Wir möchten Chuck Kimmel für Führung, John Dowd um Hilfe bei der Entwicklung dieser Zuchtstrategie, Macie Walker für ihre Arbeit in den skelettartigen Fleck zu perfektionieren und Charline Walker und Bonnie Ullmann für hilfreiche Zebrafisch Beratung danken. Diese Arbeit wurde von K99/R00 DE024190, JTN unterstützt.

alle in diesem Protokoll beschriebenen Experimente wurden in gemäß und in Übereinstimmung mit der University of Colorado und der University of Oregon institutionelle Animal Care and Use Ausschüsse (IACUC) abgeschlossen.
 1. Vorbereitung der nicht ausgewählte Start bestand <ol><li>identifizieren heterozygote Träger des mutierten Allels des Interesses von Fin clip 11 und Genotypisierung einen Bestand von voll-Geschwister Tiere durch die Methode der Wahl, wie KASP 12 , 13 , 14. Dieses Protokoll wurde mit dem Zebrafisch-mef2ca b1086-Stamm durchgeführt.</li>
	<li>KASP Genotypisierung 
	Hinweis: Allel spezifische Primer für KASP sind von der Firma entworfen, die die Reagenzien bietet (siehe Tabelle der Materialien). Um zu erhalten die entsprechenden 6-Carboxylgruppen-X-Rhodamin (ROX) Farbstoff Konzentration für die Echtzeit-PCR-Maschine besuchen die Website des Unternehmens.
	<ol><li>Ort der Zebrafisch Schweif Gewebe in 50 µL Lyse-Puffer (10 mM Tris (pH 8,3), 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl 2, 0,3 % nichtionische Tenside, 0,3 % Octylphenyl-Polyethylenglykol). Fügen Sie 10 µL von 10 mg/mL Proteinase K pro Bohrloch einer 96-Well-PCR-Platte und verdauen in einem Thermocycler bei 55 ° C für 2 bis 5 h, gefolgt von einem 20 min. 94 ° C Inaktivierung Schritt hinzu. Kühlen Sie die Lyse Produkt nach Verdauung. Hinweis: Lyse Produkte können erfolgreich für mehrere Monate nach der Zubereitung verwendet werden. Wenn Gewebe mit 50 mM NaOH lysiert wurde, blieben KASP Reaktionen erfolglos. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die NaOH-Methode der genomischen DNA-Vorbereitung nicht kompatibel mit KASP.</li>
		<li>Quantifizieren die genomische DNA mit einem Spektralphotometer. Verdünnen Sie die genomische DNA-Vorlage mit Molekularbiologie Grade Wasser, so dass jede Reaktion ca. 20-30 ng enthält. 
		Hinweis: Quantifizieren Sie 4 oder 5 Proben zu, bündeln sie, dann bereiten Sie Verdünnungen für alle Proben, die basierend auf dem Durchschnitt. Bei Verwendung dieses Protokolls für Erwachsene Schweif Gewebe ist eine 1: 100 Verdünnung oft ausreichend. Die genaue Quantifizierung der DNA-Konzentration ist nicht erforderlich.</li>
		<li>Add 0,14 µL KASP Grundierung mischen und 5 µL des KASP Master pro Probe auf Eis in eine 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch und mischen vor kurz Zentrifugieren, um Inhalt an der Unterseite des Rohres sammeln, mischen. 
		Hinweis: KASP master-Mix ist Wärme und Licht empfindlich, lagern auf dem Eis und vermeiden Sie direktes Licht.</li>
		<li>Pipettieren 5 µL Grundierung/Master mix Lösung in die Vertiefungen einer 96-Well optische PCR-Platte für die Echtzeit-PCR-Maschine verwendet wird.</li>
		<li>Pipettieren 5 µL verdünnt (ca. 5-7 ng/µL) DNA-Vorlage Proben in jedem gut und mit einer Pipette mischen Aspirieren.</li>
		<li>Hinzufügen 5 µL Nuklease-freies Wasser, 3 Brunnen dienen als keine-Vorlagensteuerelemente (NTC) und fügen Sie 5 µL verdünnter bestätigten homozygoter Wildtyp, heterozygot und homozygot mutierten DNA Schablone für Positivkontrollen.</li>
		<li>Silikondichtung eine optisch klare Folie über der Platte um sicherzustellen, dass der Film vollständig auf jedes gut versiegelt ist.</li>
		<li>Kurz Zentrifugieren die Platte 600 X g, der Inhalt an der Unterseite zu sammeln und um Luftblasen zu entfernen, aus dem Mix. 
		Hinweis: Bewahren Sie die Platte auf Eis und Schild aus Licht bis bereit zu gehen.</li>
		<li>Verwenden Sie das Radfahren Programm in Tabelle 1 dargestellt, die Hauptreaktion KASP durchzuführen.</li>
		<li>Zeigen die resultierenden Streudiagramm von Analyse-Computer produziert. Eine erfolgreiche Reaktion zeigen 4 verschiedene Gruppierungen der Punkte auf dem Grundstück ( Abbildung 3): drei probieren Gruppierungen, Genotyp und eine Gruppierung von NTCs nahe dem Ursprung entspricht. Die Positivkontrollen sollten mit der entsprechenden Probe Gruppierung trennen.</li>
		<li>Wenn das Computerprogramm nicht die Handlung, die Gruppierungen erkennt als spezifische Genotypen, zusätzliche Radfahren Sets entspricht möglicherweise erforderlich (Tabelle 2). Das Zusatzprogramm zu wiederholen, bis der Computer enge Gruppierungen vom Genotyp erkennt.</li>
		<li>Die Genotypisierung Ergebnisse in einer Tabellenkalkulationsdatei für eine einfachere Nutzung und Analyse exportieren.</li>
	</ol></li> <li>Der identifizierten heterozygote Tiere zusammen auf dem Hauptsystem Wasser.</li></ol>
 2. die erste Runde der Nachkommenschaft Scoring <ol><li><ol><li>, nachdem die Tiere aus dem Fin-Clip erholen paarweise kreuzen Geschwister heterozygoten richten Sie paarweise Intercrosses. Teiler verwenden, um sicherzustellen, dass Embryonen sind synchrone 16.</li>
		<li>Sammeln die Embryonen und halten Sie die elterlichen Paare isoliert in der Zucht Käfige.</li>
		<li>Isolierte Erwachsene überwachen, so dass aggressive Fische können getrennt oder mit Abdeckung versehen (zerkleinerten Fisch Netze arbeiten schön). Fisch sollte gefüttert werden und ihr Wasser verändert nach IACUC Richtlinien in statische Wasser.</li>
	</ol></li> <li>Embryo Aufzucht <ol><li>Bühne und erhöhen die Zebrafisch-Embryonen, Larven unter Standardbedingungen 17.</li>
		<li>Sammeln phänotypisch Wildtyp Tiere mit einer Glaspipette am Tag 5 oder 6, wenn die Schwimmblase in 75 % der Kupplung aufgeblasen ist. Phänotypische Wildtypen zu platzieren, in den Kindergarten, die Aufnahme, welche Eltern ihnen ergab. 
		Hinweis: Mit mutierten Allele, die rezessiv tödlich, die für viele Skelett Mutanten gilt, nicht reinerbige Mutanten Form Schwimmblase 18 , 19. Daher phänotypischen Wildtypen von mutierten Geschwister basierend auf aufgeblasenen Schwimmblase leicht erkannt werden können.</li>
	</ol></li> <li>Alcian blau/Alizarin rot Knorpel und Knochen Färbung <ol><li>Larven, die ihre Schwimmblase mit 0,17 g/L Tricaine-Pumpen nicht auf zu betäuben-S im Embryo Medien. Sammeln Sie Tiere in 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen mit einem weiten Bohrung Glas Pasteur pipettieren. Fügen Sie nicht mehr als 100 Larven pro Röhre.</li>
		<li>Embryo Wasser aus jeder Schlauch entfernen und Tiere in 1 mL 2 % Paraformaldehyd in 1 X PBS pro Röhre beheben. 
		Vorsicht: Wässrige PFA ist brennbar und schwere Haut- und Augenreizungen verursachen. Geeignetsten persönlichen Schutzausrüstung wie Handschuhe und Schutzbrille zu tragen und waschen Sie gründlich die Hände nach Gebrauch.</li>
		<li>Rock für 1 h; längere Fixierung beeinträchtigt Knochen zu beflecken. Überprüfen Sie die Schläuche regelmäßig während dieser und alle nachfolgenden rockende Schritte, keine Larven haben klebte an der Seite oder in den Boden des Röhrchens verklumpt.</li>
		<li>Das Fixiermittel aus Rohren mit einer Glaspipette zu entfernen, fügen Sie 1 mL 50 % Ethanol, und Rock für 10 min.</li>
		<li>Bereiten frische Färbelösung durch Zugabe von 20 µL 0,5 % Alizarin Red pro 1 mL Alcian premix (0,04 % Alcian blau/10 mM MgCl 2 / 80 % Ethanol). Entfernen Sie 50 % Ethanol zu, fügen Sie 1 mL Färbelösung zu jedem Rohr und Rock über Nacht. Larven können bis zu 5 Tage in den Fleck bleiben.</li>
		<li>Entfernen Sie die Fleck-Lösung aus den Rohren und jedes Rohr 1 mL 80 % Ethanol/10 mm MgCl 2 Lösung hinzufügen. Rocken Sie die Rohre für mindestens 1 h; über Nacht Spülen einen klarer Alcian blau Fleck produzieren kann.</li>
		<li>Entfernen Sie die 80 % Ethanol/10 mM MgCl 2 Lösung aus den Rohren und 1 mL 50 % igem Ethanol zugeben; rock für 5 min.</li>
		<li>Entfernen Sie die 50 %-Ethanol-Lösung aus den Rohren und 1 mL 25 % Ethanol und Rock für 5 min.</li>
		<li>Die 50 % ige Ethanol-Lösung aus den Rohren zu entfernen und fügen Sie 1 mL frisch zubereitete 3 % H 2 O 2 /0.5% KOH Bleichbad. Lassen Sie die Kappen öffnen und lassen Sie die Rohre stehen in einem Micro-Tube Rack für ca. 10 Minuten oder bis eine schwache braune Färbung im oberen Teil der Lösung gesehen werden kann. 
		Hinweis: Eine Schicht Bläschen Form auf die Lösung. Sorgfältige Timing ist bei diesem Schritt über bleichen führt zu einer armen doppelte Fleck.</li>
		<li>Bleichbad zu entfernen und fügen Sie 1 mL 25 % glycerol/0.1% KOH; rock für 10 min bis 1 h.</li>
		<li>25 %-glycerol/0.1%-KOH-Lösung aus den Rohren zu entfernen, Hinzufügen jedes Rohr, Rock für 10 min über Nacht 50 % glycerol/0.1%-KOH-Lösung 1 mL.</li>
		<li>50 % glycerol/0.1%-KOH-Lösung aus den Rohren zu entfernen und wieder hinzufügen 50 % glycerol/0.1%-KOH-Lösung für jedes Rohr. Rocken hilft über Nacht Luftblasen zu entfernen, die sich im Inneren Larven anreichern können. Store gebeizt Skelette Vorbereitungen bei 4 ° C, wenn nicht verwendet wird.</li>
	</ol></li> <li>Phänotyp erzielte <ol><li>Score gebeizt mutierte Nachkommen für die Penetranz des ausgewählten Phänotyps. In Nichols Et al. 1 durch Mutation entstehende Variationen für jedes Auftreten von ektopische Knochen erzielt wurden. 
		Hinweis: Da der Zebrafisch-Eltern in statische Wasser sind und der Alizarin roten Fleck kann mit der Zeit verblassen, es ist wichtig, Skelette innerhalb weniger Tage der Vollendung der skelettartigen Vorbereitung Punkten.</li>
		<li>Penetranz ist der Anteil der ein Genotyp, der einen Phänotyp hat. Die prozentuale Penetranz nach folgender Formel zu berechnen: % Penetranz = (Mutanten mit Phänotyp) / (Gesamtanzahl der Mutanten) × 100</li></ol></li></ol> 3. Auswahl der <ol><li>Wählen Sie zwei hohe Penetranz und zwei geringe Penetranz Familien für die nächste Generation. Neben Penetranz ist es wichtig, Fruchtbarkeit und Vitalität zu berücksichtigen bei der Auswahl der Familien zu propagieren; Nähere Einzelheiten dazu finden Sie unter Diskussion.</li>
	<li>Geben jedes elterlichen paar eine Sub-Lager-ID: Familie.01,.02, etc.</li>
	<li>Haus elterlichen Paare auf dem Hauptsystem mit mehreren gemischten Sex &#39; Begleiter &#39; Fisch. Begleiter-Fische können jede Zebrafisch-Zeile mit permanenten, offensichtlich Unterscheidungsmerkmale, wie z. B. veränderte Pigmentierung oder Fin-Struktur werden. 
	Hinweis: Während viele Forscher erfolgreich nur Brutpaare in einem Tank halten, sind positive Ergebnisse durch die Unterbringung von Paaren mit mehrere Begleiter Fische gesehen. Diese optionale Schritt ermöglicht Brutpaare von Tieren in größeren Schulen gehalten werden und leicht abgerufen werden, so dass sie immer wieder überquert werden können, je nach Bedarf. Elterliche Paare können wiederholt überschritten werden, um voll-Geschwister Großfamilien zu generieren; warten Sie mindestens eine Woche vor der Wiederholung überqueren das gleiche elterliche paar.</li>
	<li>Cull die Larven Familien aus Schritt 2.2.2. nicht für die nächste Generation ausgewählt wurden.</li>
	<li>Beschriften Sie die Behälter mit den Wildtyp Geschwister Larven aus ausgewählten Familien mit Penetranz von mutierten Geschwister und bis zum Erwachsenenalter als normal erhöhen.</li>
	<li>Die nächste Generation müssen mindestens vier volle Geschwister Familien, zwei für die Linie nach oben und nach unten gerichtete Linie.</li>
	<li>Bei Larven geschlechtsreif, wiederholen Sie das Protokoll beginnend bei Schritt eins mit der neuen Generation.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Nichols, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligament+versus+bone+cell+identity+in+the+zebrafish+hyoid+skeleton+is+regulated+by+mef2ca.">Ligament versus bone cell identity in the zebrafish hyoid skeleton is regulated by mef2ca.</a> Development. 143 (23), 4430-4440 (2016).</li><li>Sheehan-Rooney, K., Swartz, M. E., Zhao, F., Liu, D., Eberhart, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ahsa1+and+Hsp90+activity+confers+more+severe+craniofacial+phenotypes+in+a+zebrafish+model+of+hypoparathyroidism,+sensorineural+deafness+and+renal+dysplasia+(HDR).">Ahsa1 and Hsp90 activity confers more severe craniofacial phenotypes in a zebrafish model of hypoparathyroidism, sensorineural deafness and renal dysplasia (HDR).</a> Dis Model Mech. 6 (5), 1285-1291 (2013).</li><li>Cox, S. 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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Selektiver Zucht stellt Feinheiten der Genfunktion
Shifting mutierte Phänotypen um mehr oder weniger stark durch selektive Zucht ist eine einfache Möglichkeit, neue Einblicke in Genfunktion. Im Vergleich zu standard-Methoden der nicht ausgewählte Zucht kann das Protokoll hier vorgestellten ein viel umfassenderes Verständnis der mutierten Phänotypen ergeben. Insbesondere kann durch die Generierung von Stämmen, die schwere, die volle Bandbreite der mutierten Phänotypen au...

Der Zebrabärbling ist ein leistungsfähiges Modell für das Verständnis der Skelettbildung. Mit mutierten Zebrafisch Stämmen können Biologen Genfunktion während Skeletogenese entschlüsseln. Jedoch können Skelett mutierten Zebrafisch Phänotypen mit variabler Penetranz1,2,3,4 präsentieren die Entwicklungs- und genetische Analysen behindern können. Der Zweck dieser Methode ist dreifach. Zunächst ermöglicht Zebrafisch mutierten Linien erzeugen immer wieder schwere Phänotypen erzeugen nachgelagerte Studien wie Zeitrafferaufnahme5 und Transplantation6. Diese Art von Studien können gelähmt werden, indem er versucht, die Phänotypen zu studieren, die nur uneinheitlich manifestieren. Zweitens kann die Inzucht Zebrafisch Stämme genetischen Hintergrund Variation, also Förderung experimenteller Konsistenz und Reproduzierbarkeit verringern. Zum Beispiel alle in Situ können Hybridisierung Analysen auf eine selektiv Inzucht Belastung reduzieren verwirrende Variabilität und Schlussfolgerungen zu stärken. Drittens: Generierung von schweren und leichten Belastungen die gesamte phänotypischen Serie zeigen, die durch eine bestimmte Mutation entstehen können.
Selektive Zucht von letale Mutanten scheint auf den ersten Blick unmöglich. Wie kann eine Rasse für Penetranz, wenn die Tiere, die für die Auswahl erzielte sind tot sind? Glücklicherweise haben Methoden für die selektive Zucht von Familie Auswahl, speziell Nachkommen testen, Wirksamkeit bei der Viehzucht Programme für viele Jahre7,8gezeigt. Diese Programme dienen hauptsächlich für die selektive Zucht für Züge, die nur in einem Geschlecht, wie Milchleistung bei Kühen oder Ei-Produktion bei Hennen vorhanden sind. Die Männchen dieser Arten können nicht direkt, erzielte aber ihre Nachkommen werden ausgewertet und ein Wert wird dann an die Eltern zugewiesen. In Anlehnung an diese Strategie, beinhaltet das Protokoll hier vorgestellten erzielte die festen und gefärbten mutierten Nachkommen aus einem Paar von Zebrafisch, die heterozygot für eine Mutation von Interesse sind. Die Penetranz des Phänotyps bei den homozygoten tödlichen mutierten Nachkommen erhält die Eltern bei der Entscheidung, welche Individuen wird die nächste Generation in der Zeile zu produzieren. Wir finden, dass diese Methode ein wirksames Mittel zur Verlagerung Penetranz im Zebrafisch letale Skelett Mutanten1.
Ähnlich wie bei anderen Studien, nimmt dieses selektive Zucht-Protokoll unter Berücksichtigung Kriterien wie normale Entwicklung der Embryonen und Geschlechterverhältnis9, Gelegegrösse, Überleben der Nachkommen. Jedoch sind alle diese Faktoren im Zusammenhang mit einem mutierten Hintergrund mit dem Ziel der Verschiebung der mutierten Penetranz berücksichtigt. Daher reicht dieses Protokoll vorherigen Auslesezüchtung Paradigmen bieten eine Methode, um Stärken Entwicklungsstörungen mutierte Analysen sowie Hintergrund Homogenität zu erhöhen.
Dieses Protokoll erfordert umfangreiche Genotypisierung, deshalb es wichtig ist auf eine zuverlässige und schnelle Genotypisierung-Protokoll zu entwickeln. Es gibt viele Genotypisierung Protokolle verfügbar10,11, jedoch finden wir die KASP Genotypisierung12,13,14 ist schneller, kostengünstiger, effizienter und zuverlässiger als Methoden basierend auf Restriktionsenzym Spaltung der amplifizierten Sequenzen10. Daher sind wir ein KASP Protokoll in dieser Arbeit. Darüber hinaus wir zielen auf Skelett mutierte Phänotypen in diesem Protokoll und ein Verfahren für Alcian blau/Alizarin rote Färbung veränderte aus früheren Protokollen15umfassen.
Die hier beschriebene Methode ist eine einfache Strategie zum tödlichen mutierten Penetranz verschieben, nach oben oder unten. Während dieses Protokoll konzentriert sich auf Skelett mutierte Phänotypen, glauben wir, dass es eine sinnvolle Strategie für Tierhaltung aller mutierten Zebrafisch Linien sein wird. In der Tat hinausgeht die Nützlichkeit dieser Zuchtstrategie wahrscheinlich Zebrafisch. Wir sagen voraus, dass dieses Protokoll geändert werden kann, um Penetranz in einer Vielzahl von Organismen zu verlagern. Verschiebung tödliche Penetranz um Nachkommen testen kann dazu beitragen, den Fortschritt der Entwicklungsstörungen Genetiker voranzutreiben.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="627">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Paraformaldehyde, pelleted, solid</td>
			<td style="width:125px;">Ted Pella Co.</td>
			<td style="width:119px;">18501</td>
			<td style="width:167px;">Pelleted PFA is a safer alternative to powdered PFA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Magnesium Chloride, solid</td>
			<td style="width:125px;">Acros Organics</td>
			<td>223210010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">10x PBS, Aqueous</td>
			<td style="width:125px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP3994</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">190 proof Ethanol</td>
			<td style="width:125px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Alcian Blue, solid</td>
			<td style="width:125px;">Anatech Ltd.</td>
			<td style="width:119px;">867</td>
			<td>Must be from Anatech</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Alizarin Red, solid</td>
			<td style="width:125px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A5533-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glycerol, liquid</td>
			<td style="width:125px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP229 1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Hydrogen peroxide, liquid</td>
			<td style="width:125px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP263500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Potassium hydroxide,&#160; solid</td>
			<td style="width:125px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">P250 500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">StepOnePlus Real-time PCR Machine</td>
			<td style="width:125px;">Applied Biosystems</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">MicroAmp Fast Optical 96-well Reaction Plate with Barcode (0.1mL)</td>
			<td style="width:125px;">Applied Biosystems</td>
			<td style="width:119px;">4346906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Microseal &#39;B&#39; seal</td>
			<td style="width:125px;">BioRad</td>
			<td style="width:119px;">MSB1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">KASP Master Mix, High ROX</td>
			<td style="width:125px;">LGC</td>
			<td>KBS-1016-022</td>
			<td>https://www.lgcgroup.com/products/kasp-genotyping-chemistry/#.WOPX41UrKUk</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">KASP By Design Primer Mix</td>
			<td style="width:125px;">LGC</td>
			<td style="width:119px;">KBS-2100-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tris HCl, solid</td>
			<td style="width:125px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP153 500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">potassium chloride, solid</td>
			<td style="width:125px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP366 500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tween-20, liquid</td>
			<td style="width:125px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP337 100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Nonidet P40</td>
			<td style="width:125px;">ThermoFisher</td>
			<td>28324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Tricaine-S</td>
			<td style="width:125px;">Western Chemicals</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Proteinase K</td>
			<td style="width:125px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP1700 100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">T100 Thermal Cycler</td>
			<td style="width:125px;">BioRad</td>
			<td>1861096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Controlled Drop Pasteur Pipets</td>
			<td style="width:125px;">Fisher</td>
			<td>13-678-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Nanodrop</td>
			<td style="width:125px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>for DNA quantitation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

shifting zebrafish lethal skeletal mutant penetrance by progeny testing

Mutierte Zebrafisch Phänotypen sind oft unvollständig penetrant, nur in einigen Mutanten manifestiert. Interessante Phänotypen, die uneinheitlich erscheinen können schwierig sein, zu studieren und zu verwirrende Ergebnisse führen können. Das hier beschriebene Protokoll ist ein einfache Zucht Paradigma zu erhöhen und verringern Penetranz in tödliche Zebrafisch Skelett Mutanten. Da letale Mutanten können nicht direkt gezielt gezüchtet werden, ist die klassischen Auslesezüchtung Strategie der Nachkommenschaft Tests eingesetzt. Diese Methode beinhaltet auch Protokolle für Kompetitive Allel spezifische PCR (KASP) Genotypisierung Zebrafisch und Färbung Larven Zebrafisch Knorpel und Knochen. Anwendung der hier beschriebenen Strategie zur Tierhaltung kann die Penetranz der eine interessante skelettalen Phänotyp ermöglicht mehr reproduzierbare Ergebnisse in downstream-Anwendungen erhöhen. Darüber hinaus kann verringern die mutierten Penetranz durch diese selektive Zuchtstrategie Entwicklungsprozesse offenbaren, die am wichtigsten ist die Funktion des mutierten Gens erfordern. Während das Skelett speziell hier betrachtet wird, schlagen wir vor, dass diese Methode für alle mutierten Zebrafisch-Linien nützlich sein wird.

Dieses Protokoll ist eine langfristige Haltung Technik nützlich für Verständnis Zebrafisch Skelett Mutanten (Abbildung 1). Selektiver Zucht von Nachkommen testen sollte eine Verschiebung im allgemeinen Penetranz nach unten und nach oben in ein paar Generationen (Abbildung 2) ergeben. In unserer bisherigen Arbeit fuhren zwei Runden der Zuchtauslese die durchschnittliche Penetranz nach unten von 17 % auf 3 %1</...

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Shifting Zebrafish Lethal Skeletal Mutant Penetrance by Progeny Testing

Das Ziel dieses Protokolls ist es, die Penetranz der letale Skelett mutierte Phänotypen im Zebrafisch durch selektive Zucht zu ändern. Letale Mutanten können nicht bis ins Erwachsenenalter angebaut werden und selbst gezüchtet, daher dieses Protokoll beschreibt eine Methode für die Verfolgung und Penetranz über mehrere Generationen von Nachkommen Tests auswählen.

Verschiebung der Zebrafisch letale Skelett mutierte Penetranz um Nachkommen testen

Zebrafish mutant phenotypes are often incompletely penetrant, only manifesting in some mutants. Interesting phenotypes that inconsistently appear can be ...

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Universidad San Sebastian

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Molecular Biology

Developmental Biology

Unit 2

Mendelian Genetics

SCIENTISTS IN ACTION

7.5K Aufrufe.  University of Colorado Anschutz Medical Campus. Das Ziel dieses Protokolls ist es, die Penetranz der letale Skelett mutierte Phänotypen im Zebrafisch durch selektive Zucht zu ändern. Letale Mutanten können nicht bis ins Erwachsenenalter angebaut werden und selbst gezüchtet, daher dieses Protokoll beschreibt eine Methode für die Verfolgung und Penetranz über mehrere Generationen von Nachkommen Tests auswählen.

Serie: Shifting Zebrafish Lethal Skeletal Mutant Penetrance by Progeny Testing

Kidney Regeneration in Adult Zebrafish by Gentamicin Induced Injury

The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is the nephron. Mammals are able to repair existing nephrons after injury, but lose the ability to form new nephrons soon after birth. In contrast to mammals, adult fish produce new nephrons (neonephrogenesis) throughout their lives in response to growth requirements or injury. Recently, lhx1a has been shown to mark nephron progenitor cells in the adult zebrafish kidney, however mechanisms controlling the formation of new nephrons after injury remain unknown. Here we show our method for robust and reproducible injury in the adult zebrafish kidney by intraperitoneal (i.p.) injection of gentamicin, which uses a noninvasive visual screening process to select for fish with strong but nonlethal injury. Using this method, we can determine optimal gentamicin dosages for injury and go on to demonstrate the effect of higher temperatures on kidney regeneration in zebrafish.

Here we present a reliable method to study adult kidney regeneration by inducing acute kidney injury by gentamicin injection. We show that injury is dependent on gentamicin dosage and environmental temperature using in situ hybridization to label lhx1a+ developing new nephrons.

Nieren-Regeneration im erwachsenen Zebrafisch durch Gentamicin induzierte Schädigung

The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Mechanical Vessel Injury in Zebrafish Embryos

Zebrafish (Danio rerio) embryos have proven to be a powerful model for studying a variety of developmental and disease processes. External development and optical transparency make these embryos especially amenable to microscopy, and numerous transgenic lines that label specific cell types with fluorescent proteins are available, making the zebrafish embryo an ideal system for visualizing the interaction of vascular, hematopoietic, and other cell types during injury and repair in vivo. Forward and reverse genetics in zebrafish are well developed, and pharmacological manipulation is possible. We describe a mechanical vascular injury model using micromanipulation techniques that exploits several of these features to study responses to vascular injury including hemostasis and blood vessel repair. Using a combination of video and timelapse microscopy, we demonstrate that this method of vascular injury results in measurable and reproducible responses during hemostasis and wound repair. This method provides a system for studying vascular injury and repair in detail in a whole animal model.

This article describes a method for creating a mechanical vessel injury in zebrafish embryos. This injury model provides a platform for studying hemostasis, injury-related inflammation, and wound healing in an organism ideally suited for real-time microscopy.

Mechanische Gefäßverletzung in Zebrafischembryonen

Zebrafish (Danio rerio) embryos have proven to be a powerful model for studying a variety of developmental and disease processes.  External development ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders. In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle membrane is a critical disease determinant. To date, numerous neuromuscular conditions display degenerating muscle fibers with abnormal membrane integrity; this is most commonly observed in muscular dystrophies. Evans Blue Dye (EBD) is a vital, cell permeable dye that is rapidly taken into degenerating, damaged, or apoptotic cells; in contrast, it is not taken up by cells with an intact membrane. EBD injection is commonly employed to ascertain muscle integrity in mouse models of neuromuscular diseases. However, such EBD experiments require muscle dissection and/or sectioning prior to analysis. In contrast, EBD uptake in zebrafish is visualized in live, intact preparations. Here, we demonstrate a simple and straightforward methodology for performing EBD injections and analysis in live zebrafish. In addition, we demonstrate a co-injection strategy to increase efficacy of EBD analysis. Overall, this video article provides an outline to perform EBD injection and characterization in zebrafish models of neuromuscular disease.

In this study, we describe a straightforward method to perform Evans Blue Dye (EBD) analysis on zebrafish larvae. This technique is a powerful tool for the characterization of skeletal muscle integrity and delineation of zebrafish models of muscular dystrophy, and is a valuable method for the development of novel therapeutics.

Analyse von Zebrafisch-Larven Skelettmuskel Integrität mit Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Generation of Parabiotic Zebrafish Embryos by Surgical Fusion of Developing Blastulae

Surgical parabiosis of two animals of different genetic backgrounds creates a unique scenario to study cell-intrinsic versus cell-extrinsic roles for candidate genes of interest, migratory behaviors of cells, and secreted signals in distinct genetic settings. Because parabiotic animals share a common circulation, any blood or blood-borne factor from one animal will be exchanged with its partner and vice versa. Thus, cells and molecular factors derived from one genetic background can be studied in the context of a second genetic background. Parabiosis of adult mice has been &#160;used extensively to research aging, cancer, diabetes, obesity, and brain development. More recently, parabiosis of zebrafish embryos has been used to study the developmental biology of hematopoiesis. In contrast to mice, the transparent nature of zebrafish embryos permits the direct visualization of cells in the parabiotic context, making it a uniquely powerful method for investigating fundamental cellular and molecular mechanisms. The utility of this technique, however, is limited by a steep learning curve for generating the parabiotic zebrafish embryos. This protocol provides a step-by-step method on how to surgically fuse the blastulae of two zebrafish embryos of different genetic backgrounds to investigate the role of candidate genes of interest. In addition, the parabiotic zebrafish embryos are tolerant to heat shock, making temporal control of gene expression possible. This method does not require a sophisticated set-up and has broad applications for studying cell migration, fate specification, and differentiation in vivo during embryonic development.

This protocol provides step-by-step instruction on how to generate parabiotic zebrafish embryos of different genetic backgrounds. When combined with the unparalleled imaging capabilities of the zebrafish embryo, this method provides a uniquely powerful means to investigate cell-autonomous versus non-cell-autonomous functions for candidate genes of interest.

Die Erzeugung von Parabiotic Zebrabärbling Embryonen, die durch chirurgische Fusion der Entwicklung Blastulae

Surgical parabiosis of two animals of different genetic backgrounds creates a unique scenario to study cell-intrinsic versus cell-extrinsic roles for ...

Induction of Acute Skeletal Muscle Regeneration by Cardiotoxin Injection

Skeletal muscle regeneration is a physiological process that occurs in adult skeletal muscles in response to injury or disease. Acute injury-induced skeletal muscle regeneration is a widely used, powerful model system to study the events involved in muscle regeneration as well as the mechanisms and different players. Indeed, a detailed knowledge of this process is essential for a better understanding of the pathological conditions that lead to skeletal muscle degeneration, and it aids in identifying new targeted therapeutic strategies. The present work describes a detailed and reproducible protocol to induce acute skeletal muscle regeneration in mice through a single intramuscular injection of cardiotoxin (CTX). CTX belongs to the family of snake venom toxins and causes myolysis of myofibers, which eventually triggers the regeneration events. The dynamics of skeletal muscle regeneration is evaluated by histological analysis of muscle sections. The protocol also illustrates the experimental procedures for dissecting, freezing, and cutting the Tibialis Anterior muscle, as well as the routine Hematoxylin &#38; Eosin staining that is widely used for subsequent morphological and morphometric analysis.

This manuscript describes a detailed protocol to induce acute skeletal muscle regeneration in adult mice and subsequent manipulations of the muscles, such as dissection, freezing, cutting, routine staining, and myofiber cross-sectional area analysis.

Die Induktion von Akute Skelettmuskelregeneration durch Cardio Injection

Skeletal muscle regeneration is a physiological process that occurs in adult skeletal muscles in response to injury or disease. Acute injury-induced ...

Identification Of Erythromyeloid Progenitors And Their Progeny In The Mouse Embryo By Flow Cytometry

Macrophages are professional phagocytes from the innate arm of the immune system. In steady-state, sessile macrophages are found in adult tissues where they act as front line sentinels of infection and tissue damage. While other immune cells are continuously renewed from hematopoietic stem and progenitor cells (HSPC) located in the bone marrow, a lineage of macrophages, known as resident macrophages, have been shown to be self-maintained in tissues without input from bone marrow HSPCs. This lineage is exemplified by microglia in the brain, Kupffer cells in the liver and Langerhans cells in the epidermis among others. The intestinal and colon lamina propria are the only adult tissues devoid of HSPC-independent resident macrophages. Recent investigations have identified that resident macrophages originate from the extra-embryonic yolk sac hematopoiesis from progenitor(s) distinct from fetal hematopoietic stem cells (HSC). Among yolk sac definitive hematopoiesis, erythromyeloid progenitors (EMP) give rise both to erythroid and myeloid cells, in particular resident macrophages. EMP are only generated within the yolk sac between E8.5 and E10.5 days of development and they migrate to the fetal liver as early as circulation is connected, where they expand and differentiate until at least E16.5. Their progeny includes erythrocytes, macrophages, neutrophils and mast cells but only EMP-derived macrophages persist until adulthood in tissues. The transient nature of EMP emergence and the temporal overlap with HSC generation renders the analysis of these progenitors difficult. We have established a tamoxifen-inducible fate mapping protocol based on expression of the macrophage cytokine receptor Csf1r promoter to characterize EMP and EMP-derived cells in vivo by flow cytometry.

While infiltrating macrophages are continuously recruited to adult tissues from circulating precursors, resident macrophages seed their tissue during development, where they are maintained without further input from progenitors. The progenitors for resident macrophages were recently identified. Here, we present methods for the genetic fate mapping of the resident macrophage progenitors.

Identifizierung von Erythromyeloid Progenitoren und deren Nachkommen in der Maus Embryo Durch Durchflusszytometrie

Macrophages are professional phagocytes from the innate arm of the immune system. In steady-state, sessile macrophages are found in adult tissues where ...

Culture of Adult Transgenic Zebrafish Retinal Explants for Live-cell Imaging by Multiphoton Microscopy

An endogenous regeneration program is initiated by M&#252;ller glia in the adult zebrafish (Danio rerio) retina following neuronal damage and death. The M&#252;ller glia re-enter the cell cycle and produce neuronal progenitor cells that undergo subsequent rounds of cell divisions and differentiate into the lost neuronal cell types. Both M&#252;ller glia and neuronal progenitor cell nuclei replicate their DNA and undergo mitosis in distinct locations of the retina, i.e. they migrate between the basal Inner Nuclear Layer (INL) and the Outer Nuclear Layer (ONL), respectively, in a process described as Interkinetic Nuclear Migration (INM). INM has predominantly been studied in the developing retina. To examine the dynamics of INM in the adult regenerating zebrafish retina in detail, live-cell imaging of fluorescently-labeled M&#252;ller glia/neuronal progenitor cells is required. Here, we provide the conditions to isolate and culture dorsal retinas from Tg[gfap:nGFP]mi2004 zebrafish that were exposed to constant intense light for 35 h. We also show that these retinal cultures are viable to perform live-cell imaging experiments, continuously acquiring z-stack images throughout the thickness of the retinal explant for up to 8 h using multiphoton microscopy to monitor the migratory behavior of gfap:nGFP-positive cells. In addition, we describe the details to perform post-imaging analysis to determine the velocity of apical and basal INM. To summarize, we established conditions to study the dynamics of INM in an adult model of neuronal regeneration. This will advance our understanding of this crucial cellular process and allow us to determine the mechanisms that control INM.

Zebrafish retinal regeneration has mostly been studied using fixed retinas. However, dynamic processes such as interkinetic nuclear migration occur during the regenerative response and require live-cell imaging to investigate the underlying mechanisms. Here, we describe culture and imaging conditions to monitor Interkinetic Nuclear Migration (INM) in real-time using multiphoton microscopy.

Kultur von Adult transgener Zebrafische Retinal Explantate für das Live-Cell-Imaging von Multiphotonen-Mikroskopie

An endogenous regeneration program is initiated by M&#252;ller glia in the adult zebrafish (Danio rerio) retina following neuronal damage and death. The ...

Isolation of Type I and Type II Pericytes from Mouse Skeletal Muscles

Pericytes are perivascular multipotent cells that show heterogeneity in different organs or even within the same tissue. In skeletal muscles, there are at least two pericyte subpopulations (called type I and type II), which express different molecular markers and have distinct differentiation capabilities. Using NG2-DsRed and Nestin-GFP double-transgenic mice, type I (NG2-DsRed+Nestin-GFP-) and type II (NG2-DsRed+Nestin-GFP+) pericytes have been successfully isolated. However, the availability of these double-transgenic mice prevents the widespread use of this purification method. This work describes an alternative protocol that allows for the easy and simultaneous isolation of type I and type II pericytes from skeletal muscles. This protocol utilizes the fluorescence-activated cell sorting (FACS) technique and targets PDGFR&#946;, rather than NG2, together with the Nestin-GFP signal. Following isolation, type I and type II pericytes show distinct morphologies. In addition, type I and type II pericytes isolated with this new method, like those isolated from the double-transgenic mice, are adipogenic and myogenic, respectively. These results suggest that this protocol can be used to isolate pericyte subpopulations from skeletal muscles and possibly from other tissues.

This work describes a FACS-based protocol that allows for easy and simultaneous isolation of type I and type II pericytes from skeletal muscles.

Isolierung von Typ I und Typ II Perizyten aus Maus Skelettmuskeln

Pericytes are perivascular multipotent cells that show heterogeneity in different organs or even within the same tissue. In skeletal muscles, there are at ...

Identification of Skeletal Muscle Satellite Cells by Immunofluorescence with Pax7 and Laminin Antibodies

Immunofluorescence is an effective method that helps to identify different cell types on tissue sections. In order to study the desired cell population, antibodies for specific cell markers are applied on tissue sections. In adult skeletal muscle, satellite cells (SCs) are stem cells that contribute to muscle repair and regeneration. Therefore, it is important to visualize and trace the satellite cell population under different physiological conditions. In resting skeletal muscle, SCs reside between the basal lamina and myofiber plasma membrane. A commonly used marker for identifying SCs on the myofibers or in cell culture is the paired box protein Pax7. In this article, an optimized Pax7 immunofluorescence protocol on skeletal muscle sections is presented that minimizes non-specific staining and background. Another antibody that recognizes a protein (laminin) of the basal lamina was also added to help identify SCs. Similar protocols can also be used to perform double or triple labeling with Pax7 and antibodies for additional proteins of interest.

The precise identification of satellite cells is essential for studying their functions under various physiological and pathological conditions. This article presents a protocol to identify satellite cells on adult skeletal muscle sections by immunofluorescence-based staining.

Kennung des skelettartigen Muskels Satellitenzellen durch Immunfluoreszenz mit Pax7 und Laminin-Antikörper

Immunofluorescence is an effective method that helps to identify different cell types on tissue sections. In order to study the desired cell population, ...

Performing Human Skeletal Muscle Xenografts in Immunodeficient Mice

Treatment effects observed in animal studies often fail to be recapitulated in clinical trials. While this problem is multifaceted, one reason for this failure is the use of inadequate laboratory models. It is challenging to model complex human diseases in traditional laboratory organisms, but this issue can be circumvented through the study of human xenografts. The surgical method we describe here allows for the creation of human skeletal muscle xenografts, which can be used to model muscle disease and to carry out preclinical therapeutic testing. Under an Institutional Review Board (IRB)-approved protocol, skeletal muscle specimens are acquired from patients and then transplanted into NOD-Rag1null IL2r&gamma;null (NRG) host mice. These mice are ideal hosts for transplantation studies due to their inability to make mature lymphocytes and are thus unable to develop cell-mediated and humoral adaptive immune responses. Host mice are anaesthetized with isoflurane, and the mouse tibialis anterior and extensor digitorum longus muscles are removed. A piece of human muscle is then placed in the empty tibial compartment and sutured to the proximal and distal tendons of the peroneus longus muscle. The xenografted muscle is spontaneously vascularized and innervated by the mouse host, resulting in robustly regenerated human muscle that can serve as a model for preclinical studies.

Complex human diseases can be challenging to model in traditional laboratory model systems. Here, we describe a surgical approach to model human muscle disease through the transplantation of human skeletal muscle biopsies into immunodeficient mice.

Durchführung von Human Skeletal Muscle Xenografts bei immundefizienten Mäusen

Treatment effects observed in animal studies often fail to be recapitulated in clinical trials. While this problem is multifaceted, one reason for this ...