Wir danken Tony Kulesa, Robin Kirkpatrick und Evangelos Gatzogiannis für Unterstützung bei der anfänglichen Instrumentierung einrichten und testen. Wir danken weiter Tony Kulesa für bedeutende Hilfe schreiben und Bewertung der individuellen Einzelkorn-Tracking-Software. Diese Arbeit wurde durch die Finanzierung von Start und einen Karriere-Award auf der wissenschaftlichen Schnittstelle (PCB) von Burroughs Wellcome Foundation unterstützt.

1. Vorbereitung der Biotin-λ-DNA Hinweis: Biotin-λ-DNA-Moleküle sind bereit, durch Ligation eine Biotin-markierten Oligonukleotid, 5 &#39;-AGGTCGCCGCCC(A) 20 - Biotin - 3 &#39;, Λ-DNA Moleküle 20.
<ol><li>Prepare 0,1 mM Biotin beschriftet Oligo in TE-Puffer.</li>
	<li>Wärme 0,5 mg/mL λ-DNA Lager bei 65 ° C für 60 s und Sprung in nassem Eis sofort. 
	Hinweis: Schnelle Quench Kühlung reduziert λ-DNA-Concatemerization.</li>
	<li>Pipette 100 µL der λ-DNA-Lösung zu einem Microcentrifuge Schlauch.</li>
	<li>Add 1 µL 0.1 mM Oligo in 9 µL TE-Puffer.</li>
	<li>Add 2 µL der Oligo-Lösung für den Microcentrifuge Schlauch mit λ-DNA. Gründlich mischen. 
	Hinweis: Oligo ist in etwa eine 12-fold Molaren Überschuss über ergänzende λ-DNA Ende.</li>
	<li>Erhitzen Sie die Mischung der λ-DNA/Oligo bei 65 ° C für 60 s.</li>
	<li>Langsam die Mischung auf Raumtemperatur abkühlen. 
	Hinweis: In diesem Schritt können die Oligo bis zu ergänzenden λ-DNA Ende Tempern.</li>
	<li>Legen Sie die Mischung auf dem Eis. Fügen Sie 11 µL T4 DNA-Ligase Reaktion Puffer (endgültige Puffer Konzentration 1 X). Mischen Sie vorsichtig. Fügen Sie 2 µL (800 Stück) T4 DNA-Ligase-Enzym. Vorsichtig mischen.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Mischung für 2 h bei 16 ° C oder über Nacht bei 4 ° c</li>
	<li>Reinigen Sie das Produkt mit zentrifugalen Filterschläuche mit einem nominalen Molekulargewicht Limit von 100 kDa. Insbesondere übertragen die Schritt 1,9-Mischung in eine zentrifugale Filter Schlauch und Zentrifuge bei 14.000 x g für 5 min, mit 400 µL TE-Puffer zweimal waschen und sammeln das gereinigte Produkt. 
	Hinweis: Die als gereinigt Biotin-λ-DNA in TE-Puffer sind stabil bei-20 ° C bis zu einem Jahr.</li>
</ol> 2. Deckglas Funktionalisierung Hinweis: Glasdeckgläser sind durch die Reaktion mit Silan-PEG-Biotin funktionalisiert. Diese einstufige Reaktion Protokoll ist einfacher und zuverlässiger erfahrungsgemäß als standard zweistufige Reaktion Protokoll 20. Deckglas Funktionalisierung mit Silan-PEG-Biotin schafft Bindungsstellen für Streptavidin und minimiert die unspezifische DNA und Protein Adsorption an der Oberfläche des Deckglases.
<ol><li>Sonicate fünf Nr. 1 Deckgläsern in 95 % igem Ethanol im Inneren eine Färbung jar für 10 min und dann mit Reinstwasser dreimal ausspülen. 
	Hinweis: Die fünfte Deckglas bietet einen Ersatz bei Bruch.</li>
	<li>Füllen Sie die Färbung Glas mit 1 M KOH, 10 min. lang beschallen und dann spülen Sie mit Reinstwasser dreimal.</li>
	<li>2.1-2.2 Zyklus zweimal wiederholen.</li>
	<li>Trocknen Deckgläsern unter trockenen, sauberen Gasstrom der N 2.</li>
	<li>Weitere reinigen und trocknen Sie die Deckgläsern durch Luft Plasmabehandlung bei 900 mTorr Druck für 5 min.</li>
	<li>Brüten Deckgläsern mit 25 mg/mL Silan-Peg-Biotin speziell in 95 % igem Ethanol bei Raumtemperatur für 2 h aufgelöst, sandwich-50 µL Silan-Peg-Biotin Lösung zwischen zwei sauberen und trockenen Deckgläsern und inkubieren Sie das Deckglas &#34; Sandwiches &#34; innerhalb einer geschlossenen Pipette Tip Box mit ca. 10 mL Wasser an der Unterseite (nicht in Kontakt mit den Deckgläsern) Lösungsmittel verdampfen zu minimieren.</li>
	<li>Waschen entfernt überschüssige PEG Molekülen mit Reinstwasser und Trocknen der PEG Deckgläsern unter sauberen beschichtet trocknen Gasstrom N 2. 
	Hinweis: Die funktionalisierten Deckgläsern können bis zu drei Tage unter Umgebungsbedingungen gelagert werden.</li>
</ol> 3. Bau der Zelle fließen Hinweis: Durchflusszellen entstehen durch sandwiching eine Doppel-Klebeband mit vorgestanzten Kanäle zwischen eine PEG funktionalisiert Deckglas und ein PDMS-Platte mit Einlass und Auslass Öffnungen. Mehrere Kanäle fließen pro Durchflusszelle.
<ol><li>Strömungskanäle in einer CAD-Software-design und Schnitt die Kanäle (Breite, Tiefe und Länge der einzelnen Kanäle sind 1, 0,13 und 12 mm, beziehungsweise) auf ein Doppel-Klebeband mithilfe einer Bandabschneider (in der Regel acht Kanäle fließen pro Zelle). Entfernen Sie Klebeband Residuen der Strömungskanäle bilden.</li>
	<li>Zu PDMS Platten, mischen Sie 45 g PDMS mit 5 g Vernetzung Reagenz (genug für die Herstellung von zwölf 5 mm dicker PMDS Platten die unter Umgebungsbedingungen auf unbestimmte Zeit gespeichert werden kann) mit einem Mixer, den Teig in zwei 10 cm Petrischalen und lassen die Gerichte in einer Vakuumkammer bis im Wesentlichen alle Luftblasen sind verschwunden (manuell entfernen Luftblasen, wenn irgendwelche bleiben, wenn die Gerichte aus der Vakuumkammer entfernt werden). Übertragen Sie dann die Gerichte in einem Ofen 80 ° C bis PDMS erstarrt (ca. 2 h).</li>
	<li>Schneiden Sie ein PDMS-Platte, die die Größe der Doppel-Klebeband mit vorgestanzten Kanälen entspricht. Peel ein Schutzfilm aus dem Doppel-Klebeband und halten den Film auf eine Ebene Fläche der Platte PDMS. Ablauf und Zulauf Lochen auf der PDMS-Platte mit einem 23 Gauge-Nadel eine Biopsie Loch-Puncher.</li>
	<li>Schälen die zweite Schutzfolie aus dem Doppel-Klebeband und halten die PDMS-Band Montage an die funktionalisierten Oberfläche das Deckglas (stellen Sie sicher, dass das Deckglas flach ist. Sehen ein Bild von einer fertig montierten Durchflusszelle in Abbildung 1a).</li>
</ol> 4. Imaging-TIRF Hinweis: Biotin-λ-DNA sind angebunden an eine Flow-Kanal-Oberfläche und Laminar-Flow gilt für Flow erstrecken sich die DNA-Moleküle ( Abbildung 1 b). Die &#62; 80 % gedehnt DNA Moleküle dienen als räumlich erweiterte Vorlagen für die Bindung und den Transport Aktivität Eindringmittel beschrifteten Moleküle zu beobachten. Die Bahnen der einzelnen Moleküle werden verfolgt von Time-Lapse TIRF Imaging ( Abbildung 1 c &#38; e).
<ol><li>Fix der Messzelle am Mikroskop Bühne und Last bereits entgast leeren Puffer (10 mM Natriumphosphat, 2 mM NaCl, 50 µM EDTA, 20 mM Ethanol, 5 % (V/V) Glycerin, 0,01 % Tween-20, 1 % (V/V) β-Mercaptoethanol, pH 7,4), 0,2 mg/mL Streptavidin Lösung, 1 mg / mL Bovine Serum Albumin (BSA) und 100 pM Biotin-λ-DNA-Lösung in vier Stauseen, dass jeweils ein Tygon-Schlauch mit einem Magnetventil-Wert verbunden und eine PEEK-Schlauch durch Sleeven den Tygon-Schlauch über die kleineren PEEK Rohr (ein weiteres Tygon Schlauch verbunden verhindert Rückfluss von Reagenzien). Entgasen von Kleinmengen des Puffers durch Übernachtung Exposition, Vakuum oder kürzeren Exposition gegenüber Vakuum unter Rühren (bis Bläschen nicht mehr sichtbar sind).</li>
	<li>PEEK-Schläuche des leeren Puffer Reservoirs in einer Bucht Loch der Durchflusszelle einfügen Prime den Kanal fließt in leeren Puffer, und drei andere PEEK-Schlauch In Saugbohrungen ist der Luftdruck angetrieben von Energiefluss jedes Reagenz durch Magnetventile gesteuert und vollautomatisch über ein Computer-Skript einfügen. Achten Sie darauf, keine Luft Blasenbildung im Kanal zu induzieren.</li>
	<li>Schließen Sie ein Tygon-Schlauch mit einer kurzen PEEK Schläuche aus der Austrittsöffnung zu einem Abfallbehälter. Der kurze Blick Schlauch am Ausgang hilft Luft Blasenbildung während der Infusion zu unterdrücken, durch die Aufrechterhaltung der Überdruck im Inneren des Kanals.</li>
	<li>Tethering Biotin-λ-DNA-Moleküle zu einer Strömung Kanal Oberfläche.
	<ol><li>Flow in 0,2 mg/mL Streptavidin Lösung, 5 min inkubieren und fließen dann in leere Puffer zum Auswaschen der ungebundenen Streptavidin.</li>
		<li>Durchfluss bei 1 mg/mL BSA-Lösung 1 min inkubieren und fließen dann in leere Puffer zum Auswaschen der ungebundenen BSA. 
		Hinweis: BSA weiter unterdrückt DNA und Probe Adsorption an der Oberfläche.</li>
		<li>Flow in 100 pM Biotin-λ-DNA-Lösung, 10 min inkubieren und fließen dann in leere Puffer zum Auswaschen der ungebundenen DNAs. 
		Hinweis: Nachdem die DNA an die Oberfläche gebunden ist, vermeiden Sie schnelle fließt die gefesselte DNA-Moleküle beschädigt.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Um die Qualität der funktionalisierten Deckglas, fließen in DNA Färbung Farbstoff wie Sytox orange unter der Assay-Bedingungen verwendet werden (siehe 4.6 unten), und starten Sie Fluoreszenz imaging unter 532 nm Laser Beleuchtung. 
	Hinweis: Die Qualität der funktionalisierten Deckglas ist in der Regel gut, und die Dichte der Strömung gestreckt DNA-Moleküle wird hoch sein. Es ist wichtig, hochdichte der Fluss erstreckte sich DNA-Moleküle haben, dass DNA-Bindung und Schiebe/1D Verbreitung Ereignisse beobachtet werden können.</li>
	<li>Feinabstimmung den TIRF Winkel zum besten Signal Rauschabstand von Bildern der gestreckten DNA-Moleküle ( Abbildung 1-d) zu erreichen.</li>
	<li>Bahnen der einzelne Moleküle DNA, voran aufzeichnen wiederholen Sie die Schritte 4.2-4.4 in einen neuen Kanal (ohne DNA Farbstoff Färbung), dann ziehen bereits entgast Sub-nanomolaren Fluorophore beschriftet Moleküle mit einer genug hohen Durchflussrate mithilfe einer Spritzenpumpe und sammeln Sie Zeitraffer Fluoreszenzbilder mit einer Frame-Rate von 100 Hz. 
	Hinweis: Eine Durchflussmenge entspricht einem Weissenberg-Zahl (Wi: die dimensionslose Produkt die längste Polymer-Relaxationszeit - ca. 0,2 s für λ-DNA- und die Scherrate - die Veränderung der Strömungsgeschwindigkeit mit Abstand von der Oberfläche des Deckglases) von 500 innerhalb der Kanal wird für die Einzelmolekül-Bildgebung mit einer Frame-Rate von 100 Hz 21 empfohlen.
	<ol><li>Sammeln 10.000 Bilder in einem Field Of View (FOV), einen Film zu produzieren und ähnliche Filme aus mehreren (in der Regel zehn) FOVs pro Probe zu sammeln. 
		Hinweis: Die Dichte der Partikel in einem FOV sollte weder zu hoch - das wird Datenanalyse erschweren, indem man Objektzuordnung in Frames nicht eindeutig noch zu niedrig - die zu geringe Auftreten von Einzelmolekül-Veranstaltungen auf DNA führen könnte.</li>
		<li>Die Beleuchtungsintensität so optimieren, dass Moleküle gebunden an das Deckglas Oberfläche sind schnell Foto-gebleicht, Hintergrund zu unterdrücken, während Moleküle diffundieren auf DNA nicht vorschnell gebleicht werden, so dass längere Trajektorien erkannt werden können. 
		Hinweis: Wir verwenden in der Regel 200-800 W/cm 2 Leistungsdichte in der FOV.</li>
	</ol></li> <li>Am Ende des Schrittes 4.6 Infusion DNA Farbstoff Färbung zu bestätigen, dass DNA-Moleküle noch Strömung gestreckt werden können.</li>
	<li>Laufen sowohl positive als auch negative Kontrollproben. 
	Hinweis: Eine gute positive Kontrolle ist ein Tetrapeptid, TetraMethylRhodamine (TMR)-KRRR (TMR ist gekoppelt an das N-terminale Amin) hat eine mittlere 1D Verbreitung konstante 10,5 ± 0,7 (Standardfehler) M (bp- 2/s) bei neutralem pH 11. Eine gute Negativkontrolle ist beschriftete Proben von Interesse in Testpuffer in einem Kanal zu messen, die hat keine DNA angebunden, wo keine Diffusion auf DNA-Aktivität erkannt werden sollten.</li>
</ol> 5. Datenanalyse: Hinweis: eine benutzerdefinierte Einzelkorn-Tracking-Software wird verwendet, um die Bahnen der einzelnen Moleküle diffundieren entlang DNA erkennen und schätzen Verbreitung Konstanten. Diese Software ermittelt zunächst Zentroid Positionen der einzelnen Partikel mit hoher Genauigkeit, Partikel, die auf das Deckglas Oberfläche geklebt sind identifiziert und dann links Partikel in verschiedenen Frames Time-Lapse Trajektorien bilden. Aus diesen Bahnen werden die 1D Verbreitung konstanten geschätzt.
<ol><li>Zur Datenanalyse zu starten, öffnen Sie eine scripting Software (siehe Tabelle der Materialien) und gehen Sie zum Verzeichnis der einzelnen Partikel tracking-Software. Öffnen Sie das Skript mit dem Namen &#34; largedataprocess3.m &#34;. Ein wichtiger Parameter definiert werden, ist der Schwellenwert für einzelne Partikeldetektoren.</li>
	<li>Zu bestimmen, die optimale Schwellwert, laufen die &#34; Determine_threshold_value.m &#34; Skript. Dieses Skript zeigt wie der Schwellenwert einzelner Partikeldetektoren auswirkt. Nach der Bestimmung des optimalen Schwellenwerts, laufen die &#34; largedataprocess3.m &#34; Skript</li>
	<li>Nach Abschluss der einzelnen Partikels tracking-Analyse, filtern die rohen Flugbahnen durch Ausführen der &#34; Trajectory_filtering.m &#34; Skript. Eine grafische Benutzeroberfläche (GUI) basiert der Filterung Schritt zu visualisieren.</li>
	<li>Auf die GUI-Panel setzt die minimale Verschiebung entlang DNA, MinXDisp, auf 2 Pixel soll die maximale Verschiebung quer zur DNA, MaxYDisp, 2 Pixel die minimale Anzahl der Frames, MinFrames, auf 10 festgelegt; minimale Anzahl der Staaten von Triplett, MinTriplets, um 10; Geben Sie die minimale Diffusion konstante entlang DNA, D_par, 0; Geben Sie die maximale geschätzte Verbreitung Konstante, DNA, D_trans, auf 10 M (bp 2) S -1 quer; der minimale statistische Parameter, Chi 2 _stat auf-5 festgelegt; Legen Sie das minimale Verhältnis der Verschiebung entlang der DNA, die quer zur DNA, MinX/Y, 2. 
	Hinweis: Alle rohe Flugbahnen, die diese Filterung Parameter übergeben sind in Tabelle 1 aufgeführt, und diejenigen, die nicht in Tabelle 3 aufgeführt sind.</li>
	<li>Klicken Sie auf eine Flugbahn Nummer in der Tabelle 1, die Flugbahn wird in Grafik 1 verdrängt &#38; 2. Klicken Sie auf die &#34; Play &#34; der rohen Fluoreszenzbilder abzuspielen. Klicken Sie auf die &#34; Add_to_Table2 &#34;, die Flugbahn als ein einzelnes Molekül Schiebe-Flugbahn zu identifizieren. Am Ende werden alle Trajektorien zu Tabelle2 hinzugefügt gespeichert werden, beim Schließen der GUI.</li>
	<li>, Berechnen Sie die durchschnittliche Verbreitung konstanten, führen Sie das Skript &#34; Calculate_mean_diffusion_constant.m &#34;. Die durchschnittliche Verbreitung konstante beläuft sich aus der Menge der Flugbahnen, die haben alle Filter Schritte bestanden und wurden hinzugefügt, Tabelle 2.</li>
</ol>

<ol>
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Broad Institute können wählen, Patentanmeldungen, die Aspekte der hier vorgestellten Arbeit enthalten.

Beim Umschalten von der traditionellen zweistufigen Deckglas Funktionalisierung Reaktion Protokoll auf eine einstufige Reaktion Protokoll, bemerkten wir, dass die Zuverlässigkeit des Deckglases Funktionalisierung deutlich verbessert wird. Wie die praktische Gesamtzeit für Deckglas Vorbereitung weniger als 30 min ist, empfehlen wir bereitet frische Deckgläsern jeden Tag Einzelmolekül-Bildgebung geplant ist. Um die Verschlechterung von Silan-PEG-Biotin zu minimieren, sollte das Reagenz regelmÄÑig und abgelegt unter N2 Trockengas bei-20 ° C nach Erhalt. Hier verwenden wir keine PEG-Moleküle, die produzieren -COO– oder -CH3 terminal Gruppen, die in den letzten20verwendet wurden. Die negativen Ladungen von -COO– und die hydrophoben -CH3 Gruppen wurden genutzt, um unspezifische Adsorption von DNA-Molekülen und spezifische Proteinproben bzw. an die Oberfläche zu verhindern. Wir beobachten sehr geringe Oberfläche Adsorption von kleinen Peptid Proben auf der Biotin-terminierte PEG Oberfläche, während Silan-PEG-COOH und/oder Silan-PEG-CH3 für Tests von bestimmten Proteinproben nützlich sein könnte oder wenn Bedingungen Test (z.B. pH &#60; 7,5) Förderung der DNA-Oberflächen-Wechselwirkungen.
Die Verlagerung von Glas-Folie-Durchflusszellen PDMS Flow Zellen beschleunigt den Fluss Zelle-Bau und ermöglicht die einfache Integration von mehreren Kanälen. Oft konstruieren wir acht Kanäle pro Durchflusszelle acht unabhängige Experimenten pro funktionalisierten Deckglas zu ermöglichen. Durchsatz pro Deckglas weiter zu steigern, könnte sogar größere Anzahl von Mikro-fabrizierten Kanäle verwendet werden.
Es ist ratsam, zu verhindern, dass Luft Blasenbildung im Inneren des Kanals zu jedem Zeitpunkt nach der Erstbefüllung. Luftblasen verursachen in der Regel keinen Verlust der gefesselte DNAs (obwohl dies möglich ist), sondern eher Fluss gestört und möglicherweise verursachen DNAs an das Deckglas halten. Puffer Entgasung und die Zugabe von kleinen Tensid Mengen sind in der Regel wirksam verhindern Blasenbildung innerhalb der Schläuche und Flow-Kanal. Versuchen Sie in Fällen, wo Luftblasen in das Rohr eingeführt werden, die Bläschen unter eine langsame Strömung durchspülen und stellen Sie sicher, dass sie nicht durch die Region fließen wo DNAs angebunden sind.
Eine schlanke und effiziente Datenanalyse-Software ist von entscheidender Bedeutung, durch die riesige Menge an Daten generiert. Wir sammeln in der Regel 700.000 hochauflösende Bilder von Messungen auf einer Messzelle, die unsere benutzerdefinierte Einzelkorn-Tracking-Software innerhalb eines Tages auf einem Desktop-Computer mit einem Quadcore-Prozessor und 32 Gb Speicher verarbeitet werden können. False-positive-Rate 1D Verbreitung Flugbahnen von der Software (Schritt 5.5) zu erkennen ist Probe abhängig und kann ziemlich niedrig da: 1) die Dichte der einzelnen Partikel in das Blickfeld ist niedrig genug, so dass es etwas Mehrdeutigkeit Teilchen ganz Frames (verbindet Proteinproben sind im Allgemeinen anfälliger für unspezifische Adsorption auf das Deckglas als Peptid Proben, und somit der Puffer und die Leistungsdichte für jedes Protein probieren muss optimiert werden); (2) das Signal Rauschabstand von einzelnen Partikeln ist hoch genug, so dass die Wahrscheinlichkeit falsch-Identifikation der Partikel gering ist. Doch die Software kann gelegentlich Fehler machen, und wir empfehlen manuelle Inspektion der Daten mit dem mitgelieferten GUI zur Bewertung der Softwareleistung. In einer Anwendung, die besonders empfindlich auf falsch-Positive Flugbahn Erkennung Prozess-Parameter einschließlich der Schwellenwert, MinFrames, MinTriplets und Chi2_stat stringenter auf Kosten der geringeren Empfindlichkeit für wahre Bindung einstellbar Veranstaltungen und potenziell höhere statistische Verzerrungen bei der Flugbahn Identifikation. Wir hier teilen und unsere Einzelkorn-Tracking-Software mit der Hoffnung auf Hilfe für Daten-Analyse-Methoden zu standardisieren und zur Diskussion über best Practices zu beschreiben.
In unserem Protokoll, die kontinuierlichen Fluss erfordert während der Bildgebung um den gestreckten Zustand der DNA Schablone Moleküle zu erhalten, könnte der Flüssigkeitsströmung den Transport einiger Proteine entlang DNA-Templates bias, wenn sie durch einen hopping-Mechanismus diffundieren oder der hydrodynamischen Radius der beschrifteten Fluorophor ist große22,23. Während solche Vorurteile gemessen und in die meisten Datensätze korrigiert werden kann, der Transport von Proteinen mit einer kleinen Fluorophore beschriftet und Verbreitung durch einen Schiebemechanismus ist nicht in der Regel voreingenommen nachweisbar Maße von Flow2,4, 24. Insbesondere wurde die Auswirkungen der Strömungsgeschwindigkeit auf den Transport von Proteinen entlang DNA verwendet, die Mechanismen der Verbreitung entlang DNA23Protein zu studieren. A eng im Zusammenhang mit alternativer Ansatz, die es Messungen in Ermangelung des Flusses ermöglicht nutzt DNA-Templates mit Biotin an beiden Termini, die vorübergehend im Fluss gestreckt sind und angebunden durch beide Enden auf dem Deckglas so, dass die DNA-Moleküle bleiben ein Erweiterte Konfiguration25,26,27,28der Strom ausgeschaltet ist. Die Doppel-Tether-Methode hat den Vorteil, dass strömungsfreien Transport Experimente aber erfordert eine Änderung der beiden Enden der DNA-Vorlage Moleküle, sorgfältige Flusssteuerung in Anbindehaltung und charakterisieren die Abstände zwischen den beiden Standorten angebunden. Darüber hinaus muss die Auswirkungen der heterogenen Spannungen und DNA Konformationsänderungen Dynamik über DNA-Moleküle auf der Einzelmolekül-Assay bewertet werden.
Insgesamt neben dem Studium 1D Diffusion von Molekülen entlang DNA, als berichtet Einzelmolekül-Assay profitieren viele in-vitro- biochemischen und biophysikalische Studien Ebene einschließlich DNA Einzelmolekül Ziel Suchprozesse durch Proteine, enzymatischen Aktivitäten auf DNA und mehr.
Fehlerbehebung
Problem 1: Die Strömungskanäle auslaufen.
Lösung: Stellen Sie zunächst sicher, dass die Gestaltung der Strömungskanäle mindestens 1,5 mm Rand zur Abdichtung rund um und zwischen den Kanälen ermöglicht; und dann, während der Montage der Messzelle, stellen Sie sicher, dass Kontaktflächen zwischen dem Deckglas, Doppel-Klebeband und PDMS-Platte sind flach, trocken und frei von Schmutz, dass der Druck angewendet, um die Dichtung zu bilden einheitliche, und der Schweißvorgang wird bei Raumtemperatur durchgeführt.
Problem 2: Die Dichte der gefesselte DNAs ist zu niedrig.
Lösung: Dieses Problem entsteht, wenn die PEG Funktionalisierung Effizienz gering ist oder die DNA-Moleküle sind nicht mit Biotin funktionalisiert. Aus unserer Erfahrung, die Dichte der gefesselte DNA sollte so hoch für &#62; 90 % von den Deckgläsern zubereitet aus frischen oder Silan-PEG-Biotin Reagens ordnungsgemäß gelagert. In Fällen wenn die Dichte der gefesselte DNA mit einem bewährten Batch von Biotin-λ-DNA niedrig ist, versuchen Sie, Steigerung der Konzentration von Silan-PEG-Biotin während PEG Funktionalisierung und Konzentrationen von Streptavidin und Biotin-λ-DNA während DNA Anbindehaltung. Wenn dies fehlschlägt, ersetzen Sie die PEG und Streptavidin Reagenzien.
Problem 3: DNAs halten Sie sich an das Deckglas eind kann nicht durch Strömung gedehnt werden.
Lösung: Dieses Problem kann auch entstehen, wenn die PEG Funktionalisierung Effizienz gering ist und wird durch niedrige Assay pH verschärft. Versuchen Sie fließt in mehr BSA oder Erhöhung des pH-Werts (zB auf 8.0) zu helfen, DNA-Adsorption an der Oberfläche (Schritt 4.3.2) zu unterdrücken. Wenn DNA-Adsorption eine anhaltende Problem unter einer bestimmten Assay-Bedingung ist, versuchen Sie auch bis zu 90 % Silan-PEG-COOH während PEG Funktionalisierung.
Daten-Analyse-Hinweise:
Wir verwenden benutzerdefinierte Einzelkorn-Tracking-Software, um Bahnen der einzelnen Moleküle diffundieren entlang DNA, von identifizieren die ihre 1D Verbreitung konstanten, D1 geschätzt. Um die Datenanalyse zu verbessern, haben wir die radiale Symmetrie Algorithmus18 zur Lokalisierung der Partikel und der Kovarianz-basiertes Kalkulationstool19 für die Schätzung der 1D Verbreitung konstanten, die Datenanalyse ohne dramatisch beschleunigt Genauigkeit. Wir zuvor validiert die Individualsoftware durch die Analyse von simulierten Daten11. Die wichtigsten Schritte sind nachfolgend beschrieben.
Teilchenidentifikation:
Dieser Schritt ist für die Erkennung und Segmentierung Partikel - Beugung begrenzte Flecken - Hintergrund. Erstens räumlich Bandpass-filtern die Bilder verbessern das Signal von Partikeln im 3-5 Pixelbereich (entspricht der Größe der Point-Spread Funktion in unserem System) und dann Schwelle anhand der Intensität (siehe Skript: spt2_SD_sandbox.m).
Schwerpunkt-Zuordnung
Segmentierung des Bildes lokalisiert nur Moleküle auf Pixel-Ebene räumliche Auflösung. Um Moleküle zu viel höhere Präzision zu lokalisieren, beschäftigen Sie die radiale Symmetrie Superresolution Algorithmus18 Bilder gefiltert wie oben beschrieben. (Diese Methode basiert auf einer analytischen Berechnung und rechnerische Belastung im Vergleich zu anderen beliebten präzise Methoden wie 2D "glockenförmig" Montage erheblich reduziert (siehe Skript: spt2_SD_sandbox.m).)
Particle tracking:
Um die Flugbahn eines Teilchens durch die Zeit zu verfolgen, müssen wir die gleichen Partikel wieder erkennen, wie sie zwischen den Rahmen bewegen. Wir betrachten die Einleitung, blinken und Beendigung Stadien Komponenten eine Flugbahn. Wir beschränken die Verknüpfung der Partikel im aktuellen Frames für diejenigen, die in vorherigen Frames durch die maximale Verschiebung erlaubt pro Frame. In Fällen wo mehrere Verbindungen möglich sind, der Jonker-Volgenant-Algorithmus wird verwendet, um Global optimale Verknüpfung Sätze ergeben (siehe Skript: traceTraj4_kx.3.m).
D1-Einschätzung:
Um D1-Werte von Trajektorien abschätzen zu können, verwenden wir die Kovarianz-basierten Schätzer (CVE)19. Basierend auf eine analytische Berechnung, diese Methode ist mehr rechnerisch effizient und statistisch strenger als andere gängigen Methoden wie die Rückbildung der mittleren quadratischen Verschiebungen (siehe Skript: runspt5_SD.m).
Flugbahn zu filtern:
Einige Bahnen Artefakte wie Anbindung an Oberfläche gebundene Moleküle enthalten und müssen entfernt werden. Wir implementiert verschiedene Funktionen wie minimale Verschiebung parallel zur DNA, maximale Verschiebung quer zur DNA, minimale Länge der Flugbahn, minimale Anzahl von Triolen in Folge erkannt Positionen und minimale Wahrscheinlichkeitsergebnis (siehe Xiong Et al.,11 Definition), kann gefiltert werden, um einen minimal voreingenommene Satz von Trajektorien Moleküle diffundieren auf DNA dar zu isolieren (siehe Skript: sptViewFig2_update3x.m).

Ein altes Problem in der Biologie ist wie körpereigene Proteine, die auf spezifische Handeln stellen im Genom finden ihre DNA Ziele schnell genug für den Organismus zu überleben und wirksam auf seine Umwelt reagieren. Studien in den vergangenen vierzig Jahren vorgeschlagen und weitgehend Unterstützung, die die Hypothese, dass die Kinetik der DNA durch ein Protein Suche gezielt durch beschleunigt werden kann erleichterte Diffusion, in dem das Protein zwischen 3D Diffusion in der Masse und 1D Diffusion (einschließlich wechselt Rutschen und hüpfen Prozesse) entlang des DNA-1. Es ist nun bekannt, dass viele Proteine, die in der Genregulation, Nukleinsäure-Stoffwechsel und andere Prozesse in der Lage des Gleitens auf DNA-2,3,4,5,6,7 ,8,9. Neuere Studien berichtet darüber hinaus, dass sogar kleine Peptide binden an und schieben Sie auf DNA, mit der Fähigkeit, eine Ladung tragen können; zum Beispiel ein Eiweißmolekül oder PCR Primer entlang DNA-10,11,12,13,14.
In den letzten 15 Jahren hat Einzelmolekül Fluss-stretching Assay verbreitet, Bindung und Diffusion von Molekülen entlang DNA2,15,16zu studieren. Bei dieser Art des Tests, Biotinylierte doppelsträngige DNA-Moleküle auf der Oberfläche immobilisiert sind und eine laminare Strömung gilt für Durchfluss dehnen die DNA. Die &#62; 80 % gedehnt DNAs dienen als räumlich erweiterte Vorlagen für die Untersuchung von Bindung und Transport Aktivität von Molekülen mit Fluorophore beschriftet wo werden die Bahnen der einzelnen Moleküle entlang DNA durch Time-Lapse Fluoreszenz-Bildgebung verfolgt. In unserer Implementierung optimiert hinsichtlich Reproduzierbarkeit und Benutzerfreundlichkeit, dieser Test besteht aus fünf Hauptschritte: Vorbereitung der Biotin-λ-DNA, Deckglas Funktionalisierung, Flow Zelle Bau, Fluoreszenz-Bildgebung und Datenanalyse. In früheren Protokollen17waren Glasdeckgläser funktionalisiert durch erste reagierenden mit (3-Aminopropyl) Triethoxysilane (APTES) und dann mit Amin-reaktive Polyethylenglykol (PEG) Reagenzien (z. B. NHS-PEG-Biotin) um eine PEG Schicht bilden, die widersteht unspezifische Adsorption von Assay-Komponenten auf dem Deckglas Oberfläche. Die Qualität der funktionalisierter Deckgläsern hing weitgehend von der Qualität der PEG Reagenzien und Reaktionsbedingungen bei jedem Schritt. Unser Protokoll beschreibt eine vereinfachte Funktionalisierung Protokoll und Multiplex-Flow Zelle Konstruktion erfordert keine flüssigen Klebstoff oder Aushärtungszeit auf die Tag-Durchflusszellen montiert. Wir beschreiben auch eine schlanke und robuste Daten Analyse Verfahren11 , die rechenintensive Regression Schritte beseitigt durch die Anwendung einer radiale Symmetrie-Methode für Zentroid Lokalisierung18 und eine Kovarianz-basierte diffusion konstante Schätzer19.
Hier berichten wir eine einfache, robuste und Hochdurchsatz-Molekül fließen stretching Assay-Umsetzung mit signifikanten Verbesserungen im Deckglas Funktionalisierung, Flow-Zelle-Bau und Datenanalyse. Unter anderem entwickelten wir eine einstufige Deckglas Funktionalisierung Protokoll, in dem sauberen und trockenen Deckgläsern direkt mit Silan-PEG-Biotin reagieren. Dieses Protokoll vereinfacht die Vorbereitung Deckglas und verbessert die Zuverlässigkeit der Qualität der funktionalisierten Oberflächen im Vergleich zu den standard zweistufige Reaktion Protokoll. Wir beschreiben die Verwendung von so funktionalisiert Deckgläsern mit Mehrkanal PDMS Durchflusszellen, die robuste Schlauchverbindungen erfolgen ohne Leim zu ermöglichen. Diese Durchflusszellen weiter gehören mehrere computergesteuerte Einlässe für jede Kammer fließen die automatisierte Reagenz Stromfluss, Hands-on-Zeit während der Installation und erhöhte Assay Durchsatz zu verringern zu können.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="906">
	<tbody>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:249px;">Biotin labeled oligo, 5&#8217;-AGGTCGCCGCCC(A)20-biotin-3&#8217;</td>
			<td style="width:249px;">IDT</td>
			<td style="width:159px;">Custom oligo synthesis</td>
			<td style="width:249px;">Standard desalting purification is sufficient</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:249px;">&#955;-DNA</td>
			<td style="width:249px;">New England Biolabs Inc.</td>
			<td style="width:159px;">N3011S</td>
			<td style="width:249px;">Make aliquots and minimize freeze-thaw cycle number</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:249px;">T4 DNA ligase and ligation reaction buffer</td>
			<td style="width:249px;">New England Biolabs Inc.</td>
			<td style="width:159px;">M0202S</td>
			<td style="width:249px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:249px;">Amicon centrifugal filter tubes with NMWL of 100k Dalton</td>
			<td style="width:249px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:159px;">UFC510008</td>
			<td style="width:249px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">No. 1 glass coverslips</td>
			<td style="width:249px;">VWR</td>
			<td style="width:159px;">48393-106</td>
			<td style="width:249px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Pure ethanol</td>
			<td style="width:249px;">VWR</td>
			<td style="width:159px;">89125-186</td>
			<td style="width:249px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Potassium hydroxide pellets</td>
			<td style="width:249px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:159px;">P250-500</td>
			<td style="width:249px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Plasma cleaner, model No. PDC-32G</td>
			<td style="width:249px;">Harrick Plasma</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:249px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:249px;">Silane-peg-biotin</td>
			<td style="width:249px;">Nanocs</td>
			<td style="width:159px;">PG2-BNSL-5k</td>
			<td style="width:249px;">Store at -20oC in dry nitrogen gas</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">A CAD software</td>
			<td style="width:249px;">Autodesk</td>
			<td style="width:159px;">AutoCAD</td>
			<td style="width:249px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Double-adhesive tape</td>
			<td style="width:249px;">Adhesive Applications</td>
			<td style="width:159px;">8512-2-DP/DL</td>
			<td style="width:249px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:249px;">Tape cutter, model No. CE5000-40-CRP</td>
			<td style="width:249px;">Graphtec America</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:249px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">PDMS and crosslink reagent kit</td>
			<td style="width:249px;">R.S. Hughes</td>
			<td style="width:159px;">RTV615 CLEAR 010</td>
			<td style="width:249px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:249px;">Degassing chamber, model No. F42010-0000</td>
			<td style="width:249px;">BEL-ART Products</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:249px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Mixer, model No. ARV-310</td>
			<td style="width:249px;">Thinky</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:249px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:249px;">Hole puncher, Harris Uni-Cores, Size 0.5 mm</td>
			<td style="width:249px;">Harris Uni-Cores</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:249px;">This can be substituted with a manual biopsy punch with a similar needle size</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Tygon tubing</td>
			<td style="width:249px;">Cole Parmer</td>
			<td style="width:159px;">EW-06420-02</td>
			<td style="width:249px;">0.020&#34; ID, 0.060&#34;OD</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Peek tubing</td>
			<td style="width:249px;">Western Analytical</td>
			<td style="width:159px;">PK007-031-Y</td>
			<td style="width:249px;">0.007&#34; ID, 0.031&#34;OD</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Streptavidin</td>
			<td style="width:249px;">New England Biolabs Inc.</td>
			<td style="width:159px;">N7021S</td>
			<td style="width:249px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td style="width:249px;">New England Biolabs Inc.</td>
			<td style="width:159px;">B9000S</td>
			<td style="width:249px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Sytox orange nucleic acid stain</td>
			<td style="width:249px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:159px;">S11368</td>
			<td style="width:249px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Ti-E Microscope</td>
			<td style="width:249px;">Nikon</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td rowspan="5" style="width:249px;">Microscope, camera, objective, dichroic mirror and bandpass filter can be substituted for similar equipment</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:249px;">100x Objective, NA/1.49, CFI Apo TIRF</td>
			<td style="width:249px;">Nikon</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">CMOS camera</td>
			<td style="width:249px;">Hammamatsu</td>
			<td style="width:159px;">Orca Flash 4.0</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Dichroic mirror</td>
			<td style="width:249px;">Semrock</td>
			<td style="width:159px;">FF560/659-Di01-25x36</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Bandpass filter</td>
			<td style="width:249px;">Semrock</td>
			<td style="width:159px;">FF560/659-Di01-25x36</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:249px;">532 nm laser</td>
			<td style="width:249px;">Rayscience Innovation Limited, Shanghai</td>
			<td style="width:159px;">OEMLL-FN-532nm-C</td>
			<td style="width:249px;">Select wavelength to correspond to stain of choice</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Syringe pump</td>
			<td style="width:249px;">Chemxy</td>
			<td style="width:159px;">Fusion 200</td>
			<td style="width:249px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">TMR-KRRR, &#62;=85% purity</td>
			<td style="width:249px;">MIT Biopolymer lab</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:249px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:249px;">pVIc-Cy3B, HPLC purified</td>
			<td style="width:249px;">A gift from Dr. Walter Mangel at Brookhaven National lab</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:249px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Script programming software</td>
			<td style="width:249px;">MathWorks</td>
			<td style="width:159px;">Matlab</td>
			<td style="width:249px;"></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:249px;">* see parts list for solenoid valves, computer interface, and assembly instructions at: https://sites.google.com/site/rafaelsmicrofluidicspage/valve-controllers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a simple, robust, and high throughput single molecule flow stretching assay implementation for studying transport of molecules along dna

Wir beschreiben einen einfache, robuste und hohen Durchsatz Einzelmolekül Fluss-stretching Assay für das Studium 1D Diffusion von Molekülen entlang DNA. In diesem Test sind Glasdeckgläser in eine einstufige Reaktion mit Silan-PEG-Biotin funktionalisiert. Durchflusszellen entstehen durch ein Klebeband mit vorgestanzten Kanäle zwischen einem funktionalisierten Deckgläschen und ein PDMS-Platte mit Einlass und Auslass Öffnungen sandwiching. Mehrere Kanäle in einer Messzelle integriert sind und die Strömung von Reagenzien in jedem Kanal kann vollständig automatisiert werden, die deutlich erhöht den Durchsatz Assay und Hands-on-Zeit pro Assay reduziert. In jedem Kanal Biotin-λ-DNA sind auf der Oberfläche immobilisiert und eine laminare Strömung wird angewendet, um Fluss-die DNAs Stretch. Die DNA-Moleküle werden gedehnt &#62; 80 % ihrer Kontur Länge und dienen als räumlich erweiterte Vorlagen für die Bindung und den Transport Aktivität Eindringmittel beschrifteten Moleküle zu studieren. Die Bahnen der einzelnen Moleküle werden verfolgt von Time-Lapse Total interne Reflexion Fluoreszenz (TIRF) Bildgebung. RAW-Bilder werden analysiert, optimierte benutzerdefinierte Einzelkorn-Tracking-Software verwenden, um automatisch Bahnen der einzelnen Moleküle diffundieren entlang DNA erkennen und schätzen ihre 1D-Diffusion-Konstanten.

Abbildung 2a zeigt die erkannten Flugbahnen der pVIc-Cy3B (pVIc: GVQSLKRRRCF; Cy3B ist konjugiert, die Cystein-Reste) Moleküle diffundieren auf DNA in 2 mM NaCl-Puffer bei pH 6,5. Die Verbreitung von pVIc ist Bi-direktional und getrieben von ambient Wärmeenergie. Aus diesen Bahnen werden die 1D Verbreitung konstanten (D1-Werte) für jede Trajektorie geschätzt (siehe das Histogramm in Abbildung 2 b). Der Mittelwert D1 Wert dieser pVIc Konjugat ist sein 22,2 ± 0,9 (Standardfehler) M (bp2/s) von durchschnittlich jeder D1-Wert über Flugbahnen gewichtet nach der Anzahl der Triplett aufeinander folgende Position Forderungen in jeder Bahn berechnet.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55923/55923fig1.jpg"> 
Abbildung 1 : Vorrichtung zum Verfolgen von Bewegung der einzelnen Moleküle entlang DNA. (a) eine achtkanalige PDMS Mikrofluidik-Chip eingehalten einem funktionalisierten Deckgläschen auf die DNA kann angebunden werden, (mit USA Viertel für Skala Münze); (b) fließen Sie Zelle Zoom Schaltplan zeigt Fluss-gestreckten λ-DNA-Moleküle; (c) schematische Darstellung der TIRF Mikroskop und Flutsystem zur Dehnung DNA; (d) TIRF Bild der Flow-gestreckten λ-DNA; (e) TIRF Bild der pVIc-Cy3B (pVIc: GVQSLKRRRCF; Cy3B ist konjugiert, die Cystein-Reste) Moleküle gebunden an einen Fluss gestreckt λ-DNA. Diese Zahl wurde mit Erlaubnis2,12geändert. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55923/55923fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55923/55923fig2.jpg"> 
Abbildung 2 : Eindimensionale Diffusion von pVIc (GVQSLKRRRCF) entlang DNA. (a). Verbreitung der pVIc entlang erstreckte sich λ-DNA (137 Trajektorien) in 2 mM NaCl-Puffer bei pH 6,5. x(t) und y(t) sind die Verschiebungen entlang und quer zur λ-DNA. Gepunktete horizontale Linien zeigen fehlende Punkte aus Farbstoff zu blinken. (b). Histogramm der Diffusion Konstante, D1 für pVIc diffundieren entlang λ-DNA. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55923/55923fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Simple, Robust, and High Throughput Single Molecule Flow Stretching Assay Implementation for Studying Transport of Molecules Along DNA at JoVE.com

A Simple, Robust, and High Throughput Single Molecule Flow Stretching Assay Implementation for Studying Transport of Molecules Along DNA

Einfach, Robust und hohen Durchsatz Molekül fließen Stretching Assay-Implementierung für das Studium Transport von Molekülen entlang DNA

Dieses Protokoll zeigt einen einfache, robuste und hohen Durchsatz Einzelmolekül Fluss-stretching Assay für das Studium eindimensionale (1D) Diffusion von Molekülen entlang DNA.

We describe a simple, robust and high throughput single molecule flow-stretching assay for studying 1D diffusion of molecules along DNA. In this assay, ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biochemistry

8.0K Aufrufe.  Massachusetts Institute of Technology and Harvard Medical School. Dieses Protokoll zeigt einen einfache, robuste und hohen Durchsatz Einzelmolekül Fluss-stretching Assay für das Studium eindimensionale (1D) Diffusion von Molekülen entlang DNA.

Serie: A Simple, Robust, and High Throughput Single Molecule Flow Stretching Assay Implementation for Studying Transport of Molecules Along DNA

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the excitability of neurons. The subcellular distribution of these channels in pyramidal neurons of hippocampal area CA1 is regulated by tetratricopeptide repeat-containing Rab8b interacting protein (TRIP8b), an auxiliary subunit. Genetic knockout of HCN pore forming subunits or TRIP8b, both lead to an increase in antidepressant-like behavior, suggesting that limiting the function of HCN channels may be useful as a treatment for Major Depressive Disorder (MDD). Despite significant therapeutic interest, HCN channels are also expressed in the heart, where they regulate rhythmicity. To circumvent off-target issues associated with blocking cardiac HCN channels, our lab has recently proposed targeting the protein-protein interaction between HCN and TRIP8b in order to specifically disrupt HCN channel function in the brain. TRIP8b binds to HCN pore forming subunits at two distinct interaction sites, although here the focus is on the interaction between the tetratricopeptide repeat (TPR) domains of TRIP8b and the C terminal tail of HCN1. In this protocol, an expanded description of a method for purifying TRIP8b and executing a high throughput screen to identify small molecule inhibitors of the interaction between HCN and TRIP8b, is described. The method for high throughput screening utilizes a Fluorescence Polarization (FP) -based assay to monitor the binding of a large TRIP8b fragment to a fluorophore-tagged eleven amino acid peptide corresponding to the HCN1 C terminal tail. This method allows &#39;hit&#39; compounds to be identified based on the change in the polarization of emitted light. Validation assays are then performed to ensure that &#39;hit&#39; compounds are not artifactual.

The interaction between HCN channels and their auxiliary subunit has been identified as a therapeutic target in Major Depressive Disorder. Here, a fluorescence polarization-based method for identifying small molecule inhibitors of this protein-protein interaction, is presented.

Verfahren zur Identifizierung von niedermolekularen Inhibitoren des Protein-Protein-Wechselwirkung zwischen HCN1- und TRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

Forschung

Biochemie

High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule level in multiparameter fluorescence detection (MFD) mode is presented here. MFD maximizes the usage of all &#34;dimensions&#34; of fluorescence to reduce photophysical and experimental artifacts and allows for the measurement of interdye distance with an accuracy up to ~1 &#197; in rigid biomolecules. This method was used to identify three conformational states of the ligand-binding domain of the N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptor to explain the activation of the receptor upon ligand binding. When comparing the known crystallographic structures with experimental measurements, they agreed within less than 3 &#197; for more dynamic biomolecules. Gathering a set of distance restraints that covers the entire dimensionality of the biomolecules would make it possible to provide a structural model of dynamic biomolecules.

A protocol for high-precision FRET experiments at the single molecule level is presented here. Additionally, this methodology can be used to identify three conformational states in the ligand-binding domain of the N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptor. Determining precise distances is the first step towards building structural models based on FRET experiments.

Hochpräzisions-FRET auf Einzelmolekül-Niveau für die Bestimmung der Biomolekülstruktur

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages for identifying biologically active chemical structures that can modify complex phenotypes such as lifespan. Described here is a simple protocol for producing hundreds of 96-well culture plates with fairly consistent numbers of C. elegans in each well. Next, we specified how to use these cultures to screen thousands of chemicals for effects on the lifespan of the nematode C. elegans. This protocol makes use of temperature sensitive sterile strains, agar plate conditions, and simple animal handling to facilitate the rapid and high throughput production of synchronized animal cultures for screening.

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Here we describe a simple protocol for rapidly producing hundreds of nematode growth media agar, 96-well culture plates with consistent numbers of Caenorhhabditis elegans per well. These cultures are useful for the phenotypic screening of whole organisms. We focus here on using these cultures to screen chemicals for pro-longevity effects.

Eine einfache Methode zur chemischen Hochdurchsatz-Screening in Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

A High-Throughput Luciferase Assay to Evaluate Proteolysis of the Single-Turnover Protease PCSK9

Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 (PCSK9) is a single-turnover protease which regulates serum low-density lipoprotein (LDL) levels and, consequently, cardiovascular disease. Although PCSK9 proteolysis is required for its full hypercholesterolemic effect, the evaluation of its proteolytic function is challenging: PCSK9 is only known to cleave itself, undergoes only a single turnover, and after proteolysis, retains its substrate in its active site as an auto-inhibitor. The methods presented here describe an assay which overcomes these challenges. The assay focuses on intermolecular proteolysis in a cell-based context and links successful cleavage to the secreted luciferase activity, which can be easily read out in the conditioned medium. Via sequential steps of mutagenesis, transient transfection, and a luciferase readout, the assay can probe PCSK9 proteolysis under conditions of either genetic or molecular perturbation in a high-throughput manner. This system is well suited for both the biochemical evaluation of clinically discovered missense single-nucleotide polymorphisms (SNPs), as well as for the screening of small-molecule inhibitors of PCSK9 proteolysis.

This protocol presents a method to evaluate the proteolytic activity of an intrinsically low-activity, single turnover protease in a cellular context. Specifically, this method is applied to evaluate the proteolytic activity of PCSK9, a key driver of lipid metabolism whose proteolytic activity is required for its ultimate hypercholesterolemic function.

Ein High-Throughput Luciferase Assay Proteolyse von Single-Umsatz Protease PCSK9 bewerten

Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 (PCSK9) is a single-turnover protease which regulates serum low-density lipoprotein (LDL) levels and, ...

Single-Molecule Tracking Microscopy - A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules

Single-molecule localization microscopy probes the position and motions of individual molecules in living cells with tens of nanometer spatial and millisecond temporal resolution. These capabilities make single-molecule localization microscopy ideally suited to study molecular level biological functions in physiologically relevant environments. Here, we demonstrate an integrated protocol for both acquisition and processing/analysis of single-molecule tracking data to extract the different diffusive states a protein of interest may exhibit. This information can be used to quantify molecular complex formation in living cells. We provide a detailed description of a camera-based 3D single-molecule localization experiment, as well as the subsequent data processing steps that yield the trajectories of individual molecules. These trajectories are then analyzed using a numerical analysis framework to extract the prevalent diffusive states of the fluorescently labeled molecules and the relative abundance of these states. The analysis framework is based on stochastic simulations of intracellular Brownian diffusion trajectories that are spatially confined by an arbitrary cell geometry. Based on the simulated trajectories, raw single-molecule images are generated and analyzed in the same way as experimental images. In this way, experimental precision and accuracy limitations, which are difficult to calibrate experimentally, are explicitly incorporated into the analysis workflow. The diffusion coefficient and relative population fractions of the prevalent diffusive states are determined by fitting the distributions of experimental values using linear combinations of simulated distributions. We demonstrate the utility of our protocol by resolving the diffusive states of a protein that exhibits different diffusive states upon forming homo- and hetero-oligomeric complexes in the cytosol of a bacterial pathogen.

3D single-molecule localization microscopy is utilized to probe the spatial positions and motion trajectories of fluorescently labeled proteins in living bacterial cells. The experimental and data analysis protocol described herein determines the prevalent diffusive behaviors of cytosolic proteins based on pooled single-molecule trajectories.

Single-Molecule Tracking-Mikroskopie - Ein Werkzeug zur Bestimmung der diffusiven Zustände von zytosolischen Molekülen

Single-molecule localization microscopy probes the position and motions of individual molecules in living cells with tens of nanometer spatial and ...

DNA Sequence Recognition by DNA Primase Using High-Throughput Primase Profiling

DNA primase synthesizes short RNA primers that initiate DNA synthesis of Okazaki fragments on the lagging strand by DNA polymerase during DNA replication. The binding of prokaryotic DnaG-like primases to DNA occurs at a specific trinucleotide recognition sequence. It is a pivotal step in the formation of Okazaki fragments. Conventional biochemical tools that are used to determine the DNA recognition sequence of DNA primase provide only limited information. Using a high-throughput microarray-based binding assay and consecutive biochemical analyses, it has been shown that 1) the specific binding context (flanking sequences of the recognition site) influences the binding strength of the DNA primase to its template DNA, and 2) stronger binding of primase to the DNA yields longer RNA primers, indicating higher processivity of the enzyme. This method combines PBM and primase activity assay and is designated as high-throughput primase profiling (HTPP), and it allows characterization of specific sequence recognition by DNA primase in unprecedented time and scalability.&#160;

Protein binding microarray (PBM) experiments combined with biochemical assays link the binding and catalytic properties of DNA primase, an enzyme that synthesizes RNA primers on template DNA. This method, designated as high-throughput primase profiling (HTPP), can be used to reveal DNA-binding patterns of a variety of enzymes.

DNA-Sequenzerkennung durch DNA-Primase mit High-Throughput Primase Profiling

DNA primase synthesizes short RNA primers that initiate DNA synthesis of Okazaki fragments on the lagging strand by DNA polymerase during DNA replication. ...

A Semi-High-Throughput Adaptation of the NADH-Coupled ATPase Assay for Screening Small Molecule Inhibitors

ATPase enzymes utilize the free energy stored in adenosine triphosphate to catalyze a wide variety of endergonic biochemical processes in vivo that would not occur spontaneously. These proteins are crucial for essentially all aspects of cellular life, including metabolism, cell division, responses to environmental changes and movement. The protocol presented here describes a nicotinamide adenine dinucleotide (NADH)-coupled ATPase assay that has been adapted to semi-high throughput screening of small molecule ATPase inhibitors. The assay has been applied to cardiac and skeletal muscle myosin II's, two actin-based molecular motor ATPases, as a proof of principle. The hydrolysis of ATP is coupled to the oxidation of NADH by enzymatic reactions in the assay. First, the ADP generated by the ATPase is regenerated to ATP by pyruvate kinase (PK). PK catalyzes the transition of phosphoenolpyruvate (PEP) to pyruvate in parallel. Subsequently, pyruvate is reduced to lactate by lactate dehydrogenase (LDH), which catalyzes the oxidation of NADH in parallel. Thus, the decrease in ATP concentration is directly correlated to the decrease in NADH concentration, which is followed by change to the intrinsic fluorescence of NADH. As long as PEP is available in the reaction system, the ADP concentration remains very low, avoiding inhibition of the ATPase enzyme by its own product. Moreover, the ATP concentration remains nearly constant, yielding linear time courses. The fluorescence is monitored continuously, which allows for easy estimation of the quality of data and helps to filter out potential artifacts (e.g., arising from compound precipitation or thermal changes).

A nicotinamide adenine dinucleotide (NADH)-coupled ATPase assay has been adapted to semihigh throughput screening of small molecule myosin inhibitors. This kinetic assay is run in a 384-well microplate format with total reaction volumes of only 20 &#181;L per well. The platform should be applicable to virtually any ADP producing enzyme.

Eine semi-High-Throughput-Anpassung des NADH-gekoppelten ATPase-Assays zum Screening kleiner Molekülinhibitoren

ATPase enzymes utilize the free energy stored in adenosine triphosphate to catalyze a wide variety of endergonic biochemical processes in vivo that would ...

Production of Dynein and Kinesin Motor Ensembles on DNA Origami Nanostructures for Single Molecule Observation

Cytoskeletal motors are responsible for a wide variety of functions in eukaryotic cells, including mitosis, cargo transport, cellular motility, and others. Many of these functions require motors to operate in ensembles. Despite a wealth of knowledge about the mechanisms of individual cytoskeletal motors, comparatively less is known about the mechanisms and emergent behaviors of motor ensembles, examples of which include changes to ensemble processivity and velocity with changing motor number, location, and configuration. Structural DNA nanotechnology, and the specific technique of DNA origami, enables the molecular construction of well-defined architectures of motor ensembles. The shape of cargo structures as well as the type, number and placement of motors on the structure can all be controlled. Here, we provide detailed protocols for producing these ensembles and observing them using total internal reflection fluorescence microscopy. Although these techniques have been specifically applied for cytoskeletal motors, the methods are generalizable to other proteins that assemble in complexes to accomplish their tasks. Overall, the DNA origami method for creating well-defined ensembles of motor proteins provides a powerful tool for dissecting the mechanisms that lead to emergent motile behavior.

The goal of this protocol is to form ensembles of molecular motors on DNA origami nanostructures and observe the ensemble motility using total internal reflection fluorescence microscopy.

Produktion von Dynein und Kinesin Motor Ensembles auf DNA Origami Nanostrukturen für die Einzelmolekülbeobachtung

Cytoskeletal motors are responsible for a wide variety of functions in eukaryotic cells, including mitosis, cargo transport, cellular motility, and ...

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk population methods (Northern blot, PCR, and RNAseq) that measure mRNA levels lack the ability to provide information on cell-to-cell variation in responses. Precise single cell and allelic visualization and quantification is possible via single molecule RNA fluorescence in situ hybridization (smFISH). RNA-FISH is performed by hybridizing target RNAs with labeled oligonucleotide probes. These can be imaged in medium/high throughput modalities, and, through image analysis pipelines, provide quantitative data on both mature and nascent RNAs, all at the single cell level. The fixation, permeabilization, hybridization and imaging steps have been optimized in the lab over many years using the model system described herein, which results in successful and robust single cell analysis of smFISH labeling. The main goal with sample preparation and processing is to produce high quality images characterized by a high signal-to-noise ratio to reduce false positives and provide data that are more accurate. Here, we present a protocol describing the pipeline from sample preparation to data analysis in conjunction with suggestions and optimization steps to tailor to specific samples.&#160;

Single molecule RNA fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a method to accurately quantify levels and localization of specific RNAs at the single cell level. Here, we report our validated lab protocols for wet-bench processing, imaging and image analysis for single cell quantification of specific RNAs.

Einzelzellanalyse transkriptionell aktiver Allele mittels Einzelmolekül FISH

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...

A High-Throughput Enzyme-Coupled Activity Assay to Probe Small Molecule Interaction with the dNTPase SAMHD1

Sterile alpha motif and HD domain-containing protein 1 (SAMHD1) is a pivotal regulator of intracellular deoxynucleoside triphosphate (dNTP) pools, as this enzyme can hydrolyze dNTPs into their corresponding nucleosides and inorganic triphosphates. Due to its critical role in nucleotide metabolism, its association to several pathologies, and its role in therapy resistance, intense research is currently being carried out for a better understanding of both the regulation and cellular function of this enzyme. For this reason, development of simple and inexpensive high-throughput amenable methods to probe small molecule interaction with SAMHD1, such as allosteric regulators, substrates, or inhibitors, is vital. To this purpose, the enzyme-coupled malachite green assay is a simple and robust colorimetric assay that can be deployed in a 384-microwell plate format allowing the indirect measurement of SAMHD1 activity. As SAMHD1 releases the triphosphate group from nucleotide substrates, we can couple a pyrophosphatase activity to this reaction, thereby producing inorganic phosphate, which can be quantified by the malachite green reagent through the formation of a phosphomolybdate malachite green complex. Here, we show the application of this methodology to characterize known inhibitors of SAMHD1 and to decipher the mechanisms involved in SAMHD1 catalysis of non-canonical substrates and regulation by allosteric activators, exemplified by nucleoside-based anticancer drugs. Thus, the enzyme-coupled malachite green assay is a powerful tool to study SAMHD1, and furthermore, could also be utilized in the study of several enzymes which release phosphate species.

SAMHD1 is a deoxynucleoside triphosphate triphosphohydrolase with critical roles in human health and disease. Here we present a versatile enzyme-coupled SAMHD1 activity assay, deployed in a 384-well microplate format, that allows for the evaluation of small molecules and nucleotide analogues as SAMHD1 substrates, activators, and inhibitors.

Ein Hochdurchsatz-Assay mit enzymgekoppelter Aktivität zur Untersuchung der Wechselwirkung kleiner Moleküle mit der dNTPase SAMHD1

Sterile alpha motif and HD domain-containing protein 1 (SAMHD1) is a pivotal regulator of intracellular deoxynucleoside triphosphate (dNTP) pools, as this ...