Die Forschung im Labor von Gunzer wurde vom Bundesministerium für Bildung und Forschung (Stipendium Nr. 0315590 n.Chr.) Und der Deutschen Forschungsgemeinschaft (Nr. GU769 / 4-1, GU769 / 4-2) unterstützt. Wir danken dem IMCES für technische Unterstützung und Sebastian Kubat für die Hilfe bei der 3D-Karikaturmodellierung.

Alle Tierversuche wurden gemäß den EU-Richtlinien durchgeführt und wurden von den zuständigen örtlichen Behörden in Essen (AZ 84-02.04.2014.A036 - Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz Nordrhein-Westfalen, Essen, Deutschland) genehmigt. Die Tiere wurden unter bestimmten pathogenfreien (SPF) Bedingungen verwendet und untergebracht. 1. Induktion der Myokarditis durch Diphtherie Toxin (DTX) <ol><li> Bereiten Sie die DTX-Lösung für die Induktion von Myokarditis vor, indem Sie die DTX-Stammlösung mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) auf eine 1 μg / ml Arbeitslösung verdünnen. </li><li> Tragen Sie 100 μl dieser Lösung intratracheal (it) in 8 bis 10 Wochen alte CD11c.DTR-Mäuse ( ca. 5 ng / g Körpergewicht (bw)), wie von Hasenberg et al. Für die Anwendung einer Pilzsporen-Suspension 20 . HINWEIS: Die intraperitoneale Anwendung des Toxins kann zu einer ähnlichen Induktion führenTödliche Myokarditis Dieser Ansatz müsste aber zunächst validiert werden. <ol><li> Für sie Anwendung, betäubt die Tiere durch eine intraperitoneale (ip) Injektion von 100 mg / kg bw Ketamin und 10 mg / kg bw Xylazin. </li><li> Nach dem Erreichen einer tiefen Narkose (Zehen-Prise-Test), intubieren Sie die Tiere mit einem 22 G Indwelt Venenkatheter durch die Mundhöhle. Überprüfen Sie die korrekte Positionierung des Objektivrohres, indem Sie die Tiere mit einem kleinen Atemschutzgerät mit einer Rate von 250 Atemnoten pro Minute und einem Inhalationsvolumen von 250 μl pro Atem belüften, auch von Hasenberg et. Al. 20 HINWEIS: Wenn Sie richtig positioniert sind, ändert sich die Atemfrequenz der Tiere entsprechend den angelegten Belüftungseinstellungen. </li><li> Trennen Sie das Belüftungssystem und trennen Sie die 100 μl DTX-Lösung oder eine gleiche Menge PBS als Kontrolle durch den Katheter in die Lunge und belüften Sie die Tiere für 1 zusätzliche Min. </li></ol></li><li> Lassen Sie die Tiere sich von der Anästhesie erholen und überwachen Sie den allgemeinen Gesundheitszustand und die Körpergewichtsänderung für 4 Tage. HINWEIS: Je nach genetischem Hintergrund, Mäusestamm oder Anfangsgewicht kann die Schwere und der Beginn der Myokarditis variieren und sollte zuerst bestimmt werden. </li></ol> 2. Probenvorbereitung für die Lichtbogenmikroskopie <ol><li> 4 Tage nach Toxin-Applikation die Mäuse durch Spülen einer Induktionskammer mit einer verdampften 2% Isofluran / Sauerstoff-Mischung anästhesieren. In etwa 50 μl eines direkt markierten Anti-CD45-Antikörpers (Klon 30-F11, AlexaFluor647 (AF647)) in 50 μl PBS intravenös (iv) unter Verwendung des retro-orbitalen Applikationsweges injizieren, was eine sehr schnelle und hochgenaue Applikation der Korrekte Menge an Antikörper. HINWEIS: Die gewünschte Tiefe der Narkose wurde erreicht, wenn die Mäuse liegend sind und nicht auf Zehenstichprüfung reagieren. </li><li> Nach 2 h Inkubation, opfer die Mäuse durch zervikale Versetzung anD dauert die Herzen in situ mit 5 ml PBS / EDTA (5 mM). <ol><li> Das Herz aussetzen und die Perfusionslösung mit einem 21 G-Katheter in den rechten Ventrikel einspritzen. Perfund mit langsamem, konstantem Druck und stellen Sie sicher, dass das Blut nach dem Schneiden der Aorta entleert werden kann. HINWEIS: Diese transkardiale Perfusion kann zu kleinen Vorbereitungsartefakten führen, die die endgültige 3D-Visualisierung des Organs stören könnten. Daher konnten fortgeschrittene Tierversucher die Perfusion durch die untere Hohlvene durchführen und die Bauchaorta ausgleichen. </li></ol></li><li> Zur chemischen Fixierung wird das Herz durch die gleiche Vertiefung mit 5 ml 4% Paraformaldehyd (PFA) perfundiert. Halten Sie den Katheter an Ort und legen Sie einfach eine neue Spritze mit PFA gefüllt. Perfund mit langsamem und konstantem Druck HINWEIS: Paraformaldehyd stark toxisch; Vermeiden Sie Kontakt mit der Haut, Augen und anderen Schleimhaut. <ol><li> Vorsichtig das Herz mit gezackter Pinzette ergreifen; PuLl es etwas nach oben; Und schneiden alle Gewebeverbindungen, einschließlich der eingehenden und ausgehenden Arterien und Venen. Die Orgel für weitere 4 h in 4% PFA zur weiteren Fixierung aufbewahren. </li></ol></li><li> Um das Organ zu dehydrieren, das Herz in einer aufsteigenden Ethanolreihe mit 50%, 70% und zweimal bei 100%, jeweils für 12 h, bei 4 ° C im Dunkeln zu inkubieren. Verwenden Sie hier schwarze 5-ml-Polypropylen-Reaktionsrohre, so dass sie sich ständig in einem Rohrrotator mit einer langsamen Drehzahl drehen können, um eine Luftblasenbildung zu verhindern. </li><li> Komplette Probenvorbereitung durch chemisches Clearing. Um die Herzen transparent zu machen, inkubieren sie sie in 98% Dibenzylether (DBE), während sie sich ständig über Nacht drehen. HINWEIS: DBE reizt Augen, Haut und Atemwege. </li></ol> 3. Lichtbogen-Mikroskopie <ol><li> LSFM mit dem Lichtbogenmikroskop durchführen (siehe Materialliste). Legen Sie die Probe auf den Standardprobenhalter des Mikroskops in die DBE-gefüllte cuVette, die für Proben bis 30 mm x 30 mm x 15 mm geeignet ist. </li><li> Halten Sie die Probe während der Bildaufnahme mit dehydrierten und gelöschten Agaroseblöcken fest. <ol><li> Zur Herstellung der Agaroseblöcke 2% geschmolzene Agarose in eine Form geben (15 mm x 15 mm x 5 mm). Lassen Sie die Agarose abkühlen, bis sie erstarrt. </li><li> Dehydrieren Sie es in einer aufsteigenden Ethanol-Serie (50%, 70% und zweimal bei 100%). Inkubieren Sie die Agaroseblöcke über Nacht in 98% DBE. Lagern Sie die Agarose in DBE, bis sie verwendet wird. HINWEIS: Da die Agarose hauptsächlich aus Wasser besteht, können die Inkubationszeiten für jeden Dehydratisierungsschritt je nach Größe des Blocks verlängert werden. HINWEIS: DBE reizt die Augen, die Haut und die Atemwege. </li><li> Wenn nötig, schneide den vorbereiteten Agarose-Block auf die gewünschte Form mit einem scharfen Skalpell. Typischerweise schneiden sie prisma- oder keilförmige Formen, um an den Kanten des Probenadapters zu platzieren. HINWEIS: Da die Agarose-Blöcke elastisch sind,Die Probe bleibt bei einer geringen Kraft an Ort und Stelle. </li></ol></li><li> Erfassen Sie die interessierenden Fluoreszenzsignale (hier Autofluoreszenz- und Anti-CD45-Antikörper-Färbung) mit den entsprechenden Anregungs- und Emissionsfilter-Einstellungen. <ol><li> Für den Nachweis des Bindegewebs-abgeleiteten Autofluoreszenzsignals verwenden Sie ein 525/50 nm Bandpassfilter bei einer Anregungswellenlänge von 488 nm (OPSL: 50 mW); Die CD45-Färbung mit einem AF647-gekoppelten Antikörper wird bei 668 nm (Bandpassfilter: 680/30 nm) und bei einer Anregungswellenlänge von 647 nm (Diodenlaser: 50 mW) nachgewiesen. </li><li> Wählen Sie 4 μm als Abstand zwischen den beiden einzelnen Z-Ebenen. </li></ol></li></ol> 4. Bild Nachbearbeitung HINWEIS: Die erfassten digitalen Bilddaten wurden mit einer wissenschaftlichen 3D / 4D Bildverarbeitungs- und Analysesoftware weiterverarbeitet (siehe Tabelle). <ol><li> Öffnen und Voreinstellung der Datendateien. </stRong&gt; <ol><li> Nach dem Start der Analysesoftware wählen Sie die &quot;Surpass&quot; -Taste in der oberen linken Ecke. Um die Bildstapel zu öffnen, wählen Sie &quot;Datei&quot;, &quot;Öffnen&quot; und wählen Sie einen Ordner aus, der die Daten aus dem ersten erworbenen Kanal enthält. Wählen Sie &quot;Bearbeiten&quot; und &quot;Hinzufügen von Kanälen&quot;, um weitere erworbene Kanäle hinzuzufügen. HINWEIS: Abhängig von der Datengröße und dem Computersystem kann dieser Vorgang einige Minuten dauern. Das vorgestellte Protokoll zeigt alle Schritte für 2 Erfassungskanäle (Autofluoreszenz und AF647). </li><li> Korrigieren Sie die x-, y- und z-Voxel-Maße, indem Sie auf &quot;Bearbeiten&quot; klicken und &quot;Bildeigenschaften&quot; auswählen. Wenn das neue Fenster öffnet, passen Sie die Parameter an. HINWEIS: Dieser Schritt hängt vom eingesetzten Mikroskopsystem und dem jeweiligen Datenformat ab. Richtige xyz-Werte sind für die nachfolgende Größe und die entfernten Messungen kritisch. In den meisten Fällen werden diese Parameter als Metadaten in den Mikrographen-Dateien gespeichert. Allerdings, wenn die Datei foRmat kann von der Analysesoftware nicht korrekt interpretiert werden, es ist wichtig, die Pixelgröße manuell einzugeben. Die Pixelgröße in den x- und y-Dimensionen hängt von der Kamerapixelgröße, dem potentiell angewandten Binning und der Linse und der Objektivvergrößerung ab. Die Pixelgröße in z entspricht der selbst definierten z-Schrittgröße ( zB 4 μm). </li></ol></li><li> Kanalanpassungen <ol><li> Zuerst das Autofluoreszenzsignal in Graustufen umwandeln, indem du die &quot;Display-Einstellung&quot; (&quot;Edit&quot; und &quot;Show Display Adjustment&quot;) öffnest. Ein neues Fenster listet alle geöffneten Kanäle und die Anzeigeeinstellungen für alle von ihnen auf; Um die Standardfarbe zu ändern, den Autofluoreszenzkanal auszuwählen und den &quot;weißen&quot; Displaystil auszuwählen. Klicken Sie auf &quot;OK&quot;, um sich zu bewerben. </li><li> Für die Schwarzpegel-Einstellung gehen Sie zurück auf &quot;Display-Einstellung&quot; und stellen Sie den Schwarzpegelwert ein, um unerwünschte Hintergrundsignale auszuschließen, die keine Musterstruktur darstellenS. <ol><li> Verwenden Sie dazu das obere linke Dreieck auf der Kanalleiste und ziehen Sie es von links nach rechts. HINWEIS: Änderungen werden sofort visualisiert. Achten Sie darauf, nur Signale zu unterdrücken, die nicht aus dem Sample stammen. Minimalwerte im Hintergrund sollten niemals &quot;0&quot; sein, um pechschwarze Pixel zu vermeiden, da die Rauschsignale für zusätzliche Berechnungen benötigt werden. Stellen Sie sicher, dass alle Schwarzniveauänderungen nach der Bilderfassung durchgeführt werden. Andernfalls können wertvolle Beispielinformationen verloren gehen. Die Black-Level-Einstellung dient nur repräsentativen Zwecken. Um die gleichen Anzeigeeinstellungen über verschiedene Samples zu verwenden, können präzise Werte in das &quot;min&quot; numerische Feld unterhalb der Kanalliste eingegeben werden. Das ist sehr hilfreich für quantitative Analysen. </li></ol></li><li> Führen Sie die Intensitätseinstellung durch, indem Sie das obere rechte Dreieck verwenden, um die jeweilige Kanalintensität einzustellen oder indem Sie präzise Werte in das &quot;max&quot; numerische Feld unterhalb der Channe eingebenL Liste. </li><li> Führen Sie die Kontrasteinstellung durch, indem Sie das untere Dreieck in der Mitte der Kanalleiste ziehen, um den Gamma-Wert zu erhöhen oder zu verringern oder indem Sie die genauen Werte eingeben. </li><li> Stellen Sie den AF647-Kanal entsprechend dem Autofluoreszenzkanal ein. Als Differenz setzen Sie die Visualisierung des AF647-Signals auf eine Hitzekarte-Farb-Nachschlagetabelle. Tun Sie dies, indem Sie den Kanalmodus &quot;Feuer&quot; in einem ähnlichen Ansatz wie in Schritt 4.2.1 wählen. HINWEIS: Da die Gesamtsignalintensitäten im Vergleich zum Autofluoreszenzkanal deutlich niedriger sind, werden die Schwarzpegel in der Regel auf viel niedrigere Werte eingestellt. Für den Autofluoreszenzkanal wird die Helligkeit dieses Kanals gewöhnlich erhöht. </li><li> Wählen Sie den &quot;Blend-Modus&quot;, um Gewebestrukturen im Detail zu visualisieren. Analysiere alle Samples aus einer Serie mit den gleichen Parameterwerten. </li></ol></li><li> Virtueller Ausschnitt <ol><li> Um die Orgel vor der 3D-Szene explizit zu schneidenRt, eine Clipping-Ebene auf das gerenderte 3D-Objekt anwenden. <ol><li> Klicken Sie in der Objektliste auf das Symbol &quot;Clipping Plane&quot; (Schere). Innerhalb der Bildansicht erscheint ein gelber Rahmen und ein Manipulator (weiße Spindel). Drehen Sie die Spindel am dünneren Ende mit der Maus, indem Sie die Ausrichtung der Clipping-Ebene ändern und bewegen Sie den dickeren Mittelteil der Spindel, um die gewünschte Tiefe des Clips auszuwählen. </li><li> Verbergen Sie den Rahmen und den Manipulator, indem Sie die entsprechenden Kontrollkästchen unterhalb der Objektliste deaktivieren und die gewünschten Schnappschüsse erstellen. </li></ol></li></ol></li></ol>

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Protoc. 9 (7), 1682-1697 (2014).</li><li>Schwarz, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent-protein+stabilization+and+high-resolution+imaging+of+cleared,+intact+mouse+brains.">Fluorescent-protein stabilization and high-resolution imaging of cleared, intact mouse brains.</a> PLoS One. 10 (5), e0124650 (2015).</li><li>Hama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scale:+a+chemical+approach+for+fluorescence+imaging+and+reconstruction+of+transparent+mouse+brain.">Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain.</a> Nat. Neurosci. 14 (11), 1481-1488 (2011).</li><li>Susaki, E. 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E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transparent+tooth+model+system.+An+aid+in+the+study+of+root+canal+anatomy.">Transparent tooth model system. An aid in the study of root canal anatomy.</a> Indian J. Dent. Res. 11 (3), 89-94 (2000).</li><li>Karreman, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+and+precise+targeting+of+single+tumor+cells+in+vivo+by+multimodal+correlative+microscopy.">Fast and precise targeting of single tumor cells in vivo by multimodal correlative microscopy.</a> J. Cell Sci. 129 (2), 444-456 (2016).</li><li>Pan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shrinkage-mediated+imaging+of+entire+organs+and+organisms+using+uDISCO.">Shrinkage-mediated imaging of entire organs and organisms using uDISCO.</a> Nat. Methods. 13 (10), 859-867 (2016).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

In der modernen Life Science spielt die mikroskopische Visualisierung biologischer Prozesse eine immer wichtigere Rolle. In diesem Zusammenhang wurden in den letzten zwei Jahrhunderten viele Entwicklungen erreicht, die helfen, Fragen zu beantworten, die bis zu diesem Punkt nicht adressierbar sind. Erstens hat es eine deutliche Tendenz gegeben, die Auflösungsfähigkeit von Lichtmikroskopen grundsätzlich zu erhöhen. Mit strukturierter Beleuchtungsmikroskopie (SIM) 21 , 22 , stimulierter Emissionsverarmung (STED) -Mikroskopie 23 und photoaktivierter Lokalisierungsmikroskopie (PALM) 24 , 25 oder stochastischer optischer Rekonstruktionsmikroskopie (STORM) 26 ist die einmal postulierte Auflösung begrenzt Die Lichtbeugung 27 war deutlich gebrochen. Die zweite häufig gezielte Herausforderung bestand darin, das zelluläre Verhalten in einer Umgebung zu beobachtenDer natürliche Zustand so genau wie möglich. In diesem Zusammenhang wurde die Entwicklung von In-situ- oder In-vivo -Bildgebungsansätzen gezwungen. Um die begrenzte Lichtdurchdringungstiefe in komplexen biologischen Geweben zu überwinden, hat die 2-Photonenmikroskopie 28 , 29 neue Maßstäbe in diesem Forschungsfeld gesetzt. Allerdings ist ein Merkmal, dass alle diese Mikroskopie Techniken in der Regel teilen ist die Verwendung von High-NA-Ziele, um eine bestmögliche Auflösung zu gewährleisten. Obwohl es Mikrostrukturen genauer behebt, beschränkt der Einsatz von High-NA-Zielen das Sichtfeld sowie den Arbeitsabstand erheblich. Infolgedessen wird der biologische Kontext in Bezug auf die Umwelt oft im wahrsten Sinne des Wortes unscharf. Um diese Lücke zu schließen, hat die LSFM-Entwicklung vor kurzem Interesse erlangt und bietet eine Mikroskopie-Technik, die in der Lage ist, fluoreszierende Strukturen bei zellulärer Größe zu lösenSondern auch die gesamte 3D-Information eines Exemplars mit einer Größe von mehr als 1 cm bequem zu beurteilen. Das hier beschriebene Protokoll stellt eine Methode dar, wie man ein Ultramikroskop einsetzt, um ein zelluläres Leukozyten-Infiltrat in ganzen murinen Herzen zu visualisieren. Nach der erfolgreichen Induktion der sterilen Myokarditis in einem CD11c.DTR-Mausmodell 30 erhält das jeweilige Tier eine iv-Injektion eines fluorochromgekoppelten Anti-CD45-Antikörpers, der für 2 h im lebenden Tier zirkuliert. Grundsätzlich sollte durch die Durchführung eines Post-mortem die Voll-Mount-Antikörper-Färbung zwischen Organ-Fixierung und Proben-Dehydratation möglich sein. Unglücklicherweise verlangt die Vollmontage-Färbung viel längere Inkubationsschritte und erhöht damit die für die Probenerzeugung benötigte Zeit ( dh um 4-21 Tage) 6 , 31 . Darüber hinaus ist dieser intravitale Färbeansatz nicht nur schneller, sondern liefert auchWirksamere Gewebepenetration des Antikörpers im Vergleich zu einem Voll-Färbeprotokoll 9 . Obwohl die absolute Färbeeffizienz nicht quantifiziert wurde, wird erwartet, dass ein großer Teil der Leukozytenpopulation markiert wird, da das resultierende Fluoreszenzsignal bemerkenswert stark ist. Sowohl die fluoreszierenden Proteine ​​als auch die Antikörper-Markierung selbst überleben weitgehend den nachfolgenden Clearing-Prozess, und beide scheinen für eine lange Zeitspanne stabil zu sein. Es sollte auch angemerkt werden, dass ein Lösungsmittel-basiertes Mittel für das Gewebe-Clearing verwendet wird. Dies beeinträchtigt nach dem Clearing-Prozess einen ganzheitlichen Färbeansatz. Das lösungsmittelbasierte Gewebe-Clearing ist ein reversibles Phänomen, so dass eine Übertragung des gereinigten Gewebes in ein wasserbasiertes Medium (wie PBS), das üblicherweise für die Standard-Antikörper-Färbung verwendet wird, zu einer nicht transparenten Probe führen würde. Daher müssten nicht standardmäßige Färbeprotokolle in organischen Lösungsmitteln hergestellt werden<html> Bei der Probenreinigung ist ein Voll-Färbeverfahren erforderlich. Die anschließende Herzperfusion ist absolut notwendig, um so viel Restblut wie möglich zu eliminieren, da Blut in den folgenden Schritten schlecht gereinigt wird und die bildgebenden Ergebnisse drastisch verschlechtert. Nach dem Ausscheiden des Herzens wird das Gewebewasser in einer aufsteigenden Ethanolreihe entfernt. Dieser Schritt kann als erster Teil des chemischen Clearing angesehen werden. Die Idee besteht darin, das Gewebewasser mit einem Immersionsmedium zu ersetzen, das besser dem mittleren Brechungsindex (RI) der Probe der Wahl entspricht. DBE wurde als Immersionsmedium nach dem Protokoll von Ertuk et al. 32 , mit einigen Modifikationen. DBE hat einen Brechungsindex von 1,55 (nD20) und wurde mit anderen Clearing-Mitteln wie Benzylalkohol: Benzylbenzoat (BABB; RI (nD20) = 1,56) 6 , 7 oder Saccharose (RI (nD20) = 1,44 verglichen )Es wurde eine ähnliche Fluoreszenzkonservierung unter Verwendung von Ethylcinnamat (ECI) erhalten. Wir haben ihre Verwendung in einer Studie über die automatisierte Quantifizierung von Glomeruli in nephretischen Nieren beschrieben 9. Der Muskel Gewebe, einmal geschätzt, dass es einen Brechungsindex von 1,382 ± 0,004 33 hat , wurde mit allen Substanzen, die wir ausgewertet haben, gleich gut geklärt. Daher war der entscheidende Faktor für die Wahl der DBE die Fluoreszenzkonservierung und nicht das Clearingpotential Änderung dieses passiven Clearing-Protokolls, die Verwendung eines aktiven Verfahrens wie CLARITY 34 , 35 , wo die Entfernung von Lipiden mit Hilfe eines elektrophoretischen Stromes zu stark geklärten Geweben führt, sollte möglich sein. Im Gegensatz zu einem solchen Wasser -basierte Clearing-Methode führt das DBE-Clearing zu einer signifikanten HärtungDes Gewebes, begleitet von geringer Schrumpfung. Dies ermöglicht eine einfache Handhabung der Proben und erfordert keine weiteren Anpassungen für die Bildgebung, wie das Einbetten der Probe in einen Agaroseblock. Daher wäre die Übertragung dieses Protokolls auf eine Methode wie CLARITY anspruchsvoll, aber die Menschen haben die Verwendung des gewählten Ultramikroskops (siehe Tabelle der Materialien) mit diesem Ansatz erfolgreich demonstriert 3 . Es ist wichtig, die potentielle Zerstörung von endogenen Fluoreszenzsignalen sorgfältig anhand der Clearing-Methode der Wahl zu bewerten. Da wir noch nie mit CLARITY oder anderen Active-Clearing-Protokollen gearbeitet haben, können wir die Fluorochrom-Reaktion in diesen Systemen nicht kommentieren. Der schlimmste Fall wäre, dass eine nachfolgende Voll-Mount-Antikörper-Färbung durchgeführt werden müsste. Diese Methode ist leicht auf andere Organe, wie z. B. murine Lungen, einstellbar. Nieren; Gehirne; Und sogar Knochen, wie der Femur, Tibia oder Calvaria. Während Auswertung<html> Ng das Anwendungspotential auf neue Geweberegionen und / oder neue fluoreszierende Markierungsstrategien, die größte Herausforderung besteht in der Regel darin, das Protokoll so zu gestalten, dass die Fluoreszenz am Leben bleibt. Die lösungsmittelbasierten Immersionsmedien 13 und die Dehydratisierungsmittel 36 haben einen direkten Einfluss auf die Integrität der Fluorochrome. Die Verwendung von AlexaFluor-Derivaten wird empfohlen, da sie in verschiedenen Protokollen ziemlich stabil zu sein scheinen. Allerdings müssen sehr oft andere Fluorochrome eingesetzt werden. In diesem Fall ist es definitiv wert, die Verwendung anderer Clearing-Mittel ( z. B. Scale 37 , Cubic 38 , Succrose 13 , Clarity 13 , 34 , PACT 39 , FocusClear 13 , SeeDB 31 , Methylsalicylat 40 , 3Disco 32 , BABB) zu bewertenLass = &quot;xref&quot;&gt; 6 und ECI 9 ) und andere Dehydratationsalternativen ( zB Methanol und Tetrahydrofuran 13 ). Wie bei vielen anderen LSFM-Ansätzen ist der Prozess der Positionierung des transparenten Herzens unter dem Mikroskop anspruchsvoll. Kommerzielle Systeme bieten genügend Platz für die Installation von Proben die Größe der Maus Organe, einschließlich Lungenlappen, Nieren oder Herzen. Im Moment stehen jedoch keine standardisierten Probenhalter für diese Proben zur Verfügung. Deshalb mussten wir eine Montagevorrichtung unter Verwendung von geklärten und neu geformten Agaroseblöcken herstellen. Dennoch musste eine gewisse Anzahl von Bilddatensätzen aufgrund von Bewegungsartefakten entsorgt werden. Dieses Problem wurde auch aufgrund der langen Erfassungszeit des hier verwendeten Mikroskops erhöht. Potenziell wird die Generierung von riesigen Datensätzen deutlich von schnelleren Systemen profitieren, aber wir hatten nicht die Chance, ein schnelleres Mikroskop zu verwenden. Unser Mikroskop (siehe Tabelle oF-Materialien) wurde um einen Zoom-Mikroskop-Körper gebaut und mit einem Lasermodul, einer sCMOS-Kamera mit einer Pixelgröße von 6,5 x 6,5 mm 2 und einer Detektionsoptik mit einem optischen Vergrößerungsbereich von 1,26x bis 12,6X ausgestattet. Der zentrale Teil der Detektionsoptik war ein 0,5 NA Objektiv mit einem Arbeitsabstand von 5,5 mm, der die Beobachtung eines großen Sichtfeldes zwischen 1,7 und 17,6 mm diagonal erlaubte. Das war groß genug, um die optische Schnittdarstellung ganzer Herzherzen durchzuführen. Die Korrektur der chromatischen Aberration zwischen 400 und 800 nm wurde durch die mechanische Einstellung des Objektivs erreicht. Bei Bedarf wurden bei der computergestützten Nachbearbeitung chromatische Korrekturen durchgeführt. Die sphärische Aberration, auch in dickeren Exemplaren, wurde in diesem System nicht beobachtet und musste daher nicht korrigiert werden. Alles in allem präsentieren wir hier ein robustes Protokoll für die chemische Reinigung und Analyse von räumlichen lEukozytenverteilung innerhalb von murinen Herzen mit Licht-Blatt-Mikroskopie. An dieser Stelle ist es wichtig zu betonen, dass dieses LSFM-Verfahren kaum feine Gewebestrukturen wie Kapillaren lösen kann. In dieser Hinsicht ist dieses LSFM gut geeignet, um die allgemeine Immunzellenverteilung zu charakterisieren und potenzielle Immunzellenansammlungen innerhalb des Organs zu beschreiben. Allerdings muss man bedenken, dass LSFM im Allgemeinen nicht die perfekte Wahl für die Analyse und Quantifizierung der zellulären Lokalisierung in kleinen Orgel-Sub-Strukturen, wie die Vaskulatur ist. Um diese Fragen zu beantworten, sollte LSFM mit anderen Methoden wie Histologie oder 2-Photonen-Mikroskopie ergänzt werden. Weitere Einschränkungen dieses Protokolls sind die Beschränkung auf maximal 3-4 Farben - der blaue Kanal ist für andere Signale außer der Autofluoreszenz schwer zu verwenden - die Beschränkung auf feste Proben und die maximale Stichprobengröße von 30 mm x 30 mm x 15 Mm Auch der starke Geruch und die akute Toxizität von DBE sollten genommen werdenN berücksichtigen. Wenn der letztere Punkt problematisch ist, kann Ethylcinnamat als alternatives Klärungsmittel 9 verwendet werden. Der große Vorteil der Auswahl dieser Mikroskopie-Technik ist die Fähigkeit, das gesamte Organ auf einmal zu analysieren. Bei konventionellen Analysen von Hämatoxylin- und Eosin-gefärbten, formalinfixierten und paraffineingebetteten (FFPE) histologischen Gewebeabschnitten besteht eine hohe Wahrscheinlichkeit, wichtige räumliche Bereiche zu fehlen, wenn nicht jeder einzelne Abschnitt analysiert wird. Darüber hinaus ermöglicht die Lichtbogenmikroskopie nicht nur ein virtuelles Schneiden der Probe in jeder dreidimensionalen Ebene, sondern bietet auch dieses Potenzial, ohne die Probe zu zerstören oder Schneideartefakte zu verursachen. Bei Bedarf kann das feste Organ anschließend für weitere Analysen verarbeitet werden, wie z. B. eine korrelative Licht- und Elektronenmikroskopie, um bestimmte Regionen von Interesse zu lösen. Eine Vorlage für eine solche Studie findet sich in der Arbeit von Karreman et al. , Wo die Korrelation wetteWurde ein 2-Photonen-Mikroskopie-Bildstapel und dreidimensionale Elektronenmikroskopie-Daten erfolgreich gezeigt 41 . Ein weiterer vielversprechender Ansatz könnte die Kombination dieses Protokolls mit der kürzlich veröffentlichten uDISCO-Methode sein, die auch auf einem organischen Lösungsmittel basiert und das die Untersuchung von viel größeren Organen durch einen Standard-LSFM 42 ermöglichen würde.

Während der Evolution der Lichtmikroskopie erschienen viele spezialisierte Formen, die alle entwickelt wurden, um Einschränkungen im Visualisierungsprozess für bestimmte Exemplare zu minimieren. Ein solches Verfahren ist die Lichtbogen-Fluoreszenzmikroskopie (LSFM). Erstmals im Jahre 1903 von Siedentopf und Zsigmondy 1 entwickelt und Anfang der 90er Jahre 2 erste biologische Grundanwendungen gefunden, ist LSFM bis heute zum leistungsstärksten mikroskopischen Werkzeug für die Visualisierung von großen Exemplaren wie intakten Mausorganen mit Fluoreszenzsignalauflösung geworden Bis auf zellulare Ebene. Aufgrund dieser Vorteile, in Kombination mit seinem Potenzial für Live-Zell-Bildgebung, Nature Methods namens LSFM die &quot;Methode des Jahres 2014 3 &quot;. Wie der Name schon sagt, wird die Probenbeleuchtung in einem LSFM durch leichte Blätter durchgeführt, die senkrecht zur Achse des verwendeten Objektivs orientiert sindOder Emissionslicht-Sammlung und anschließende Bilderzeugung. Das Lichtbogen wird gewöhnlich entweder durch Fokussieren von breiten, kollimierten Laserstrahlen mit einer zylindrischen Linse oder durch die schnelle Seitwärtsbewegung von schmalen, fokussierten Laserstrahlen in nur einer horizontalen oder vertikalen Ebene 4 , 5 erzeugt . Auf diese Weise wird nur die Brennebene der Abbildungsoptik beleuchtet, typischerweise mit einer Dicke von 1-4 μm. Folglich werden für eine in der Beleuchtungsebene platzierte Fluoreszenzprobe sowohl die Erzeugung von Streulicht als auch die Effekte des Photobleichens aus Bereichen oberhalb oder unterhalb der Brennebene eliminiert oder stark unterdrückt 6 , 7 . Da alle Out-of-Focus-Flugzeuge nicht beleuchtet sind, werden in diesen Bereichen Photobleicheffekte weggelassen. Im Gegensatz zur herkömmlichen konfokalen oder Multiphotonenmikroskopie sind die Wege des beleuchteten und emittierten Lichts voneinander getrennt, so dass das endgültige Bild qual<html> Nicht von der perfekten Fokussierung des Anregungslichtstrahls durch die Ziele abhängt. Abhängig von der zugrundeliegenden Frage ist es daher möglich, Ziele mit einem enormen Sichtfeld (FOV) zu verwenden, so dass die größtmögliche Fläche der beleuchteten Ebene ohne irgendwelche in xy-Richtung bewegenden Bauteile abgebildet werden kann. In modernen LSFM-Systemen wird ein Fluoreszenzbild des erzeugten optischen Abschnitts auf einer hochempfindlichen ladungsgekoppelten Vorrichtung (CCD) oder komplementären Metalloxid-Halbleiter- (CMOS-) Kameras erfasst, die in der Lage sind, das gesamte Sichtfeld (FOV) zu erfassen, In Mikrosekunden. Daher ist es möglich, durch Bewegen der Probe durch das Lichtblatt und durch Erfassen von Bildern in definierten z-Schritten die vollständige 3D-Information einer Probe in einer angemessenen Zeitspanne 8 , 9 zu erhalten , wodurch diese Technik für die lebende Zelle anwendbar ist Studien 10 ,Ass = &quot;xref&quot;&gt; 11 , 12 . Dennoch, obwohl LSFM eine schnelle, empfindliche und fluoreszenzfreundliche Methode anbietet, ist die Lichtdurchlässigkeit durch die Probe immer noch ein wichtiges Thema, besonders wenn große biologische Proben das Ziel für eine 3D-Analyse sind. Die Lichtdurchlässigkeit wird durch physikalische Aspekte der Absorption und durch Lichtstreuung an Grenzflächen von Strukturen mit unterschiedlichen Brechungsindizes kritisch modifiziert 13 . Wenn daher Proben mehrere Millimeter groß sind, wird LSFM meist mit Clearing-Protokollen kombiniert, um die Proben optisch transparent zu machen. Diese Techniken basieren auf der Idee, Wasser aus dem jeweiligen biologischen Gewebe zu entfernen und es mit wasser- oder (organischen) lösemittelbasierten Immersionsmedien auszutauschen, die so gewählt sind, dass sie die Brechungsindizes der jeweiligen Zielgewebekomponenten eng anpassen. Als Ergebnis wird die laterale Lichtstreuung minimiert und alle Wellenlängen werden minimiertVon Licht kann viel effizienter durch das Gewebe 13 gehen . In vielen Fällen erscheinen die so behandelten biologischen Proben makroskopisch kristallklar, was es ermöglicht, dass LSFM auch auf ganzen Mausorganen mit langen Arbeitsabständen mit geringem Vergrößerungsgrad durchgeführt wird. Hier stellen wir ein Vorbereitungsprotokoll für die Großprobenabbildung in einem Lichtbogenmikroskop vor (siehe Tabelle der Materialien), das wir zur Untersuchung des zellulären Herzinfiltrums in einem Mausmodell der Myokarditis 15 etabliert haben. CD11c.DTR-Mäuse exprimieren den Primaten-Diphtherie-Toxinrezeptor (DTR) unter der Kontrolle des CD11c-Promotors 16 . Folglich werden Zellen in diesen Mäusen, die CD11c zusammen mit dem DTR exprimieren, gegenüber dem Exotoxin von Corynebacterium diphtheria (Diphtherietoxin, DTX) empfindlich gemacht ; Die systemische Behandlung dieser Tiere mit DTX führt zu einer Erschöpfung aller CD11c + ceLl CD11c ist ein Integrin und ist als Zelloberflächenrezeptor für eine Vielzahl unterschiedlicher löslicher Faktoren in Aktivierungs- und Reifungsprozessen vor allem in Zellen der monozytischen Linie 17 involviert. Folglich wurde das CD11c.DTR-Mausmodell intensiv verwendet, um die Rolle der dendritischen Zellen und Makrophagen-Teilmengen im Kontext vieler verschiedener immunologischer Fragen zu untersuchen. Im Laufe der Zeit wurde berichtet, dass CD11c.DTR-Mäuse, die systemisch mit DTX behandelt wurden, nachteilige Nebenwirkungen entwickeln und stark erhöhte Mortalitätsraten aufweisen können 18 , 19 . In letzter Zeit konnten wir die zugrunde liegende Todesursache 15 identifizieren, die die Entwicklung einer fulminanten Myokarditis nach intratrachealer DTX-Anwendung bei diesen Tieren beschreibt. Die Toxin-Herausforderung verursachte zelluläre Zerstörung, auch in zentralen Teilen des Stimulus-Übertragungssystems im Herzen. Dies wurde von massiven CD45 begleitet+ Leukozyten infiltrieren, schließlich führt zu tödlichen Herzrhythmusstörungen. In diesem Fall war nicht nur das Aussehen der Leukozytenpopulation wichtig, sondern auch ihre räumliche Verteilung im Herzen. Diese experimentelle Frage stellt eine Herausforderung für die moderne mikroskopische Bildgebung dar, die wir durch einen Lichtbogenmikroskopieansatz gelöst haben, der durch intravitale Antikörperfärbung und ein organisches Lösemittelbasiertes optisches Clearingprotokoll unterstützt wird.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>diphtheria toxin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D0564</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphate buffered saline</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>L182-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ketamine [50 mg/ml]</td>
			<td>Inresa</td>
			<td>PZN 4089014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>xylazine [2 %]</td>
			<td>Ceva</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>syringe</td>
			<td>Braun</td>
			<td>REF 9161502</td>
			<td>Braun Omincan F&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>indwelt venous catheter&#160;</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>REF 381923</td>
			<td>BD Insyte Autoguard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>small animal respirator</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>73-0044</td>
			<td>MiniVent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anit-CD45 antibody (AF647)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>103124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) disodium salt dihydrate</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>8043.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>catheter (21 G)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>REF 387455</td>
			<td>BD valu-set</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE tube (5 ml)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>EKY9.1</td>
			<td>Rotilabo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethanol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9065.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dibenzyl ether</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>108014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tube rotator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-753</td>
			<td>MACSmix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>agarose (low gelling)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A4018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mold (15x15x5 mm)</td>
			<td>Tissue Tek</td>
			<td>4566</td>
			<td>Cryomold&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>light sheet microscope system</td>
			<td>LaVision Biotec</td>
			<td></td>
			<td>Ultramicroscope&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microscope body</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>MVX10&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>0.5&#160;NA MVPLAPO 2XC, WD 5.5&#160;mm&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sCMOS camera 5.5MP</td>
			<td>Andor Technology</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>488 nm OPSL (50mW) laser</td>
			<td>Coherent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>647 nm&#160; diode laser (50mW)</td>
			<td>Coherent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D image processing &#38; analysis software</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td></td>
			<td>IMARIS Ver. 8.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>transgenic mouse strain</td>
			<td>Steffen Jung et al.</td>
			<td></td>
			<td>CD11c.DTR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>wt mouse strain</td>
			<td>Envigo</td>
			<td></td>
			<td>Balb/c Ola Hsd J</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser Module</td>
			<td>LaVision Biotec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MVPLAPO 2XC Objective Lens</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative visualization of leukocyte infiltrate in a murine model of fulminant myocarditis by light sheet microscopy

Die Lichtbogen-Fluoreszenzmikroskopie (LSFM) ist in Kombination mit chemischen Clearing-Protokollen zum Goldstandard für die Analyse fluoreszenzmarkierter Strukturen in großen biologischen Proben geworden und liegt in der zellulären Auflösung. Mittlerweile ermöglichen die ständige Verfeinerung der zugrunde liegenden Protokolle und die erweiterte Verfügbarkeit von spezialisierten kommerziellen Systemen die Untersuchung der Mikrostruktur ganzer Mausorgane und ermöglichen sogar die Charakterisierung des zellularen Verhaltens in verschiedenen lebenszykologischen Bildgebungsansätzen. Hier beschreiben wir ein Protokoll für die räumliche Vollmontage Visualisierung und Quantifizierung der CD45 + Leukozytenpopulation in entzündeten Mausherzen. Das Verfahren verwendet einen transgenen Mausstamm (CD11c.DTR), der vor kurzem als ein robustes, induzierbares Modell für die Untersuchung der Entwicklung einer fulminanten tödlichen Myokarditis, gekennzeichnet durch tödliche Herzrhythmusstörungen, gezeigt wurde. Dieses Protokoll enthält Myokarditis Induktion, intravitAl-Antikörper-vermittelte Zellfärbung, Organpräparation und LSFM mit anschließender computergestützter Bildnachbearbeitung. Obwohl es als hoch angepasstes Verfahren für unsere besondere wissenschaftliche Frage dargestellt ist, stellt das Protokoll die Blaupause eines leicht einstellbaren Systems dar, das auch ganz andere fluoreszierende Strukturen in anderen Organen und sogar in anderen Spezies ansprechen kann.

Der vorgestellte LSFM-Ansatz analysiert die Leukozytenverteilung und die Menge in murinen Herzen bei der Induktion einer schweren Myokarditis. Abbildung 1A erklärt das Vorbehandlungsprotokoll für die transgenen CD11c.DTR-Mäuse zur Myokarditis-Induktion. Dieser Schritt stellt den notwendigen Auslöser für die Rekrutierung von Leukozyten zum Myokard dar. Nach erfolgreicher DTX-Anwendung entwickeln die Tiere schwere Krankheitssymptome wie allgemeine Schwäche, Anorexie und Gewichtsverlust im Bereich von 2-4 Tagen. Nach 4 Tagen werden die Leukozyten von der iv . Anwendung von Fluorochrom-gekoppeltem Anti-CD45-Antikörper vor der transkardialen Perfusion, um das Blut aus dem Kreislauf zu entfernen. Wenn sie erfolgreich durchgeführt werden, drehen sich das Herz und andere Organe weißlich. Anschließend wird das Organ herausgeschnitten und das Gewebewasser wird mit DBE durch eine aufsteigende Ethanolreihe und eine endgültige Inkubation in DBE ausgetauscht. Abbildung 1B zeigt den FahrplanDer einzelnen Inkubationsschritte, in denen das Organ eine erhebliche Schrumpfung erfährt. Das chemisch freigewordene Organ wird dann auf eine DBE-gefüllte Abbildungskammer auf dem Standard-Mikroskop-Gewebehalter übertragen. Zur Stabilisierung des Organs während der 3D-Bilderfassung wird es durch transparente Agaroseblöcke fixiert. Die detaillierte Positionierung der Probe ist in Abbildung 2 dargestellt. Die Erfassung eines ganzen Bildstapels, bestehend aus 2 Kanälen (Autofluoreszenz und Anti-CD45), dauert ca. 20-30 Minuten und erzeugt eine Datendatei von ca. 16 GB. Schließlich werden die resultierenden Daten als künstliches 3D-Rendering analysiert, bei dem die Leukozytenverteilung in einer Wärmeabbildungsansicht angezeigt wird. In Abbildung 3 (obere Reihe) können die stark entzündeten Bereiche eines Herzens eines DTX-behandelten Tieres durch ihre rötlich-weißliche Erscheinung wahrgenommen werden. Eine detailliertere Untersuchung des 3D-Modells zeigt die Leukozytenkonzentration, insbesondere in Bereichen des Herzleitungssystems, wie der Atriovent<html> Rikuläres Bündel und die Purkinje Fasern. Im Gegensatz dazu zeigen die Herzen von PBS-behandelten Tieren dieses Entzündungsmuster überhaupt nicht (untere Reihe). <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/55450/55450fig1.jpg" /> Abbildung 1: Schema der Induktion und Probenvorbereitung der Diphtherie-Toxin-induzierten Myokarditis. ( A ) Die Entwicklung der Myokarditis wurde durch sie verursacht . Anwendung von Diphtherietoxin (100 ng / Tier). Nach 4 Tagen war die Myokarditis vollständig entwickelt und ein AF647-gekoppelter Anti-CD45-Antikörper (15 μg / Tier) wurde injiziert . Um CD45 + Leukozyten zu detektieren. Die Tiere wurden 2 Stunden später durch zervikale Versetzung geopfert, und die Herzen wurden mit PBS / EDTA (5 mM) gefolgt von 4% PFA perfundiert. ( B ) Nach der Entfernung wurde das Organ mit einer aufsteigenden Ethanolreihe dehydratisiert und schließlich durch Nachtinkubation in Dibenzylether gereinigt..com / files / ftp_upload / 55450 / 55450fig1large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/55450/55450fig2.jpg" /> Abbildung 2: Schema der Probenpositionierung im Mikroskop. Das chemisch gereinigte, transparente Herz (4) wurde auf dem Probenhalter (2 und 5) positioniert und mit Hilfe von gereinigten Agaroseblöcken (6) stabilisiert. Dieses Konstrukt wurde dann in die DBE-gefüllte Glasküvette (3) getaucht. Zur Erfassung wurde eine 0,5 NA Objektivlinse (1) mit einem Arbeitsabstand von 5,5 mm eingesetzt. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55450/55450fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/55450/55450fig3.jpg" /> Abbildung 3: Repräsentative 3D-Renderings von Ganz-oderGan Light-Sheet-Mikroskopie. CD11c.DTR-Mäuse wurden intratracheal mit DTX (obere Reihe) oder PBS (untere Reihe) behandelt. 4 Tage später wurde die Entwicklung der Myokarditis, dargestellt durch CD45 + Leukozyteninfiltration, durch Fluoreszenz-Licht-Blatt-Mikroskopie sichtbar gemacht. Um die CD45 + -Zellen zu färben, wurde ein Anti-CD45-Antikörper, der an AF647 gekoppelt war, iv 2 h injiziert, bevor die Mäuse geopfert wurden. Das Autofluoreszenzsignal des Bindegewebes wird grau dargestellt, während das CD45 + Infiltrat in Wärmeformfarben (blau: low signal; white: high signal) dargestellt wird. Jede Zeile besteht aus 4 digital abgeschnittenen 3D-Renderings und zeigt die Situation innerhalb der Orgel. Die Clipping-Tiefe relativ zum vorderen Teil des Herzens ist über den einzelnen Bildern deklariert. Die Figur wurde von Mann et al. 15 Maßstab = 1 mm. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55450/55450fig3large.jpg" target="_blank">Klicken Sie bitte hier</a>Um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Quantitative Visualization of Leukocyte Infiltrate in a Murine Model of Fulminant Myocarditis by Light Sheet Microscopy

Hier beschreiben wir einen Lichtbogen-Mikroskop-Ansatz, um das Herz-CD45 + -Leukozyten-Infiltrat in einem murinen Modell der aseptischen fulminanten Myokarditis zu visualisieren, das durch die intratracheale Diphtherie-Toxin-Behandlung von CD11.DTR-Mäusen induziert wird.

Quantitative Visualisierung von Leukozyten-Infiltrat in einem Murin-Modell der Fulminant-Myokarditis durch Licht-Blatt-Mikroskopie

Light-sheet fluorescence microscopy (LSFM), in combination with chemical clearing protocols, has become the gold standard for analyzing fluorescently ...

quantitative-visualization-leukocyte-infiltrate-murine-model

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

7.7K Aufrufe.  University of Duisburg/Essen.  Hier beschreiben wir einen Lichtbogen-Mikroskop-Ansatz, um das Herz-CD45 + -Leukozyten-Infiltrat in einem murinen Modell der aseptischen fulminanten Myokarditis zu visualisieren, das durch die intratracheale Diphtherie-Toxin-Behandlung von CD11.DTR-Mäusen induziert wird. 

Serie: Quantitative Visualization of Leukocyte Infiltrate in a Murine Model of Fulminant Myocarditis by Light Sheet Microscopy

A Murine Model of Muscle Training by Neuromuscular Electrical Stimulation

Neuromuscular electrical stimulation (NMES) is a common clinical modality that is widely used to restore1, maintain2 or enhance3-5 muscle functional capacity. Transcutaneous surface stimulation of skeletal muscle involves a current flow between a cathode and an anode, thereby inducing excitement of the motor unit and the surrounding muscle fibers. 
NMES is an attractive modality to evaluate skeletal muscle adaptive responses for several reasons. First, it provides a reproducible experimental model in which physiological adaptations, such as myofiber hypertophy and muscle strengthening6, angiogenesis7-9, growth factor secretion9-11, and muscle precursor cell activation12 are well documented. Such physiological responses may be carefully titrated using different parameters of stimulation (for Cochrane review, see 13). In addition, NMES recruits motor units non-selectively, and in a spatially fixed and temporally synchronous manner14, offering the advantage of exerting a treatment effect on all fibers, regardless of fiber type. Although there are specified contraindications to NMES in clinical populations, including peripheral venous disorders or malignancy, for example, NMES is safe and feasible, even for those who are ill and/or bedridden and for populations in which rigorous exercise may be challenging. 
Here, we demonstrate the protocol for adapting commercially available electrodes and performing a NMES protocol using a murine model. This animal model has the advantage of utilizing a clinically available device and providing instant feedback regarding positioning of the electrode to elicit the desired muscle contractile effect. For the purpose of this manuscript, we will describe the protocol for muscle stimulation of the anterior compartment muscles of a mouse hindlimb.

A murine model of neuromuscular electrical stimulation (NMES), a safe and inexpensive clinical modality, to the anterior compartment muscles is described. This model has the advantage of modifying a readily available clinical device for the purpose of eliciting targeted and specific muscle contractions in mice.

Einem Mausmodell der Muscle Training durch neuromuskuläre Elektrostimulation

Neuromuscular electrical stimulation (NMES) is a common clinical modality that is widely used to restore1, maintain2 or enhance3-5 muscle functional ...

Forschung

Medizin

Using Quantitative Real-time PCR to Determine Donor Cell Engraftment in a Competitive Murine Bone Marrow Transplantation Model

Murine bone marrow transplantation models provide an important tool in measuring hematopoietic stem cell (HSC) functions and determining genes/molecules that regulate HSCs. In these transplant model systems, the function of HSCs is determined by the ability of these cells to engraft and reconstitute lethally irradiated recipient mice. Commonly, the donor cell contribution/engraftment is measured by antibodies to donor- specific cell surface proteins using flow cytometry. However, this method heavily depends on the specificity and the ability of the cell surface marker to differentiate donor-derived cells from recipient-originated cells, which may not be available for all mouse strains. Considering the various backgrounds of genetically modified mouse strains in the market, this cell surface/ flow cytometry-based method has significant limitations especially in mouse strains that lack well-defined surface markers to separate donor cells from congenic recipient cells. Here, we reported a PCR-based technique to determine donor cell engraftment/contribution in transplant recipient mice. We transplanted male donor bone marrow HSCs to lethally irradiated congenic female mice. Peripheral blood samples were collected at different time points post transplantation. Bone marrow samples were obtained at the end of the experiments. Genomic DNA was isolated and the Y chromosome specific gene, Zfy1, was amplified using quantitative Real time PCR. The engraftment of male donor-derived cells in the female recipient mice was calculated against standard curve with known percentage of male vs. female DNAs. Bcl2 was used as a reference gene to normalize the total DNA amount. Our data suggested that this approach reliably determines donor cell engraftment and provides a useful, yet simple method in measuring hematopoietic cell reconstitution in murine bone marrow transplantation models. Our method can be routinely performed in most laboratories because no costly equipment such as flow cytometry is required.

Determining donor cell engraftment presents a challenge in mouse bone marrow transplant models that lack well-defined phenotypical markers. We described a methodology to quantify male donor cell engraftment in female transplant recipient mice. This method can be used in all mouse strains for the study of HSC functions.

Mittels quantitativer real-time PCR zum Donor Cell Engraftment in einem Competitive Murine Bone Marrow Transplantation Modell fest

Murine bone marrow transplantation models provide an important tool in measuring hematopoietic stem cell (HSC) functions and determining genes/molecules ...

Murine Model of Wound Healing

Wound healing and repair are the most complex biological processes that occur in human life. After injury, multiple biological pathways become activated. Impaired wound healing, which occurs in diabetic patients for example, can lead to severe unfavorable outcomes such as amputation. There is, therefore, an increasing impetus to develop novel agents that promote wound repair. The testing of these has been limited to large animal models such as swine, which are often impractical. Mice represent the ideal preclinical model, as they are economical and amenable to genetic manipulation, which allows for mechanistic investigation. However, wound healing in a mouse is fundamentally different to that of humans as it primarily occurs via contraction. Our murine model overcomes this by incorporating a splint around the wound. By splinting the wound, the repair process is then dependent on epithelialization, cellular proliferation and angiogenesis, which closely mirror the biological processes of human wound healing. Whilst requiring consistency and care, this murine model does not involve complicated surgical techniques and allows for the robust testing of promising agents that may, for example, promote angiogenesis or inhibit inflammation. Furthermore, each mouse acts as its own control as two wounds are prepared, enabling the application of both the test compound and the vehicle control on the same animal. In conclusion, we demonstrate a practical, easy-to-learn, and robust model of wound healing, which is comparable to that of humans.

A murine model of cutaneous wound healing that can be used to assess therapeutic compounds in physiological and pathophysiological settings.

Mausmodell der Wundheilung

Wound healing and repair are the most complex biological processes that occur in human life. After injury, multiple biological pathways become activated. ...

A Murine Model of Subarachnoid Hemorrhage

In this video publication a standardized mouse model of subarachnoid hemorrhage (SAH) is presented. Bleeding is induced by endovascular Circle of Willis perforation (CWp) and proven by intracranial pressure (ICP) monitoring. Thereby a homogenous blood distribution in subarachnoid spaces surrounding the arterial circulation and cerebellar fissures is achieved. Animal physiology is maintained by intubation, mechanical ventilation, and continuous on-line monitoring of various physiological and cardiovascular parameters: body temperature, systemic blood pressure, heart rate, and hemoglobin saturation. Thereby the cerebral perfusion pressure can be tightly monitored resulting in a less variable volume of extravasated blood. This allows a better standardization of endovascular filament perforation in mice and makes the whole model highly reproducible. Thus it is readily available for pharmacological and pathophysiological studies in wild type and genetically altered mice.

A standardized mouse model of subarachnoid hemorrhage by intraluminal Circle of Willis perforation is described. Vessel perforation and subarachnoid bleeding are monitored by intracranial pressure monitoring. In addition various vital parameters are recorded and controlled to maintain physiologic conditions.

Einem Mausmodell der Subarachnoidalblutung

In this video publication a standardized mouse model of subarachnoid  hemorrhage (SAH) is presented. Bleeding is induced by endovascular Circle of  Willis ...

Reproducable Paraplegia by Thoracic Aortic Occlusion in a Murine Model of Spinal Cord Ischemia-reperfusion

Background 
Lower extremity paralysis continues to complicate aortic interventions. The lack of understanding of the underlying pathology has hindered advancements to decrease the occurrence this injury.&#160;The current model demonstrates reproducible lower&#160;extremity paralysis following thoracic aortic occlusion.
Methods 
Adult male C57BL6 mice were anesthetized with isoflurane. Through a cervicosternal incision the aorta was exposed. The descending thoracic aorta and left subclavian arteries were identified without entrance into pleural space. Skeletonization of these arteries was followed by immediate closure (Sham) or occlusion for 4 min (moderate ischemia) or 8 min (prolonged ischemia). The sternotomy and skin were closed and the mouse was transferred to warming bed for recovery.&#160; Following recovery, functional analysis was obtained at 12 hr intervals until 48 hr.
Results 
Mice that underwent sham surgery showed no observable hind&#160;limb deficit. Mice subjected to moderate ischemia for 4 min had minimal functional deficit at 12 hr followed by progression to complete paralysis at 48 hr. Mice subjected to prolonged ischemia had an immediate paralysis with no observable hind-limb movement at any point in the postoperative period. There was no observed intraoperative or post&#160;operative mortality.
Conclusion 
Reproducible lower extremity paralysis whether immediate or delayed can be achieved in a murine model. Additionally, by using a median sternotomy and careful dissection, high survival rates, and reproducibility can be achieved.

The lack of mechanistic understanding of spinal cord ischemia-reperfusion injury has hindered further adjuncts to prevent paraplegia following high risk aortic operations. Thus, the development of animal models is imperative. This manuscript demonstrates reproducible lower extremity paralysis following thoracic aortic occlusion in a murine model.

Reproduzierbare Paraplegie von thorakalen Aorta Occlusion in einem Mausmodell der Spinal Cord Ischämie-Reperfusion

Background
Lower extremity paralysis continues to complicate aortic interventions. The lack of understanding of the underlying pathology has hindered ...

Noninvasive Assessment of Cardiac Abnormalities in Experimental Autoimmune Myocarditis by Magnetic Resonance Microscopy Imaging in the Mouse

Myocarditis is an inflammation of the myocardium, but only ~10% of those affected show clinical manifestations of the disease. To study the immune events of myocardial injuries, various mouse models of myocarditis have been widely used. This study involved experimental autoimmune myocarditis (EAM) induced with cardiac myosin heavy chain (Myhc)-&#945; 334-352 in A/J mice; the affected animals develop lymphocytic myocarditis but with no apparent clinical signs. In this model, the utility of magnetic resonance microscopy (MRM) as a non-invasive modality to determine the cardiac structural and functional changes in animals immunized with Myhc-&#945; 334-352 is shown. EAM and healthy mice were imaged using a 9.4 T (400 MHz) 89 mm vertical core bore scanner equipped with a 4 cm millipede radio-frequency imaging probe and 100 G/cm triple axis gradients. Cardiac images were acquired from anesthetized animals using a gradient-echo-based cine pulse sequence, and the animals were monitored by respiration and pulse oximetry. The analysis revealed an increase in the thickness of the ventricular wall in EAM mice, with a corresponding decrease in the interior diameter of ventricles, when compared with healthy mice. The data suggest that morphological and functional changes in the inflamed hearts can be non-invasively monitored by MRM in live animals. In conclusion, MRM offers an advantage of assessing the progression and regression of myocardial injuries in diseases caused by infectious agents, as well as response to therapies.

This study demonstrates the successful establishment of magnetic resonance microscopy imaging as a non-invasive tool to assess the cardiac abnormalities in mice affected with autoimmune myocarditis. The data indicate that the technique can be used to monitor the disease-progression in live animals.

Nicht-invasive Beurteilung der Herzfehlbildungen in experimentellen autoimmunen Myokarditis von Magnetic Resonance Imaging Microscopy in der Maus

Myocarditis is an inflammation of the myocardium, but only ~10% of those affected show clinical manifestations of the disease. To study the immune events ...

Evaluation of Tumor-infiltrating Leukocyte Subsets in a Subcutaneous Tumor Model

Specialized immune cells that infiltrate the tumor microenvironment regulate the growth and survival of neoplasia.&#160; Malignant cells must elude or subvert anti-tumor immune responses in order to survive and flourish. Tumors take advantage of a number of different mechanisms of immune &#8220;escape,&#8221; including the recruitment of tolerogenic DC, immunosuppressive regulatory T cells (Tregs), and myeloid-derived suppressor cells (MDSC) that inhibit cytotoxic anti-tumor responses. Conversely, anti-tumor effector immune cells can slow the growth and expansion of malignancies: immunostimulatory dendritic cells, natural killer cells which harbor innate anti-tumor immunity, and cytotoxic T cells all can participate in tumor suppression. The balance between pro- and anti-tumor leukocytes ultimately determines the behavior and fate of transformed cells; a multitude of human clinical studies have borne this out. Thus, detailed analysis of leukocyte subsets within the tumor microenvironment has become increasingly important. Here, we describe a method for analyzing infiltrating leukocyte subsets present in the tumor microenvironment in a mouse tumor model. Mouse B16 melanoma tumor cells were inoculated subcutaneously in C57BL/6 mice. At a specified time, tumors and surrounding skin were resected en bloc and processed into single cell suspensions, which were then stained for multi-color flow cytometry. Using a variety of leukocyte subset markers, we were able to compare the relative percentages of infiltrating leukocyte subsets between control and chemerin-expressing tumors. Investigators may use such a tool to study the immune presence in the tumor microenvironment and when combined with traditional caliper size measurements of tumor growth, will potentially allow them to elucidate the impact of changes in immune composition on tumor growth. Such a technique can be applied to any tumor model in which the tumor and its microenvironment can be resected and processed.

This protocol describes a method for the detailed evaluation of leukocyte subsets within the tumor microenvironment in a mouse tumor model. Chemerin-expressing B16 melanoma cells were implanted subcutaneously into syngeneic mice. Cells from the tumor microenvironment were then stained and analyzed by flow cytometry, allowing for detailed leukocyte subset analyses.

Bewertung der Tumor-infiltrierenden Leukozyten-Untergruppen in einer subkutanen Tumormodell

Specialized immune cells that infiltrate the tumor microenvironment regulate the growth and survival of neoplasia.&#160; Malignant cells must elude or ...

Evaluation of Lung Metastasis in Mouse Mammary Tumor Models by Quantitative Real-time PCR

Metastatic disease is the spread of malignant tumor cells from the primary cancer site to a distant organ and is the primary cause of cancer associated death 1. Common sites of metastatic spread include lung, lymph node, brain, and bone 2. Mechanisms that drive metastasis are intense areas of cancer research. Consequently, effective assays to measure metastatic burden in distant sites of metastasis are instrumental for cancer research. Evaluation of lung metastases in mammary tumor models is generally performed by gross qualitative observation of lung tissue following dissection. Quantitative methods of evaluating metastasis are currently limited to ex vivo and in vivo imaging based techniques that require user defined parameters. Many of these techniques are at the whole organism level rather than the cellular level 3-6. Although newer imaging methods utilizing multi-photon microscopy are able to evaluate metastasis at the cellular level 7, these highly elegant procedures are more suited to evaluating mechanisms of dissemination rather than quantitative assessment of metastatic burden. Here, a simple in vitro method to quantitatively assess metastasis is presented. Using quantitative Real-time PCR (QRT-PCR), tumor cell specific mRNA can be detected within the mouse lung tissue.

This protocol describes how to use quantitative Real-time PCR (QRT-PCR) to detect tumor cell specific mRNA representing metastasis within the mouse lung tissue.

Beurteilung von Lungenmetastasen in Maus-Mammatumormodelle durch quantitative Echtzeit-PCR

Metastatic disease is the spread of malignant tumor cells from the primary cancer site to a distant organ and is the primary cause of cancer associated ...

Reproducible Arterial Denudation Injury by Infrarenal Abdominal Aortic Clamping in a Murine Model

Percutaneous vascular interventions uniformly result in arterial denudation injuries that subsequently lead to thrombosis and restenosis. These complications can be attributed to impairments in re-endothelialization within the wound margins. Yet, the cellular and molecular mechanisms of re-endothelialization remain to be defined. While several animal models to study re-endothelialization after arterial denudation are available, few are performed in the mouse because of surgical limitations. This undermines the opportunity to exploit transgenic mouse lines and investigate the contribution of specific genes to the process of re-endothelialization. Here, we present a step-by-step protocol for creating a highly reproducible murine model of arterial denudation injury in the infrarenal abdominal aorta using external vascular clamping. Immunocytochemical staining of injured aortas for fibrinogen and &#946;-catenin demonstrate the exposure of a pro-thrombotic surface and the border of intact endothelium, respectively. The method presented here has the advantages of speed, excellent overall survival rate, and relative technical ease, creating a uniquely practical tool for imposing arterial denudation injury in transgenic mouse models. Using this method, investigators may elucidate the mechanisms of re-endothelialization under normal or pathological conditions.

Understanding the cellular and molecular mechanisms of re-endothelialization following arterial denudation injury is of paramount importance in preventing thrombosis and restenosis of arteries. Here we describe a protocol for reproducible arterial denudation injury of the infrarenal abdominal aorta. The procedure was developed to investigate the underlying mechanisms that regulate endothelial regeneration using mouse models.

Reproduzierbare Arterielle Denudation Verletzung von Infra Abdominal Aortic Spannen in einem Mausmodell

Percutaneous vascular interventions uniformly result in arterial denudation injuries that subsequently lead to thrombosis and restenosis. These ...

Intravital Microscopy of Monocyte Homing and Tumor-Related Angiogenesis in a Murine Model of Peripheral Arterial Disease

The therapeutic goal for peripheral arterial disease and ischemic heart disease is to increase blood flow to ischemic areas caused by hemodynamic stenosis. Vascular surgery is a viable option in selected cases, but for patients without indications for surgery such as progression to rest pain, critical limb ischemia, or major disruptions to life or work, there are few possibilities for mitigating their disease. Cell therapy via monocyte-enhanced perfusion through the stimulation of collateral formation is one of a few non-invasive options.
Our group examines arteriogenesis after monocyte transplantation into mice using the hindlimb ischemia model. Previously, we have demonstrated improvement in hindlimb perfusion using tetanus-stimulated syngeneic monocyte transplantation. In addition to the effects on the collateral formation, tumor growth could be affected by this therapy as well. To investigate these effects, we use a basement membrane-like matrix mouse model by injecting the extracellular matrix of the Engelbreth-Holm-Swarm sarcoma into the flank of the mouse, after occlusion of the femoral artery.
After the artificial tumor studies, we use intravital microscopy to study in vivo tumor-angiogenesis and monocyte homing within collateral arteries. Previous studies have described the histological examination of animal models, which presupposes subsequent analysis to post-mortem artifacts. Our approach visualizes monocyte homing to areas of collateralization in real time sequences, is easy to perform, and investigates the process of arteriogenesis and tumor angiogenesis in vivo.

Monocytes are important mediators of arteriogenesis in the context of peripheral arterial disease. Using a basement membrane-like matrix and intravital microscopy, this protocol investigates monocyte homing and tumor-related angiogenesis after monocyte injection in the femoral artery ligation murine model.