025</td>
			<td>2050</td>
		</tr>
<tr>
<td>Spincoating</td>
			<td>30 s bei 3250 u/min</td>
			<td>30 s @ 2500 u/min</td>
			<td>30 s bei 3250 u/min</td>
		</tr>
<tr>
<td>Weiche Backen</td>
			<td>3 min @ 95 ° C</td>
			<td>2 min @ 65 ° C + 5 min. @ 95 ° C</td>
			<td>3 min @ 65 ° C + 7 min. @ 95 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Belichtungszeit</td>
			<td>140 mJ/cm2
</td>
			<td>157 mJ/cm2
</td>
			<td>170 mJ/cm2
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nach Exposition Backen</td>
			<td>4 min @ 95 ° C</td>
			<td>1 min @ 65 ° C + 5 min. @ 95 ° C</td>
			<td>2 min @ 65 ° C + 7 min. @ 95 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Entwicklung</td>
			<td>3 min</td>
			<td>5 min</td>
			<td>6 min</td>
		</tr>
<tr>
<td>Harte Backen (optional)</td>
			<td>3-5 min. @ 200 ° C</td>
			<td>3-5 min. @ 200 ° C</td>
			<td>3-5 min. @ 200 ° C</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 3: Photolithographie Schritte durchgeführt, ein Gerät mit einer zentralen Kammer 3 μm Höhe bauen. Höhen der Mittelstufen Kammern: 18, 50 und 90 µm.
Ergänzende Daten 1: masks_neuron_volume_chips.tiff. Schematische Darstellung der Masken verwendet, um das PDMS-Gerät (DRIE Maske und Masken 1-3) zu fabrizieren. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56923/masks_neuron_volume_chips.tiff">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.</a>
Ergänzende Daten 2: Datei "masks_neuron_volume_chips.dxf". Elektronische Dateien ermöglicht, um die DRIE Maske und Masken 1-3 zu fabrizieren. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56923/masks_neuron_volume_chips.dxf">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.</a>
Ergänzende Daten 3: "Mask_Photoresist-stripes.dxf". Elektronische Dateien ermöglicht, um die Maske für die Fotolithografie Photoresist Streifen zu fabrizieren. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56923/Mask_Photoresist-stripes.dxf">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.</a>
Ergänzende Daten 4: conversion_mattotiff.m-Datei <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56923/conversion_mattotiff.m">Klicken Sie bitte hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>
Ergänzende Daten 5: importfilevol.m-Datei <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56923/importfilevol.m">Klicken Sie bitte hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>

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High-resolution Volume Imaging of Neurons by the Use of Fluorescence eXclusion Method and Dedicated Microfluidic Devices

Volumen ist ein wichtiger Parameter zur physiologischen und pathologischen Eigenschaften der Zellen. Wir beschreiben eine fluoreszierende Ausschluss-Methode, flächenhafte Messung von in-vitro- neuronale Volumen mit Sub mikrometrische axiale Auflösung benötigt für die Analyse von Neuriten und dynamische Strukturen in neuronale Wachstum impliziert.

Hochauflösende Volume Imaging von Neuronen durch den Einsatz von Fluoreszenz-Ausschluss Methode und mikrofluidischen Geräten gewidmet

Volume is an important parameter regarding physiological and pathological characteristics of neurons at different time scales. Neurons are quite unique ...

high-resolution-volume-imaging-neurons-use-fluorescence-exclusion

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

7.0K Aufrufe.  Université PSL, CNRS. Volumen ist ein wichtiger Parameter zur physiologischen und pathologischen Eigenschaften der Zellen. Wir beschreiben eine fluoreszierende Ausschluss-Methode, flächenhafte Messung von in-vitro- neuronale Volumen mit Sub mikrometrische axiale Auflösung benötigt für die Analyse von Neuriten und dynamische Strukturen in neuronale Wachstum impliziert.

Serie: High-resolution Volume Imaging of Neurons by the Use of Fluorescence eXclusion Method and Dedicated Microfluidic Devices

An Organotypic Slice Assay for High-Resolution Time-Lapse Imaging of Neuronal Migration in the Postnatal Brain

Neurogenesis in the postnatal brain depends on maintenance of three biological events: proliferation of progenitor cells, migration of neuroblasts, as well as differentiation and integration of new neurons into existing neural circuits. For postnatal neurogenesis in the olfactory bulbs, these events are segregated within three anatomically distinct domains: proliferation largely occurs in the subependymal zone (SEZ) of the lateral ventricles, migrating neuroblasts traverse through the rostral migratory stream (RMS), and new neurons differentiate and integrate within the olfactory bulbs (OB). The three domains serve as ideal platforms to study the cellular, molecular, and physiological mechanisms that regulate each of the biological events distinctly. This paper describes an organotypic slice assay optimized for postnatal brain tissue, in which the extracellular conditions closely mimic the in vivo environment for migrating neuroblasts. We show that our assay provides for uniform, oriented, and speedy movement of neuroblasts within the RMS. This assay will be highly suitable for the study of cell autonomous and non-autonomous regulation of neuronal migration by utilizing cross-transplantation approaches from mice on different genetic backgrounds.

This protocol describes an organotypic slice assay optimized for the postnatal brain and high-resolution time-lapse imaging of neuroblast migration in the rostral migratory stream.

Ein organotypischen Assay für High-Resolution Time-Lapse Imaging neuronaler Migration in der postnatalen Gehirn

Neurogenesis in the postnatal brain depends on maintenance of three biological events: proliferation of progenitor cells, migration of neuroblasts, as ...

Forschung

Neurowissenschaften

A Rapid Approach to High-Resolution Fluorescence Imaging in Semi-Thick Brain Slices

A fundamental goal to both basic and clinical neuroscience is to better understand the identities, molecular makeup, and patterns of connectivity that are characteristic to neurons in both normal and diseased brain. Towards this, a great deal of effort has been placed on building high-resolution neuroanatomical maps1-3. With the expansion of molecular genetics and advances in light microscopy has come the ability to query not only neuronal morphologies, but also the molecular and cellular makeup of individual neurons and their associated networks4. Major advances in the ability to mark and manipulate neurons through transgenic and gene targeting technologies in the rodent now allow investigators to 'program' neuronal subsets at will5-6. Arguably, one of the most influential contributions to contemporary neuroscience has been the discovery and cloning of genes encoding fluorescent proteins (FPs) in marine invertebrates7-8, alongside their subsequent engineering to yield an ever-expanding toolbox of vital reporters9. Exploiting cell type-specific promoter activity to drive targeted FP expression in discrete neuronal populations now affords neuroanatomical investigation with genetic precision.
Engineering FP expression in neurons has vastly improved our understanding of brain structure and function. However, imaging individual neurons and their associated networks in deep brain tissues, or in three dimensions, has remained a challenge. Due to high lipid content, nervous tissue is rather opaque and exhibits auto fluorescence. These inherent biophysical properties make it difficult to visualize and image fluorescently labelled neurons at high resolution using standard epifluorescent or confocal microscopy beyond depths of tens of microns. To circumvent this challenge investigators often employ serial thin-section imaging and reconstruction methods10, or 2-photon laser scanning microscopy11. Current drawbacks to these approaches are the associated labor-intensive tissue preparation, or cost-prohibitive instrumentation respectively.
Here, we present a relatively rapid and simple method to visualize fluorescently labelled cells in fixed semi-thick mouse brain slices by optical clearing and imaging. In the attached protocol we describe the methods of: 1) fixing brain tissue in situ via intracardial perfusion, 2) dissection and removal of whole brain, 3) stationary brain embedding in agarose, 4) precision semi-thick slice preparation using new vibratome instrumentation, 5) clearing brain tissue through a glycerol gradient, and 6) mounting on glass slides for light microscopy and z-stack reconstruction (Figure 1).
For preparing brain slices we implemented a relatively new piece of instrumentation called the 'Compresstome' VF-200 (http://www.precisionary.com/products_vf200.html). This instrument is a semi-automated microtome equipped with a motorized advance and blade vibration system with features similar in function to other vibratomes. Unlike other vibratomes, the tissue to be sliced is mounted in an agarose plug within a stainless steel cylinder. The tissue is extruded at desired thicknesses from the cylinder, and cut by the forward advancing vibrating blade. The agarose plug/cylinder system allows for reproducible tissue mounting, alignment, and precision cutting. In our hands, the 'Compresstome' yields high quality tissue slices for electrophysiology, immunohistochemistry, and direct fixed-tissue mounting and imaging. Combined with optical clearing, here we demonstrate the preparation of semi-thick fixed brain slices for high-resolution fluorescent imaging.

Here we describe a rapid and simple method to image fluorescently labeled cells in semi-thick brain slices. By fixing, slicing, and optically clearing brain tissue we describe how standard epifluorescent or confocal imaging can be used to visualize individual cells and neuronal networks within intact nervous tissue.

Eine schnelle Annäherung an High-Resolution Fluoreszenz-Imaging in Semi-Thick Hirnschnitten

A fundamental goal to both basic and clinical neuroscience is to better understand the identities, molecular makeup, and patterns of connectivity that are ...

High-resolution Functional Magnetic Resonance Imaging Methods for Human Midbrain

Functional MRI (fMRI) is a widely used tool for non-invasively measuring correlates of human brain activity. However, its use has mostly been focused upon measuring activity on the surface of cerebral cortex rather than in subcortical regions such as midbrain and brainstem. Subcortical fMRI must overcome two challenges: spatial resolution and physiological noise. Here we describe an optimized set of techniques developed to perform high-resolution fMRI in human SC, a structure on the dorsal surface of the midbrain; the methods can also be used to image other brainstem and subcortical structures.
High-resolution (1.2 mm voxels) fMRI of the SC requires a non-conventional approach. The desired spatial sampling is obtained using a multi-shot (interleaved) spiral acquisition1. Since, T2* of SC tissue is longer than in cortex, a correspondingly longer echo time (TE ~ 40 msec) is used to maximize functional contrast. To cover the full extent of the SC, 8-10 slices are obtained. For each session a structural anatomy with the same slice prescription as the fMRI is also obtained, which is used to align the functional data to a high-resolution reference volume.
In a separate session, for each subject, we create a high-resolution (0.7 mm sampling) reference volume using a T1-weighted sequence that gives good tissue contrast. In the reference volume, the midbrain region is segmented using the ITK-SNAP software application2. This segmentation is used to create a 3D surface representation of the midbrain that is both smooth and accurate3. The surface vertices and normals are used to create a map of depth from the midbrain surface within the tissue4.
Functional data is transformed into the coordinate system of the segmented reference volume. Depth associations of the voxels enable the averaging of fMRI time series data within specified depth ranges to improve signal quality. Data is rendered on the 3D surface for visualization.
In our lab we use this technique for measuring topographic maps of visual stimulation and covert and overt visual attention within the SC1. As an example, we demonstrate the topographic representation of polar angle to visual stimulation in SC.

This article describes techniques to perform high-resolution functional magnetic resonance imaging with 1.2 mm sampling in human midbrain and subcortical structures using a 3T scanner. Use of these techniques to resolve topographic maps of visual stimulation in the human superior colliculus (SC) is given as an example.

Hochauflösende Functional Magnetic Resonance Imaging Methods for Human Mittelhirn

Functional MRI (fMRI) is a widely used tool for non-invasively measuring correlates of human brain activity. However, its use has mostly been focused upon ...

High-resolution Live Imaging of Cell Behavior in the Developing Neuroepithelium

The embryonic spinal cord consists of cycling neural progenitor cells that give rise to a large percentage of the neuronal and glial cells of the central nervous system (CNS). Although much is known about the molecular mechanisms that pattern the spinal cord and elicit neuronal differentiation1, 2, we lack a deep understanding of these early events at the level of cell behavior. It is thus critical to study the behavior of neural progenitors in real time as they undergo neurogenesis.
In the past, real-time imaging of early embryonic tissue has been limited by cell/tissue viability in culture as well as the phototoxic effects of fluorescent imaging. Here we present a novel assay for imaging such tissue for long periods of time, utilizing a novel ex vivo slice culture protocol and wide-field fluorescence microscopy (Fig. 1). This approach achieves long-term time-lapse monitoring of chick embryonic spinal cord progenitor cells with high spatial and temporal resolution.
This assay may be modified to image a range of embryonic tissues3, 4 In addition to the observation of cellular and sub-cellular behaviors, the development of novel and highly sensitive reporters for gene activity (for example, Notch signaling5) makes this assay a powerful tool with which to understand how signaling regulates cell behavior during embryonic development.

Imaging embryonic tissue in real-time is challenging over long periods of time. Here we present an assay for monitoring cellular and sub-cellular changes in chick spinal cord for long periods with high spatial and temporal resolution. This technique can be adapted for other regions of the nervous system and developing embryo.

Hochauflösende Live-Bildgebung von Zell-Verhalten in der Entwicklung von Neuroepithel

The embryonic spinal cord consists of cycling neural progenitor cells that give rise to a large percentage of the neuronal and glial cells of the central ...

High-resolution In Vivo Manual Segmentation Protocol for Human Hippocampal Subfields Using 3T Magnetic Resonance Imaging

The human hippocampus has been broadly studied in the context of memory and normal brain function and its role in different neuropsychiatric disorders has been heavily studied. While many imaging studies treat the hippocampus as a single unitary neuroanatomical structure, it is, in fact, composed of several subfields that have a complex three-dimensional geometry. As such, it is known that these subfields perform specialized functions and are differentially affected through the course of different disease states. Magnetic resonance (MR) imaging can be used as a powerful tool to interrogate the morphology of the hippocampus and its subfields. Many groups use advanced imaging software and hardware (&#62;3T) to image the subfields; however this type of technology may not be readily available in most research and clinical imaging centers. To address this need, this manuscript provides a detailed step-by-step protocol for segmenting the full anterior-posterior length of the hippocampus and its subfields: cornu ammonis (CA) 1, CA2/CA3, CA4/dentate gyrus (DG), strata radiatum/lacunosum/moleculare (SR/SL/SM), and subiculum. This protocol has been applied to five subjects (3F, 2M; age 29-57, avg. 37). Protocol reliability is assessed by resegmenting either the right or left hippocampus of each subject and computing the overlap using the Dice&#39;s kappa metric. Mean Dice&#39;s kappa (range) across the five subjects are: whole hippocampus, 0.91 (0.90-0.92); CA1, 0.78 (0.77-0.79); CA2/CA3, 0.64 (0.56-0.73); CA4/dentate gyrus, 0.83 (0.81-0.85); strata radiatum/lacunosum/moleculare, 0.71 (0.68-0.73); and subiculum 0.75 (0.72-0.78). The segmentation protocol presented here provides other laboratories with a reliable method to study the hippocampus and hippocampal subfields in vivo using commonly available MR tools.

High-resolution In Vivo Manual Segmentation Protocol for Human Hippocampal Subfields Using 3T Magnetic Resonance Imaging

The goal of this manuscript is to study the hippocampus and hippocampal subfields using MRI. The manuscript describes a protocol for segmenting the hippocampus and five hippocampal substructures: cornu ammonis (CA) 1, CA2/CA3, CA4/dentate gyrus, strata radiatum/lacunosum/moleculare, and subiculum.

Hohe Auflösung<em&gt; In-vivo-</em&gt; Manuelle Segmentierung Protokoll für Menschen Hippocampus Teilfelder Verwenden von 3T Kernspintomographie

The human hippocampus has been broadly studied in the context of memory and normal brain function and its role in different neuropsychiatric disorders has ...

Analysis of Developing Tooth Germ Innervation Using Microfluidic Co-culture Devices

Innervation plays a key role in the development, homeostasis and regeneration of organs and tissues. However, the mechanisms underlying these phenomena are not well understood yet. In particular, the role of innervation in tooth development and regeneration is neglected.
Several in vivo studies have provided important information about the patterns of innervation of dental tissues during development and repair processes of various animal models. However, most of these approaches are not optimal to highlight the molecular basis of the interactions between nerve fibres and target organs and tissues.
Co-cultures constitute a valuable method to investigate and manipulate the interactions between nerve fibres and teeth in a controlled and isolated environment. In the last decades, conventional co-cultures using the same culture medium have been performed for very short periods (e.g., two days) to investigate the attractive or repulsive effects of developing oral and dental tissues on sensory nerve fibres. However, extension of the culture period is required to investigate the effects of innervation on tooth morphogenesis and cytodifferentiation.
Microfluidics systems allow co-cultures of neurons and different cell types in their appropriate culture media. We have recently demonstrated that trigeminal ganglia (TG) and teeth are able to survive for a long period of time when co-cultured in microfluidic devices, and that they maintain in these conditions the same innervation pattern that they show in vivo.
On this basis, we describe how to isolate and co-culture developing trigeminal ganglia and tooth germs in a microfluidic co-culture system.This protocol describes a simple and flexible way to co-culture ganglia/nerves and target tissues and to study the roles of specific molecules on such interactions in a controlled and isolated environment.

Co-cultures represent a valuable method to study the interactions between nerves and target tissues and organs. Microfluidic systems allow co-culturing ganglia and whole developing organs or tissues in different culture media, thus representing a valuable tool for the in vitro study of the crosstalk between neurons and their targets.

Die Analyse der Entwicklung von Zahnkeim Innervation Mit Microfluidic Co-Kultur-Geräte

Innervation plays a key role in the development, homeostasis and regeneration of organs and tissues. However, the mechanisms underlying these phenomena ...

High-resolution Structural Magnetic Resonance Imaging of the Human Subcortex In Vivo and Postmortem

The focus of this study was to test the resolution limits of structural MRI of a postmortem brain compared to living human brains. The resolution of structural MRI in vivo is ultimately limited by physiological noise, including pulsation, respiration and head movement. Although imaging hardware continues to improve, it is still difficult to resolve structures on the millimeter scale. For example, the primary visual sensory pathways synapse at the lateral geniculate nucleus (LGN), a visual relay and control nucleus in the thalamus that normally is organized into six interleaved monocular layers. Neuroimaging studies have not been able to reliably distinguish these layers due their small size that are less than 1 mm thick.
The resolving limit of structural MRI, in a postmortem brain was tested using multiple images averaged over a long duration (~24 h). The purpose was to test whether it was possible to resolve the individual layers of the LGN in the absence of physiological noise. A proton density (PD)1 weighted pulse sequence was used with varying resolution and other parameters to determine the minimum number of images necessary to be registered and averaged to reliably distinguish the LGN and other subcortical regions. The results were also compared to images acquired in living human brains. In vivo subjects were scanned in order to determine the additional effects of physiological noise on the minimum number of PD scans needed to differentiate subcortical structures, useful in clinical applications.

High-resolution Structural Magnetic Resonance Imaging of the Human Subcortex In Vivo and Postmortem

Here we present a protocol to determine the minimum number images that needed to be registered and averaged to resolve subcortical structures and test whether the individual layers of the LGN could be resolved in the absence of physiological noise.

Hochauflösende Strukturkernspintomographie des menschlichen Subcortex<I&gt; In-vivo-</I&gt; Und Postmortem

The focus of this study was to test the resolution limits of structural MRI of a postmortem brain compared to living human brains. The resolution of ...

Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

Susceptibility to neuron cell death associated to neurodegeneration and ischemia are exceedingly increased in the aged brain but mechanisms responsible are badly known. Excitotoxicity, a process believed to contribute to neuron damage induced by both insults, is mediated by activation of glutamate receptors that promotes Ca2+ influx and mitochondrial Ca2+ overload. A substantial change in intracellular Ca2+ homeostasis or remodeling of intracellular Ca2+ homeostasis may favor neuron damage in old neurons. For investigating Ca2+ remodeling in aging we have used live cell imaging in long-term cultures of rat hippocampal neurons that resemble in some aspects aged neurons in vivo. For this end, hippocampal cells are, in first place, freshly dispersed from new born rat hippocampi and plated on poli-D-lysine coated, glass coverslips. Then cultures are kept in controlled media for several days or several weeks for investigating young and old neurons, respectively. Second, cultured neurons are loaded with fura2 and subjected to measurements of cytosolic Ca2+ concentration using digital fluorescence ratio imaging. Third, cultured neurons are transfected with plasmids expressing a tandem of low-affinity aequorin and GFP targeted to mitochondria. After 24 hr, aequorin inside cells is reconstituted with coelenterazine and neurons are subjected to bioluminescence imaging for monitoring of mitochondrial Ca2+ concentration. This three-step procedure allows the monitoring of cytosolic and mitochondrial Ca2+ responses to relevant stimuli as for example the glutamate receptor agonist NMDA and compare whether these and other responses are influenced by aging. This procedure may yield new insights as to how aging influence cytosolic and mitochondrial Ca2+ responses to selected stimuli as well as the testing of selected drugs aimed at preventing neuron cell death in age-related diseases.

Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

Intracellular Ca2+ remodeling in aging may contribute to excitotoxicity and neuron damage, processes mediated by Ca2+ overload. We aimed at investigating Ca2+ remodeling in the aging brain using fluorescence and bioluminescence imaging of cytosolic and mitochondrial Ca2+ in long-term cultures of rat hippocampal neurons, a model of neuronal aging.

Fluoreszenz- und Biolumineszenz-Bildgebung subzellulärer Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Im Alter von Neuronen im Hippocampus

Susceptibility to neuron cell death associated to neurodegeneration and ischemia are exceedingly increased in the aged brain but mechanisms responsible ...

High-Resolution Quantitative Immunogold Analysis of Membrane Receptors at Retinal Ribbon Synapses

Retinal ganglion cells (RGCs) receive excitatory glutamatergic input from bipolar cells. Synaptic excitation of RGCs is mediated postsynaptically by NMDA receptors (NMDARs) and AMPA receptors (AMPARs). Physiological data have indicated that glutamate receptors at RGCs are expressed not only in postsynaptic but also in perisynaptic or extrasynaptic membrane compartments. However, precise anatomical locations for glutamate receptors at RGC synapses have not been determined. Although a high-resolution quantitative analysis of glutamate receptors at central synapses is widely employed, this approach has had only limited success in the retina. We developed a postembedding immunogold method for analysis of membrane receptors, making it possible to estimate the number, density and variability of these receptors at retinal ribbon synapses. Here we describe the tools, reagents, and the practical steps that are needed for: 1) successful preparation of retinal fixation, 2) freeze-substitution, 3) postembedding immunogold electron microscope (EM) immunocytochemistry and, 4) quantitative visualization of glutamate receptors at ribbon synapses.

The postembedding immunogold method is one of the most effective ways to provide high-resolution analyses of the subcellular localization of specific molecules. Here we describe a protocol to quantitatively analyze glutamate receptors at retinal ribbon synapses.

Hochauflösende Quantitative Immungold-Analyse von Membranrezeptoren auf der Netzhaut Ribbon Synapsen

Retinal ganglion cells (RGCs) receive excitatory glutamatergic input from bipolar cells. Synaptic excitation of RGCs is mediated postsynaptically by NMDA ...

High-resolution Confocal Imaging of the Blood-brain Barrier: Imaging, 3D Reconstruction, and Quantification of Transcytosis

The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic multicellular interface that regulates the transport of molecules between the circulation and the brain. Transcytosis across the BBB regulates the delivery of hormones, metabolites, and therapeutic antibodies to the brain parenchyma. Here, we present a protocol that combines immunofluorescence of free-floating sections with laser scanning confocal microscopy and image analysis to visualize subcellular organelles within endothelial cells at the BBB. Combining this data-set with 3D image analysis software allows for the semi-automated segmentation and quantification of capillary volume and surface area, as well as the number and intensity of intracellular organelles at the BBB. The detection of mouse endogenous immunoglobulin (IgG) within intracellular vesicles and their quantification at the BBB is used to illustrate the method. This protocol can potentially be applied to the investigation of the mechanisms controlling BBB transcytosis of different molecules in vivo.

Here we present a microscopy-based protocol for high-resolution imaging and a three-dimensional reconstruction of the mouse neurovascular unit and blood-brain barrier using brain free-floating sections. This method allows for the visualization, analysis, and quantification of intracellular organelles at the BBB.

Hochauflösende konfokale Bildgebung der Blut - Hirn-Schranke: Bildgebung, 3D-Rekonstruktion und Quantifizierung der Transcytosis

The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic multicellular interface that regulates the transport of molecules between the circulation and the brain. ...