Die Autoren danken Paola Suatoni, Elena Bertocchi, Carolina Ninni, Annamaria Calanca und Chiara Banfi für Umgang mit Freiwilligen in den Prüfungen und für die Amtshilfe; und Claudio Jacomelli und Claudio Citterio für das Datenmanagement. Die Arbeit wurde unterstützt durch die italienische Vereinigung für Krebsforschung [Investigator Grants Nr. 15928 bis 14318 GS und 12162 (spezielles Programm "Innovative Tools for Cancer Risk Assessment und Früherkennung", 5 x 1000)]; Das italienische Gesundheitsministerium [Grant Nr. RF-2010]; Grant UO1 CA166905 vom National Cancer Institute (USA). MB wurde von einem Fondazione Pezcoller Stipendium unterstützt.

das Protokoll wurde von der Ethikkommission der Forschung unserer Institution angenommen.
 1. Plasma Musterkollektion <ol><li>sammeln 10 mL Vollblut Probe in Vacutainer-Röhrchen mit Spray-beschichtete K 2 EDTA und bei Raumtemperatur lagern. 
	Hinweis: Um die Hämolyse zu minimieren, separate Plasma innerhalb von 2 h. Lagern Sie nicht Vollblut bei niedriger Temperatur (d.h., 4 ° C) zu vermeiden, Thermoschock und Zell-Lyse, die zu einer unspezifischen MiRNA-Version führen.</li>
	<li>Innerhalb von 1 h, trennen das Plasma durch Zentrifugation zunächst auf 1.258 x g und 4 ° C für 10 min.</li>
	<li>Überstand Plasma in einer 15 mL-Tube, sorgfältig Vermeidung des Kontakts mit dem lymphozytären Ring übertragen.</li>
	<li>Zentrifuge das Plasma ein zweites Mal bei 1.258 x g und 4 ° C für 10 min.</li>
	<li>Aliquoten 1 mL Plasma in 1,5 mL Cryovials, sammeln den Plasma-Anteil an der Unterseite des Rohres zu vermeiden.</li>
	<li>Speichern die Aliquote bei &#8722; 80 ° C, außer für die Bewertung der Hämolyse. Die molekulare Analyse sollte innerhalb von 5 Wochen durchgeführt werden.</li>
</ol> 2. Bewertung der Hämolyse durch photometrische Messung <ol><li>unmittelbar nach der Plasma Trennung Schritt in eine Küvette für Spektralphotometrie, machen eine 01:10 Verdünnung der Probe mit 1 X PBS-Puffer (z. B., 100 µL des Plasmas in 900 µL 1 X Plasma PBS) und mischen, Homogenisieren it. 
	Hinweis: Die Plasma-Proben sollten nicht eingefroren werden bevor die photometrische Messungen als das Einfrieren-Auftauen der Probe (und vor allem in Lipämische Proben), flockt bilden könnten, die die photometrische Analyse beeinträchtigen.</li>
	<li>Lesen die Extinktion bei 375 nm, 414 nm, 541 nm und 576 nm mit einem UV-Vis Spektralphotometer mit einem Basislinienkorrektur ließ sich bei 750 nm und eine Länge von 10 mm. führen Sie eine leere Messung mit 1 mL 1 X PBS.</li>
	<li>Berechnen Sie das Verhältnis zwischen der Extinktion bei 414 nm und 375 nm, wenn höher als 1.4, betrachten das Beispiel hämolysiert und wiederholen Sie die Blutentnahme (QC1 in Tabelle 1).</li>
</ol> 3. Plasma Gesamt RNA Extraktion <ol><li>bereiten Sie eine 1-Thioglycerol/Homogenisierung (OMG) Lösung mit 20 µL 1 Thioglycerol pro mL Homogenisierung Lösung. Da 1-Thioglycerol zähflüssig ist, sorgfältig pipette für eine genaue Messung. Kühlen Sie die OMG-Lösung auf Eis oder bei 2-10 ° C, bevor mit it. 
	Hinweis: Die Arbeitslösung liegt stabil bei 2 bis 10 ° C für 1 Monat.</li>
	<li>Unterbrechen die lyophilisierten DNase I durch Hinzufügen von 275 µL Nuklease-freie Wasser in die Flasche und vorsichtig mischen (nicht Wirbel zu tun). Als visuelle Hilfe, fügen Sie 5 µL blau färben, die rekonstituierte DNase ich und die Lösung in Einweg-Aliquote in Nuklease-freie Rohre zu verzichten. Speichern der wiederhergestellten DNase I bei-30 ° C bis-10 ° c</li>
	<li>Ausgehend von 200 µL des Plasmas, 200 µL der gekühlten OMG-Lösung hinzufügen.</li>
	<li>Vortex 15-30 s um eine vollständige Homogenisierung zu gewährleisten. Tritt Schaum, lassen Sie die Probe auf Ice absetzen</li>
	<li>Fügen Sie 200 µL Lysis Puffer und 25 µL Proteinase K der homogenisierten Probe und Wirbel für 20 s.</li>
	<li>Inkubation die Proben 15 min in einem Thermomixer bei 37 vorgeheizt ° c</li>
	<li>Laden eine Patrone für jede Probe auf dem Deck des Instruments und die Plugger in der richtigen Position zu platzieren.</li>
	<li>Übertragung an die gewünschte Position in der Instrument-Patrone der lysate.</li>
	<li>Hinzufügen 5 µL DNase ich Lösung in die richtige Position in der Patrone.</li>
	<li>Fügen Sie 60 µL Nuklease-freies Wasser an der Basis jeder Elution Tube.</li>
	<li>Wählen Sie die &#34; RSC MiRNA Gewebe &#34; Methode und die automatisierte Reinigung laufen beginnen. Die total RNA-Proben können bei gelagert werden &#8722; 80 ° c</li>
</ol> 4. Taq-basierte RT <ol><li>Taq RT Primer Pool mit MiRNAs von Interesse verwenden, um die RNA in cDNA mit dem Taq MicroRNA Reverse Transcription Kit konvertieren.</li>
	<li>Bereiten 12 µL RT-Reaktion-Mix auf Eis in einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch vorschriftsmäßig Kit, mit 6 µL des benutzerdefinierten Taq RT Primer Pools.</li>
	<li>Add 3 µL Gesamt RNA für ein Endvolumen von 15 µL und inkubieren Sie Eis für 5 min.</li>
	<li>Laden der Funktelegrafie-Reaktion auf einem Thermo-Cycler wie folgt konfiguriert: 16 ° C für 30 min, 42 ° C für 30 min, 85 ° C für 5 min und Halt bei 4 ° c 
	Bemerkung: Die cDNA kann bei-15 bis-20 ° C für mindestens eine Woche.</li>
</ol> 5. Vorverstärkung <ol><li>Mix 2,5 µL des Produktes RT mit 12,5 µL Taq Master Mix 2 X 3,75 µL Taq Custom Pool und 6,25 µL Nuklease-freies Wasser für ein Gesamtvolumen von 25 µL.</li>
	<li>Führen die Vorverstärkung Reaktion mit einem Thermo-Cycler entsprechend dem folgenden thermischen Profil: 95 ° C für 10 min, 55 ° C für 2 min, 72 ° C für 2 min, 12 Zyklen von 95 ° C für 15 s und 60 ° C für 4 min. , dann halten Sie bei 99,9 ° C für 10 min und 4 ° c</li>
	<li>Verdünnen das Produkt durch Zugabe von 175 µL 0.1 X TE, pH 8.0. 
	Bemerkung: Das verdünnte Produkt kann bei-15 bis-20 ° C für mindestens eine Woche.</li>
</ol> 6. RT-qPCR Reaktion auf Custom Taq Array MicroRNA Karten <ol><li>Gebrauch der 384-Well-MicrofluidicCustom Taq Array MicroRNA Karte Plasmaspiegel von den 24 bestimmte MiRNAs (gesichtet in zweifacher Ausfertigung) auf 8 Proben gleichzeitig zu messen. MiRBase-ID (v21) für 24 MiRNAs sind: hat-MiR-101-3 p, hat-MiR-106a - 5P, hat-MiR-126-3 p, hat-MiR-133a - 3P, hat-MiR-140-3 p, hat-MiR-140-5 p, hat-MiR-142-3 p, hat-MiR-145-5-p, hat-MiR-148b - 3P, hat-MiR - 15 b - 5P, hat-MiR-16-5 p, hat-MiR-17-5 p hat-MiR-197-3 p, hat-MiR - 19 b - 3p, hat-MiR-21-5 p hat-MiR-221-3 p, hat-MiR-28-3 p, hat-MiR - 30 b - 5P, hat-MiR - 30c - 5P, hat-MiR-320a, hat MiR 451a, hat-MiR-486-5 p, hat-MiR-660-5 p und hat-MiR-92a - 3 p.</li>
	<li>Mix 1.13 µL der verdünnten Probe PreAmp mit 56,25 µL 2 X Taq Universal Master Mix und 55.69 µL Nuklease-freies Wasser in einem Rohr 0,5 mL.</li>
	<li>Bis zu 8 PCR-Reaktion-Mix auf die Custom Taq Array MicroRNA Karten laden.</li>
	<li>Zentrifuge bei 311 X g für 2 min.</li>
	<li>Die eigene Karte mit dem Array Karte Sealer versiegeln.</li>
	<li>Laufen die Echtzeit-Reaktion mit einem Real-Time PCR System ändern die Radsport-Parameter wie folgt: 94,5 ° C für 10 min, 40 Zyklen von 97 ° C für 30 s und 59,7 ° C für 60 s.</li>
</ol> 7. Extrapolation von Daten und Kennzahlen Generation <ol><li>Nutzung der Software zu Ct Rohwerte, Einstellung einer automatischen Basislinie, die Hintergrund-Signale und einen festen Schwellenwert von 0,15 für alle Proben und Proben zu entfernen. Entfernen Sie Flecken mit Armen Verstärkung Kurven und/oder schlechte passive Bezugssignale.</li>
	<li>Export Ct Rohwerte in &#34; XLS &#34; format und verwenden Sie den Ct-Mittelwert der beiden Duplikate zur weiteren Analyse.</li>
	<li>Korrelat MiRNAs &#39; Ausdruck Niveaus zu historischen Messungen an Proben der klinischen Studie (Tabelle 2). Wenn mindestens 50 % der Proben auf jeder custom made mikrofluidischen Karte eine Pearson ergeben &#39; s Korrelation &#60; 97,5, wiederholen Sie die Karte (QC2 in Tabelle 1).</li>
	<li>Berechnen die &#8722; ΔCts zwischen allen MiRNAs, entspricht der log2-Werte der MiRNA Verhältnisse.</li>
</ol> 8. Bewertung der Hämolyse durch die damit verbundenen MiRNA Signatur <ol><li>generieren die Hämolyse-bezogene MiRNA-Signatur verwenden die folgenden MiRNA-Verhältnisse mit jeweiligen Cut-Offs (log2 Werte) für kurze Lagerung Plasmaproben (1-5 Wochen bei &#8722; 80 ° C): MiR-126/451 &#60; &#8722; 0,07, 15 b/451 &#60; &#8722; 3,67, 221/451 &#60; &#8722; 3.18, 30 b/451 &#60; &#8722; 1.1, 126/486-5p &#60; &#8722; 0,33, 15 b/486-5 p &#60; &#8722; 3.86, 221/486-5 p &#60; &#8722; 3,17, 30 b/486-5 p &#60; &#8722; 1,42, 126/92a &#60; 1,8, 15 b/92a &#60; &#8722; 1.8, 221/92a &#60; &#8722; 1,04, 30 b/92a &#60; 0,87, 126/16 &#60; &#8722; 2,85, 15 b/16 &#60; &#8722; 6.33, 221/16 &#60; &#8722; 5.9, 30 b/16 &#60; &#8722; 3,68.</li>
	<li>Klassifizieren als lipämischen Proben, wo mindestens 50 % der Verhältnisse (8 von 16) jeweiligen Cut-off betragen (QC3 in Tabelle 1).</li>
</ol> 9. Definition der Ebene des Risikos: hoch, Mittel und niedrig <ol><li>definieren die vier Unterschriften von MiRNA-Verhältnisse die MSC zu komponieren, wie in Abbildung 3: Risiko einer Erkrankung (RD), aggressive Krankheitsrisiko (RAD), Vorhandensein von Krankheit (PD) und aggressive Krankheit (PAD).</li>
	<li>Für jede Signatur definieren die Verhältnisse, die Überschreitung der jeweiligen Grenzwert für kurze Lagerung Plasmaproben (1-5 Wochen bei &#8722; 80 ° C). Die Anzahl der über Verhältnisse als positiv betrachtet werden musste ist 9 von 27 für RD und PD und 14 von 28 für RAD und PAD ( Abbildung 3).</li>
	<li>Attribut auf jede Probe die jeweiligen MSC Risikostufe wie folgt: geringes Risiko, wenn RD Neg &#8745; PD Neg &#8745; RAD Neg &#8745; PAD Neg; mittlere Risiko wenn RD pos &#8746; PD pos &#8745; RAD Neg &#8745; PAD Neg; oder hohem Risiko wenn RAD pos &#8746; PAD pos ( Abbildung 3 B).</li>
</ol>

<ol>
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Gabriella Sozzi, Mattia Boeri und Ugo Pastorino sind Co-Erfinder der drei Patentanmeldungen lizenziert, Gensignia Life Sciences über die MiRNA-Signatur in diesem Artikel veröffentlicht. Die übrigen Autoren erklären keine Interessenkonflikte in Bezug auf die eingereichten Arbeiten.

Tücken und Herausforderungen des methodischen Workflows BioMILD die erste prospektive Studie analysieren zirkulierenden MiRNAs als Diagnosewerkzeug ist, wurden Schwellen und Trenngrenzen genutzt für die Datenanalyse aus retrospektiven Serie generiert. Um das Problem der unterschiedlichen Speicherintervall von Plasma-Proben zu überwinden, können die Parameter möglicherweise eine Erhöhung der MSC Leistung erhalten verfeinert werden. Dennoch, bevor MiRNAs Analyse, verschiedene Aspekte des Gesamtprozesses müssen sorgfältig geprüft werden, wie z. B. die Einschlusskriterien, der Probengewinnung und Verarbeitung und der Bioinformatik-Algorithmus angenommen für die Datenanalyse. Die folgenden Abschnitte konzentrieren sich auf die kritischsten Punkte des Workflows in der vorliegenden Arbeit, die großen Probleme der einzelnen Schritte und Strategien zu deren Überwindung dann vorschlagen beschrieben.
Studienpopulation Aufnahmekriterien für die BioMILD screening-Verfahren sind: 50-75 Jahre alten, schweren aktuelle oder ehemalige (weniger als 10 Jahre) Raucher mit mindestens 30 Pack-Jahren und keine vorherige Erfahrung im Bereich von Krebs innerhalb von 5 Jahren. In dieser Population waren die geschätzten Lunge Krebs Prävalenz und Inzidenz pro Jahr etwa 1 % und 0,7 %, beziehungsweise. Um den MSC-Test wie beschrieben in das vorgeschlagene Protokoll anzuwenden, sollte die Bevölkerung analysiert ähnliche Merkmale pflegen. Insbesondere beinhaltet die QC2 Schritt beschriebenen Vergleich mit den gegebenen historischen Daten aus einer ähnlichen Einwohnerzahl. Während eine Korrelation unter 97,5 technische Probleme hindeuten könnte, auf der anderen Seite sind die meisten Personen mit veränderten zirkulierenden MiRNA Ebenen reflektiert das Risiko für Lungenkrebs tatsächlich unterhalb dieser Schwelle. Das heißt, wenn eine Bevölkerung höheres Risiko an Lungenkrebs zu erkranken QC2 Schritt mit den Parametern hier berichtet zugewiesen wird, kann es akzeptabel Proben ausschließen. Dann sollten neue, richtige Verweisparameter definiert werden, die spezifisch für jede Bevölkerung nach erwarteten Ergebnisse analysiert werden.
Blutentnahme und Hämolyse Die Sammlung von biologischen Proben ist ein entscheidender Pre-analytischen Schritt, da es Sample-Qualität und Eigenschaften beeinträchtigen kann, so ändern Sie die endgültigen Ergebnisse der Analysen. Bezug auf Blutproben ist es wichtig, frisches Blut zu sammeln und die Probe so schnell wie möglich zu verarbeiten. Proben sollten bei 4 ° C gelagert weder werden nach Blutentnahme, eingefroren, da Einfrieren und Auftauen Passagen Zelle Lysis (Hämolyse) und RNA-Abbau induzieren können. Zur Minimierung von Hämolyse Prozess wird vorgeschlagen, um Plasma innerhalb von 2 h von Blut Sammlung31 zu trennen.
Hämolyse ist vor allem auf den Abbau der roten Blutkörperchen (Erythrozyten) und konsequente Veröffentlichung ihrer Inhalte in der Umgebung. Dies könnte ein Problem für die zirkulierenden MiRNAs testen, da die Freigabe des intrazellulären Inhalts RBCs MicroRNA-Profil im Blut, möglicherweise beeinflussen die Genauigkeit der Plasma-basierte Analyse30dramatisch verändert.
Auch minimale Ebenen der Hämolyse im Plasma-Proben identifizieren können, ist entscheidend für Studien basierend auf zirkulierenden MiRNAs als Biomarker. Hämolyse kann zunächst durch Sichtkontrolle, seit nach der Zentrifugation zweistufig beurteilt werden, die die Farbe des Plasma von gelb bis rot für stark lipämischen Proben reichen kann. Jedoch möglicherweise bloße Sichtprüfung nicht empfindlich genug, im Rahmen der molekularen Biomarker-Forschung.
Eine einfache vor-analytische Methode, lipämischen Plasma-Proben zu identifizieren ist die photometrische Messung bei Wellenlänge (λ) = 414 nm die wichtigsten Oxyhemoglobin Peak Absorption nach entsprechende Anpassung für jede andere Quelle von Störungen. Aus diesem Grund wir normalisiert den 414 nm-Gipfel auf den Wert der Extinktion bei 375 nm, bezeichnend für die Lipid-Inhalt33. Alternativ, oder besser, in Kombination, ein Lipämie-Independenthemolysis Punkten (HS) verwendeten34werden können. Dieses spektralphotometrisch basierende Verfahren erkennen mindestens 6,1 mg/dL freies Hämoglobin. Andernfalls können lipämischen Proben durch den Nachweis von Erythrozyten-spezifische MiRNAs identifiziert werden. Da noch ein sehr geringer Prozentsatz der Hämolyse eine erhebliche Zunahme der Erythrozyten-spezifische MiRNA Level32hervorrufen kann, identifiziert Fortunato Et Al. eine spezifische Hämolyse-bezogene Signatur basierend auf 16 MiRNAs-Verhältnisse, die effizient können Hämolyse in Plasma-Proben-33zu klassifizieren. Die genannten Tests verwendet werden, in Kombination seit der Extinktion Verhältnis 414/375 und/oder der HS in einer Pre-analytische Phase weitere Kosten zu sparen angenommen werden, während der Messung im Zusammenhang mit Hämolyse MiRNAs in einer Post-analytische Phase als eine Qualitätskontrolle verwendet werden kann Schritt.
Zirkulierenden MiRNAs Isolation und RNA Reinheit Die Extraktion RNA-Verfahren ist eine sehr einflussreiche Schritt für den Erfolg der nachfolgenden Analysen. Ausgehend von einem niedrigen Eingabesample wie Plasma, muss Extraktion so effizient wie möglich, eine genaue Quantifizierung der MiRNAs zu gewährleisten. Plasma zeichnet sich durch hohe Konzentrationen von vielen Proteinen, einschließlich Nukleasen und anderen Komponenten die nachgelagerten enzymatische Reaktionen der RT-qPCR stören können und den Nachweis von zirkulierenden MiRNAs beeinflussen könnten. Mehrere Methoden der Extraktion in diese Arten von Studien benutzt worden, aber in der Regel organische Extraktion, gefolgt von Silica-basierten RNA Anreicherung erlaubt die Entfernung des Plasma-Hemmer besser dann TRIzol allein35. Dennoch wurde in den letzten Jahren manuelle Extraktion durch automatisierte Extraktion ersetzt. Geringe Risiko der Kontamination, die höhere Reproduzierbarkeit und der wirtschaftlichen Verwendung sind die wichtigsten Vorteile von automatisierten Systemen im Vergleich zu manuellen Isolierung Protokolle. Automatisierte Extraktionsmethoden ergab darüber hinaus die höchsten Beträge MiRNA von Blutproben und die höchste Effizienz im Vergleich zu manuellen Protokolle36.
Problem der Normalisierung Normalisierung der MiRNA-Plasmaspiegel ist nach wie vor ein umstrittenes Thema. In der Tat können Unterschiede in der Sample-Qualität oder Quantität der Identifizierung der wirkliche Veränderungen in MiRNAs Ausdruck Ebenen verursacht durch das Vorhandensein oder die Gefahr von Krankheiten, und so führt zu mehrdeutigen Daten Interpretationen und irreführende Schlussfolgerungen stören. Bisher hat die mangelnde Konsens in verschiedenen Normalisierung Strategien37geführt.
Gesamt-RNS Plasma-Proben entnommen ist in der Regel unterhalb der Schwelle der standard Quantifizierungsmethoden wie UV-Spektrophotometrie oder Fluoreszenz-basierte Spektrophotometrie, so dass RNA Masse Standardisierung38. Folglich sollte ein bestimmtes Volumen, anstatt einen festen Betrag der eluierten RNA als Input für die RT Reaktion39gewählt werden.
Housekeeping Abschriften für die MiRNA-Analyse in Gewebeproben verwendet, eignen sich wie RNU48 und RNU6, nicht für die Normalisierung der extrazellulären MiRNA Messungen, wie sie beide nicht immer im Kreislauf durch RNase-vermittelten Abbau40nachweisbar sind, und sind auch in einer Krankheit-spezifisch37dereguliert. Es ist unklar, ob alle umlaufenden MiRNAs effektiv als Referenz-Steuerelemente verwendet werden könnten. Beispielsweise wird MiR-16 häufig für die Zimmerreinigung, aber d vorgeschlagen.verschiedene Studien haben gezeigt, dass es im Plasma-Proben von Krebs Patienten28,37dereguliert ist. Darüber hinaus sind MiR-16 Ebenen stark durch Hämolyse30betroffen.
Zwar für Hochdurchsatz-Assays messen verschiedene MiRNAs und Normalisierung auf die mittlere Ausdruckswert allgemein anerkannten41, wenn eine begrenzte Anzahl von MiRNAs muss analysiert werden, kann dieser Normalisierung Ansatz angewendet werden. Boeri Et Al. gegründet um die Normalisierung-Problem zu umgehen, zuvor einen Algorithmus basiert auf gegenseitigen Verhältnisse unter 24 MiRNAs28. Ein solcher Ansatz, trotz des Seins sehr nützlich für die Entwicklung von Diagnose-Tool erlaubt nicht leicht unterscheiden effektiv MiRNAs, die möglicherweise eine Rolle in der Entwicklung von Tumoren, und so identifizieren MiRNAs als funktionierende Kalibratoren verändert. Eine weitere effektive Strategie, angenommen von der Fraktion der Bianchi Et Al. , die ein Serum MiR-Test zur Krebs-Früherkennung von Lungenkrebs entwickelt beruhte auf Normalisierung auf das geometrische Mittel aus einer Gruppe von 6 "Zimmermädchen Serum-MiRNAs" Variation weniger zwischen Proben und Klassen von Patienten42.
Merkmale der MiRNA-basierte Flüssigbiopsie und Einsatzmöglichkeiten Plasma-basierte MSC ist ein molekularer nichtinvasive Test zur Früherkennung von Lungenkrebs bei starken Rauchern untersucht. Der MSC-Test erkennen zwischen- oder risikoreiche Themen vor der Lunge-Krebs-Erkennung durch LDCT, mit hoher Sensibilität (SE, 87 %) und negativen prädiktiven Wert (NPV, 99 %). Insbesondere könnten MSC LDCT Screening implementieren, durch die Reduzierung von falsch-positiven Ergebnissen auf 3,7 % von 19,7 % für LDCT allein29. Der MSC-Test hat auch gezeigt, um eine gute prognostische Leistung haben, wenn man nur Lungenkrebs Krebs-Patienten, und könnte als ein monitoring-Tool verwendet werden, allein oder in Kombination mit anderen klinischen pathologischen Parametern43,44. Der MSC-Test könnte potenziell größere Kohärenz der Lunge Krebs diagnostische Algorithmen, damit Verringerung Screening Wirtschaftlichkeit ermöglichen.
Neben MSC sind andere nicht-invasive Tests zur Früherkennung von Lungenkrebs Krebs berichtet worden. Bianchi Et Al. vorgeschlagen, ein zirkulierende MiR-Test basiert auf einem 34-MiRNA Unterschrift45, dann auf einem 13 MiRNA Signatur42reduziert. Serum-Proben-Fordiscovery und Validierung stammen aus der kontinuierlichen Beobachtung der Rauchen Themen (COSMOS) LDCT screening-Studie, bei der Europäischen Institut für Onkologie (IEO, Mailand, Italien) durchgeführt. Der MiR-Test zeigte 78 % Genauigkeit für die Lunge-Krebs-Erkennung bei Probanden mit hohem Risiko. Zwischen den 13 Serum-MiRNAs und die Komposition der MSC 24 waren nur 5 MiRNAs (MiR-92a, MiR-30 b, MiR - 30 c, MiR-148a und MiR-140-5 p) überlappen. Dies könnte auf die unterschiedliche Art der Proben (Serum vs. Plasma) ab und zu Daten Ausarbeitung fällig. In der Tat wurden für den MiR-Test, die Autoren ausgewählte 6 MiRNAs Verhalten sich als Zimmermädchen im Serum, 3 davon auch unter die MSC MiRNA Verhältnisse (MiR-15 b, MiR-19 b und MiR-197). Trotzdem überprüfen der MSC im Plasma und der MiR-Test in Serumproben mehr tief die Verwendung von MiRNA-basierte Flüssigbiopsie zur Erkennung von Lungenkrebs.
MiRNAs Profilerstellung für die Identifizierung der Lunge-Krebs-Biomarker wurde auch Sputum Proben46durchgeführt. Auswurf kann leicht gesammelt und MiRNA Ausdruck Ebenen scheinen extrem stabil drin sein. Jedoch Lunge-Krebs-Screening-Freiwillige sind älter als 50-55 Jahre und starke Raucher mit Komorbiditäten wie COPD, wodurch Auswurf schwer zu bekommen. In der Tat unter die verschiedenen Körperflüssigkeiten, Plasma ist eine der besten Alternativen zu untersuchen, die potenzielle Rolle von MiRNAs als (aber nicht beschränkt auf) Lunge-Krebs-Biomarker.
Insgesamt kann in der vorliegenden Arbeit beschriebene Verfahren relevant im Zusammenhang mit verschiedenen Krankheiten, ohne Einschränkung in der Art der Pathologie untersucht (von Krebs, Nervensystem und Herz-Kreislauf-Erkrankungen oder Diabetes) und der Zweck der klinische Anwendung (ein Biomarker für Diagnose, Prognose oder sogar Ansprechen auf die Behandlung).

Lungenkrebs ist die am häufigsten diagnostizierte Krebsart weltweit, entfallen etwa 25 % aller Krebs-Diagnosen-1. Trotz des stetigen Rückgangs der Lungenkrebs Sterblichkeit in den letzten 2 Jahrzehnten, vor allem aufgrund der reduzierten Tabakkonsum bleibt Lungenkrebs die häufigste Ursache für Krebstod bei Männern und Frauen. Im Jahr 2017 dürfte es entfallen ca. 25 % und 20 % der gesamten Krebstodesfälle in den Vereinigten Staaten und Europa, bzw.1,2.
Da die Symptome in der Regel nicht in frühen Krankheit auftreten, sind die Mehrzahl der Fälle von Lungenkrebs in späten Stadien diagnostiziert. Dies führt zu eine begrenzte Möglichkeit für therapeutische Intervention und schlechte Wirksamkeit von Behandlungen3. Daher richten sich viele wissenschaftliche Anstrengungen zur Ermittlung eines effektiven Tests zur Früherkennung von Lungenkrebs Krebs.
Eine Vielzahl von screening-Studien zeigt, dass Brust Röntgen kein Wert in der Lunge-Krebs-Screening, während niedrig dosiertes Tomographie (LDCT) ein besseres Werkzeug im Vergleich zum Röntgen berechnete für die Erkennung von frühen Stadium Lungenkrebs Krebs4. Darüber hinaus hat sich gezeigt, dass Thatscreening mit dem Einsatz von LDCT Lunge Krebsmortalität unter aktuellen und ehemaligen Kettenraucher5bis zu 20 % reduziert. Diese Daten unterstützen die Verwendung der Lunge-Krebs-Screening in einer Hochrisiko-Population gemäß den Richtlinien von mehreren Fachgesellschaften4,6.
Der Hinweis zu den wichtigsten Anliegen über LDCT Screening ist die hohe Rate der falsch-positiven Ergebnissen und Überdiagnose. Dass insofern die wissenschaftliche Gemeinschaft eine Strategie sucht, um diese Probleme zu überwinden und die Spezifität des LDCT Screening Tests zu erhöhen. Die Entwicklung der nicht-invasiven ergänzende Biomarker könnte hier hilfreich sein. Bis heute gibt es eine umfangreiche Liste von Kandidaten Biomarker untersucht, wie z. B. MiRNAs, zellfreie DNA-Methylierung gen, kleine Proteine und andere7.
Blutbasierte Biomarker, einschließlich Immunantwort Biomarker und zirkulierenden MiRNAs, sind diejenigen, die die erweiterte Validierung Phase8zu erreichen. Die Immunantwort Biomarker basieren auf den Erkenntnissen, die Immunantworten gegen beide intrazellulären und Oberfläche Tumorantigenen in Lunge Krebs Patienten9aufgebaut sind. Zum Beispiel, Ajona Et al. die Rolle der C4d, ein Abbauprodukt des klassischen Ergänzung-Signalwegs in der Diagnose und Prognose von Lungenkrebs Krebs10bewertet. Ansonsten eine handelsübliches Autoantikörper Serum testen Prüfung sieben im Zusammenhang mit Tumor-Antigene validiert in Patienten mit nicht-kleinzelligem Lungenkrebs und zeigten 36 % der Sensibilität und 91 % Spezifität11wurde. Immunantwort Biomarker sind interessant, aber weitere Validierungsstudien sind für eine mögliche klinische Anwendung erforderlich.
MiRNAs sind endogene kleine nicht-kodierende RNAs mit konservierten Mechanismus und großen funktionellen Bedeutung aller Tier- und Pflanzenarten Königreiche. Die Rolle der MiRNAs ist Protein Übersetzung zu regulieren: sie unterdrücken die Expression von einer großen Anzahl von Ziel Gene12. Es ist gut dokumentiert, dass Veränderungen OfmiRNAs Ausdruck in der Pathogenese der menschlichsten Krebs12,13,14beitragen. Darüber hinaus lösen Tumor und Stromazellen Zellen MiRNAs, stabilisiert durch ihre Einbeziehung in Microvesicles oder durch Assoziation an RNA-bindende Proteine, in Körperflüssigkeiten wie Plasma und Serum15,16, Urin17 , und Speichel18. Zirkulierenden MiRNAs kann somit der Wirtsantwort und die dynamische Wechselwirkung zwischen Tumor und seine Mikroumgebung19reflektieren. Zusammengenommen haben diese Beobachtungen zirkulierenden MiRNAs eine vielversprechende Klasse von Biomarkern für die Erkennung von Krebserkrankungen gemacht.
Zirkulierenden MiRNAs kann mit verschiedenen Methoden erkannt werden: Microarray Plattformen20, quantitative reverse Transkription PCR (RT-qPCR)21und nächsten Generation Sequencing (NGS)14,22. In den letzten Jahren wurden verschiedene Ausdruck Profil Studien basierend auf den oben genannten Technologien entwickelt. Microarray ist eine Hochdurchsatz-Technologie, bis zu Tausenden von MiRNAs in einer einzigen Probe zu analysieren. Es hat jedoch niedriger Dynamikumfang und Spezifität im Vergleich zu RT-qPCR oder NGS. Darüber hinaus Microarray ist eine nicht-quantitative Methode, so dass weitere experimenteller Validierung erforderlich ist. Sequenz-basierte Methoden ermöglicht die Identifizierung von unbekannten MiRNAs und eignen sich vor allem in einem Discovery-Phase. Auf der anderen Seite NGS Methoden sind immer noch teuer und erfordern spezielle Ausrüstung und Experten Bioinformatikern, wodurch ihre Verwendung in großen Validierung Kohorten und in klinischen Umgebungen23. Im Moment ist RT-qPCR die meisten adoptierten Plattform für MiRNA-Erkennung in eine Diagnose/klinischen Kontext24in Umlauf. Gibt es unterschiedliche RT-qPCR-Technologien für MiRNAs Analyse zur Verfügung, aber die Stem-Loop-RT gefolgt von TaqMan PCR ist die am weitesten verbreitete25. Diese Technik ist besonders sensibel und präzise (single Nucleotide Diskriminierung) und hat einen hohen Dynamikbereich; Allerdings ermöglicht es die Erkennung von bekannten MiRNAs nur.
Die MicroRNA-Qualitätskontrolle Studie Mestdagh Et Al. umfassend untersucht die Eigenschaften von einigen im Handel erhältlichen Plattformen für MiRNAs Profilerstellung basiert auf den drei oben genannten Technologien26(MiRQC-Studie). Durch die Analyse von 196 MiRNAs in Geweben und Serumproben, war die Leistung der verschiedenen Plattformen hinsichtlich der Reproduzierbarkeit, Empfindlichkeit, Genauigkeit, Spezifität und Konkordanz der differentielle Expression bewertet. Die Ergebnisse haben gezeigt, dass Plattformen auf NGS basierend und Microarray Technologien eine höhere Reproduzierbarkeit und Spezifität, aber RT-qPCR-Plattformen waren genauer, empfindlich und hatte eine höhere Erkennungsrate, vor allem für niedrige input RNA-Proben, wie Körper Flüssigkeiten. RT-qPCR scheint somit die am besten geeignete Methode für eine mögliche Anwendung in der klinischen Routinediagnostik zu sein.
Im Jahr 2011 analysiert Sozzi Et Al. das MiRNA-Profil des Plasmaproben von Freiwilligen in einem ersten LDCT Screeningtrial (INT-IEO Testversion)27 eingeschrieben und vier MiRNA-Signaturen von gegenseitigen Verhältnisse unter 24 zirkulierenden MiRNAs komponiert generiert wurden. Diese Signaturen waren in der Lage, die Krankheit freier Individuen von Patienten mit einer Diskriminierung oder tödlichen Lungenkrebs Zeit oder bis zu 2 Jahre vor LDCT Krankheit Erkennung28. In einem weiteren Papier, derselben Gruppe beschrieb zum ersten Mal der MiRNA Signatur Sichter (MSC), durch die Kombination von vier MiRNA-Signaturen, um Patienten in drei Risikostufen zu Schichten: hoher, mittlerer und niedriger. Seine klinische Nutzen wurde in einer großen Retrospektive von mehr als 1.000 eingeschriebene Teilnehmer in der MILDEN Screening-Studie, einer randomisierten Studie zum Vergleich der jährlichen oder zweijährlichen LDCT Arme mit einer Beobachtung Arm29validiert. In der Tat, die Kombination von MSC und LDCT reduziert die LDCT False-Positive-Rate von ungefähr 5 Mal und waren die drei MSC-RisikogruppenGesamtüberleben assoziiert.
Später im Jahr 2013 auf der "Fondazione IRCCS Istituto Nazionale dei Tumori" (Mailand, es) eine prospektive Screening trial (BioMILD) Umsetzung LDCT mit dem Plasma nach MSC-Test wurde ins Leben gerufen. Freiwillige in der BioMILD Studie eingeschrieben unterziehen LDCT und Blut Entnahme, die sofort bearbeitet wird, um Plasma für MiRNA profiling mit custom made mikrofluidischen Karten zu trennen. Die Kombination der LDCT und MSC Ergebnisse definiert die spezifischen Algorithmus24screening.
In der vorliegenden Arbeit das gesamte methodische Protokoll verwendet in der BioMILD Studie beschrieben wird, ausgehend von Blut Musterkollektion, Plasma Isolation RNA-Extraktion, und die 24 MiRNAs Ausdruck Profilierung mit benutzerdefinierten RT-qPCR mikrofluidischen Karten gemacht. Angesichts der hohen Konsistenz und Reproduzierbarkeit, können diese Verfahren auch für die Entwicklung der MiRNA-basierten flüssigen Biopsien bei anderen Krankheiten verwendet werden.

<table style="border-collapse:collapse;width:570pt" width="760">
	<colgroup>
		<col style="width:162pt" width="216" />
		<col style="width:122pt" width="162" />
		<col style="width:89pt" width="119" />
		<col style="width:197pt" width="263" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl25" height="21" style="width:162pt;height:15.75pt" width="216">&#160;1x PBS&#160;</td>
			<td class="xl26" style="width:122pt" width="162">Lonza</td>
			<td class="xl26" style="width:89pt" width="119">BE-17-516</td>
			<td class="xl23" style="width:197pt" width="263"></td>
		</tr>
		<tr height="63" style="height:47.25pt">
			<td class="xl21" height="63" style="width:162pt;height:47.25pt" width="216">20xTE Buffer, pH 8.0</td>
			<td class="xl26" style="width:122pt" width="162">Molecular probe</td>
			<td class="xl26" style="width:89pt" width="119">T11493</td>
			<td class="xl22" style="width:197pt" width="263">Dilute the 20X stock solution to have the final concentration of&#160; 0,1X in Nuclease-free water</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:162pt;height:15.75pt" width="216">Nuclease-free water&#160;</td>
			<td class="xl26" style="width:122pt" width="162"></td>
			<td class="xl26" style="width:89pt" width="119"></td>
			<td class="xl23"></td>
		</tr>
		<tr height="126" style="height:94.5pt">
			<td class="xl21" height="126" style="width:162pt;height:94.5pt" width="216">Maxwell RSC miRNA Tissue Kit&#160;</td>
			<td class="xl26" style="width:122pt" width="162">Promega</td>
			<td class="xl26" style="width:89pt" width="119">AS1460</td>
			<td class="xl21" style="width:197pt" width="263">The kit contains Homogenization Solution, DNase I, Proteinase K, Lysis Buffer and cartridges. For 1-Thioglycerol, inhalation and contact with skin and eyes should be avoided. Use it under a Fume Cabinet.</td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.5pt">
			<td class="xl21" height="42" style="width:162pt;height:31.5pt" width="216">TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit&#160;</td>
			<td class="xl22" style="width:122pt" width="162">Thermo Fisher</td>
			<td class="xl26" style="width:89pt" width="119">4366596</td>
			<td class="xl23"></td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.5pt">
			<td class="xl21" height="42" style="width:162pt;height:31.5pt" width="216">Custom TaqMan RT Primer Pool&#160;</td>
			<td class="xl22" style="width:122pt" width="162">Thermo Fisher</td>
			<td class="xl26" style="width:89pt" width="119">4459649</td>
			<td class="xl23"></td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.5pt">
			<td class="xl21" height="42" style="width:162pt;height:31.5pt" width="216">TaqMan PreAmp Master Mix 2X&#160;</td>
			<td class="xl22" style="width:122pt" width="162">Thermo Fisher</td>
			<td class="xl26" style="width:89pt" width="119">4391128</td>
			<td class="xl23"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:162pt;height:15.75pt" width="216">Custom TaqMan&#160; PreAmp pool&#160;</td>
			<td class="xl22" style="width:122pt" width="162">Thermo Fisher</td>
			<td class="xl26" style="width:89pt" width="119">4459657</td>
			<td class="xl23"></td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.5pt">
			<td class="xl21" height="42" style="width:162pt;height:31.5pt" width="216">TaqMan Universal Master Mix II, No UNG 2x&#160;</td>
			<td class="xl22" style="width:122pt" width="162">Thermo Fisher</td>
			<td class="xl26" style="width:89pt" width="119">4440048</td>
			<td class="xl23"></td>
		</tr>
		<tr height="63" style="height:47.25pt">
			<td class="xl21" height="63" style="width:162pt;height:47.25pt" width="216">Custom TaqMan Array MicroRNA Cards&#160;</td>
			<td class="xl22" style="width:122pt" width="162">Thermo Fisher</td>
			<td class="xl26" style="width:89pt" width="119">4449137</td>
			<td class="xl22" style="width:197pt" width="263">Bring the Custom TaqMan Array MicroRNA Cards to room temperature before to load samples</td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.5pt">
			<td class="xl21" height="42" style="width:162pt;height:31.5pt" width="216">Vacutainer Safety-Lock Blood Collection Set&#160;</td>
			<td class="xl26" style="width:122pt" width="162">Becton Dickinson</td>
			<td class="xl26" style="width:89pt" width="119">367286-364815</td>
			<td class="xl23"></td>
		</tr>
		<tr height="46" style="height:34.5pt">
			<td class="xl21" height="46" style="width:162pt;height:34.5pt" width="216">Vacutainer plastic spray-coated K2EDTA tube.&#160;</td>
			<td class="xl26" style="width:122pt" width="162">Becton Dickinson</td>
			<td class="xl26" style="width:89pt" width="119">366643</td>
			<td class="xl23">Lavender BD Hemogard closure&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:162pt;height:15.75pt" width="216">Cuvette PS semi-micro&#160;</td>
			<td class="xl22" style="width:122pt" width="162">VWR/PBI</td>
			<td class="xl22" style="width:89pt" width="119">&#160;643-0326</td>
			<td class="xl23">Light path 10 mm</td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.5pt">
			<td class="xl21" height="42" style="width:162pt;height:31.5pt" width="216">NanoDrop 2000c UV-VIS Spectrophotometer</td>
			<td class="xl22" style="width:122pt" width="162">Thermo Fisher</td>
			<td class="xl22" style="width:89pt" width="119"></td>
			<td class="xl23"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:162pt;height:15.75pt" width="216">Cryogenic vials 1.5 ml&#160;</td>
			<td class="xl22" style="width:122pt" width="162">Sigma-Aldrich</td>
			<td class="xl22" style="width:89pt" width="119">Z359033</td>
			<td class="xl23"></td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.5pt">
			<td class="xl21" height="42" style="width:162pt;height:31.5pt" width="216">Centrifuge 5810R&#160;</td>
			<td class="xl22" style="width:122pt" width="162">Eppendorf</td>
			<td class="xl22" style="width:89pt" width="119"></td>
			<td class="xl24" style="width:197pt" width="263">Bring the centrifuge to 4 &#176;C before starting plasma collection</td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.5pt">
			<td class="xl21" height="42" style="width:162pt;height:31.5pt" width="216">Heraeus Multifuge 3S+ Centrifuge</td>
			<td class="xl22" style="width:122pt" width="162">Thermo Fisher</td>
			<td class="xl22" style="width:89pt" width="119">D-37520</td>
			<td class="xl23"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:162pt;height:15.75pt" width="216">Vortex Mixer</td>
			<td class="xl22" style="width:122pt" width="162">Velp Scientifica</td>
			<td class="xl22" style="width:89pt" width="119">F202A0173</td>
			<td class="xl23"></td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.5pt">
			<td class="xl21" height="42" style="width:162pt;height:31.5pt" width="216">ThermoMixer T- shaker</td>
			<td class="xl23">Euroclone&#160;</td>
			<td class="xl23">A00564</td>
			<td class="xl28" style="width:197pt" width="263">Bring the Thermo Mixer to 37 &#176;C before starting RNA&#160; extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:162pt;height:15.75pt" width="216">Maxwell RSC Instrument</td>
			<td class="xl22" style="width:122pt" width="162">Promega</td>
			<td class="xl22" style="width:89pt" width="119">AS4500</td>
			<td class="xl23"></td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.5pt">
			<td class="xl21" height="42" style="width:162pt;height:31.5pt" width="216">GeneAmp PCR System 9700 thermo-cycler&#160;</td>
			<td class="xl22" style="width:122pt" width="162">Thermo Fisher</td>
			<td class="xl22" style="width:89pt" width="119"></td>
			<td class="xl23"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:162pt;height:15.75pt" width="216">ViiA 7 Real-Time PCR System&#160;</td>
			<td class="xl22" style="width:122pt" width="162">Thermo Fisher</td>
			<td class="xl22" style="width:89pt" width="119"></td>
			<td class="xl23"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:162pt;height:15.75pt" width="216">ViiA 7 RUO software&#160;</td>
			<td class="xl22" style="width:122pt" width="162">Thermo Fisher</td>
			<td class="xl22" style="width:89pt" width="119"></td>
			<td class="xl23"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:162pt;height:15.75pt" width="216">Arrey Card Staker/Sealer</td>
			<td class="xl22" style="width:122pt" width="162">Thermo Fisher</td>
			<td class="xl26" style="width:89pt" width="119">4331770</td>
			<td class="xl23"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microrna based liquid biopsy: the experience of the plasma mirna signature classifier (msc) for lung cancer screening

Die Entwicklung eines minimal-invasive Tests wie flüssigen Biopsie für Früherkennung Lunge in der präklinischen Phase ist entscheidend für das Ergebnis dieser tödlichen Krankheit zu verbessern. Micro-RNAs (MiRNAs) sind Gewebe, die bestimmten, kleinen, nicht-kodierende RNAs, die Regulierung der Genexpression, die als extrazelluläre Boten des biologischen Signale handeln kann das Übersprechen zwischen den Tumor und seine umliegenden Mikroumgebung abgeleitet. Sie können somit ideale Kandidaten für die Früherkennung von Lungenkrebs darstellen. In dieser Arbeit wird ein methodischer Workflow für die prospektive Validierung eines zirkulierenden MiRNA-Tests mit custom made mikrofluidischen Karten und quantitative Real-Time PCR in Plasma-Proben von Freiwilligen bei einem Lungenkrebs screening Studie eingeschrieben vorgeschlagen. Seit die Veröffentlichung von Hämolyse-bezogene MiRNAs und mehr allgemeine technische Fragen die Analyse beeinflussen kann, werden die Qualitätskontrolle-Schritte in den Standardarbeitsanweisungen enthalten darüber hinaus auch vorgestellt. Das Protokoll ist reproduzierbare und zuverlässige quantitative Ergebnisse gibt; Allerdings sollte bei Verwendung von großen klinischen Serien pre-analytische und analytische Funktionen vorsichtig bewertet werden.

Die BioMILD-Studie ist eine prospektive Studie zur Früherkennung von Lungenkrebs mit dem Zweck der Prüfung der Wirksamkeit eines kombinierten LDCT-MSC-Ansatzes als Erstlinien Screening-Tests in einer großen Kohorte von starker Raucher Personen. Eine Klasse von Risiko zugeschrieben wird jeder Freiwillige auf der Grundlage der MiRNA-Test, die Verhältnisse zwischen 24 Plasma zirkulierenden MiRNAs auswertet. Als weitgehend gemeldeten30,31,32ist Hämolyse ein kritischer Punkt für die Analyse von zirkulierenden MiRNA, da falsche Ergebnisse durch eine unspezifische Freisetzung von MiRNAs durch Blutkörperchen erreicht werden konnte. In der vorgeschlagenen methodischen Workflow eine pre-analytische Qualitätskontrolle Schritt (QC1 in Tabelle 1) zur Identifizierung hämolysiert, und somit nicht analysierbar Plasmaproben wurde beschrieben. Abbildung 1 berichtet eine photometrische Analyse der lipämischen (Abb. 1A) und nicht hämolysiert (Abbildung 1B) Plasmaproben mit entsprechenden A414/A375-Werte. Im klinischen Kontext waren das Ergebnis eines molekularen Tests ist entscheidend für Freiwilligenmanagement, diese QC1 ermöglicht die Blutentnahme zu wiederholen und in den meisten Fällen die Wiederherstellung der Probenmaterials.
Nach molekularen Verarbeitung sollte die RT-qPCR-Leistung genau ausgewertet werden, um technische Probleme zu identifizieren. Abbildung 2 A zeigt eine RT-qPCR mit geringer Leistung durch eine schlechte passive Referenzsignal. In diesem Fall die Vorverstärkung Produkt zu einer neuen mikrofluidischen Karte Nachladen wird empfohlen. Wenn der RT-qPCR gut, wie in Abbildung 2B abschneidet, die Karte geht zum ersten Post analytische Qualitätskontrolle Schritt um sicherzustellen, dass die MiRNA Ausdruckswerte vergleichbar mit der historischen Messung sind (QC2 in Tabelle 1). Wenn die QC2 Schritt fehlschlägt, ein technisches Problem aufgetreten, während der reversen Transkription oder in der Pre-Amplifikationen, und es ist praktisch die gesamte molekulare Verarbeitung ab reversen Transkription zu wiederholen.
Der letzte Schritt der Qualitätskontrolle (QC3 in Tabelle 1) wertet die Hämolyse auch auf molekularer Ebene. Ausdruck Niveaus von 4 Erythrozyten-spezifische MiRNAs (Mir-16, Mir-451, Mir-486-5 p und Mir-92a) waren im Vergleich zu denen von 4 nicht-Hämolyse Verwandte MiRNAs (Mir-126, Mir-15 b, Mir-221 und Mir-30 b), erzeugen die Hämolyse-bezogene MiRNA-Signatur komponiert von der 16 (4 x 4) MiRNA-Verhältnisse. Positive Proben werden als hämolysiert, während negative Proben, die letzte MSC Risikoklassifizierung Ebene gehen, wie Protokoll Abschnitt 9 und Abbildung 3beschrieben, klassifiziert.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56326/56326fig1.jpg"> 
Abbildung 1: Spektralphotometrische Analyse der frischen Plasmaproben. Spektralfotometrische Profile von (A) 2 hämolysiert und (B) 2 nicht hämolysiert Plasmaproben, Messung der Extinktion Verhältnis zwischen Wellenlängen A414 und A375. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56326/56326fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56326/56326fig2.jpg"> 
Abbildung 2 : RT-qPCR Leistung in mikrofluidischen Karten Analyse. Verstärkung und Mehrkomponenten-Grundstücke Armen vergleichen (A) und (B) gute Qualität mikrofluidischen Karten. Alle 24 MiRNAs und einer einzigen mitgebrachten MiRNA sind in jeder Gruppe berichtet. Die Mehrkomponenten Grundstücke illustrieren die passive Referenz-Signale in dieser RT-qPCR-Reaktionen auftreten. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56326/56326fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56326/56326fig3.jpg"> 
Abbildung 3: MSC-Algorithmus zur Risikostratifizierung. Repräsentative Ergebnisse unter Berücksichtigung 6 Plasma-Proben von Freiwilligen in BioMILD screening Studie eingeschrieben. (A) MiRNA-Verhältnisse Unterschriften von Risiko einer Erkrankung (RD), aggressive Krankheitsrisiko (RAD), Krankheit (PD), Vorhandensein von aggressiven Krankheit (PAD) und entsprechenden Cut-off Werte (log2) für Plasma-Proben aufbewahrt bei-80 ° C bei mindestens 1 Woche und bis zu 5 Wochen. (B) Kombination der vier Unterschriften zu Schichten analysierbar Proben in hoch (H), Mittelstufe (I) und low (L) MSC Risikostufe. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56326/56326fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

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MicroRNA Based Liquid Biopsy: The Experience of the Plasma miRNA Signature Classifier MSC for Lung Cancer Screening

Hier präsentieren wir Ihnen die detaillierten Protokolls in die BioMILD screening-Verfahren zur Durchführung des zirkulierenden MicroRNA Signatur Klassifikator Tests zur Früherkennung von Lungenkrebs Krebs.

MicroRNA Based Flüssigbiopsie: Die Erfahrung der Plasma MiRNA Signatur Klassifikator (MSC) für Lung Cancer Screening

The development of a minimally invasive test, such as liquid biopsy, for early lung cancer detection in its preclinical phase is crucial to improve the ...

microrna-based-liquid-biopsy-experience-plasma-mirna-signature

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Cancer Research

MicroRNA Based Liquid Biopsy: The Experience of the Plasma miRNA Signature Classifier (MSC) for Lung Cancer Screening

15.5K Aufrufe.  Fondazione IRCCS Istituto Nazionale dei Tumori. Hier präsentieren wir Ihnen die detaillierten Protokolls in die BioMILD screening-Verfahren zur Durchführung des zirkulierenden MicroRNA Signatur Klassifikator Tests zur Früherkennung von Lungenkrebs Krebs.

Serie: MicroRNA Based Liquid Biopsy: The Experience of the Plasma miRNA Signature Classifier MSC for Lung Cancer Screening

Utilizing Functional Genomics Screening to Identify Potentially Novel Drug Targets in Cancer Cell Spheroid Cultures

The identification of functional driver events in cancer is central to furthering our understanding of cancer biology and indispensable for the discovery of the next generation of novel drug targets. It is becoming apparent that more complex models of cancer are required to fully appreciate the contributing factors that drive tumorigenesis in vivo and increase the efficacy of novel therapies that make the transition from pre-clinical models to clinical trials.
Here we present a methodology for generating uniform and reproducible tumor spheroids that can be subjected to siRNA functional screening. These spheroids display many characteristics that are found in solid tumors that are not present in traditional two-dimension culture. We show that several commonly used breast cancer cell lines are amenable to this protocol. Furthermore, we provide proof-of-principle data utilizing the breast cancer cell line BT474, confirming their dependency on amplification of the epidermal growth factor receptor HER2 and mutation of phosphatidylinositol-4,5-biphosphate 3-kinase (PIK3CA) when grown as tumor spheroids. Finally, we are able to further investigate and confirm the spatial impact of these dependencies using immunohistochemistry.

Identifying novel drug targets that transition from pre-clinical testing to human trials is a scientific priority. To that end, here we describe a functional genomics approach for examining the impact of gene depletion on cancer cell line spheroids, which more appropriately model human cancers in vivo.

Functional Genomics Screening Verwendung zur Identifizierung möglicher neuer Wirkstoff-Targets in Cancer Cell Sphäroid-Kulturen

The identification of functional driver events in cancer is central to furthering our understanding of cancer biology and indispensable for the discovery ...

Forschung

Krebsforschung

Flow Cytometry-based Drug Screening System for the Identification of Small Molecules That Promote Cellular Differentiation of Glioblastoma Stem Cells

Glioblastoma (GBM) is the most common and most lethal primary brain tumor in adults, causing roughly 14,000 deaths each year in the U.S. alone. Median survival following diagnosis is less than 15 months with maximal surgical resection, radiation, and temozolomide chemotherapy. The challenges inherent in developing more effective GBM treatments have become increasingly clear, and include its unyielding invasiveness, its resistance to standard treatments, its genetic complexity and molecular adaptability, and subpopulations of GBM cells with phenotypic similarities to normal stem cells, herein referred to as glioblastoma stem cells (GSCs). Because GSCs are required for tumor growth and progression, differentiation-based therapy represents a viable treatment modality for these incurable neoplasms. 
The following protocol describes a collection of procedures to establish a high throughput screening platform aimed at the identification of small molecules that promote GSC astroglial differentiation. At the core of the system is a glial fibrillary acidic protein (GFAP) differentiation reporter-construct. The protocol contains the following general procedures: (1) establishing GSC differentiation reporter lines; (2) testing/validating the relevance of the reporter to GSC self-renewal/clonogenic capacity; and (3) high-capacity flow-cytometry based drug screening. 
The screening platform provides a straightforward and inexpensive approach to identify small molecules that promote GSCs differentiation. Furthermore, utilization of libraries of FDA-approved drugs holds the potential for the identification of agents that can be repurposed more rapidly. Also, therapies that promote cancer stem cell differentiation are expected to work synergistically with current "standard of care" therapies that have been shown to target and eliminate primarily more differentiated cancer cells.

An efficient screening protocol is presented for the identification of small molecules that promote astroglial differentiation in glioblastoma stem cells (GSCs). The assay is based on a stem cell differentiation reporter whereby the expression of the enhanced GFP (eGFP) is driven by the human GFAP promoter.

Flow Cytometry-based Drug Screening-System für die Identifizierung von kleinen Molekülen, die zelluläre Differenzierung von Stammzellen Glioblastom zu fördern

Glioblastoma (GBM) is the most common and most lethal primary brain tumor in adults, causing roughly 14,000 deaths each year in the U.S. alone. Median ...

Practical Considerations in Studying Metastatic Lung Colonization in Osteosarcoma Using the Pulmonary Metastasis Assay

The pulmonary metastasis assay (PuMA) is an ex vivo lung explant and closed cell culture system that permits researchers to study the biology of lung colonization in osteosarcoma (OS) by fluorescence microscopy. This article provides a detailed description of the protocol, and discusses examples of obtaining image data on metastatic growth using widefield or confocal fluorescence microscopy platforms. The flexibility of the PuMA model permits researchers to study not only the growth of OS cells in the lung microenvironment, but also to assess the effects of anti-metastatic therapeutics over time. Confocal microscopy allows for unprecedented, high-resolution imaging of OS cell interactions with the lung parenchyma. Moreover, when the PuMA model is combined with fluorescent dyes or fluorescent protein genetic reporters, researchers can study the lung microenvironment, cellular and subcellular structures, gene function, and promoter activity in metastatic OS cells. The PuMA model provides a new tool for osteosarcoma researchers to discover new metastasis biology and assess the activity of novel anti-metastatic, targeted therapies.

The goal of this article is to provide a detailed description of the protocol for the pulmonary metastasis assay (PuMA). This model permits researchers to study metastatic osteosarcoma (OS) cell growth in lung tissue using a widefield fluorescence or confocal laser-scanning microscope.

Praktische Überlegungen an einem Studium von metastasierendem Lungenkrebs Besiedlung in Osteosarkom mit pulmonalen Metastasen-Assay

The pulmonary metastasis assay (PuMA) is an ex vivo lung explant and closed cell culture system that permits researchers to study the biology of lung ...

The Establishment of a Lung Colonization Assay for Circulating Tumor Cell Visualization in Lung Tissues

Metastasis is the major cause of cancer death. The role of circulating tumor cells (CTCs) in promoting cancer metastasis, in which lung colonization by CTCs critically contributes to early lung metastatic processes, has been vigorously investigated. As such, animal models are the only approach that captures the full systemic process of metastasis. Given that problems occur in previous experimental designs for examining the contributions of CTCs to blood vessel extravasation, we established an in vivo lung colonization assay in which a long-term-fluorescence cell-tracer, carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE), was used to label suspended tumor cells and lung perfusion was performed to clear non-specifically trapped CTCs prior to lung removal, confocal imaging, and quantification. Polymeric fibronectin (polyFN) assembled on CTC surfaces has been found to mediate lung colonization in the final establishment of metastatic tumor tissues. Here, to specifically test the requirement of polyFN assembly on CTCs for lung colonization and extravasation, we performed short term lung colonization assays in which suspended Lewis lung carcinoma cells (LLCs) stably expressing FN-shRNA (shFN) or scramble-shRNA (shScr) and pre-labeled with 20 &#956;M of CFSE were intravenously inoculated into C57BL/6 mice. We successfully demonstrated that the abilities of shFN LLC cells to colonize the mouse lungs were significantly diminished in comparison to shScr LLC cells. Therefore, this short-term methodology may be widely applied to specifically demonstrate the ability of CTCs within the circulation to colonize the lungs.

An animal model is needed to decipher the role of circulating tumor cells (CTCs) in promoting lung colonization during cancer metastasis. Here, we established and successfully performed an in vivo assay to specifically test the requirement of polymeric fibronectin (polyFN) assembly on CTCs for lung colonization.

Die Einrichtung eines Lunge Kolonisation Assays für zirkulierenden Tumor Zelle Visualisierung im Lungengewebe

Metastasis is the major cause of cancer death. The role of circulating tumor cells (CTCs) in promoting cancer metastasis, in which lung colonization by ...

Elastic Staining on Paraffin-embedded Slides of pT3N0M0 Gastric Cancer Tissue

The elastic lamina, which is usually located in the sub-mesothelial layer, adjacent to the peritoneum mesothelial cells, is amphiphilic on hematoxylin and eosin (H&amp;E) staining but can be visualized through elastic staining. One of the important benefits of elastic staining is that it makes it easy to determine whether tumor cells have invaded beyond the elastic lamina. This helps in examining the extent of peritoneal surface invasion, thereby distinguishing the pT3 and pT4 stages in gastrointestinal cancer. In this study, we present a protocol to identify elastic fibers in the formalin-fixed, paraffin-embedded pT3N0M0 gastric cancer tissue sections. We prepare 5-&#181;m paraffin sections fixed on slides, and then all the slides are deparaffinated and rehydrated during the staining procedure. Subsequently, all the sections are oxidized by potassium permanganate, bleached by oxalic acid, stained by elastic staining, and counterstained by Van Gieson's. Finally, we examine the effect of staining; elastic lamina is stained blue-black and collagen fibers are stained red, while the cancer cells are stained in varying shades of yellow. We also describe in detail the methods used for determining the positional relationship between cancer cells and elastic lamina. This method is simple, low-cost, and widely applicable in the identification of peritoneal surface invasion in gastrointestinal cancer because of its outstanding selectivity for elastic fibers and authentic results.

Here, we present a protocol of elastic staining to identify elastic fibers in pT3N0M0 gastric cancer tissues on formalin-fixed, paraffin-embedded sections. Subsequently, we describe a method to determine whether tumor cells invade beyond the elastic lamina.

Elastische Färbung auf Paraffin-eingebetteten Dias von pT3N0M0 Magenkrebsgewebe

The elastic lamina, which is usually located in the sub-mesothelial layer, adjacent to the peritoneum mesothelial cells, is amphiphilic on hematoxylin and ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cells for the Generation of Tumor Antigen-specific T Cells

The generation and expansion of functional T cells in vitro can lead to a broad range of clinical applications. One such use is for the treatment of patients with advanced cancer. Adoptive T cell transfer (ACT) of highly enriched tumor antigen-specific T cells has been shown to cause durable regression of metastatic cancer in some patients. However, during expansion, these cells may become exhausted or senescent, limiting their effector function and persistence in vivo. Induced pluripotent stem cell (iPSC) technology may overcome these obstacles by leading to in vitro generation of large numbers of less differentiated tumor antigen-specific T cells. Human iPSC (hiPSC) have the capacity to differentiate into any type of somatic cell, including lymphocytes, which retain the original T cell receptor (TCR) genomic rearrangement when a T cell is used as a starting cell. Therefore, reprogramming of human tumor antigen-specific T cells to hiPSC followed by redifferentiation to T cell lineage has the potential to produce rejuvenated tumor antigen-specific T cells. Described here is a method for generating tumor antigen-specific CD8&#945;&#946;+ single positive (SP) T cells from hiPSC using OP9/DLL1 co-culture system. This method is a powerful tool for in vitro T cell lineage generation and will facilitate the development of in vitro derived T cells for use in regenerative medicine and cell-based therapies.

This article describes a method to generate functional tumor antigen-specific induced pluripotent stem cell-derived CD8&#945;&#946;+ single positive T cells using OP9/DLL1 co-culture system.

Verwendung von humaninduzierten pluripotenten Stammzellen zur Erzeugung von Tumorantigen-spezifischen T-Zellen

The generation and expansion of functional T cells in vitro can lead to a broad range of clinical applications. One such use is for the treatment of ...

Perfusion and Inflation of the Mouse Lung for Tumor Histology

The ability to evaluate lung histology is critical for the fields of lung cancer research and cancer metastasis. It is equally important to perform necropsies rapidly and efficiently from studies without sacrificing the quality of the tissues procured. The goal of this protocol is to present a method to rapidly perfuse, inflate, and fix mouse lungs for downstream histological analysis. This method does not standardize lung inflation; thus, it does not require any special procedures or equipment and instead simply instills fixative directly through the trachea following perfusion through the heart. This allows for sufficient estimation of tumor size, histology, and scoring. This also allows for the collection of frozen tissue prior to lung tissue fixation. This method is limited in that it does not allow for later morphometric quantification of the lung; however, it is more than sufficient for lung tumor analysis from genetically engineered mouse models (GEMMs), syngeneic models, as well as xenograft tumor and metastasis studies.

The purpose of this method is to present a simple and efficient method for the perfusion, inflation, and fixation of mouse lungs for the examination of lung tumor pathology and evaluation of metastases to the lung.

Perfusion und Inflation der Mauslunge für Tumorhistologie

The ability to evaluate lung histology is critical for the fields of lung cancer research and cancer metastasis. It is equally important to perform ...

Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells

Metastasis, the primary cause of morbidity and mortality for most cancer patients, can be challenging to model preclinically in mice. Few spontaneous metastasis models are available. Thus, the experimental metastasis model involving tail-vein injection of suitable cell lines is a mainstay of metastasis research. When cancer cells are injected into the lateral tail-vein, the lung is their preferred site of colonization. A potential limitation of this technique is the accurate quantification of the metastatic lung tumor burden. While some investigators count macrometastases of a pre-defined size and/or include micrometastases following sectioning of tissue, others determine the area of metastatic lesions relative to normal tissue area. Both of these quantification methods can be exceedingly difficult when the metastatic burden is high. Herein, we demonstrate an intravenous injection model of lung metastasis followed by an advanced method for quantifying metastatic tumor burden using image analysis software. This process allows for investigation of multiple end-point parameters, including average metastasis size, total number of metastases, and total metastasis area, to provide a comprehensive analysis. Furthermore, this method has been reviewed by a veterinary pathologist board-certified by the American College of Veterinary Pathologists (SEK) to ensure accuracy.

Intravenous injection of cancer cells is often used in metastasis research, but the metastatic tumor burden can be difficult to analyze. Herein, we demonstrate a tail-vein injection model of metastasis and include a novel approach to analyze the resulting metastatic lung tumor burden.

Pathologische Analyse der Lungenmetastasierung nach lateraler Schwanzveneninjektion von Tumorzellen

Metastasis, the primary cause of morbidity and mortality for most cancer patients, can be challenging to model preclinically in mice. Few spontaneous ...

Modeling Brain Metastases Through Intracranial Injection and Magnetic Resonance Imaging

Metastatic spread of cancer is an unfortunate consequence of disease progression, aggressive cancer subtypes, and/or late diagnosis. Brain metastases are particularly devastating, difficult to treat, and confer a poor prognosis. While the precise incidence of brain metastases in the United States remains hard to estimate, it is likely to increase as extracranial therapies continue to become more efficacious in treating cancer. Thus, it is necessary to identify and develop novel therapeutic approaches to treat metastasis at this site. To this end, intracranial injection of cancer cells has become a well-established method in which to model brain metastasis. Previously, the inability to directly measure tumor growth has been a technical hindrance to this model; however, increasing availability and quality of small animal imaging modalities, such as magnetic resonance imaging (MRI), are vastly improving the ability to monitor tumor growth over time and infer changes within the brain during the experimental period. Herein, intracranial injection of murine mammary tumor cells into immunocompetent mice followed by MRI is demonstrated. The presented injection approach utilizes isoflurane anesthesia and a stereotactic setup with a digitally controlled, automated drill and needle injection to enhance precision, and reduce technical error. MRI is measured over time using a 9.4 Tesla instrument in The Ohio State University James Comprehensive Cancer Center Small Animal Imaging Shared Resource. Tumor volume measurements are demonstrated at each time point through use of ImageJ. Overall, this intracranial injection approach allows for precise injection, day-to-day monitoring, and accurate tumor volume measurements, which combined greatly enhance the utility of this model system to test novel hypotheses on the drivers of brain metastases.

Intracranial brain metastasis modeling is complicated by an inability to monitor tumor size and response to treatment with precise and timely methods. The presented methodology couples intracranial tumor injection with magnetic resonance imaging analysis, which when combined, cultivates precise and consistent injections, enhanced animal monitoring, and accurate tumor volume measurements.

Modellierung von Hirnmetastasen durch intrakranielle Injektion und Magnetresonanztomographie

Metastatic spread of cancer is an unfortunate consequence of disease progression, aggressive cancer subtypes, and/or late diagnosis. Brain metastases are ...

Detection of Cell-Free DNA in Blood Plasma Samples of Cancer Patients

Identifying mutations in tumors of cancer patients is a very important step in disease management. These mutations serve as biomarkers for tumor diagnosis as well as for the treatment selection and its response in cancer patients. The current gold standard method for detecting tumor mutations involves a genetic test of tumor DNA by means of tumor biopsies. However, this invasive method is difficult to be performed repeatedly as a follow-up test of the tumor mutational repertoire. Liquid biopsy is a new and emerging technique for detecting tumor mutations as an easy-to-use and non-invasive biopsy approach.
Cancer cells multiply rapidly. In parallel, numerous cancer cells undergo apoptosis. Debris from these cells are released into a patient&#8217;s circulatory system, together with finely fragmented DNA pieces, called cell-free DNA (cfDNA) fragments, which carry tumor DNA mutations. Therefore, for identifying cfDNA based biomarkers using liquid biopsy technique, blood samples are collected from the cancer patients, followed by the separation of plasma and buffy coat. Next, plasma is processed for the isolation of cfDNA, and the respective buffy coat is processed for the isolation of a patient&#39;s genomic DNA. Both nucleic acid samples are then checked for their quantity and quality; and analyzed for mutations using next-generation sequencing (NGS) techniques.
In this manuscript, we present a detailed protocol for liquid biopsy, including blood collection, plasma, and buffy coat separation, cfDNA and germline DNA extraction, quantification of cfDNA or germline DNA, and cfDNA fragment enrichment analysis.

In this paper we present a detailed protocol for non-invasive liquid biopsy technique, including blood collection, plasma and buffy coat separation, cfDNA and germline DNA extraction, quantification of cfDNA or germline DNA, and cfDNA fragment enrichment analysis.

Nachweis zellfreier DNA in Blutplasmaproben von Krebspatienten

Identifying mutations in tumors of cancer patients is a very important step in disease management. These mutations serve as biomarkers for tumor diagnosis ...