This study was supported by the Swiss National Science Foundation (Grant 32003B_127619).

Die Quadrizeps Muskelbiopsie aus einem narkotisierten Schwein genommen, aus denen Mitochondrien durch differentielle Zentrifugation isoliert werden. Das Schwein wird danach für ein anderes Experiment verwendet. Die Studie wird in Übereinstimmung mit den National Institutes of Health Leitlinien für die Pflege und Verwendung von Versuchstieren und mit Zustimmung des Animal Care Committee des Kantons Bern, Schweiz durchgeführt. 1. Skelettmuskel Homogenisieren und Mitochondriale Isolation <ol><li> Excise 5-10 g Quadrizeps Probe von einem narkotisierten Schwein. Im vorliegenden Test verwenden Schweineskelettmuskel. Dieses Protokoll kann auch von anderen Spezies Mitochondrien zu isolieren , verwendet werden (zB Ratten, Mäuse, Mensch, etc.). HINWEIS: Dieser Schritt ist von einem Facharzt mit Erfahrung in der Chirurgie durchgeführt wird. <ol><li> Sedate Schweine mit intramuskulär Ketamin (20 mg / kg) und Xylazin (2 mg / kg), vor der Narkose mit intra induziertvenöse Midazolam (0,5 mg / kg, sowie Atropin 0,02 mg / kg). Aufrechterhaltung einer Anästhesie mit kontinuierlicher intravenöser Infusion von Propofol (4-8 mg / kg pro h) und Fentanyl (30 &amp; mgr; g / kg pro h) während der Operation. </li></ol></li><li> Sofort tauchen in ein Becherglas mit 20 ml eiskaltem mitochondrialen Isolationspuffer (Tabelle 1) , um die Gewebeprobe. HINWEIS: Die Puffer während der Homogenisierung verwendet und Zentrifugationen sollte mit Cytosol kompatibel mit einer ionischen und osmotische Stärke eine physiologisch relevanten pH eiskalt und haben sein. </li><li> Wiegen Sie die Gewebeprobe in das Becherglas auf einer analytischen tarierten Balance. Tarieren mit dem Becher 20 ml Isolationspuffer enthält. </li><li> Das Becherglas auf einem Eiskübel. HINWEIS: alle nächsten Schritte aus, um für die Homogenisierung Verfahren bei der Eiskübel Temperatur und halten alle Puffer auf dem Eis Eimer. </li><li> Mince die Skelettmuskulatur in den Becher (auf Eis halten) in 1-2 mm kleine Stücke für 3-4 min mit feinen scissors. </li><li> Spülen Sie das zerkleinerte Gewebe im Becherglas zweimal mit eiskaltem Isolationspuffer (jeweils 20 ml Waschschritt). </li><li> Suspendieren des Gewebes in 10 Volumina des Isolationspuffer pro Gewebegewicht (g), die 5 mg Protease / g Gewebe. </li><li> Das Becherglas in einem Eisbad auf den Magnetrührer und unter Rühren für 10 min. </li><li> Verdünne die Suspension in dem Becherglas mit zusätzlichen 10 Volumina des Isolationspuffer pro Gewebegewicht (g), supplementiert mit 0,2% (Gewicht / Volumen) entfettetes Rinderserumalbumin (BSA). </li><li> Dekantieren alle der Isolationspuffer mit 0,2% BSA ergänzt und spülen das Gewebe im Becherglas zweimal mit eiskaltem Isolationspuffer mit 0,2% BSA ergänzt war (jeweils 20 ml Waschschritt). </li><li> Resuspendieren des Gewebes in 10 Volumina Isolationspuffer pro Gewebegewicht (g) mit 0,2% BSA ergänzt mit entfetteter. </li><li> Homogenisieren des Gewebes mit einem halbautomatischen Glas-Homogenisator (auf Eis gehalten) mit einem locker sitzende Stößel (10 Schläge). HINWEIS: Homogenize die Gewebe immer in der gleichen Weise (gleiche Anzahl von Schlägen, beispielsweise 10 Hübe). Eine höhere Anzahl von Hüben beschädigen und entkoppeln kann die Mitochondrien. Vorzugsweise homogenisieren das Gewebe eines automatisierten Homogenisator. Manuell (und subjektiv) homogenisierte Gewebeproben in Glas Homogenisatoren können unterschiedliche Qualitäten von isolierten Mitochondrien produzieren. </li><li> Zentrifuge das homogenisierte Gewebe bei 4 ° C für 10 min bei 10.000 x g. HINWEIS: Alle Zentrifugationsschritte werden in Zentrifugen mit Festwinkelrotoren ausgeführt. </li><li> Überstand verwerfen eine serologische Pipette und das Pellet in BSA-ergänzt eiskaltem Isolationsmedium (10 ml / g Gewebe). </li><li> Zentrifugiere die Suspension bei 4 ° C für 10 min bei 350 x g. </li><li> Reservieren Sie den Überstand eine serologische Pipette und verwerfen das Pellet (Zelltrümmer). </li><li> Filtriere den Überstand in einen Becher (auf Eis gehalten) durch zwei Lagen Gaze (17 Fäden / cm 2) zu entfernen Zelle DEBRist. </li><li> Zentrifuge die filtrierte Suspension bei 4 ° C für 10 min bei 7.000 x g. </li><li> Überstand verwerfen und resuspendieren das rohe mitochondriale Pellet in dem Isolationspuffer (5 ml / g Gewebe), supplementiert mit 0,2% (Gewicht / Volumen) BSA und zentrifugiert die Suspension bei 4 ° C für 10 min bei 7.000 x g. </li><li> Überstand verwerfen und resuspendieren das rohe mitochondriale Pellet in Waschpuffer (Tabelle 1). Zentrifugiere die Suspension wieder bei 4 ° C für 10 min bei 7.000 x g. </li><li> Überstand verwerfen und resuspendieren das rohe mitochondriale Pellet in Waschpuffer und Zentrifugieren Sie die Suspension wieder bei 4 ° C für 10 min bei 7000 x g. </li><li> Überstand verwerfen und resuspendieren das rohe mitochondriale Pellet in 1,0 ml Waschpuffer. </li><li> Bestimmen Sie die Proteinkonzentration der Mitochondrien-Suspension und halten Sie die konzentrierte mitochondriale Suspension auf Eis. HINWEIS: Die Proteinkonzentration kann mit jedem Standard-Methode gemessen werden. </li><li> Grade bevorzu Respirationstest Assays resuspendieren in dem Atmungspuffer auf eine Endkonzentration von 0,4 mg / mL mitochondrialen Protein die mitochondriale Suspension. </li></ol> 2. Hochauflösende Respirationstest <ol><li> Pipette 2,1 ml Atmungspuffer (Tabelle 1) 16 in eine hochauflösende Oxygraph Kammer und rühren Sie den Puffer kontinuierlich einen magnetischen Rührstab in der Kammer unter Verwendung von (700 rpm) bei 37 ° C für 1 h , bis eine stabile Sauerstofffluss Signal der polarographischen Sauerstoffsensor erhalten wird. HINWEIS: Polarographische Sauerstoffelektroden in jeder Oxygraph Kammer, um die Sauerstoffkonzentration zu messen und den Sauerstoffverbrauch (Fluss) in jeder Kammer zu berechnen. Die Sauerstoffkonzentration und der Sauerstoffverbrauch Raten (Fluss) sind Echtzeit-Online in einem Computer zur Datenerfassung und Analyse unter Verwendung von Software angezeigt. Darüber hinaus, um genaue und zuverlässige Ergebnisse, instrumental Sauerstoff Hintergrundkorrektur sollte, um sicherzustellen seinnach den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. HINWEIS: Genau 2,1 ml Atmungspuffer wird für die Kalibrierung eines abschließenden Kammervolumen von 2,0 mL in die Kammer hinzugefügt, nachdem die Stopfen verschließen. </li><li> Führen Sie eine Luftkalibrierung des polarographischen Sauerstoffsensors nach Protokollen des Herstellers 17. HINWEIS: Während der Luftkalibrierung, mit einer Gasphase vorhanden ist, die Medien Sauerstoffkonzentration in der Größenordnung von 15-20 min ins Gleichgewicht wird. Je nach Temperatur, Luftdruck und die Löslichkeit von Medien -Sauerstoff-Konzentration kann berechnet werden. </li><li> die Atmung Medium aus der Oxygraph Kammer Nach Luftkalibrierung, absaugen und 2,1 ml isolierter Mitochondrien-Suspension (0,4 mg / ml mitochondriale Protein) aus Schritt 1.24 zu einer Kammer des Oxygraph hinzuzufügen. HINWEIS: Das Volumen der Atmungspuffer ist abhängig von der Geräteeinstellung und Hersteller. Für hochauflösende Respirometrie, die 2,1 ml der Atmung buffer zur Kalibrierung eines abschließenden Kammervolumen von 2,0 mL in die Kammer hinzugefügt, nachdem die Stopfen verschließen. </li><li> Schließen der Oxygraph Kammer durch Einführen des Stopfens. </li><li> Rühren Sie die mitochondriale Suspension kontinuierlich einen magnetischen Rührstab in der Kammer (700 Umdrehungen pro Minute) bei 37 ° C und Aufzeichnung der Zellatmung zu Beginn der Studie unter Verwendung von 3-5 min, bis eine stabile Sauerstoffflusssignal erreicht wird. HINWEIS: Die Sauerstoffkonzentration und Sauerstofffluss - Signal in Echtzeit online in einem Computer angezeigt unter Verwendung von Software zur Datenerfassung und Analyse 17. </li><li> Anschließend injizieren Substrate und Inhibitoren für die mitochondriale Atmung durch die Titan-Injektionsöffnungen der Anschläge die folgenden Standardprotokolle verwenden. </li></ol> 3. Komplexe I-abhängige Respiration <ol><li> Bereiten Sie eine Oxygraph Kammer die isolierte mitochondriale Suspension (0,4 mg / ml) nach dem Verfahren enthält, in den Schritten von 2,1 bis 2,5 undwarten auf ein stabiles Signal. </li><li> Injizieren von 12,5 &amp; mgr; l von 0,8 M Malat (5 mM Endkonzentration) und 10 &amp; mgr; l 2 M Glutamat (10 mM Endkonzentration) in die Oxygraph enthaltenden Kammer getrennt mitochondriale Suspension (0,4 mg / ml) durch die Titaninjektionsöffnung der Kammer Topfen und Aufzeichnung der Zellatmung für 3-5 Minuten, bis ein stabiler Sauerstoffflusssignal erreicht wird. Hinweis: alle Injektionen in den folgenden Schritten werden durch die Titan-Injektionsöffnungen von Anschlägen durchgeführt Spritzen verwenden. </li><li> Einzuspritzen 10 ul 0,05 M ADP (0,25 mM) in die Kammer durch die Oxygraph Titan Injektionsöffnung der Kammer Topfen und aufzuzeichnen erhöht mitochondrialen Atmung, bis die Sauerstoffflusssignal, nimmt dann ab und stabilisiert (3-5 min). HINWEIS: Das Plateau der Atmung nach ADP hinaus zeigt an, dass ADP-Konzentration hoch und sättigenden war. Je nach der Menge der Mitochondrien während der Atmung verwendet wird, sollte ADP-Konzentration titriert werden,für einen stabilen Zustand 3 Sauerstoffverbrauch (maximale Atmung). Die Zugabe von ADP in der mitochondrialen Suspension wird eine Erhöhung des Sauerstoffverbrauchs und der Sauerstoffflusssignal erhöht (Zustand 3 Atmung) induzieren. Nachdem der ADP verbraucht wird, wird der Sauerstofffluss Signal (Zustand 4 Atmung) zu verringern. </li></ol> 4. Komplexe II-abhängige Respiration <ol><li> Bereiten Sie eine Oxygraph Kammer isolierte mitochondriale Suspension, die (0,4 mg / ml) nach dem in den Schritten beschriebenen Verfahren 2,1-2,5 und für ein stabiles Signal warten. </li><li> Injizieren 2 ul 0,2 mM Rotenon (0,2 uM), &quot;Vorsicht&quot; in die Oxygraph Kammer durch die Titaninjektionsöffnung der Kammer Stopfens unter Verwendung einer Spritze und die Zellatmung für 3-5 min, bis ein stabiler Sauerstoffflusssignal aufzuzeichnen erreicht. HINWEIS: Rotenon ist ein gefährliches Gift und kann erhebliche Auswirkungen auf die menschliche Gesundheit haben. </li><li> Einzuspritzen 20 ul 1 M Succinat (10 mM) in die Oxygraph chBernstein und Rekord mitochondriale Atmung für 3-5 Minuten, bis eine stabile Sauerstoffflusssignal erreicht wird. </li><li> Einzuspritzen 10 ul 0,05 M ADP (0,25 mM) in die Kammer durch die Oxygraph Titan Injektionsöffnung der Kammer Topfen und aufzuzeichnen Zellatmung, bis der Sauerstoffflusssignal ansteigt, stabilisiert, nimmt dann ab und stabilisiert (3-5 min). HINWEIS: Die Zugabe von ADP in der mitochondrialen Suspension wird eine Erhöhung des Sauerstoffverbrauchs und der Sauerstoffflusssignal auslösen wird (Zustand 3 Atmung) erhöhen. Nachdem der ADP verbraucht wird, wird der Sauerstofffluss Signal (Zustand 4 Atmung) zu verringern. </li></ol> 5. Komplex IV-abhängige Respiration <ol><li> Bereiten Sie eine Oxygraph Kammer isolierte mitochondriale Suspension, die (0,4 mg / ml) nach dem Verfahren in den Schritten 2.1 bis 2.5 des Protokolls und warten auf ein stabiles Signal. </li><li> Dann injizieren 2,5 ul von 0,8 mM Ascorbat (1 mM). Unmittelbar danach 2,5 &amp; mgr; l von 0,2 injizierenM TMPD (0,25 mM) und 10 &amp; mgr; l von 0,05 M ADP (0,25 mM) in die Oxygraph Kammer und Aufzeichnung der Zellatmung, bis das Signal erhöht Sauerstofffluss und stabilisiert (3-5 min). </li><li> injizieren schließlich 10 &amp; mgr; l von 1 M Natriumazid (5 mM) &quot;Vorsicht&quot; in die Oxygraph Kammer und aufzuzeichnen Zellatmung, bis die Sauerstoffflusssignal ab und stabilisiert. HINWEIS: Natriumazid ein gefährliches Gift ist und einen erheblichen Einfluss auf die menschliche Gesundheit haben kann. </li></ol> 6. Cytochrome C-Test <ol><li> Bereiten Sie eine Oxygraph Kammer isolierte mitochondriale Suspension, die (0,4 mg / ml) nach dem Verfahren in den Schritten 2.1 bis 2.5 des Protokolls und warten auf ein stabiles Signal. </li><li> Injizieren von 12,5 &amp; mgr; l von 0,8 M Malat (5 mM Endkonzentration) und 10 &amp; mgr; l 2 M Glutamat (10 mM Endkonzentration) in die Kammer Oxygraph isoliert mitochondriale Suspension mit (0,4 mg / ml) durch die Titaninjektionsöffnung der Kammer stopperund notieren Sie die Zellatmung für 3-5 Minuten, bis ein stabiler Sauerstoffflusssignal erreicht wird. </li><li> Einzuspritzen 10 ul 0,5 M ADP (2,5 mM) in die Oxygraph Kammer durch die Titaninjektionsöffnung der Kammer Topfen und Aufzeichnung mitochondrialen Atmung, bis der Sauerstoffflusssignal zunimmt, nimmt dann ab und stabilisiert (3-5 min). </li><li> Schließlich injizieren 5 ul 4 mM Cytochrom c (10 &amp; mgr; M) in die Oxygraph Kammer und aufzuzeichnen Zellatmung für 5 Minuten, bis ein stabiler Sauerstoffflusssignal erreicht wird. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

In der vorliegenden Studie beschreiben wir ein Protokoll hoher Qualität, intakt und eng gekoppelten Skelettmuskel Mitochondrien durch differentielle Zentrifugation isoliert werden, die für funktionelle Studien wie hochauflösenden Respirometrie verwendet werden kann. Um intakt und eng gekoppelten Mitochondrien zu isolieren, gibt es einige kritische Punkte im Rahmen der vorliegenden Protokoll berücksichtigt werden. Nach dem Skelettgewebe Ernte, sollte es sofort in eiskaltem mitochondrialen Isolationspuffer eingetaucht werden. Alle Zentrifugationsschritte sollten bei 4 ° C und mitochondriale Suspension durchgeführt werden sollte immer auf Eis während der Isolierung zu halten. Die Isolationsverfahren sollte so schnell wie möglich durchgeführt werden. Das Homogenat sollte in sauberen Waschmittel freien Zentrifugenröhrchen zentrifugiert werden. Am Ende des Verfahrens sollte die mitochondriale Suspension konzentriert werden aufbewahrt und unmittelbar vor verdünnt werden, um Respirationstest. Da Respirometrie Daten sind als pmol pro Sekunde pe ausgedrücktr Milligramm mitochondrialen Protein, ist es wichtig, eine gute Technik zu verwenden, um genau die mitochondriale Proteinkonzentration nach der Isolation messen. In einigen Mitochondrien-Isolierungsverfahren kann es vorkommen, dass die Mitochondrien entkoppelt sind oder nicht verbrauchen Sauerstoff richtig hochauflösende Respirometrie verwenden. Um diese Probleme zu überwinden, sollte das Gewebe stets in der gleichen Weise homogenisiert werden (dieselbe Anzahl von Strichen) unter Verwendung des Homogenisators mit der lose sitzende Stößel (Schritt 1.12). Hier wir homogenisieren immer das Skelettmuskelgewebe mit 10 Hüben eines automatisierten Homogenisator. Eine höhere Anzahl von Hüben beschädigen und entkoppeln kann die Mitochondrien. Manuell (und subjektiv) homogenisierte Gewebeproben in Glas Homogenisatoren können unterschiedliche Qualitäten von isolierten Mitochondrien produzieren. Das Einfrieren der Mitochondrien kann auch in abgekoppelt Mitochondrien führen und man sollte darauf achten, dass Zentrifugationen bei 4 ° C durchgeführt werden und nicht unter dieser temperatur. Die mitochondriale Integrität kann auch beeinträchtigt werden, wenn der pH der Pufferlösungen ist falsch oder die Zentrifugationsröhrchen sind nicht sauber. Man sollte sicherstellen, dass die Zentrifugenröhrchen sind Waschmittel frei und richtig gewaschen. Einer der ersten wichtigen Faktoren bei der Isolierung betrachtet werden soll, Gewebe auf sanfte Weise zu homogenisieren. Weichteile erfordern sanfte mechanische Kräfte während der Homogenisierung angewendet, während Hartgewebe viel stärkere mechanische Kräfte erfordern. Puffer während der Homogenisierung und Zentrifugationen verwendet werden, sollten mit Cytosol mit einer ionischen und osmotische Stärke kompatibel einen physiologisch relevanten pH eiskalt und haben sein. Für harte Gewebe, wie Skelettmuskel, nach mechanischer Homogenisierung können Proteasen wie Trypsin zugegeben werden , um das Gewebe 4, 5 disaggregieren. Einige der Einschränkungen der isolierten Mitochondrien, basierend auf dDifferenzweg Zentrifugation sind i) die möglicherweise beschädigten Mitochondrien während der Homogenisierung und Isolationsprozedur 19, ii) die großen Mengen der Gewebeproben für die mitochondriale Isolierung erforderlich ist , iii) der mögliche Verlust und Veränderungen in bestimmten mitochondrialen Elektronentransportkette Komplexe Untereinheiten während der Homogenisierung und Zentrifugationsschritte 18 und iv) die erhöhte Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies während der Homogenisierung und Zentrifugationsschritte, die mit mitochondrialen Funktion 18 stören können. Die Vorteile der Dounce Homogenisierung und dem Differential Zentrifugationsverfahren , um rohe Mitochondrien für Atmungs Experimente in Bezug auf bestehende Verfahren wie Dichtegradientenzentrifugation 20 sind zu isolieren , dass das Verfahren ist schnell und Mitochondrien innerhalb eines kurzen Zeitraums isoliert. Daher kann Atem Experimente innerhalb von 1 durchgeführt werden,h. Darüber hinaus ist das Verfahren preiswert, sehr leistungsfähig und die durch differentielle Zentrifugation erhalten Mitochondrien können Respirometrie Assays verwendet werden. Die Untersuchung des mitochondrialen Sauerstoffverbrauchs unter Verwendung von isolierten Mitochondrien bietet mehrere Vorteile gegenüber permeabilisierten Fasern oder Zellen: keine signifikante Interferenz mit cytosolischen Proteinen, die mit mitochondrialen Funktion und Bioenergetik stören können; keine Notwendigkeit für zellulare Permeabilisierung; und Substrate der mitochondrialen Atmungskette Komplexe können direkt in den isolierten Mitochondrien hinzugefügt werden. Eine der alternativen Methoden mitochondrialen Skelettmuskel Atmung zu messen , ist die Verwendung permeabilisierten Muskelfasern 9. Einige der Vorteile der permeabilisierten Muskelfasern über isolierte Mitochondrien sind i) keine mechanische Homogenisierung Schritt ist erforderlich, und ii) sehr kleine Mengen an Gewebe (wenige mg) für Respirometrie Assays erforderlich sind. Der Nachteil permeabilized Muskelfaser ist die geringere Sauerstoffdiffusion in die Mitochondrien in das Faserbündel. Diese Diffusionsbeschränkung erfordert größere Mengen an ADP während Respirometrie Assays. Ein weiteres alternatives Verfahren ist die Verwendung von Voll Gewebehomogenaten 22, die ein sehr schnelles Verfahren und erfordert keine differentielle Zentrifugationsschritte Mitochondrien zu isolieren. Verwendung von ganzen Gewebehomogenat kann den Verlust einiger Mitochondrien während der Isolierung zu verhindern, aber es können auch andere cytosolische Faktoren vorliegen, die mit der Analyse des mitochondrialen Funktionen wie Sauerstoffverbrauch stören können. Nachdem die differentielle Zentrifugation Mastering rohe Mitochondrien für Atemtests zu isolieren, eine zukünftige Anwendung ist es, die Atem Kapazitäten der Mitochondrien über neue Techniken wie mit der mitochondrialen Außenmembran anti-TOM22 (Translokase der äußeren Membran der Mitochondrien 22 Homolog) Antikörper-coupl isoliert zu untersuchened magnetische Kügelchen 21.

Mitochondriale Bioenergetik und Atemkapazitäten können in permeabilisierten Zellen oder Fasern nicht nur untersucht werden, sondern auch in isolierten Mitochondrien. In der vorliegenden Studie beschreiben wir ein Protokoll intakten Skelettmuskel Mitochondrien mit differenzieller Zentrifugation für hochauflösende Respirometrie Messungen zu isolieren. Zur Isolierung intakte Mitochondrien für Respirometrie wird das Gewebe homogenisiert und Mitochondrien werden durch ein herkömmliches Verfahren isoliert differentielle Zentrifugation. Die differentielle Zentrifugation Methode basiert auf sequenzielle Zentrifugationen basiert (in einer Reihe von zunehmenden Geschwindigkeit) von Gewebe - Homogenate wurde durch Pallade und Mitarbeiter zuerst eingeführt fast 70 Jahre vor 1. Das Gewebe wird zunächst mit einer Schere zerkleinert und mechanisch in einem Glas-Homogenisator mit einem locker sitzende Stößel homogenisiert. Danach wird das Homogenisat bei niedriger Geschwindigkeit und das resultierende Pellet zentrifugiert, das ununterbrochene Gewebe enthält, zelluläreTrümmer und Kerne wird verworfen. Dann wird der Überstand mehrmals mit hoher Geschwindigkeit und die mitochondriale angereicherte Fraktion wird gesammelt zentrifugiert. Die Vorteile der differentiellen Zentrifugationsverfahren zu isolieren Mitochondrien sind, dass: i) das Verfahren ist schnell und Mitochondrien innerhalb 1-1,5 h (respiratorische Experimenten isoliert werden sollte so schnell wie möglich durchgeführt werden); ii) es ist preiswert; und iii) es ist sehr leistungsfähig und die durch differentielle Zentrifugation erhalten Mitochondrien sind rein genug für Respirometrie Assays. Die Nachteile der differentielle Zentrifugation Methode zur Isolierung Mitochondrien sind, dass i) die Mitochondrien beschädigt werden könnte und abgekoppelt während der Homogenisierung; ii) die Verunreinigung der Mitochondrien mit anderen zellulären Komponenten (könnte die mitochondriale Pellet mit weiteren Zentrifugationsschritte) durch weiteres Waschen gelöst werden; iii) die Möglichkeit , verschiedene mitochondriale Subpopulationen von der Auswahl, zum Beispiel während einer differenziellen Zentrifugationen Schritte, mitochondria mit niedriger Dichte kann 7 ausgeschlossen werden; und iv) die mitochondriale Zell umgebenden fehlt und nur die theoretische maximale Atmung gemessen werden. Ein weiteres Verfahren zur Isolierung Mitochondrien für Respirometrie Assays ist die Dichtegradientenzentrifugation 2. Bei dieser Technik wird der Gewebeextrakt über eine Lösung von Sucrose oder einem Percoll-Gradienten überlagert (mit höherer Dichte auf dem Boden des Zentrifugenröhrchen) und mit einer bestimmten Geschwindigkeit zentrifugiert, die Mitochondrien verursacht von anderen zellulären Bestandteilen isoliert werden entsprechend ihrer Dichten. Diese Methode wird häufig verwendet, Gehirn Mitochondrien aus Synaptosomen mit sehr geringer Kontamination zu isolieren. Jedoch werden die Rattenleber - Mitochondrien isoliert durch Dichtegradienten-Zentrifugation mit anderen Zellorganellen 3 stark verunreinigt. Eine der Beschränkungen dieses Verfahrens besteht darin, daß die vorliegende Sucrosegradienten in dem Zentrifugationsröhrchen bersten könnte somich Mitochondrien (osmotischer Schock). Je nach der Art des Gewebes; gibt es einige wichtige Faktoren für die Isolierung von intakten Mitochondrien durch differentielle Zentrifugation zu betrachten. Die erste Notwendigkeit ist Gewebe auf sanfte Weise zu homogenisieren. Weiches Gewebe wie Niere, Gehirn und Leber erfordern sanfte mechanische Kräfte während der Homogenisierung angewendet. Dies steht im Gegensatz zu Hartgewebe wie Herz- und Skelettmuskel, die viel stärkere mechanische Kräfte erfordern. Das zerkleinerte Gewebe wird in der Regel mit Proteinase vor der Homogenisierung behandelt, um das Gewebe zu erweichen. Alle Puffer während der Homogenisierung und Zentrifugation verwendet werden , sollten mit Cytosol mit einer ionischen und osmotische Stärke kompatibel einen physiologisch relevanten pH eiskalt sein und haben 4, 5. Einer der Vorteile von isolierten mitochondrialen bioenergetischen studieren ist, dass zelluläre Plasmamembranen brauchen nicht permeabi seinlized mit Detergenzien wie Saponin Digitonin oder 4, 6, die den mitochondrialen Außenmembran Integrität beeinträchtigen könnten. Ein weiterer Vorteil der isolierten Mitochondrien ist das Fehlen von anderen cytosolische Faktoren, die mit der Analyse des mitochondrialen Funktionen wie Sauerstoffverbrauch stören können. Die Nachteile der isolierten Mitochondrien verwenden , sind die mögliche Auswahl bestimmter mitochondrialer Populationen während der Zentrifugationsschritte, Schäden an den Mitochondrien während der Homogenisierung und die Voraussetzung für die hohe Mengen an biologischen Proben , um eine gute Ausbeute an isolierten Mitochondrien 7, 8 zu erhalten. Nach dem Isolierungsverfahren, die Atemfrequenz der mitochondrialen Komplexe I-, II- und IV-abhängige (Zustände 2, 3 und 4) sind hochauflösende Respirometrie ermittelt. Für komplexe I-driven Atmung, Glutamatund Malat werden zugegeben, gefolgt von Adenosindiphosphat (ADP), gefolgt. Für komplexe II-driven Atmung wird Succinat zugegeben, gefolgt von ADP gefolgt. Für komplexe IV gesteuerte Atmung, Ascorbat und tetramethylphenylendiamine (TMPD) zugegeben , gefolgt von ADP 9, 10, 11, 12. Zustand 2 bezieht sich auf den Sauerstoffverbrauch in der Gegenwart von Substraten allein. Zustand 3 bezieht sich auf den Sauerstoffverbrauch in Gegenwart von Substraten und ADP. Zustand 4 bezieht sich auf den Sauerstoffverbrauch nach der ADP Verarmungs. Die Atemkontrolle Verhältnis (RCR) ist ein Index der Kopplung von ATP - Produktion Sauerstoffverbrauch und wird als das Verhältnis zwischen dem Zustand 3 und Zustand 4 13 berechnet, 15. Zusammenfassend beschreiben wir ein Protokoll funktionale und intakte Skelett-Muskel Mitochondrien durch differentielle Zentrifugation zu isolieren und verwenden diese isoliert mitochondria für funktionelle und bioenergetischen Studien wie hochauflösenden Respirometrie.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ADP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A 4386</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycin A</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A 8674</td>
			<td>Chemical, dissolve in ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.00127</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A 7699</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A 6003</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>fluka</td>
			<td>3779</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamate</td>
			<td>Sigma,</td>
			<td>G 1626</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H 7523</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.04936</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.04873</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K-lactobionate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L 2398</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M 9272</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Morpholinopropane sulphonic acid (MOPS)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.06129</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O2k-Core: Oxygraph-2k&#160;</td>
			<td>Oroboros Instruments</td>
			<td>10000-02</td>
			<td>High-resolution respirometry instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase, bacterial</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P 8038</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2002</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R 8875</td>
			<td>Chemical, dissolve in ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Succinate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S 2378</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schuett homogen-plus semiautomatic homogeniser&#160;</td>
			<td>schuett-biotec GmbH</td>
			<td>3.201 011</td>
			<td>Tissue homogenizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T 8691</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMPD</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T 3134</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of intact mitochondria from skeletal muscle by differential centrifugation for high-resolution respirometry measurements

Mitochondria are involved in cellular energy metabolism and use oxygen to produce energy in the form of adenosine triphosphate (ATP). Differential centrifugation at low- and high-speed is commonly used to isolate mitochondria from tissues and cultured cells. Crude mitochondrial fractions obtained by differential centrifugation are used for respirometry measurements. The differential centrifugation technique is based on the separation of organelles according to their size and sedimentation velocity. The isolation of mitochondria is performed immediately after tissue harvesting. The tissue is immersed in an ice-cold homogenization medium, minced using scissors and homogenized in a glass homogenizer with a loose-fitting pestle. The differential centrifugation technique is efficient, fast and inexpensive and the mitochondria obtained by differential centrifugation are pure enough for respirometry assays. Some of the limitations and disadvantages of isolated mitochondria, based on differential centrifugation, are that the mitochondria can be damaged during the homogenization and isolation procedure and that large amounts of the tissue biopsy or cultured cells are required for the mitochondrial isolation.

Komplexe I-abhängige Atmung Isolierte mitochondrialer Komplex I abhängigen Atemfrequenzen (Zustände 2, 3 und 4) sind hochauflösende Respirometrie bestimmt (Abbildung 1 ist ein repräsentatives Diagramm). Mitochondriale Komplex I Substrate, Glutamat und Malat, werden durch die Zugabe von ADP zugegeben. Zustand 2 bezieht sich auf den Sauerstoffverbrauch in der Gegenwart der Substrate allein. Zustand 3 bezieht sich auf den Sauerstoffverbrauch in der Gegenwart der Substrate und ADP. Zustand 4 bezieht sich auf den Sauerstoffverbrauch nach der ADP Verarmungs. RCR ist ein Index für die Kopplung von Sauerstoff zu ATP - Produktion Verbrauch und wird als das Verhältnis zwischen dem Zustand 3 und Zustand berechnet 4. Wie bei der Zugabe von ADP in Abbildung 1 gezeigt, sind die mitochondriale Atmungsrate steigt sofort (Zustand 3 Atmung), und dann sinkt (Zustand 4 Atmung) auf ein Niveau, sehr similar, die der Zustand 2. Dies deutet auf eine hohe RCR und dass die mitochondriale Integrität ist gut bei Isolierungsverfahren erhalten. 2 ist ein repräsentatives Diagramm der Messung einer niedrigen Zustand 3 Atmungsrate und RCR, mit einem hohen Zustand 4 Atmungsrate, was darauf hinweist ungeeignet und erfolglose mitochondrialen Isolation. Eine hohe Atmungsrate bei Zustand 4 ist ein Indikator für die mitochondriale Proton leakiness 15. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/55251/55251fig1.jpg" /> Abbildung 1: Erfolgreiche mitochondrialen Trennung: mitochondriale Integrität ist gut während des Isolierungsverfahren erhalten. Kurven von der hochauflösenden Respirometrie Verwendung Glutamat und Malat als Substrate (Komplex I-abhängige Atmung). Die blaue Linie stellt die Sauerstoffkonzentration. Die rote Linie stellt den Sauerstofffluss (Neigung der Sauerstoffkonzentration). Die oxygen Konzentration nimmt im Laufe der Zeit als isolierte Mitochondrien den verfügbaren Sauerstoff verwenden. Der Sauerstoffverbrauch wird als pmol / (sx mg mitochondrialen Protein) ausgedrückt. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55251/55251fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55251/55251fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/55251/55251fig2.jpg" /> Abbildung 2: Erfolglose mitochondrialen Trennung: mitochondriale Integrität während des Isolierungsverfahrens anzeigt ungeeignet mitochondrialen Isolation nicht gut erhalten. Kurven von der hochauflösenden Respirometrie Verwendung Glutamat und Malat als Substrate (Komplex I-abhängige Atmung). Die blaue Linie stellt die Sauerstoffkonzentration. Die rote Linie stellt den Sauerstofffluss (Neigung der Sauerstoffkonzentration). Die Sauerstoffkonzentration verringert sich im Laufe der Zeit als isolierte Mitochondrien die availab verwendenle Sauerstoff. Der Sauerstoffverbrauch wird als pmol / (sx mg mitochondrialen Protein) ausgedrückt. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55251/55251fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55251/55251fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> Komplexe II-abhängige Atmung Isolierte mitochondrialer Komplex II abhängigen Atemfrequenzen (Zustände 2, 3 und 4) sind hochauflösende Respirometrie bestimmt (Abbildung 3 ist ein repräsentatives Diagramm). Für diesen Test wird die mitochondriale Komplex I durch Zugabe von Rotenon inhibiert, und dann Succinat (Komplex II Substrat) zugesetzt, gefolgt von ADP. 3 zeigt , dass bei Zugabe von ADP, die mitochondriale Atmung steigt sofort an und sinkt dann auf Werte sehr ähnlich der Zustand 2, was anzeigt , gut gekoppelten Mitochondrien und dassmitochondriale Integrität ist gut während des Isolierungsverfahren erhalten. Der berechnete RCR - Wert für dieses typischen Experiment ist 4,23, die mit den Werten in enger Übereinstimmung ist 10 in der Literatur gezeigt, 11, 23). 4 ist ein repräsentatives Diagramm der Messung einer niedrigen Zustand 3 Atmungsrate und RCR, mit einem hohen Zustand 4 Atemfrequenz anzeigt , unangemessene Isolation. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/55251/55251fig3.jpg" /> Abbildung 3: Erfolgreiche mitochondrialen Trennung: mitochondriale Integrität ist gut während des Isolierungsverfahren erhalten. Kurven von der hochauflösenden Respirometrie Verwendung Succinat als Substrat (Komplex II-abhängige Atmung). Die blaue Linie stellt die Sauerstoffkonzentration. Die rote Linie stellt den Sauerstofffluss (Steigung vonSauerstoffkonzentration). Die Sauerstoffkonzentration verringert sich im Laufe der Zeit als isolierte Mitochondrien den verfügbaren Sauerstoff verwenden. Der Sauerstoffverbrauch wird als pmol / (sx mg mitochondrialen Protein) ausgedrückt. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55251/55251fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55251/55251fig3large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/55251/55251fig4.jpg" /> Abbildung 4: Erfolglose mitochondrialen Trennung: mitochondriale Integrität während des Isolierungsverfahrens anzeigt , unangemessene Isolation nicht gut erhalten. Kurven von der hochauflösenden Respirometrie Verwendung Succinat als Substrat (Komplex II-abhängige Atmung). Die blaue Linie stellt die Sauerstoffkonzentration. Die rote Linie stellt den Sauerstofffluss (Neigung der Sauerstoffkonzentration). Die Sauerstoffkonzentration verringert sich im Laufe der Zeit als isolierte Mitochondria verwenden, um die verfügbaren Sauerstoff. Der Sauerstoffverbrauch wird als pmol / (sx mg mitochondrialen Protein) ausgedrückt. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55251/55251fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55251/55251fig4large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> Komplex IV-abhängige Atmung Isolierte mitochondrialer Komplex IV abhängigen Atemfrequenzen (Zustände 2, 3) bestimmt unter Verwendung von hochauflösenden Respirometrie (Abbildung 5, ein repräsentatives Diagramm). Für diesen Test Ascorbat / TMPD und ADP werden zugegeben, gefolgt von Natriumazid, gefolgt Komplex IV zu inhibieren. Der Unterschied zwischen der Sauerstoffverbrauch vor und nach Zugabe von Natriumazid wird als der reale Komplex IV Atmung interpretiert. 5 ist ein repräsentatives Diagramm measurement eines hohen Komplex IV-abhängige Atmungsrate Zustand 3 anzeigt, dass die mitochondriale Integrität auch bei Isolierungsverfahren erhalten bleibt. Im Gegensatz dazu ist Figur 6 ist ein repräsentatives Diagramm der Messung einer niedrigen Zustand 3 anzeigt unangemessene Trennung. <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/55251/55251fig5.jpg" /> Abbildung 5: Erfolgreiche mitochondrialen Trennung: mitochondriale Integrität ist gut während des Isolierungsverfahren erhalten. Kurven von der hochauflösenden Respirometrie Verwendung Ascorbat / TMPD als Substrat (Komplex IV abhängigen Atmung). Komplex IV Atmung (Zustand 3) wird durch Subtrahieren des Sauerstoffverbrauchs vor und nach Zugabe von Natriumazid interpretiert. Die blaue Linie stellt die Sauerstoffkonzentration. Die rote Linie stellt den Sauerstofffluss (Neigung der Sauerstoffkonzentration). Die Sauerstoffkonzentration verringert sich im Laufe der Zeit als isolierte mitochondria den verfügbaren Sauerstoff verwenden. Der Sauerstoffverbrauch wird als pmol / (sx mg mitochondrialen Protein) ausgedrückt. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55251/55251fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55251/55251fig5large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 6" src="/files/ftp_upload/55251/55251fig6.jpg" /> Abbildung 6: Erfolglose mitochondrialen Trennung: mitochondriale Integrität während des Isolierungsverfahrens anzeigt , unangemessene Isolation nicht gut erhalten. Kurven von der hochauflösenden Respirometrie Verwendung Ascorbat / TMPD als Substrat (Komplex IV abhängigen Atmung). Komplex IV Atmung (Zustand 3) wird durch Subtrahieren des Sauerstoffverbrauchs vor und nach Zugabe von Natriumazid interpretiert. Die blaue Linie stellt die Sauerstoffkonzentration. Die rote Linie stellt den Sauerstofffluss (Neigung der Sauerstoffkonzentration). Der Sauerstoff concentration verringert sich im Laufe der Zeit als isolierte Mitochondrien den verfügbaren Sauerstoff verwenden. Der Sauerstoffverbrauch wird als pmol / (sx mg mitochondrialen Protein) ausgedrückt. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55251/55251fig6large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55251/55251fig6large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> Auswertung der mitochondrialen Außenmembran Integrität Cytochrom c unter Verwendung von Auszuwerten ist die Qualität der mitochondrialen Präparation, Cytochrom-c-Test durchgeführt, um die mitochondriale äußeren Membranintegrität bestimmen, durch Messung der mitochondrialen Atmung nach der anschließenden Zugabe von Glutamat und Malat, ADP und Cytochrom c (ADP stimuliert Komplex II-abhängigen Zustand 3 Atmung in der Anwesenheit von Cytochrom c). Wie in 7 gezeigt, ist Cytochrom c nicht komplex I-abhängigen Zustand 3 re verbessern<html> spiration der isolierten Mitochondrien, was darauf hinweist, dass es aus der mitochondrialen Außenmembran und der mitochondrialen Integrität erhalten bleibt kein Verlust von Cytochrom c war. <img alt="Figur 6" src="/files/ftp_upload/55251/55251fig7.jpg" /> Abbildung 7: Cytochrome c erhöht nicht die Atmung des isolierten mitochondrialen: mitochondriale Integrität ist gut während des Isolierungsverfahren erhalten. Kurven von der hochauflösenden Respirometrie Verwendung Glutamat / Malat als Substrat (Komplex I-abhängige Atmung). Die blaue Linie stellt die Sauerstoffkonzentration. Die rote Linie stellt den Sauerstofffluss (Neigung der Sauerstoffkonzentration). Die Sauerstoffkonzentration verringert sich im Laufe der Zeit als isolierte Mitochondrien den verfügbaren Sauerstoff verwenden. Der Sauerstoffverbrauch wird als pmol / (sx mg mitochondrialen Protein) ausgedrückt.m / files / ftp_upload / 55251 / 55251fig7large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="2"> Mitochondriale Isolationspuffer </td></tr><tr><td> Chemisch </td><td> Konzentration </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 100 mM </td></tr><tr><td> MgSO 4 </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> morpholinopropan sulfonsäure (MOPS) </td><td> 50 mM </td></tr><tr><td> Ethylendinitrilotetraessigsäure (EGTA) </td><td> 1,0 mM </td></tr><tr><td> ATP </td><td> 1,1 mM </td></tr><tr><td colspan="2"> pH 7,4 </td></tr><tr><td colspan="2"></td></tr><tr><td colspan="2"> Mitochondriale Waschpuffer </td></tr><tr><td> Chemisch </td><td> Konzentration </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 100 mM </td></tr><tr><td> MOPS </td><td> 50 mM </td></tr><tr><td> EGTA </td><td> 0,5 mM </td></tr><tr><td colspan="2"> pH 7,4 </td></tr><tr><td></td><td rowspan="2"></td></tr><tr><td> Mitochondriale Atmung Puffer 16 </td></tr><tr><td> Chemisch </td><td> Konzentration </td></tr><tr><td> Sucrose </td><td> 110 mM </td></tr><tr><td> EGTA </td><td> 0,5 mM </td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> 3,0 mM </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 80 mM </td></tr><tr><td> K-Lactobionat </td><td> 60 mM </td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> Taurin </td><td> 20 mM </td></tr><tr><td> Hepes </td&gt; <td> 20 mM </td></tr><tr><td> BSA </td><td> 1,0 g / L </td></tr><tr><td colspan="2"> pH 7,1 </td></tr></tbody></table> Tabelle 1: Die Zusammensetzung von Puffern.

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Isolation of Intact Mitochondria from Skeletal Muscle by Differential Centrifugation for High-resolution Respirometry Measurements

Here, a quadriceps muscle specimen is taken from an anaesthetized pig and mitochondria are isolated by differential centrifugation. Then, the respiratory rates of mitochondrial respiratory chain complexes I, II and IV are determined using high-resolution respirometry.

Isolation of Intact Mitochondria von Skeletal Muscle durch differentielle Zentrifugation für hochauflösende Messungen Respirationstest

Mitochondria are involved in cellular energy metabolism and use oxygen to produce energy in the form of adenosine triphosphate (ATP). Differential ...

isolation-intact-mitochondria-from-skeletal-muscle-differential

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

18.0K Aufrufe.  Inselspital, Bern University Hospital. Here, a quadriceps muscle specimen is taken from an anaesthetized pig and mitochondria are isolated by differential centrifugation. Then, the respiratory rates of mitochondrial respiratory chain complexes I, II and IV are determined using high-resolution respirometry.

Serie: Isolation of Intact Mitochondria from Skeletal Muscle by Differential Centrifugation for High-resolution Respirometry Measurements

Mitochondrial Isolation from Skeletal Muscle

Mitochondria are organelles controlling the life and death of the cell. They participate in key metabolic reactions, synthesize most of the ATP, and regulate a number of signaling cascades2,3. Past and current researchers have isolated mitochondria from rat and mice tissues such as liver, brain and heart4,5. In recent years, many researchers have focused on studying mitochondrial function from skeletal muscles.
Here, we describe a method that we have used successfully for the isolation of mitochondria from skeletal muscles 6. Our procedure requires that all buffers and reagents are made fresh and need about 250-500 mg of skeletal muscle. We studied mitochondria isolated from rat and mouse gastrocnemius and diaphragm, and rat extraocular muscles. Mitochondrial protein concentration is measured with the Bradford assay. It is important that mitochondrial samples be kept ice-cold during preparation and that functional studies be performed within a relatively short time (~1 hr). Mitochondrial respiration is measured using polarography with a Clark-type electrode (Oxygraph system) at 37&deg;C7. Calibration of the oxygen electrode is a key step in this protocol and it must be performed daily. Isolated mitochondria (150 &mu;g) are added to 0.5 ml of experimental buffer (EB). State 2 respiration starts with addition of glutamate (5mM) and malate (2.5 mM). Then, adenosine diphosphate (ADP) (150 &mu;M) is added to start state 3. Oligomycin (1 &mu;M), an ATPase synthase blocker, is used to estimate state 4. Lastly, carbonyl cyanide p-[trifluoromethoxy]-phenyl-hydrazone (FCCP, 0.2 &mu;M) is added to measurestate 5, or uncoupled respiration 6. The respiratory control ratio (RCR), the ratio of state 3 to state 4, is calculated after each experiment. An RCR &ge;4 is considered as evidence of a viable mitochondria preparation.
In summary, we present a method for the isolation of viable mitochondria from skeletal muscles that can be used in biochemical (e.g., enzyme activity, immunodetection, proteomics) and functional studies (mitochondrial respiration).

This protocol describes a procedure to study the respiration of mitochondria isolated from skeletal muscles. This method was adapted from Scorrano et al. (2007). The mitochondrial isolation procedure requires about 2 hours. The mitochondrial respiration can be completed in about 1 hour.

Mitochondriale Isolation von der Skelettmuskulatur

Mitochondria are organelles controlling the life and death of the cell. They participate in key metabolic reactions, synthesize most of the ATP, and ...

Forschung

Biologie

Purification of Progenitors from Skeletal Muscle

Skeletal muscle contains multiple progenitor populations of distinct embryonic origins and developmental potential. Myogenic progenitors, usually residing in a "satellite cell position" between the myofiber plasma membrane and the laminin-rich basement membrane that ensheaths it, are self-renewing cells that are solely committed to the myogenic lineage1,2. We have recently described a second class of vessel associated progenitors that can generate myofibroblasts and white adipocytes, which responds to damage by efficiently entering proliferation and provides trophic support to myogenic cells during tissue regeneration3,4. One of the most trusted assays to determine the developmental and regenerative potential of a given cell population relies on their isolation and transplantation5-7. To this end we have optimized protocols for their purification by flow cytometry from enzymatically dissociated muscle, which we will outline in this article. The populations obtained using this method will contain either myogenic or fibro/adipogenic colony forming cells: no other cell types are capable of expanding in vitro or surviving in vivo delivery. However, when these populations are used immediately after the sort for molecular analysis (e.g qRT-PCR) one must keep in mind that the freshly sorted subsets may contain other contaminant cells that lack the ability of forming colonies or engrafting recipients.

Method for the enzymatic dissociation, surface labeling and purification by flow cytometry of fibro/adipogenic and myogenic progenitors from murine skeletal muscle.

Reinigung von Vorläufern aus Skelettmuskeln

Skeletal muscle contains multiple progenitor populations of distinct embryonic origins and developmental potential. Myogenic progenitors, usually residing ...

Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle

Muscle regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite cells. Satellite cells are defined by their position between the basal lamina and the sarcolemma of each myofiber. Current knowledge of their behavior heavily relies on the use of the single myofiber isolation protocol. In 1985, Bischoff described a protocol to isolate single live fibers from the Flexor Digitorum Brevis (FDB) of adult rats with the goal to create an in vitro system in which the physical association between the myofiber and its stem cells is preserved 1. In 1995, Rosenblattmodified the Bischoff protocol such that myofibers are singly picked and handled separately after collagenase digestion instead of being isolated by gravity sedimentation 2, 3. The Rosenblatt or Bischoff protocol has since been adapted to different muscles, age or conditions 3-6. The single myofiber isolation technique is an indispensable tool due its unique advantages. First, in the single myofiber protocol, satellite cells are maintained beneath the basal lamina. This is a unique feature of the protocol as other techniques such as Fluorescence Activated Cell Sorting require chemical and mechanical tissue dissociation 7. Although the myofiber culture system cannot substitute for in vivo studies, it does offer an excellent platform to address relevant biological properties of muscle stem cells. Single myofibers can be cultured in standard plating conditions or in floating conditions. Satellite cells on floating myofibers are subjected to virtually no other influence than the myofiber environment. Substrate stiffness and coating have been shown to influence satellite cells' ability to regenerate muscles 8, 9 so being able to control each of these factors independently allows discrimination between niche-dependent and -independent responses. Different concentrations of serum have also been shown to have an effect on the transition from quiescence to activation. To preserve the quiescence state of its associated satellite cells, fibers should be kept in low serum medium 1-3. This is particularly useful when studying genes involved in the quiescence state. In serum rich medium, satellite cells quickly activate, proliferate, migrate and differentiate, thus mimicking the in vivo regenerative process 1-3. The system can be used to perform a variety of assays such as the testing of chemical inhibitors; ectopic expression of genes by virus delivery; oligonucleotide based gene knock-down or live imaging. This video article describes the protocol currently used in our laboratory to isolate single myofibers from the Extensor Digitorum Longus (EDL) muscle of adult mice (6-8 weeks old).

Isolation and culture of myofibers is the gold standard in vitro system to study the transition of satellite cells through quiescence, activation and differentiation. Importantly, the single myofiber culture system preserves the myofiber/stem cell association, which is an essential component of the muscle stem cell niche.

Isolation und Kultur der einzelnen Muskelfasern und ihre Satelliten aus adulten Skelettmuskel

Muscle  regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite  cells. Satellite cells are defined by  their position between the ...

Assessment of Calcium Sparks in Intact Skeletal Muscle Fibers

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in the striated muscle fibers that appear as highly localized Ca2+ release events mediated by ryanodine receptor (RyR) Ca2+ release channels on the sarcoplasmic reticulum (SR) membrane. Proper assessment of muscle Ca2+ sparks could provide information on the intracellular Ca2+&#160;handling properties of healthy and diseased striated muscles. Although Ca2+ sparks events are commonly seen in resting cardiomyocytes, they are rarely observed in resting skeletal muscle fibers; thus there is a need for methods to generate and analyze sparks in skeletal muscle fibers.
Detailed here is an experimental protocol for measuring Ca2+ sparks in isolated flexor digitorm brevis (FDB) muscle fibers using fluorescent Ca2+ indictors and laser scanning confocal microscopy. In this approach, isolated FDB fibers are exposed to transient hypoosmotic stress followed by a return to isotonic physiological solution. Under these conditions, a robust Ca2+ sparks response is detected adjacent to the sarcolemmal membrane in young healthy FDB muscle fibers. Altered Ca2+ sparks response is detected in dystrophic or aged skeletal muscle fibers. This approach has recently demonstrated that membrane-delimited signaling involving cross-talk between inositol (1,4,5)-triphosphate receptor (IP3R) and RyR contributes to Ca2+ spark activation in skeletal muscle. In summary, our studies using osmotic stress induced Ca2+ sparks showed that this intracellular response reflects a muscle signaling mechanism in physiology and aging/disease states, including mouse models of muscle dystrophy (mdx mice) or amyotrophic lateral sclerosis (ALS model).

Described here is a method to directly measure calcium sparks, the elementary units of Ca2+ release from sarcoplasmic reticulum&#160;in intact skeletal muscle fibers. This method utilizes osmotic-stress-mediated triggering of Ca2+ release from ryanodine receptor in isolated muscle fibers. The dynamics and homeostatic capacity of intracellular Ca2+ signaling can be employed to assess muscle function in health and disease.

Bewertung von Calcium in Sparks Intact Skelettmuskelfasern

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in ...

Isolation of Blood-vessel-derived Multipotent Precursors from Human Skeletal Muscle

Since the discovery of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), the native identity and localization&#160;of MSCs have been obscured by their retrospective isolation in culture. Recently, using fluorescence-activated cell sorting (FACS), we and other researchers prospectively identified and purified three subpopulations of multipotent precursor cells associated with the vasculature of human skeletal muscle. These three cell populations: myogenic endothelial cells (MECs), pericytes (PCs), and adventitial cells (ACs), are localized respectively to the three structural layers of blood vessels: intima, media, and adventitia. All of these human blood-vessel-derived stem cell (hBVSC) populations not only express classic MSC markers but also possess mesodermal developmental potentials similar to typical MSCs. Previously, MECs, PCs, and ACs have been isolated through distinct protocols and subsequently characterized in separate studies. The current isolation protocol, through modifications to the isolation process and adjustments in the selective cell surface markers, allows us to simultaneously purify all three hBVSC subpopulations by FACS from a single human muscle biopsy. This new method will not only streamline the isolation of multiple BVSC subpopulations but also facilitate future clinical applications of hBVSCs for distinct therapeutic purposes.

Blood vessels within human skeletal muscle harbor several multi-lineage precursor populations that are ideal for regenerative applications. This isolation method allows simultaneous purification of three multipotent precursor cell populations respectively from three structural layers of blood vessels: myogenic endothelial cells from intima, pericytes from media, and adventitial cells from adventitia.

Isolierung von Blutgefäß abgeleiteten multi Vorläufer von menschlichen Skelettmuskel

Since the discovery of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), the native identity and localization&#160;of MSCs have been obscured by their retrospective ...

Generation of Myospheres From hESCs by Epigenetic Reprogramming

Generation of a homogeneous and abundant population of skeletal muscle cells from human embryonic stem cells (hESCs) is a requirement for cell-based therapies and for a "disease in a dish" model of human neuromuscular diseases. Major hurdles, such as low abundance and heterogeneity of the population of interest, as well as a lack of protocols for the formation of three-dimensional contractile structures, have limited the applications of stem cells for neuromuscular disorders. We have designed a protocol that overcomes these limits by ectopic introduction of defined factors in hESCs - the muscle determination factor MyoD and SWI/SNF chromatin remodeling complex component BAF60C - that are able to reprogram hESCs into skeletal muscle cells. Here we describe the protocol established to generate hESC-derived myoblasts and promote their clustering into tridimensional miniaturized structures (myospheres) that functionally mimic miniaturized skeletal muscles7.

Here, we describe a protocol based on epigenetic reprogramming of human embryonic stem cells (hESCs) toward generating a homogeneous population of skeletal muscle progenitors that under permissive culture conditions form three-dimensional clusters of contractile myofibers (myospheres), which recapitulate biological features of human skeletal muscles.

Generierung von Myospheres Von hESCs durch epigenetische Reprogrammierung

Generation of a homogeneous and abundant population of skeletal muscle cells from human embryonic stem cells (hESCs) is a requirement for cell-based ...

Rapid Isolation And Purification Of Mitochondria For Transplantation By Tissue Dissociation And Differential Filtration

Previously described mitochondrial isolation methods using differential centrifugation and/or Ficoll gradient centrifugation require 60 to 100 min to complete. We describe a method for the rapid isolation of mitochondria from mammalian biopsies using a commercial tissue dissociator and differential filtration. In this protocol, manual homogenization is replaced with the tissue dissociator&#8217;s standardized homogenization cycle. This allows for uniform and consistent homogenization of tissue that is not easily achieved with manual homogenization. Following tissue dissociation, the homogenate is filtered through nylon mesh filters, which eliminate repetitive centrifugation steps. As a result, mitochondrial isolation can be performed in less than 30 min. This isolation protocol yields approximately 2 x 1010 viable and respiration competent mitochondria from 0.18 &#177; 0.04 g (wet weight) tissue sample.

A method for rapid isolation of mitochondria from mammalian tissue biopsies is described. Rat liver or skeletal muscle preparations were homogenized with a commercial tissue dissociator and mitochondria were isolated by differential filtration through nylon mesh filters. Mitochondrial isolation time is &#60;30 min compared to 60 - 100 min using alternative methods.

Schnelle Isolierung und Reinigung von Mitochondrien für die Transplantation von Gewebe-Dissoziation und Differential Filtration

Previously described mitochondrial isolation methods using differential centrifugation and/or Ficoll gradient centrifugation require 60 to 100 min to ...

Isolation of Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High Throughput Microplate Respiratory Measurements

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial respirometric assays from isolated mitochondrial preparations allow for the assessment of mitochondrial function, as well as determination of the mechanism(s) of action of drugs and proteins that modulate metabolism. Current isolation procedures often require large quantities of tissue to yield high quality mitochondria necessary for respirometric assays. The methods presented herein describe how high quality purified mitochondria (~ 450 &#181;g) can be isolated from minimal quantities (~75-100 mg) of mouse skeletal muscle for use in high throughput respiratory measurements. We determined that our isolation method yields 92.5&#177; 2.0% intact mitochondria by measuring citrate synthase activity spectrophotometrically. In addition, Western blot analysis in isolated mitochondria resulted in the faint expression of the cytosolic protein, GAPDH, and the robust expression of the mitochondrial protein, COXIV. The absence of a prominent GAPDH band in the isolated mitochondria is indicative of little contamination from non-mitochondrial sources during the isolation procedure. Most importantly, the measurement of O2 consumption rate with micro-plate based technology and determining the respiratory control ratio (RCR) for coupled respirometric assays shows highly coupled (RCR; &#62;6 for all assays) and functional mitochondria. In conclusion, the addition of a separate mincing step and significantly reducing motor driven homogenization speed of a previously reported method has allowed the isolation of high quality and purified mitochondria from smaller quantities of mouse skeletal muscle that results in highly coupled mitochondria that respire with high function during microplate based respirometirc assays.

Here, we present a modification of a previously reported method that allows for the isolation of high quality and purified mitochondria from smaller quantities of mouse skeletal muscle. This procedure results in highly coupled mitochondria that respire with high function during microplate based respirometirc assays.

Isolierung von Mitochondrien von minimalen Mengen an Maus-Skelettmuskel für die Hochdurchsatz-Mikroplatten-Atemmessungen

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial ...

High-resolution Respirometry to Assess Mitochondrial Function in Permeabilized and Intact Cells

A high-resolution oxygraph is a device for measuring cellular oxygen consumption in a closed-chamber system with very high resolution and sensitivity in biological samples (intact and permeabilized cells, tissues or isolated mitochondria). The high-resolution oxygraph device is equipped with two chambers and uses polarographic oxygen sensors to measure oxygen concentration and calculate oxygen consumption within each chamber. Oxygen consumption rates are calculated using software and expressed as picomoles per second per number of cells. Each high-resolution oxygraph chamber contains a stopper with injection ports, which makes it ideal for substrate-uncoupler-inhibitor titrations or detergent titration protocols for determining effective and optimum concentrations for plasma membrane permeabilization. The technique can be applied to measure respiration in a wide range of cell types and also provides information on mitochondrial quality and integrity, and maximal mitochondrial respiratory electron transport system capacity.

High-resolution respirometry is used to determine mitochondrial oxygen consumption. This is a straightforward technique to determine mitochondrial respiratory chain complexes&#39; (I-IV) respiratory rates, maximal mitochondrial electron transport system capacity, and mitochondrial outer membrane integrity.

Hochauflösende Respirationstest zur Beurteilung mitochondrialen Funktion in permeabilisierten und Intakte Zellen

A high-resolution oxygraph is a device for measuring cellular oxygen consumption in a closed-chamber system with very high resolution and sensitivity in ...

High-resolution Respirometry to Measure Mitochondrial Function of Intact Beta Cells in the Presence of Natural Compounds

High-resolution respirometry allows for the measurement of oxygen consumption of isolated mitochondria, cells and tissues. Beta cells play a critical role in the body by controlling blood glucose levels through insulin secretion in response to elevated glucose concentrations. Insulin secretion is controlled by glucose metabolism and mitochondrial respiration. Therefore, measuring intact beta cell respiration is essential to be able to improve beta cell function as a treatment for diabetes. Using intact 832/13 INS-1 derived beta cells we can measure the effect of increasing glucose concentration on cellular respiration. This protocol allows us to measure beta cell respiration in the presence or absence of various compounds, allowing one to determine the effect of given compounds on intact cell respiration. Here we demonstrate the effect of two naturally occurring compounds, monomeric epicatechin and curcumin, on beta cell respiration under the presence of low (2.5 mM) or high glucose (16.7 mM) conditions. This technique can be used to determine the effect of various compounds on intact beta cell respiration in the presence of differing glucose concentrations.

The goal of this protocol is to measure the effect of glucose-mediated changes to mitochondrial respiration in the presence of natural compounds on intact 832/13 beta cells using high-resolution respirometry.

Hochauflösender Respirometrie, mitochondriale Funktion intakt Beta-Zellen in Anwesenheit von Naturstoffen zu messen

High-resolution respirometry allows for the measurement of oxygen consumption of isolated mitochondria, cells and tissues. Beta cells play a critical role ...