Diese Arbeit wurde unterstützt von der National Institute of Deafness und anderen Kommunikationsstörungen Zuschüsse R01DC015824 (KMS) und T32DC00038 (Unterstützung SD), die Abteilung für Verteidigung gewähren W81XWH-15-1-0472 (KMS), die Bertarelli Foundation (KMS), die Nancy Sayles Day Foundation (KMS) und das Lauer Tinnitus Research Center (KMS). Wir danken Jessica E. Sagers, BA für aufschlussreiche Kommentare zum Manuskript.

Das Studienprotokoll wurde vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) von Massachusetts Eye und Ear genehmigt. Die Experimente wurden nach dem Ethikkodex der World Medical Association durchgeführt. 1. Vorbereitung der Dissektion <ol><li> Vorbereitung der chirurgischen Tabelle <ol><li> Verwenden Sie 70% Ethanol, um den chirurgischen Tisch zu desinfizieren. </li><li> Lege zwei unversöhnliche Vorbereitungspads neben dem Mikroskop auf. </li><li> Bereiten Sie das Instrumentenfach vor, einschließlich der hitze-sterilisierten Bedienschere, eines Skalpellgriffes, eines Mikromessers und einer Pinzette (jeweils zwei # 4 &amp; # 55). Legen Sie die Instrumententafel und eine 50 mm breitblättrige Petrischale auf eine nicht sterile Unterlage. </li><li> Erhalten Sie eine sterile # 15 Skalpell Klinge; Ein abdichtbarer Plastikbeutel oder -behälter (zur Entsorgung der Schlachtkörper im Einklang mit den institutionellen Richtlinien); Eis in einem Eimer; Und kalte, sterile Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS). Lege diese Gegenstände auf dieAndere nonsterile Pad </li><li> Übertragen Sie die HBSS in ein 50 ml Plastiklaborrohr und legen Sie es auf Eis. </li></ol></li><li> Vorbereitung der Kultur <ol><li> Bereiten Sie alle Materialien in einer laminaren Strömungshaube vor. Für jede vier Exemplare, setzen vier autoklavierte 10 mm runde Glasabdeckungen in die vier Einlagen der 35 mm 4-well Petrischale. </li><li> Für jede 4 Exemplare wird ein Gesamtvolumen von 300 μl, bestehend aus folgendem in einem Mikrozentrifugenröhrchen, vermischt: 10 μl Gewebeklebstoff, 285 μl NaHCO 3 und 5 μl NaOH. </li><li> 40 μl der resultierenden Lösung auf jeden Deckzettel geben und dort mindestens 20 min bei RT ablassen; Diese Lösung kann für mehrere Stunden auf dem Deckglas belassen werden, kann aber nicht O / N bleiben. </li><li> Legen Sie eine oder zwei 35 mm 4-well Petrischale in einer 10 cm Petrischale, um zwei Barrieren gegen Verschmutzung zu schaffen. </li><li> Bereiten Sie Kulturmedium mit 98% Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM), 1% N-2 und 1% Ampicillin (65 μl pro Vertiefung in einem (Mikro-) Zentrifugenröhrchen). Die Lösung vor 25 ° C auf 25 ° C erwärmen. </li></ol></li></ol> 2. Murine Cochlear Explant Dissection <ol><li> Enthauptung der neonatalen Maus <ol><li> Erhalten Sie eine 60-mm-Plastik-Petrischale und sprühen Sie 70% Ethanol in den Deckel, so dass die Oberfläche nass ist. </li><li> Gießen Sie kaltes HBSS aus dem Kunststoff-Laborrohr in den unteren Teil des 60-mm-Plastiks und die 50 mm klare Wand aus Glas-Petrischale. Lagern Sie das Plastiklaborrohr und beide Petrischalen auf Eis, um das Gewebe kalt zu halten, wann immer es nicht zerlegt wird. </li><li> Lege eine P3 - P5 - gealterte neonatale Maus auf Eis in einen Cutoff - Finger eines Latexhandschuhs und warte, bis die Hypothermie den Verlust des Bewusstseins (ca. 1-3 min) induziert. </li><li> Entkuppeln Sie die Maus schnell mit einer Arbeitsschere und entsorgen Sie den Körper in der versiegelbaren Plastiktüte. Setzen Sie den abgetrennten Neugeborenenkopf in die70% Ethanol im Deckel der 60 mm Plastik-Petrischale. </li></ol></li><li> Makroskopische Dissektion des Schläfenbeins <ol><li> Entfernen Sie die Haut des Schädels, indem Sie einen oberflächlichen Schnitt vom vorderen bis zum hinteren Ende (direkt über die Sagittalnaht) mit dem Skalpellblatt machen. </li><li> Schneiden Sie beide äußeren Gehörgänge mit dem Skalpellblatt und falten Sie die Haut nach vorne, um den ganzen Schädel auszusetzen. HINWEIS: Obwohl für dieses Schritt kein Dissektionsmikroskop benötigt wird, kann es für eine verbesserte Visualisierung verwendet werden. </li><li> Öffnen Sie den Schädel entlang der Sagittal Naht mit dem # 15 Skalpell Klinge. Achten Sie darauf, den Schädel zu schneiden, indem Sie die Klinge vorsichtig von vorne nach hinten nach oben bewegen und die Kompression der Cochleae vermeiden. HINWEIS: Der Schädel sollte in diesem Alter nicht verknöchert werden und sollte leicht schneiden. </li><li> Entfernen und verwerfen Sie die Schnauze, indem Sie einen vertikalen Schnitt direkt hinter den Umlaufbahnen mit dem # 15 Skalpell machenKlinge. HINWEIS: Der hintere Teil des Schädels sollte noch das Gehirn und die Cochleae enthalten. </li><li> Entsorgen Sie das Vorderhirn, Kleinhirn und Hirnstamm durch stumpfe Dissektion mit # 4 Pinzette. </li></ol></li><li> Mikroskopische Extraktion der Cochleae <ol><li> Stellen Sie das Mikroskop (6,5fache Vergrößerung) und die Lichtquelle ein, indem Sie die Pinzette unter den Geltungsbereich stellen und die Beleuchtung und den Fokus optimieren. </li><li> Legen Sie die beiden Hälften des Schädels in die 60 mm Plastik-Petrischale, die mit kaltem HBSS gefüllt ist. </li><li> Vollständig die Cochlea / e ausstellen, die als angrenzend an die umgebende Stapedialarterie (eine gewundene Arterie innerhalb des Schläfenbeins) identifizierbar ist, und das Orgel aus dem Schläfenbein mit Hilfe der # 4 Pinzette unverblümt trennen. </li><li> Übertragen Sie die Cochlea in die 50 mm, klarwandige, Petrischale mit Glasboden und legen Sie die Schale unter das Mikroskop. </li><li> Legen Sie die 60 mm Plastik Petrischale mit der anderen Hälfte des Schädels auf Eis. </Li&gt; <li> Entfernen Sie die Cochlea aus dem Vestibularsystem und zerlegen Sie sorgfältig die Cochlear-Otic-Kapsel (typisch knorpelig in diesem Alter) mit # 4 Pinzette. Verwenden Sie # 55 Pinzette für alle weiteren Schritte. </li></ol></li><li> Endschritte der Gewebeverarbeitung <ol><li> Weiter mit der Verarbeitung des Innenohrgewebes durch sorgfältiges Trennen des Spiralbandes an das Orgel von Corti aus dem Rest der Cochlea und dem Modiolus mit dem Mikromesser oder zwei Pinzetten. <ol><li> In den dunkleren, lichtdurchlässigen Bereich an der Felsspalte zwischen dem Spiralband und dem Haarzellenbereich schneiden und mit dem darauffolgenden Entfernen des Spiralbandes fortfahren, indem man ihn am grundsätzlichsten anfängt und ihn bei gleichzeitiger Verschiebung sanft abwickelt. </li></ol></li><li> Positionieren Sie die Probe, um eine längliche, sagittale Ansicht der Cochlea zu erhalten und die Cochlea in zwei bis drei Abschnitte unter Verwendung des Mikromessers zu schneiden, wobei diese Abschnitte als die apikale (mittlere) und b klassifiziert werdenAsal dreht sich Entfernen Sie das Gewebe überlegen und unterhalb der tatsächlichen Schicht von Haarzellen und Neuriten, um ein Cochlea-Explantatstück zu erreichen, das horizontal auf der Petrischale liegen kann. HINWEIS: Eine angemessene Größe für eine stabile Haftung an der Kulturschale ist etwa die Hälfte einer Cochlear-Umdrehung. </li><li> Entfernen Sie die Tectorialmembran, eine sehr dünne lichtdurchlässige Schicht, die dem Organ des Corti unmittelbar überlegen ist, indem Sie sie sanft mit einer Pinzette abschälen. </li><li> Entfernen Sie die Membran von Reissner, die den SGNs überlegen ist, indem Sie sie mit einer Pinzette auf beiden Seiten berühren und sie abschälen. HINWEIS: Entfernen Sie alle seitlich angeordneten beschädigten Haarzellen, indem Sie sie mit dem Mikromesser abschneiden. </li></ol></li></ol> 3. Übertragen von Exemplaren auf die Kulturplatten <ol><li> Entfernen Sie die 45 μl Gewebeklebstofflösung aus den vier Deckgläschen. Waschen Sie jeden Deckel mit 50 μl sterilem H 2 O. Aspirieren Sie das Wasser. </li><li> Hebe die 1-ml-Pipette auf. Die Pipettenspitze mit ca. 120 μl DMEM benetzen, um zu verhindern, dass die Probe an der Innenseite der Spitze anhaftet. </li><li> Übertragen Sie die Proben einzeln mit der 1-ml-Pipette. Pipettieren Sie maximal 70 μl aus der HBSS-gefüllten, kleinen, klarwandigen, mit Petritornen versehenen Petrischale und legen Sie die Probe zusammen mit der Flüssigkeit auf eine der 4 Inlays (vorbereitet mit Deckgläschen) in die 4-Well-Petrischale . </li><li> Überprüfen Sie unter dem Mikroskop (50fache Vergrößerung), dass sich die Probe in der richtigen Ausrichtung befindet. Stellen Sie sicher, dass der Bereich der Haarzellen, von dem die Tectorialmembran entfernt wurde, nach oben zeigt. Sicherstellen, dass die Basilarmembran zusammen mit dem beschnittenen, basalen Teil des Modiolus nach unten weist und an dem Deckglas haftet. <ol><li> Wenn die Probe bei der Inspektion umgedreht wird, legen Sie die HBSS ab, die in der Pipettenspitze in die Einlage verbleibt, und positionieren Sie das Stück, bis es richtig ausgerichtet ist. NEINTE: Dies verhindert, dass Haarzellen in Kulturmedium ohne strukturelle Unterstützung aus dem Deckglas schweben, was zu Degeneration führen könnte. </li></ol></li><li> Setzen Sie überschüssiges HBSS mit der 1-ml-Pipette ein. Warten auf 15 s. </li><li> 25 μl des vorbereiteten warmen Kulturmediums (98% DMEM, 1% N-2 und 1% Ampicillin) direkt auf die Probe pipettieren. Achten Sie darauf, das Exemplar nicht mit der Pipette zu berühren. Ersetzen Sie die inneren und äußeren Petrischalenabdeckungen und inkubieren Sie O / N bei 37 ° C. </li><li> Setzen Sie alle Lagerlösungen an ihre richtigen Stellen zurück, entsorgen Sie Schlachtkörper und Restmüll, dekontaminieren Sie den chirurgischen Tisch nach institutionellen Richtlinien ( z. B. mit Ethanol oder Hypochlorit), reinigen und autoklavieren Sie die Instrumente und entsorgen Sie die Scharfe im entsprechenden Behälter . </li></ol> 4. Hinzufügen von endgültigen Kulturmedien und Substanzen von Interesse ANMERKUNG: Cochlea-Explantate sind für 10-16 Stunden später bereit. <ol><li> Vorbereitung einer MischungVon 97% DMEM, 1% fötalem Rinderserum (FBS), 1% N-2 und 1% Ampicillin (65 μl pro Vertiefung in einem Mikrozentrifugenröhrchen, Erwärmen der Lösung auf 25 ° C vor Gebrauch). </li><li> Fügen Sie andere Substanzen für die Lösungen für die jeweiligen Behandlungsgruppen hinzu. Wenn fluoreszierende Substanzen zugegeben werden ( zB grün fluoreszierende Proteine ​​(GFP) -exprimierende Viren, wurde in einer neueren Publikation eine Konzentration von 10 10 GC Adeno-assoziierten Viren (AAVs) für 48 h in 50 μl) verwendet Licht. </li><li> Übertragen Sie die Cochlea-Explantat-haltigen Petrischalen aus dem Inkubator und legen Sie sie unter die laminare Strömungshaube. </li><li> Aspirieren Sie das alte Kulturmedium (ohne FBS) mit der Pipette aus den Inlays. </li><li> Fügen Sie 60 μl pro Vertiefung des vorbereiteten Warmkultur- (Behandlungs-) Mediums (97% DMEM, 1% FBS, 1% N-2, 1% Ampicillin und die interessierenden Stoffe) hinzu. </li><li> Legen Sie die Petrischale wieder in den Inkubator (37 ° C). </li><li> Ansicht rEgal unter dem Mikroskop, um Anzeichen einer Kontamination, zelluläre Migration oder Ablösung des Cochlea-Explantats zu identifizieren und Färbung nach maximal 7 Tagen durchzuführen. </li></ol> 5. Immunfluoreszenz - Tag 1 <ol><li> Vorbereitung der Blockierungslösung (94% Phosphat-gepufferte Saline (PBS), 5% normales Ziegen- oder Pferdeserum (NGS / NHS, abhängig von den sekundären Antikörpern) und 1% nichtionisches Tensid (siehe Tabelle der Materialien )) und Bestand Antikörper-Lösung (98,6% PBS, 1% NHS und 0,4% nichtionisches Tensid mit den jeweiligen Antikörpern). ANMERKUNG: Antikörper umfassen Kaninchen anti-Myo7A bei einer Konzentration von 1: 400+ (Myosin 7A, für innere und äußere Haarzellen) und Maus anti-TuJ1 1: 200+ (β-Tubulin, für SGNs) ODER Maus (IgG1) anti -CtBP2 1: 200+ (C-terminales Bindungsprotein, für Presynapse), Maus (IgG2a) anti-PSD95 1: 50+ (postsynaptische Dichte, für postsynapse) und Hühner anti-NF-H 1: 1000+ (Neurofilament, Für SGNs und Nervenfasern). &quot;+&quot; MeaNs &quot;oder höher&quot;. </li><li> Das Kulturmedium mit einer Pipette ausspülen. Achten Sie darauf, das Exemplar nicht zu berühren. </li><li> Unter der Laminar-Flow-Kapuze spülen Sie die Cochlea-Explantate zweimal mit sterilem PBS aus und legen die Exemplare für 5 min nach jeder Wäsche auf einen Shaker. </li><li> Fixieren Sie das Gewebe in 4% Paraformaldehyd (PFA - VORSICHT) für 20 min auf dem Shaker (unter der Kapuze). Aspirieren Sie die PFA. </li><li> Tragen Sie 60 μl PBS auf die Cochlea-Explantate und legen Sie die Petrischale auf einen Shaker für 5 min. Aspirieren Sie die PBS. Wiederholen Sie 3x. </li><li> Legen Sie die Cochlea-Explantate in eine präparierte Sperrlösung (94% PBS, 5% NHS und 1% nichtionisches Tensid) für 30 min auf Shaker. </li><li> Legen Sie die Cochlea-Explantate in eine vorbereitete Antikörper-Lösung (98,6% PBS, 1% NHS und 0,4% nichtionisches Tensid) mit den jeweiligen primären Antikörpern (Vortex vor Gebrauch) O / N auf einem Zähler bei RT. HINWEIS: Wickeln Sie die Petrischalen mit feuchten Papiertüchern ein, die in Plastikfolie eingeschlossen sind (oder Aluminiumfolie, wenn das hinzugefügte SolutIon enthält fluoreszierende Materialien wie GFP-exprimierende Viren), um das Geschirr feucht zu halten und die Verdampfung der Antikörperlösung O / N zu verhindern. </li></ol> 6. Immunfluoreszenz - Tag 2 <ol><li> Bereiten Sie den 4 &#39;, 6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) -Färbung (300 nM) vor und verwenden Sie die Stamm-Antikörper-Lösung, um die richtigen sekundären Antikörper-Mischungen zu erhalten, die komplementär zu den primären Antikörpern in Schritt 5.1 sind. (IgG1) 488 1: 200+ und Ziegen-Anti-Maus 568 1: 200+ ODER Ziegen-Anti-Maus (IgG1) 568 1: 1000+, Ziegen-Anti-Maus (IgG2a) 488 1: Und Ziegen-Anti-Huhn 647 1: 200+ ODER Phalloidin 568 1: 200+ (für innere und äußere Haarzellen)). </li><li> Ansaugen der primären Antikörperlösung. </li><li> Tragen Sie 60 μl PBS auf die Cochlea-Explantate und legen Sie die Petrischale auf einen Shaker für 5 min. Aspirieren Sie die PBS. Wiederholen Sie 3x. </li><li> Legen Sie die Cochlea-Explantate in die vorbereitete Antikörper-Lösung (98,6% PBS, 1% NHS und 0,4% nichtionisches Tensid) mit der ResPektive sekundäre Antikörper (Vortex vor Gebrauch) für 1,5 h auf einem Theke und vor Licht schützen. </li><li> Aspirieren Sie die sekundäre Antikörperlösung und spülen Sie die Cochlea-Explantate mit einem DAPI-Fleck aus (Platzieren auf einem Shaker für 1 Minute und dann aspirieren). </li><li> Tragen Sie 60 μl PBS auf die Cochlea-Explantate und legen Sie die Petrischale auf einen Shaker für 5 min. Aspirieren Sie die PBS. Wiederholen Sie 3x. </li><li> Verwenden Sie Pinzetten, um Deckgläser mit Proben aus der 4-Well-Platte zu entfernen, tauchen Sie sie in einen mit destilliertem H 2 O gefüllten Empfänger und trocknen Sie die Deckgläser, indem Sie sie vertikal mit Papiertüchern in Berührung bringen. </li><li> Legen Sie einen Tropfen Antifade-Montagemedium auf den Objektträger und umdrehen Sie die Deckgläser, um das nach unten gerichtete Gewebe in das Medium einzutauchen. </li><li> Dichtung des Deckglases mit klarem Nagellack, der den Rand umgibt (ohne die Probe unter dem Glas zu zerkleinern). Lassen Sie die Rutschen flach in einem überdachten Bereich weg von Licht für 15 - 20 min bis trocken und thSie in eine Schachtel legen oder unter dem konfokalen Mikroskop untersuchen. HINWEIS: Die Fluoreszenzfärbung wird am besten durch die Aufbewahrung der Objektträger bei 4 oder -20 ° C erhalten. </li></ol> 7. Konfokale Bildgebung <ol><li> Erhalten Sie einen Überblick und gezoomte Bilder für die Orgel der Region Corti, einschließlich Neuriten und SGNs. HINWEIS: Standardeinstellungen für den Imaging-Prozess: Format von 1.024 x 1.024 Pixeln, Geschwindigkeit von 400 Hz, Frame-Durchschnitt von 3, 20% Gesamt-Laserintensität und meist 20X und 63X Objektiv mit Öleintritt (potentiell kombiniert mit 2fachem Digitalzoom). Die Kanaleinstellungen für das DAPI-, Myo7A- und TuJ1-Färbeprotokoll sind oben skizziert: 405 5% DAPI, &quot;Smart Gain&quot; 766.8V, &quot;Smart Offset&quot; 0,0% - 488 15% Fluoresceinisothiocyanat (FITC), &quot;Smart Gain&quot; 622.2V , &quot;Smart Offset&quot; 0,0% - 561 13% Tetramethylrhomadinisothiocyanat (TRITC), &quot;Smart Gain&quot; 562.4V, &quot;Smart Offset&quot; 0,0%. </li><li> Fügen Sie die Bilder in einem Z-Stack mit demSoftware, um eine z-Achsenprojektion zu erhalten. </li></ol>

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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+sensory+stimulation+alters+the+molecular+make-up+of+glutamatergic+hair+cell+synapses+in+the+developing+cochlea.">Reduced sensory stimulation alters the molecular make-up of glutamatergic hair cell synapses in the developing cochlea.</a> Neuroscience. , 50-62 (2016).</li><li>Zinn, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Silico+Reconstruction+of+the+Viral+Evolutionary+Lineage+Yields+a+Potent+Gene+Therapy+Vector.">In Silico Reconstruction of the Viral Evolutionary Lineage Yields a Potent Gene Therapy Vector.</a> Cell Rep. 12 (6), 1056-1068 (2015).</li><li>Wu, Z., Yang, H., Colosi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+genome+size+on+AAV+vector+packaging.">Effect of genome size on AAV vector packaging.</a> Mol Ther. 18 (1), 80-86 (2010).</li><li>Shu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Adeno-Associated+Viral+Vectors+That+Target+Neonatal+and+Adult+Mammalian+Inner+Ear+Cell+Subtypes.">Identification of Adeno-Associated Viral Vectors That Target Neonatal and Adult Mammalian Inner Ear Cell Subtypes.</a> Hum Gene Ther. , (2016).</li><li>Kao, S. Y., Soares, V. Y., Kristiansen, A. G., Stankovic, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+TRAIL-DR5+pathway+promotes+sensorineural+degeneration+in+the+inner+ear.">Activation of TRAIL-DR5 pathway promotes sensorineural degeneration in the inner ear.</a> Aging Cell. 15 (2), 301-308 (2016).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Die Forscher müssen die Dissektionstechnik perfektionieren, bevor sie Experimente mit Cochlea-Explantaten durchführen. Haarzellen werden häufig während der Sezierungen, die früh in der Lernkurve durchgeführt wurden, beschädigt, und ein besonders problematisches Moment für ihre Integrität ist die Entfernung der tectorialen Membran, die ständige Hände, richtige Werkzeuge und Erfahrung erfordert. Um Zeit und Ressourcen zu sparen, sollte eine visuelle Kontrolle unter dem Sektionsmikroskop durchgeführt werden und möglicherweise beschädigte Bereiche beachtet werden. Anstatt teure primäre und sekundäre Antikörper zu verwenden, sind billigere Reagenzien wie Phalloidin für Vorversuche besser geeignet. Leicht beschädigte Explantate können potentiell noch als Kontrollen in bestimmten Experimenten (Analyse von nicht betroffenen Abschnitten) oder für die Prüfung neuer Kombinationen von Antikörpern verwendet werden. Die Übertragung der Exemplare ist auch besonders wichtig, denn man muss dafür sorgen, dass die StückeSind nicht umgedreht (&quot;schwimmende&quot; Haarzellen ohne die Führung des beschichteten Deckglases oft degeneriert). Eine zentrale Position auf dem Deckglas erleichtert alle weiteren Pipettierschritte. Für Negativkontrollexperimente mit neuartigen Verbindungen (die offensichtlich im Kulturmedium löslich sein müssen) ist es wichtig, das entsprechende Vehikel auf die Explantate anzuwenden und sich nicht ausschließlich auf unbehandelte Explantate zu konzentrieren. Zum Beispiel, wenn ein kommerzielles Medikament Natriumcitrat zusätzlich zu dem aktiven Bestandteil enthält, dann sollte Natriumcitrat zu den negativen Kontroll-Cochlea-Explantaten hinzugefügt werden, da Natriumcitrat selbst eine Wirkung haben könnte. Einschränkungen für die Verwendung von Cochlea-Explantaten beinhalten die Tatsache, dass diese organotypischen Kulturen typischerweise von jungen Welpen abgeleitet sind, die sich noch postnatalen Entwicklungsänderungen unterziehen und dass es einen fehlenden ionischen Gradienten über das Explantat gibt, was für normal istIn vivo hören Allerdings ist der Nutzen des Protokolls in einer kürzlich erschienenen Publikation zu AAVs 18 zwingend dargestellt. Während diese Gruppe von Vektoren auf etwa 4,7 kb Verpackungskapazität beschränkt ist, ist sie zu einer wichtigen Ressource für die Therapie mehrerer menschlicher Syndrome geworden. Mit dem Cochlea-Explantat-Modell zeigte die oben genannte Publikation, dass das Anc80-Virus die traditionellen AAV-Serotypen bei der Transduktion einer Vielzahl von Cochlearzellen, einschließlich Haarzellen und SGNs, übertraf. Diese In-vitro- Befunde wurden anschließend durch die Wahl der vielversprechendsten Kandidaten für die Injektion durch das runde Fenster in Maus-Welpen in vivo bestätigt. Das Ex-vivo- Modell bietet eine Möglichkeit, die Anatomie der Cochlea erfolgreich zu rekapitulieren und die Zeit und die Ressourcen zu reduzieren, die für die Durchführung von In-vivo- Arbeiten benötigt werden 27 . Ein weiterer Vorteil der Ex vIvo-Modell ist sein Potenzial für die Anwendung auf die Untersuchung von spezifischen zellulären Mechanismen, die zu SNHL beitragen. Durch die Anwendung von Verbindungen, die in der Tumor-Mikroumgebung ( z. B. menschliche Tumorsekrete) zu einem Explantat gefunden werden, kann die Wirkung dieser Verbindungen auf die Cochlea direkt sichtbar gemacht und die Wirksamkeit oder Toxizität potentieller Arzneimitteltherapien beurteilt werden. Das ist wichtig, weil die menschliche Cochlea nicht biopsiert werden kann und die Zellen darin nicht in vivo sichtbar gemacht werden können . Zum Beispiel untersuchte eine aktuelle Publikation das ototoxische Potenzial von Proteinen, die aus vestibulären Schwannomen sezerniert wurden, die intrakranielle Tumore sind, die aus den Vestibularnerven entstehen und bei 95% der Patienten einen Hörverlust verursachen. Die Anwendung von menschlichen Tumorsekreten auf Cochlea-Explantate, verglichen mit Sekreten von kontrollierten gesunden menschlichen Nerven, bestätigte die toxischen Wirkungen dieser Sekrete auf die Cochlea 19 . Das gleiche Experiment wäre schwierig, in einem in vivo zu replizierenModell aufgrund der immunogenen Reaktion gegen menschliche Proteine, die in einer immunkompetenten Maus auftreten würde. Zusammenfassend stellt dieses Manuskript eine Technik dar, die das gleichzeitige Studium von Cochlear-Haarzellen, Synapsen, Neuriten und Neuronen in einem Ex-vivo- Modell ermöglicht. Dieses Modell kann dazu beitragen, einen Einblick in die Wirkmechanismen von Molekülen zu erhalten, die neu in der Cochlea 28 sind , einschließlich Faktoren in den menschlichen Sekreten 19 , 20 , während sie möglicherweise das Screening von Kandidaten-therapeutischen Verbindungen 18 vor ihrer Untersuchung in vivo beschleunigen.

Sensorineural Hörverlust (SNHL) spiegelt Schäden am Innenohr oder aufsteigender Gehörgang. Während Hörverlust das häufigste sensorische Defizit bei Menschen 1 ist , existieren heilende Therapien noch nicht 2 . Obgleich Cochlear- oder auditorische Hirnstammimplantate ein gewisses Maß an Hörvermögen für Patienten mit schwerer bis tiefgehender SNHL wiederherstellen können, ist das Hören, das von diesen Geräten zur Verfügung gestellt wird, immer noch sehr verschieden von dem &quot;natürlichen&quot; Gehör, vor allem bei Versuchen, die Sprache im Lärm zu verstehen oder Musik zu hören. Während die Haarzelldegeneration seit langem als die primäre Konsequenz traumatischer auditorischer Ereignisse ( z. B. Exposition gegenüber lautem Rauschen) angesehen wird, gibt es wachsende Hinweise darauf, dass die Synapsen, die Informationen von Haarzellen zum Hörnerv übermitteln, mindestens ebenso anfällig für akustisches Trauma 3 sind , 4 , 5 </sup<html> &gt; , 6 Da menschliche audiometrische Schwellenwerte, der aktuelle Goldstandard für die Auswertung der Hörfunktion, keine spezifische Zellschädigung im Innenohr vorhersagen, sind so bald wie möglich raffinierte Werkzeuge erforderlich, um die zelluläre Degeneration so schnell wie möglich zu erkennen und eine adäquate Behandlung einzuleiten 7 . Vielversprechende pharmazeutische Behandlungen für Hörverlust werden oft in homogenen Zellkulturen in vitro getestet, aber solche Systeme präzisieren die Cochlea-Mikroumgebung nicht genau. Cochlear-Zellen sind bekannt, um trophische Faktoren zu sezern, die andere Zelltypen innerhalb der Cochlea 8 , 9 beeinflussen, ein entscheidendes in vivo- Verfahren, das verloren geht, wenn das Organ von Corti 10 , 11 oder Spiral-Ganglion-Neuronen (SGNs) 12 isoliert oder kultiviert wird Molekulare Marker werden analysiertEf &quot;&gt; 13. In vivo- Studien, die für die Validierung von In-vitro- Daten notwendig sind, um neue, personalisierte Behandlungen für Hörverlust bei der Verfolgung von&quot; Präzisionsmedizin &quot;zu schaffen, erfordern erhebliche Ressourcen und Zeit. Dies ist besonders wichtig bei der Betrachtung Wie viel Aufwand für die Vervollkommnung und Durchführung von Mittelohr- oder Rundfenster-Membran-Injektionen mit Hörtests und die anschließende Zerlegung von Cochlear-Vollmontagen erforderlich ist. Das effiziente Screening von vielversprechenden Verbindungen in organotypischen Ex-vivo- Kulturen, die als Cochlea-Explantate bekannt sind, bietet eine wirtschaftliche und zuverlässige Alternative 14 , 15 , 16 , 17 . Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll, mit dem bearbeitete Cochlea-Explantate erzeugt, gepflegt und ausgewertet werden können. Spezielle Anwendungen für dieses Modell werden unterstrichen, einschließlich seiner Verwendung in der ScreeningVon potentiell therapeutischen Verbindungen und der vergleichenden Bewertung von Virusvektoren für die Gentherapie. Ein Ex-vivo- Explantat-Ansatz ermöglicht es Forschern, die Effekte einer gegebenen Behandlung auf verschiedene Zellpopulationen in situ zu visualisieren, die Identifizierung von zelltypspezifischen Mechanismen und die anschließende Verfeinerung von zielgerichteten Therapeutika zu erleichtern. Insgesamt bietet diese Technik ein Modell, um die Cochlea ex vivo zu studieren, während sie ein vitales Übersprechen zwischen den sehr unterschiedlichen Zelltypen, die in der Cochlea koexistieren, bewahrt werden.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ampicillin, Sodium Salt</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11593-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CtBP2 antibody, mouse(IgG1)</td>
			<td>BD Transduction Laboratories</td>
			<td>612044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Myo7A antibody, rabbit</td>
			<td>Proteus Biosciences</td>
			<td>25-6790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-NF-H antibody, chicken</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>AB5539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-PSD95 antibody, mouse(IgG2a)</td>
			<td>Antibodies Inc.</td>
			<td>75-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-TuJ1 antibody, mouse</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>801202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive, 5 mg</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CELLSTAR 15 ml Centrifuge Tubes, Conical bottom, Graduation, Sterile</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>188161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CELLSTAR Cell Culture Dish, 100x20 mm</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>664160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CELLSTAR Cell Culture Dish, 35x10 mm, four inner rings</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>627170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CELLSTAR Cell Culture Dish, 60x15 mm</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>628160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CELLSTAR 50 ml Centrifuge Tubes, Conical bottom, Graduation, Sterile</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>227261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear Nail Polish</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear Wall Glass Bottom Dishes (Glass 40mm), PELCO&#174;, Sleeve/20, 50x7 mm</td>
			<td>Ted Pella Inc.</td>
			<td>14027-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips, Round, Glass, 10 mm diameter, Thickness #1, 0.13-0.16mm</td>
			<td>Ted Pella Inc.</td>
			<td>260368</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distilled water, 500 ml</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15230-162&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose, pyruvate, no glutamine, 500 ml</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10313-039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #4 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11241-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #55 Forceps (Dumostar)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11295-51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl alcohol, Pure, 200 proof, anhydrous, &#8805;99.5%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>459836-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, qualified, USDA-approved regions, 500 ml</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10437-028&#160;</td>
			<td>Aliquot in 50 ml tubes and store in -20&#176;C freezer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamate - GlutaMAX supplement, 100 ml</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>goat anti-chicken-647 secondary antibody</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-21469</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>goat anti-mouse(IgG)-568 secondary antibody</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>goat anti-mouse(IgG1)-568 secondary antibody</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-21124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>goat anti-mouse(IgG2a)-488 secondary antibody</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-21131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>goat anti-rabbit-488 secondary antibody</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R37116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2O, sterile, EmbryoMax Ultra Pure Water, 500ml</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>TMS-006-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS, calcium, magnesium, no phenol red, 500 ml</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14025-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instrument Tray with Lid Stainless Steel</td>
			<td>Mountainside Medical</td>
			<td>TechMed4255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro (dissecting) knife &#8211; angled 30&#176;</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10056-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides, VistaVision, color-coded, 75 x 25 mm (3 x 1&#34;), 1 mm thick, white, pack of 72</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16004-382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 Supplement (100X), 5 ml</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3, Sodium Bicarbonate 7.5% solution, 100 ml</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25080-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH, sodium hydroxide solution, 1 l</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>SS266-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Horse Serum (NHS)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16050130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operating scissors</td>
			<td>Roboz Surgical Instruments Co.</td>
			<td>RS-6806</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde, Reagent Grade, Crystalline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td>Prior to use: Establish Standard Operating Procedures based on protocols available online</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, pH 7.4, 500 ml</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010-023&#160;</td>
			<td>Autoclave prior to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin, Alexa Fluor 568&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A12380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prep Pad, Non Sterile&#160;</td>
			<td>Medline</td>
			<td>05136CS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe-Lock Microcentrifuge Tubes, Polypropylene, 0.5 ml</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>022363719</td>
			<td>Autoclave prior to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe-Lock Microcentrifuge Tubes, Polypropylene, 1.5 ml</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>022363204</td>
			<td>Autoclave prior to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Blades - #15</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10015-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Handle - #4</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10004-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stemi 2000-C Stereo Microscope</td>
			<td>Zeiss&#160;</td>
			<td>000000-1106-133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCS SP5 confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X (non-ionic surfactant)</td>
			<td>Integra</td>
			<td>T756.30.30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VectaShield antifade mounting medium for fluorescence</td>
			<td>Vector Laboratories, Inc.</td>
			<td>H-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zipper Bag, Reclosable, 4&#39;&#39; x 6&#39;&#39; - 2 mil. thick</td>
			<td>Zipline</td>
			<td>0609132541599</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

neonatal murine cochlear explant technique as an in vitro screening tool in hearing research

Während es in den vergangenen Jahrzehnten bemerkenswerte Fortschritte in der Hörforschung gegeben hat, gibt es noch keine Heilung für den sensorineuralen Hörverlust (SNHL), eine Bedingung, die typischerweise eine Beschädigung oder einen Verlust der empfindlichen mechanosensorischen Strukturen des Innenohrs beinhaltet. Ausgefeilte In-vitro- und Ex-vivo- Assays haben sich in den letzten Jahren entwickelt, was es ermöglicht, eine zunehmende Anzahl von potentiell therapeutischen Verbindungen zu screenen und gleichzeitig die Ressourcen zu minimieren und die Bemühungen um die Entwicklung von Kuren für SNHL zu beschleunigen. Obwohl homogene Kulturen bestimmter Zelltypen weiterhin eine wichtige Rolle in der aktuellen Forschung spielen, verlassen sich viele Wissenschaftler nun auf komplexere organotypische Kulturen von murinen inneren Ohren, die auch als Cochlea-Explantate bekannt sind. Die Erhaltung organisierter Zellstrukturen im Innenohr erleichtert die in situ- Bewertung verschiedener Komponenten der Cochlea-Infrastruktur, einschließlich innerer und äußerer Haarzellen, Spiralganglion-Neuronen, NeurItes und unterstützende Zellen. Hier präsentieren wir die Vorbereitung, Kultur, Behandlung und Immunfärbung von neonatalen murinen Cochlea-Explantaten. Die sorgfältige Vorbereitung dieser Explantate erleichtert die Identifizierung von Mechanismen, die zu SNHL beitragen und ein wertvolles Instrument für die Hörforschungsgemeinschaft darstellen.

Während viele Protokolle auf Orgel von Corti explants konzentrieren, versucht diese Technik, die Anatomie der gesamten Cochlear-Umdrehung zu bewahren, einschließlich der SGNs. Dies gibt den Forschern die Möglichkeit, die Auswirkungen einer gegebenen Behandlung auf Neuriten und Somata von SGNs zusätzlich zu dem Organ von Corti zu analysieren. Die Durchführung einer Sektion, die einen Teil des Modiolus bewahrt, wie hier beschrieben, ist technisch anspruchsvoller, als das Organ von Corti allein zu erforschen. Allerdings ist die Neuriten- und SGN-Region wichtig, da in dieser Region nach der Anwendung vestibulärer Schwannom-Sekrete (Abbildung 1 ) und extrazellulären Vesikeln in zwei jüngsten Publikationen mit der gleichen Methodik 19 , 20 signifikante pathologische Effekte beobachtet wurden. Solche Veränderungen konnten nicht durch die Verwendung von isolierten Orgel von Corti-Explantaten aufgedeckt werden. ThE-Quantifizierung von beschädigten oder GFP-exprimierenden Zellen für innere und äußere Haarzellen, unterstützende Zellen und SGNs können durch manuelle Zählung oder mit einem automatisierten Prozess durchgeführt werden, wie der, der in das ImageJ-Plugin NeuronJ eingebaut ist. Repräsentative Bereiche für diese Zählungen können nach der Bestätigung ihrer Korrelation mit den Gesamtzahlen festgelegt werden. 3D-Rekonstruktionen sind besonders nützlich, um Überlagerungseffekte in den z-Achsenprojektionen von SGNs auszuschließen. Faserorganisation, Anzahl der SGNs pro gegebener Fläche und SGN-Soma-Bereich können ausgewertet werden. Die Färbung und Zählung von Synapsen, Haarzellen und Neuriten ist in Abbildung 2 dargestellt; Kann das gleiche Protokoll auch für Cochlear-Volllager verwendet werden und hat sich als zuverlässiges Modell für diese Zwecke erwiesen 17 , 21 , 22 . Andere Forscher haben elegante alternative Methoden etabliert, die auch in experimentelle Paradigmen 23 &lt; integriert werden können/ Sup&gt; , 24 . Die maximale Kulturlänge ist in der Regel durch den Beginn der zellulären Migration begrenzt und hängt von der Konzentration von FBS im Kulturmedium ab. Als der Anteil der FBS von fünf Prozent auf drei Prozent oder ein Prozent reduziert wurde, wurde der Zeitraum für die Aufrechterhaltung eines anatomisch intakten Cochlea-Explantats auf etwa eine Woche verlängert (Abbildung 3 ). Fig. 4 zeigt GFP-positive Cochlea-Explantationszellen nach der Transduktion mit dem synthetischen Adeno-assoziierten Virusvektor Anc80 für 48 h 25 . In dieser Ansicht können innere Haarzellen, äußere Haarzellen und unterstützende Zellen quantifiziert werden, während eine 3D-Rekonstruktion dazu beitragen kann, GFP-positive Zellen im SGN-Bereich zu quantifizieren. Verschiedene virale Serotypen können im Hinblick auf ihre Transduktionseffizienz in bestimmten ce verglichen werdenLl Typen mit der skizzierten Methodik 18 . <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/55704/55704fig1.jpg" /> Abbildung 1: Repräsentative konfokale Mikroskopie Bilder von Cochlea-Explantaten aus den apikalen und basalen Regionen nach Inkubation mit Sekreten von großen Aurikularnerven oder vestibulären Schwannomen für 48 h . ( A ) Übersicht Bild eines Explantats Das Rechteck markiert den Bereich in Nahaufnahmen. Maßstab = 200 μm. ( B - E ) Vergrößerte Ansichten von Haarzellen und Neuriten. Maßstab = 50 μm. Grün = Myosin 7A (Myo7A), Flecken Haarzellen; Rot = Klasse III Beta-Tubulin (Tuj1), Flecken neuronale Strukturen. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55704/55704fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/55704/55704fig2.jpg" /> Abbildung 2: Konfokale Mikroskopie Bild der Cochlear Explant Hair Cell Region. ( A ) Intakte Synapsen können durch Markierung von präsynaptischen (C-terminalen Bindungsprotein, roten) und postsynaptischen (postsynaptischen Dichte-95, grünen) Proteinen zusammen mit der Färbung von neuronalen Strukturen (Neurofilament, Blau) beurteilt werden. OHC, äußere Haarzellen; IHC, innere Haarzellen. Maßstab = 10 μm. ( B ) Fokus auf die innere Haarzellenregion mit der Anzahl der inneren Haarzellen (rote Pfeilspitzen) und Neuriten (blaue Pfeilspitzen). Aufgrund der Verzweigung der neuronalen Strukturen ist es wichtig, den Abstand von den inneren Haarzellen beim Zählen zu standardisieren (hervorgehoben mit dem weißen Rahmen, der direkt mit den Synapsen verbunden ist). Maßstab = 5 μm. ( C ) Nahaufnahmen von separaten Synapsen (2 vor- und postsynaptische Paare mit weißen Pfeilspitzen markiert). Maßstab = 1 &amp;<html> # 181; m. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55704/55704fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/55704/55704fig3.jpg" /> Abbildung 3: Repräsentative konfokale Mikroskopie Bilder von apikalen und basalen Cochlea-Explantaten nach 7 d in Kultur mit entweder 3% oder 1% FBS. ( A und B ) In 3% FBS inkubierte Zellen beginnen zwischen 4 und 5 Tagen zu migrieren (hellgraue Pfeile für Haarzellen, rote Pfeile für Neuriten), ( C und D ) Explantate in 1% FBS halten die organisatorische Integrität bis zum Tag 7. Hellgrau: Myosin 7A (Myo7A), Flecken alle Haarzellen; Rot: Klasse III Beta-Tubulin (Tuj1), Flecken neuronale Strukturen. OHC, äußere Haarzellen; IHC, innere Haarzellen. Maßstab = 100 μm, angewendet auf alle Platten.Iles / ftp_upload / 55704 / 55704fig3large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/55704/55704fig4.jpg" /> Abbildung 4: Konfokale Mikroskopie Bild einer Cochlea-Explantation nach Exposition gegenüber dem synthetischen Adeno-assoziierten Virus Vektor Anc80 für 48 h. Transduzierte Zellen exprimieren GFP (grün). Myosin 7A (Myo7A, blau) Flecken Äußere Haarzellen (OHC) und innere Haarzellen (IHC); Klasse-III-Beta-Tubulin (Tuj1, rot) verlässt neuronale Strukturen. Supp .: Bereich der Sox2-positiven Stützzellen; SGN, Spiralganglion Neuronen. Maßstab: 100 μm. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55704/55704fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Neonatal Murine Cochlear Explant Technique as an In Vitro Screening Tool in Hearing Research at JoVE.com

Technik der Cochlea-Explantation von Mäusen bei Neugeborenen als In-vitro-Screening-Instrument in der Hörforschung | Medizin | Video

Neonatal Murine Cochlear Explant Technique as an In Vitro Screening Tool in Hearing Research

Das Ziel dieses Protokolls ist es, die Vorbereitung, Kultur, Behandlung und Immunfärbung von neonatalen murinen Cochlea-Explantaten zu demonstrieren. Die Technik kann als In-vitro- Screening-Tool in der Hörforschung genutzt werden.

Neonatal Murine Cochlear Explant Technik als<em&gt; In vitro</em&gt; Screening-Tool in der Hörforschung

While there have been remarkable advances in hearing research over the past few decades, there is still no cure for Sensorineural Hearing Loss (SNHL), a ...

neonatal-murine-cochlear-explant-technique-as-an-vitro-screening-tool

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Neonatal Murine Cochlear Explant Technique as an In Vitro Screening Tool in Hearing Research

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Sensory Systems

SCIENTISTS IN ACTION

17.4K Aufrufe.  Massachusetts Eye and Ear.  Das Ziel dieses Protokolls ist es, die Vorbereitung, Kultur, Behandlung und Immunfärbung von neonatalen murinen Cochlea-Explantaten zu demonstrieren. Die Technik kann als In-vitro- Screening-Tool in der Hörforschung genutzt werden. 

Serie: Neonatal Murine Cochlear Explant Technique as an In Vitro Screening Tool in Hearing Research

Making Sense of Listening: The IMAP Test Battery

The ability to hear is only the first step towards making sense of the range of information contained in an auditory signal. Of equal importance are the abilities to extract and use the information encoded in the auditory signal. We refer to these as listening skills (or auditory processing AP). Deficits in these skills are associated with delayed language and literacy development, though the nature of the relevant deficits and their causal connection with these delays is hotly debated.
When a child is referred to a health professional with normal hearing and unexplained difficulties in listening, or associated delays in language or literacy development, they should ideally be assessed with a combination of psychoacoustic (AP) tests, suitable for children and for use in a clinic, together with cognitive tests to measure attention, working memory, IQ, and language skills. Such a detailed examination needs to be relatively short and within the technical capability of any suitably qualified professional. Current tests for the presence of AP deficits tend to be poorly constructed and inadequately validated within the normal population. They have little or no reference to the presenting symptoms of the child, and typically include a linguistic component. Poor performance may thus reflect problems with language rather than with AP. To assist in the assessment of children with listening difficulties, pediatric audiologists need a single, standardized child-appropriate test battery based on the use of language-free stimuli.
We present the IMAP test battery which was developed at the MRC Institute of Hearing Research to supplement tests currently used to investigate cases of suspected AP deficits. IMAP assesses a range of relevant auditory and cognitive skills and takes about one hour to complete. It has been standardized in 1500 normally-hearing children from across the UK, aged 6-11 years. Since its development, it has been successfully used in a number of large scale studies both in the UK and the USA. IMAP provides measures for separating out sensory from cognitive contributions to hearing. It further limits confounds due to procedural effects by presenting tests in a child-friendly game-format. Stimulus-generation, management of test protocols and control of test presentation is mediated by the IHR-STAR software platform. This provides a standardized methodology for a range of applications and ensures replicable procedures across testers. IHR-STAR provides a flexible, user-programmable environment that currently has additional applications for hearing screening, mapping cochlear implant electrodes, and academic research or teaching.

A test battery (IMAP) for performing an in-depth assessment of auditory and cognitive abilities contributing to listening skills is described. It is quick to administer, child-friendly and free from linguistic confounds. Stimulus generation and protocol management are controlled via a software platform (IHR-STAR) to ensure replicable procedures.

Making Sense of Listening: Der IMAP-Test Battery

The ability to hear is only the first step towards making sense of the range of information contained in an auditory signal. Of equal importance are the ...

Forschung

Medizin

A Strategy to Identify de Novo Mutations in Common Disorders such as Autism and Schizophrenia

There are several lines of evidence supporting the role of de novo mutations as a mechanism for common disorders, such as autism and schizophrenia. First, the de novo mutation rate in humans is relatively high, so new mutations are generated at a high frequency in the population. However, de novo mutations have not been reported in most common diseases. Mutations in genes leading to severe diseases where there is a strong negative selection against the phenotype, such as lethality in embryonic stages or reduced reproductive fitness, will not be transmitted to multiple family members, and therefore will not be detected by linkage gene mapping or association studies. The observation of very high concordance in monozygotic twins and very low concordance in dizygotic twins also strongly supports the hypothesis that a significant fraction of cases may result from new mutations. Such is the case for diseases such as autism and schizophrenia. Second, despite reduced reproductive fitness1 and extremely variable environmental factors, the incidence of some diseases is maintained worldwide at a relatively high and constant rate. This is the case for autism and schizophrenia, with an incidence of approximately 1% worldwide. Mutational load can be thought of as a balance between selection for or against a deleterious mutation and its production by de novo mutation. Lower rates of reproduction constitute a negative selection factor that should reduce the number of mutant alleles in the population, ultimately leading to decreased disease prevalence. These selective pressures tend to be of different intensity in different environments. Nonetheless, these severe mental disorders have been maintained at a constant relatively high prevalence in the worldwide population across a wide range of cultures and countries despite a strong negative selection against them2. This is not what one would predict in diseases with reduced reproductive fitness, unless there was a high new mutation rate. Finally, the effects of paternal age: there is a significantly increased risk of the disease with increasing paternal age, which could result from the age related increase in paternal de novo mutations. This is the case for autism and schizophrenia3. The male-to-female ratio of mutation rate is estimated at about 4&#x2013;6:1, presumably due to a higher number of germ-cell divisions with age in males. Therefore, one would predict that de novo mutations would more frequently come from males, particularly older males4. A high rate of new mutations may in part explain why genetic studies have so far failed to identify many genes predisposing to complexes diseases genes, such as autism and schizophrenia, and why diseases have been identified for a mere 3% of genes in the human genome. Identification for de novo mutations as a cause of a disease requires a targeted molecular approach, which includes studying parents and affected subjects. The process for determining if the genetic basis of a disease may result in part from de novo mutations and the molecular approach to establish this link will be illustrated, using autism and schizophrenia as examples.

Molecular genetic strategy for finding de novo mutations causing common disorders such as autism and schizophrenia.

Eine Strategie, um de novo Mutationen in Common Störungen wie Autismus und Schizophrenie Identifizieren

There are several lines of evidence supporting the role of de novo mutations as a mechanism for common disorders, such as autism and schizophrenia. First, ...

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As such, primary or &#39;neuronal-like&#39; cell culture systems are commonly utilized. While&#160;these systems are relatively easy to work with, and are useful model systems in which various functional outcomes (such as cell death) can be readily quantified, the examined outcomes and pathways in cultured immature neurons (such as excitotoxicity-mediated cell death pathways) are not necessarily the same as those observed in mature brain, or in intact tissue. Therefore, there is the need to develop models in which cellular mechanisms in mature neural tissue can be examined. We have developed an in vitro technique that can be used to investigate a variety of molecular pathways in intact nervous tissue. The technique described herein utilizes rat cortical tissue, but this technique can be adapted to use tissue from a variety of species (such as mouse, rabbit, guinea pig, and chicken) or brain regions (for example, hippocampus, striatum, etc.). Additionally, a variety of stimulations/treatments can be used (for example, excitotoxic, administration of inhibitors, etc.). In conclusion, the brain slice model described herein can be used to examine a variety of molecular mechanisms involved in excitotoxicity-mediated brain injury.

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

We have developed a brain slice model which can be used to examine molecular mechanisms involved in excitotoxicity-mediated brain injury.&#160;This technique generates viable mature brain tissue and reduces animal numbers required for experimentation, whilst keeping the neuronal circuitry, cellular interactions, and postsynaptic compartments partly intact.

Exzitotoxische Stimulation der Hirn Microslices als<em&gt; In-vitro-</em&gt; Modell der Stroke

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As ...

Dissection and Explant Culture of Murine Allantois for the In Vitro Analysis of Allantoic Attachment

The placenta is essential for the growth and development of mammalian embryos. For this reason, numerous genetic alterations and likely also environmental insults that disturb placenta development or function can cause early pregnancy loss in mice and humans. Nevertheless, simple in vitro assays to screen for potential effects on placenta formation are lacking. Here, we focus on modeling the first and critical step in placenta formation, which consists of the attachment of the allantois to the chorion. We describe a method to rapidly assess the attachment of allantoic explants on immobilized &#945;4&#946;1 integrin, which serves as a chorio-mimetic substrate.This in vitro approach enables a qualitative evaluation of the attachment and spreading behavior of multiple allantois explants at different consecutive time points. The protocol may be used to investigate the effect of targeted mouse mutations, drugs, or various environmental factors that have been linked to pregnancy complications or fetal loss on allantois attachment ex vivo.

Dissection and Explant Culture of Murine Allantois for the In Vitro Analysis of Allantoic Attachment

We describe an in vitro assay to model chorioallantoic attachment, the first step in placenta formation. The protocol demonstrates the dissection and explant culture of murine allantoides on immobilized &#945;4&#946;1 integrin. Allantois attachment is evaluated microscopically at pre-determined time points.

Dissektion und modellabhängigen Kultur der murinen Allantois zur In-vitro- Analyse der Viruswenig Anlage

The placenta is essential for the growth and development of mammalian embryos. For this reason, numerous genetic alterations and likely also environmental ...

Vagus Nerve Stimulation As an Adjunctive Neurostimulation Tool in Treatment-resistant Depression

Vagus nerve stimulation (VNS) is an approved neurostimulation therapy. The purpose of the method is to treat patients with therapy-resistant depression (TRD). VNS exhibits antidepressive and stabilizing effects. This method is particularly useful as a long-term treatment, in which up to two-thirds of patients respond. The vagus nerve stimulator is positioned on the left vagus nerve during a surgical procedure and is activated telemetrically by a wand connected to a handheld computerized device. The treating physician can perform various adjustments of the vagus nerve stimulator during in-office visits (e.g., by modifying stimulation intensity or stimulation frequency) to achieve maximum therapeutic effects with low side effects. Set-up of the device usually takes several months. Typical side effects include wound infection, temporary salivation, coughing, paralysis of the vocal cords, bradycardia, or even asystole. The patient can stop the VNS by placing a magnet over the generator. The current protocol describes delivery of the specific stimulation tool and methods for adjusting the tuning parameters to achieve the best remission rates in patients with TRD.

Vagus nerve stimulation (VNS) has been shown to be effective as an adjunct treatment for treatment-resistant depression (TRD). VNS leads to antidepressive and antisuicidal effects and quality of life improvements. This protocol offers a step-by-step guide to managing and adjusting a vagus nerve stimulator for efficient treatment of TRD.

Vagusnerv-Stimulation als Zusatztherapie Neurostimulation Instrument bei behandlungsresistenter Depression

Vagus nerve stimulation (VNS) is an approved neurostimulation therapy. The purpose of the method is to treat patients with therapy-resistant depression ...

Murine Precision-Cut Liver Slices as an Ex Vivo Model of Liver Biology

Understanding the mechanisms of liver injury, hepatic fibrosis, and cirrhosis that underlie chronic liver diseases (i.e., viral hepatitis, non-alcoholic fatty liver disease, metabolic liver disease, and liver cancer) requires experimental manipulation of animal models and in vitro cell cultures. Both techniques have limitations, such as the requirement of large numbers of animals for in vivo manipulation. However, in vitro cell cultures do not reproduce the structure and function of the multicellular hepatic environment. The use of precision-cut liver slices is a technique in which uniform slices of viable mouse liver are maintained in laboratory tissue culture for experimental manipulation. This technique occupies an experimental niche that exists between animal studies and in vitro cell culture methods. The presented protocol describes a straightforward and reliable method to isolate and culture precision-cut liver slices from mice. As an application of this technique, ex vivo liver slices are treated with bile acids to simulate cholestatic liver injury and ultimately assess the mechanisms of hepatic fibrogenesis.

This protocol provides a simple and reliable method for the production of viable precision-cut liver slices from mice. The ex vivo tissue samples can be maintained under laboratory tissue culture conditions for multiple days, providing a flexible model to examine liver pathobiology.

Murine Präzisionsgeschnittene Leberscheiben als Ex-Vivo-Modell der Leberbiologie

Understanding the mechanisms of liver injury, hepatic fibrosis, and cirrhosis that underlie chronic liver diseases (i.e., viral hepatitis, non-alcoholic ...

Measurement of Strial Blood Flow in Mouse Cochlea Utilizing an Open Vessel-Window and Intravital Fluorescence Microscopy

Transduction of sound is metabolically demanding, and the normal function of the microvasculature in the lateral wall is critical for maintaining endocochlear potential, ion transport, and fluid balance. Different forms of hearing disorders are reported to involve abnormal microcirculation in the cochlea. Investigation of how cochlear blood flow (CoBF) pathology affects hearing function is challenging due to the lack of feasible interrogation methods and the difficulty in accessing the inner ear. An open vessel-window in the lateral cochlear wall, combined with fluorescence intravital microscopy, has been used for studying CoBF changes in vivo, but mostly in guinea pig and only recently in the mouse. This paper and the associated video describe the open vessel-window method for visualizing blood flow in the mouse cochlea. Details include 1) preparation of the fluorescent-labeled blood cell suspension from mice; 2) construction of an open vessel-window for intravital microscopy in an anesthetized mouse, and 3) measurement of blood flow velocity and volume using an offline recording of the imaging. The method is presented in video format to show how to use the open window approach in mouse to investigate structural and functional changes in the cochlear microcirculation under normal and pathological conditions.

An open vessel-window approach using fluorescent tracers provides sufficient resolution for cochlear blood flow (CoBF) measurement. The method facilitates the study of structural and functional changes in CoBF in mouse under normal and pathological conditions.

Messung des restrischen Blutflusses in Maus-Cochlea mittels offenem Gefäßfenster und intravitaler Fluoreszenzmikroskopie

Transduction of sound is metabolically demanding, and the normal function of the microvasculature in the lateral wall is critical for maintaining ...

Performing Intracochlear Electrocochleography During Cochlear Implantation

Electrocochleography (ECochG) measures inner ear potentials generated in response to acoustic stimulation of the ear. These potentials reflect the residual function of the cochlea. In cochlear implant candidates with residual hearing, the implant electrode can directly measure ECochG responses during the implantation process. Various authors have described the ability to monitor the inner ear function by continuous ECochG measurements during the surgery. The measurement of ECochG signals during surgery is not trivial. There are no interpretable signals in up to 20% of cases. For a successful recording, a standardized procedure is recommended to achieve the highest measurement reliability and avoid possible pitfalls. Therefore, seamless collaboration between the CI surgeon and CI technician is key. This video consists of an overview of the system setup and a stepwise procedure of performing intracochlear ECochG measurements during CI surgery. It shows the surgeon's and the CI technician's roles in the process, and how a smooth collaboration between the two is made possible.

Electrocochleography (ECochG) measures inner ear potentials generated in response to acoustic stimulation. In cochlear implant (CI) candidates, such inner ear potentials can be measured directly with the implant electrodes. In this video, we systematically explain how to perform ECochG recordings during CI surgery.

Durchführung der intracochlearen Elektrokochleographie während der Cochlea-Implantation

Electrocochleography (ECochG) measures inner ear potentials generated in response to acoustic stimulation of the ear. These potentials reflect the ...

Modified Technique for the Use of Neonatal Murine Hearts in the Langendorff Preparation

The use of the ex-vivo retrograde perfused heart has long been a cornerstone of ischemia-reperfusion investigation since its development by Oskar Langendorff over a century ago. Although this technique has been applied to mice over the last 25 years, its use in this species has been limited to adult animals. Development of a successful method to consistently cannulate the neonatal murine aorta would allow for the systematic study of the isolated retrograde perfused heart during a critical period of cardiac development in a genetically modifiable and low-cost species. Modification of the Langendorff preparation enables cannulation and establishment of reperfusion in the neonatal murine heart while minimizing ischemic time. Optimization requires a two-person technique to permit successful cannulation of the newborn mouse aorta using a dissecting microscope and a modified commercially available needle. The use of this approach will reliably establish retrograde perfusion within 3 min. Because the fragility of the neonatal mouse heart and ventricular cavity size prevents direct measurement of intraventricular pressure generated using a balloon, use of a force transducer connected by a suture to the apex of the left ventricle to quantify longitudinal contractile tension is necessary. This method allows investigators to successfully establish an isolated constant-flow retrograde-perfused newborn murine heart preparation, permitting the study of developmental cardiac biology in an ex-vivo manner. Importantly, this model will be a powerful tool to investigate the physiological and pharmacological responses to ischemia-reperfusion in the neonatal heart.

The present protocol describes aortic cannulation and retrograde perfusion of the ex-vivo neonatal murine heart. A two-person strategy, using a dissecting microscope and a blunted small gauge needle, permits reliable cannulation. Quantification of longitudinal contractile tension is achieved using a force transducer connected to the apex of the left ventricle.

Modifizierte Technik zur Verwendung von neonatalen Murinherzen im Langendorff-Präparat

The use of the ex-vivo retrograde perfused heart has long been a cornerstone of ischemia-reperfusion investigation since its development by Oskar ...

Effect of Hyaluronic Acid 35 kDa on an In Vitro Model of Preterm Small Intestinal Injury and Healing Using Enteroid-Derived Monolayers

In vitro scratch wound assays are commonly used to investigate the mechanisms and characteristics of epithelial healing in a variety of tissue types. Here, we describe a protocol to generate a two-dimensional (2D) monolayer from three-dimensional (3D) non-human primate enteroids derived from intestinal crypts of the terminal ileum. These enteroid-derived monolayers were then utilized in an in vitro scratch wound assay to test the ability of hyaluronan 35 kDa (HA35), a human milk HA mimic, to promote cell migration and proliferation along the epithelial wound edge. After the monolayers were grown to confluency, they were manually scratched and treated with HA35 (50 &#181;g/mL, 100 &#181;g/mL, 200 &#181;g/mL) or control (PBS). Cell migration and proliferation into the gap were imaged using a transmitted-light microscope equipped for live-cell imaging. Wound closure was quantified as percent wound healing using the Wound Healing Size Plugin in ImageJ.&#160;The scratch area and rate of cell migration and the percentage of wound closure were measured over 24 h. HA35 in vitro accelerates wound healing in small intestinal enteroid monolayers, likely through a combination of cell proliferation at the wound edge and migration to the wound area. These methods can potentially be used as a model to explore intestinal regeneration in the preterm human small intestine.

Effect of Hyaluronic Acid 35 kDa on an In Vitro Model of Preterm Small Intestinal Injury and Healing Using Enteroid-Derived Monolayers

This protocol describes a method to establish and perform a scratch wound assay on two-dimensional (2D) monolayers derived from three-dimensional (3D) enteroids isolated from non-human primate ileum.

Wirkung von Hyaluronsäure 35 kDa auf ein In-vitro-Modell der vorzeitigen Dünndarmverletzung und Heilung unter Verwendung enteroid-abgeleiteter Monoschichten

In vitro scratch wound assays are commonly used to investigate the mechanisms and characteristics of epithelial healing in a variety of tissue types. ...