Die Autoren möchten sich QuinXell Technologies und CellD, insbesondere Lothar Grannemann und Dominique Ghozlan für ihre Hilfe mit dem Bioreaktor bestätigen. Wir danken Catherine Le Visage, die uns mit den Pullulan / Dextran-Polysaccharid-Gerüste zur Verfügung gestellt. Diese Arbeit wurde von der Europäischen Union (ERC-2014-Cog Projekt MATISSE 648.779) und von der AgenceNationalede la Recherche (ANR), Frankreich (MagStem Projekt ANR-11 SVSE5) unterstützt.

1. Aufbau der Magneteinrichtungen HINWEIS: Die Vorrichtungen zur Zellbesiedelung verwendet , variieren je nach der Anwendung (Abbildung 1). Aggregat zu bilden, wird die Anzahl der Zellen auf 2,5 × 10 5 / Aggregat begrenzt, so dass die magnetischen Spitzen sehr dünn sein muss (750 &amp; mgr; m im Durchmesser). Um das 1,8 cm 2/7 mm dickes Scaffolds Saatgut, müssen die Magnete größer (3 mm im Durchmesser) , und werden die Zellmigration durch die Poren des Gerüsts gewährleisten. <ol><li> Aufbau einer Vorrichtung mit Mikromagnete für Aggregatbildung (1A) <ol><li> Make Mikrolöcher mit einem 0,8-mm-Bohrer durch Aluminiumbleche (3 cm im Durchmesser und 6 mm dick). </li><li> Legen Sie eine magnetische Spitze (750 &amp; mgr; m im Durchmesser) in jedes Loch der Platte. </li><li> Diese Scheibe über einen Permanentmagnet Neodymium, die Magnetisierung bis zur Sättigung gewährleistet. </li></ol></li><li> Aufbau einer Vorrichtung für Gerüst Aussaat ( <strOng&gt; 1B) <ol><li> Schneidet harten Polystyrol in 2,4 cm 2 Quadrate. </li><li> Einsatz 9 kleine Magnete (3 mm im Durchmesser, 6 mm lang) in einem gleichen Abstand über eine Fläche von 1,6 cm 2. </li><li> Dieses Gerät über einen permanenten Neodym-Magneten. </li></ol></li></ol> 2. Stem Cell Labeling HINWEIS: Es wurden Stammzellen mit 0,1 mM magnetischen Nanopartikeln für 30 min (2,6 ± 0,2 pg Eisen / Zelle) markierte Aggregate zu bilden, während sie mit 0,2 mM magnetischen Nanopartikeln für 30 min (5 ± 0,4 pg Eisen / Zelle) markiert wurden auf Saatgut Gerüste. Diese Nanopartikel - Konzentrationen und Inkubationszeiten wurden bereits veröffentlicht und für MSC und anderen Zellen 18, 19, verwendet , und es bestimmt wurde , dass Nanopartikel beeinflusst weder die Lebensfähigkeit der Zellen noch MSC Differenzierungsfähigkeit. Die Eisenmasse von den Stammzellen eingebracht wurde mittels Single-ce gemessenll Magnetophorese 19, 20. <ol><li> Kultur von humanen mesenchymalen Stammzellen (MSC) in komplettem mesenchymalen Stammzellwachstumsmedium (MSCGM) bei 37 ° C und 5% CO 2 , bis nahe zur Konfluenz (~ 90%). </li><li> Bereiten Sie die magnetische Markierungslösung durch Mischen von 0,1 oder 0,2 mM Maghemit Citrat beschichteten Eisenoxid (γFe 2 O 3; Kern: 8 nm Durchmesser) in serumfreien 5A Medium McCoy modifizierte bei Roswell Park Memorial Institute (RPMI) ohne Glutamin und enthaltend 5 mM Natriumcitrat. </li><li> Entsorgen des Mediums, spülen Sie die Zellen mit serumfreiem RPMI - Medium ohne Glutamin und 10 ml Eisenoxid - Nanopartikel - Lösung pro 150 cm 2 Kulturkolben, dem minimalen Volumen benötigt , um alle Zellen zu bedecken. </li><li> Inkubieren für 30 min bei 37 ° C und 5% CO 2 und dann die Nanopartikel - Lösung verwerfen. Spülen für 5 Minuten mit serumfreiem RPMI-Medium ohne Glutamin nan das internalisierenoparticles noch an die Plasmamembran gebunden. </li><li> Verwerfen Sie den RPMI-Medium und 25 ml komplettes Medium MSCGM pro Kolben. Inkubiere über Nacht bei 37 ° C und 5% CO 2. </li></ol> 3. Magnetische Zell Seeding <ol><li> Frisch bereiten das chondrogenen Medium nach Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit hohem Glucose mit L-Glutamin durch Zugabe von 50 &amp; mgr; M L-Ascorbinsäure-2-phosphat, 0,1 &amp; mgr; M Dexamethason, 1 mM Natriumpyruvat, 0,35 mM L-Prolin, 1% universelle Kultur Ergänzung mit Insulin, Transferrin und menschliche Selenige Säure (ITS-Premix) und 10 ng / ml transformierender Wachstumsfaktor-beta 3 (TGF-β3). </li><li> Lösen sie die magnetischen Zellen unter Verwendung von 8 ml 0,05% Trypsin-EDTA pro 150 cm 2 Kulturkolben und zentrifugieren Sie die dissoziierten Zellen bei 260 × g für 5 min. Anzusaugen, das Medium und zähle die resuspendierten Zellen. </li><li> Eine Glasboden-Zellkultur-Petrischale (35 mm) auf der Oberseite der beiden Magnetvorrichtungen. </li><li> Um magnetically Aggregate bilden, 3 ml chondrogenen Medium zu der Petrischale hinzuzufügen und sanft das kleinste Volumen möglich ist (nicht mehr als 8 &amp; mgr; l) , die 2,5 × 10 5 Zellen pro Aggregat markierten Ablagerung (bis zu 16 Aggregaten abgelagert werden kann). Lassen Sie die Petrischale für 20-30 min ohne ihn zu bewegen, so dass es Sphäroide zu bilden, und dann das komplette Gerät, einschließlich der Petrischale mit 16 die Aggregate in den Inkubator bei 37 ° C und 5% CO 2. </li><li> Formsteuer Aggregate nach dem gleichen Protokoll und ersetzen das gesamte Medium mit chondrogenen Medium ohne TGF-β3. <ol><li> Um das 3D-Aggregat-Konstrukt zu erzeugen, legen zwei Aggregate in Kontakt am Tag 8-8 Dubletten zu bilden und die Fusion einzuleiten. Am Tag 11, fusionieren 2 Dubletten 4 Vierlinge zu bilden. Schließlich verschmelzen die vier Vierlinge am Tag 15 die endgültige Struktur zu erhalten. </li><li> Zur gleichen Zeit bilden sich Aggregate von 2,5 x 10 5 Zentrifugieren markierten Stammzellen bei 26015; g für 5 min in 15-ml-Röhrchen mit 1,5 ml chondrogenen Medium mit oder ohne TGF-β3 (für die Probe und die Kontrolle, jeweils). </li></ol></li><li> Magnetisch seed Scaffolds Platzieren jedes getrocknetes Gerüst in eine Petrischale. Verwenden Polysaccharid poröse Gerüste aus Pullulan / Dextran - 21. Für jedes Gerüst, verdünnte 2 × 10 6 markierte Stammzellen in 350 &amp; mgr; l von chondrogenen Medium ohne TGF-β3 und sorgfältig die Zellen auf das Gerüst pipettieren. <ol><li> bei 37 ° C für 5 min inkubieren Vollzellpenetration innerhalb des Gerüsts zu ermöglichen, und fügen Sie dann vorsichtig 3 ml chondrogenen Medium mit oder ohne TGF-β3 (für die Probe oder Kontrolle, jeweils), um die Petrischale. </li><li> Inkubiere das cellularized Gerüst an seiner Magnetvorrichtung bei 37 ° C und 5% CO 2 für 4 Tage für Zellmigration durch die Poren und das Gerüstes Confinement zu ermöglichen. </li></ol></li><li> Zur gleichen Zeit, Samen Gerüste mit 2 x 10 6 </sbis&gt; markierte Stammzellen nach dem gleichen Verfahren und Inkubieren ohne die Magneten gleichmäßig seeded Gerüste als positive Kontrollen zu erhalten. </li></ol> 4. Differenzierung in Chondrozyten HINWEIS: Nach 4 Tagen Inkubation entfernen, die Magnete und weiterhin die chondrogene Reifung entweder in einer Petrischale (statische Bedingungen) oder in einem Bioreaktor (dynamische Bedingungen). Negative Kontrollproben werden in statischen Bedingungen mit chondrogenen Medium ohne TGF-β3 gereift. <ol><li> In statischen Bedingungen halten die cellularized Gerüste oder Aggregate in der gleichen Petrischale. Ändern Sie den chondrogenen Medium zweimal pro Woche für 21 Tage. </li><li> In dynamischen Bedingungen, bereitet den Bioreaktor. <ol><li> Schneiden Silikonschlauch an der entsprechenden Länge entsprechend dem Protokoll des Herstellers. </li><li> Autoklaviert alle Materialien: 500 ml Kulturkammer, Schläuche, 2-Wege-Rotatoren und Käfige. </li><li> Legen Sie die Bioreaktor Teile in einen sterilen microbiologische Sicherheit Station. Schließen Sie den Schlauch an den 2-Wege-Rotatoren und in die Kulturkammer nach den Anweisungen des Herstellers. </li><li> übertragen sorgfältig die cellularized Scaffolds in sterilisierte Käfigen einem sterilen Spatel verwendet wird. Platz 2 Gerüste pro Käfig. Wenn die Käfige bereit sind, legen Sie sie in die Nadeln des Deckels, damit sie nicht während der weiteren Drehung bewegt. Füllen der Kulturkammer mit chondrogenem Medium und schließen, wobei der Deckel die Käfige enthalten. </li></ol></li><li> Schalten Sie die peristaltische Pumpe den Schlauch mit chondrogenem Medium zu füllen und Luftblasen zu beseitigen. </li><li> Und sichern die gefüllte Kammer in den Motor des Bioreaktors und schalten auf dem Computer, der die Drehungen steuert sowohl des Armes und der Kammer. </li><li> Anwenden einer Rotationsgeschwindigkeit von 5 Umdrehungen pro Minute (rpm), die beide auf dem Arm und der Kammer. Stellen Sie die peristaltische Pumpe bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 10 Umdrehungen pro Minute für die kontinuierliche Zuführung der cellularized Gerüste. </li></ol> HINWEIS: Vor der RNA-Extraktion, verdaut die Gerüste mit einer enzymatischen Lösung. <ol><li> Herstellung von 1 ml Enzymlösung durch Zugabe von 100 &amp; mgr; l von Pullulanase (40 U / ml) und 50 ul Dextranase (60 mg / ml) zu 850 ml serumfreiem DMEM Medium. </li><li> Spülen Sie die Gerüste zweimal mit serumfreiem DMEM-Medium, entsorgen Sie das Medium, und fügen Sie 800 ul der Enzymlösung pro Gerüst. Inkubieren für 15-30 min bei 37 ° C unter leichtem Schütteln. </li><li> Wenn das Gerüst vollständig gelöst ist, werden die Lösung um die Zellen in ein 1,5-ml-Röhrchen, Zentrifuge bei 300 × g für 10 min enthält, sorgfältig das Medium absaugen, spült zweimal mit steriler 1 × Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS), Zentrifuge bei 300 × g für 10 min und erneut suspendieren die Zellen in der RNA-Isolierungslösung. </li><li> Um die RNA aus den Aggregaten zu extrahieren, legen Sie die Sphäroiden in der RNA-Isolationslösung undvollständig zerquetscht sie mit einem Homogenisator RNA-Extraktion vor der Durchführung. </li><li> Isolieren Sie die RNA ein Kit zur Gesamt-RNA-Extraktion unter Verwendung nach den Anweisungen des Herstellers. </li><li> Synthetisieren komplementärer DNA von 400 ng Gesamt-RNA unter Verwendung von reverser Transkriptase gemäß den Anweisungen des Herstellers unter Verwendung von 250 ng-Zufallsprimer, 1 &amp; mgr; l dNTP-Mix (jeweils 10 mM) und 40 U / ml RNase-Inhibitor; Das Endvolumen der Reaktion beträgt 20 &amp; mgr; L. Am Ende der Reaktion, fügen 80 ul destilliertes Wasser, um ein Endvolumen von 100 &amp; mgr; l zu erhalten. </li><li> Für eine quantitative Polymerase-Kettenreaktion (PCR), mit einem PCR-Gemisch ein fluoreszierendes Reagens enthält, um die relative Expression der Gene von Interesse, wie Aggrecan (AGC) und Kollagen II (Col II) quantitativ zu bestimmen, das mit 10 × verdünnt cDNA. Normalisieren des Niveaus der Genexpression mit dem Referenz-Genen ribosomale Protein, Groß, P0 (RPLP0). Führen Sie die Berechnungen mit der 2 - ΔΔCT FormelGegebenen ΔΔCT = ACT von differenzierten Zustand - bedeuten ACT der Kontrollbedingung, und jeder ACT stellt die CT des Gens von Interesse - die CT des Referenzgens (RPLP0). </li><li> Bestimmen, statistische Messungen als Mittelwert, die Standardabweichung des Mittelwerts (SEM) ±. Führen Sie die Analyse mit n ≥ 2 unabhängigen Experimenten. Verwenden Sie T-Test die statistischen Unterschiede zwischen zentrifugierten Pellets und magnetischen Fusionen (* p &lt;0,05) zu analysieren. Bestimmen Sie die Bedeutung mit Kruskal-Wallis-Test (one-way ANOVA nichtparametrischer) statistisch signifikante Unterschiede zwischen differenzierten Gerüsten und mit dem Steuer Gerüst (* p &lt;0,05) zu analysieren. </li></ol> 6. Die histologische Analyse <ol><li> Spülen Sie die cellularized Gerüste oder Aggregate mit sterilem 1 × PBS, fixieren sie in 10% Formalin-Lösung für 1 h bei Raumtemperatur und spült mit 1 × PBS. </li><li> Entfernen Sie die PBS, bettet die Proben in optimaler cutting Temperatur Verbindung (OCT), und sie in einem Bad Isopentan in flüssigen Stickstoff getaucht einzufrieren. Lagern Sie die Probe bei -20 ° C. Schneiden Sie die Proben mit einem Kryostat-8 &amp; mgr; m Kryoschnitte für die Aggregate oder 12 &amp; mgr; m für die cellularized Gerüste zu erhalten. </li><li> Verfärbung die Kryoschnitte mit 0,5% Toluidinblau-Lösung für 2 min, Spülen in Leitungswasser, Entwässern mit 100% Ethanol, Toluol klären, und montieren die Objektträger mit einem Befestigungsmittel für die Lichtmikroskopie. </li></ol>

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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Erstens, weil die hier vorgestellten Techniken auf der Internalisierung von magnetischen Nanopartikeln beruhen, ein wichtiges Thema ist das Ergebnis der Nanopartikel, wenn sie innerhalb der Zellen zu lokalisieren. Es ist wahr , dass Eisen - Nanopartikeln potenzielle Toxizität oder beeinträchtigter Differenzierung Kapazität auslösen können je nach ihrer Größe, Beschichtungs- und Belichtungszeit 19, 22. Jedoch haben mehrere Studien keinen Einfluss auf die Zellphysiologie gezeigt , wenn gekapselte Eisennanopartikel 23 in Form von magnetoferritin verwendet wurden, eine biologische magnetischen Nanopartikel 24, oder sie wurden mit einer einfachen Beschichtung und Citrat ausreichenden Konzentrationen 18 verwendet. Wenn zusätzlich Eisenoxid-Nanopartikel in ähnlichen Bedingungen wie in diesem Dokument beschrieben ist, verwendet wurde (mit MSC und Chondrogenese) haben wir gezeigt, kürzlich, dass eine schnelle und fast vollständige Zersetzung des nanoparticles tritt in etwa 10 Tagen auf zelluläre Inkorporation und MSC Sphäroidbildung innerhalb der Endosomen. Interessanterweise wurde diese massive Abbau mit der effizienten Speicherung des freien Eisens innerhalb des Ferritin - Protein verbunden und führte zu einer sehr geringen Einfluss auf die zelluläre Eisenstoffwechsel, ein gutes Vorzeichen für zukünftige klinische Anwendungen 25. Ein weiterer kritischer Punkt ist die Forderung der Zellverdichtung Chondrogenese zu initiieren. Üblicherweise wird die Kondensation von Zellen durch Zentrifugation erreicht; Jedoch wird dieses Verfahren durch eine geringe Anzahl von Zellen begrenzt (nicht mehr als 2,5 × 10 5 Zellen). Vergangenheit dieser Zahl, die Nährstoffe und Gas nicht in die Mitte der Aggregate diffundieren, Triggern Zellnekrosen. Hier wird die magnetische Kondensation von markierten Stammzellen in Aggregate erscheint als eine wichtige Methode zur Bildung 3D-Konstrukte für die Knorpelgeweberegeneration. Ein solches magnetisches Verfahren wurde von anderen Autoren verwendet worden, umAufbau 3D Sphäroide: durch Magnetschwebebahn mit einem Magneten auf der Oberseite der Platte nach der Dissoziation der Zellen 23 oder mit Eisenstiften platziert das Magnetfeld 26 zu lokalisieren. Jedoch Magnetschwebebahn erscheint nicht für weitere Stufen des Aggregat Fusion geeignet zu sein. Im Gegensatz dazu mit den magnetischen hier vorgeschlagenen Verfahren können wir alle Fusionsschritte steuern, um eine Schritt-für-Schritt Knorpelgewebekonstruktion zu erhalten. Kurz gesagt, dieser mehrstufigen Prozess beginnt mit Einschluss von Stammzellen in Aggregate Bausteine ​​und wird durch die Fusion dieser Blöcke in eine größere Struktur folgt. Die kritischen Schritte dieses Gerüsts freien Stammzellaggregationsverfahren sind die folgenden: Erstens, man muss jedes Aggregat bilden, mit einem möglichst kleinen Volumen von Zellen wie möglich und zweitens, muß man die Fusionsschritte steuern die Bildung eines einzelnen, großen zu vermeiden Aggregat. Das Gewebe erhält hier war reich an Kollagen II und Aggrecan. Sie stellte auch den advantages von mit flexiblen Geometrie und Größe und des Seins gerüstfrei. Der magnetische Ansatz wurde auch zur Führung Stammzellen innerhalb dicken und großen Gerüsten verwendet wird; eine weitere Alternative für die Gestaltung von verschiedenen Formen und Größen. Der entscheidende Schritt ist hier die Gerüste mit einem geeigneten Volumen an Zellen zu impfen: weder zu wenig eine Gesamt homogene Verteilung der Zellen zu haben, noch zu viel jeden Zellverlust zu vermeiden. Magnetische Kräfte wurden verwendet , vorher zu gewinnen und Zellen innerhalb Gerüste zu behalten und Zellaussaat 27, 28 zu erhöhen. Hier ausreichendes Zell Kondensation innerhalb der Poren der Polysaccharid-Gerüste führte zu einem erfolgreichen Chondrogenese. Die extrazelluläre Matrixproduktion war deutlich verbessert, wenn die magnetisch cellularized Gerüste auf die Transduktion / Scherstressstimuli durch den Bioreaktor dank seiner biaxialen Drehung vorgesehen unterworfen. Es wurde in anderen Studien gezeigt, dass MULti-axialen Belastungsbedingungen verbessert die Qualität von Geweben aus Chondrozyten 29 gebildet. Dieses neuartige Bioreaktor Konzept stellt eine echte Verstärkung , wenn zu den bestehenden Techniken verglichen, wobei nur Druckkräfte 30 angelegt werden, 31, 32. Zusammenfassend für die chondrogene Differenzierung, die Verwendung von magnetischem Einschluss von markierten Stammzellen Aggregate als auch zu bilden und zu manipulieren, um als Gerüst für die Erstellung von Millimetergröße Knorpelzellkonstrukten erlaubt Samen. Darüber hinaus bietet ein wertvolles Anwendungen neues Werkzeug für die regenerative Medizin magnetische Zellaussaat mit dynamischer Differenzierung zu kombinieren.

Magnetische Nanopartikel ist bereits in der Klinik als Kontrastmittel für die Magnetresonanztomographie (MRI) verwendet wird, und die therapeutischen Anwendungen weiter wachsen. Zum Beispiel hat es vor kurzem , dass markierte Zellen in vivo unter Verwendung eines externen Magnetfeld manipuliert werden können , gezeigt worden und können an einer definierten Stelle der Implantation 1, 2, 3 gerichtet und / oder aufrechterhalten werden. In der regenerativen Medizin, können sie organisierte Gewebe in vitro 4, einschließlich Gefäßgewebe 5, 6, 7, 8 Knochen, Knorpeln und 9 zu konstruieren , werden verwendet. Gelenkknorpel wird in einer avaskuläre Umgebung eingetaucht, Reparaturen der extrazellulären Matrix-Komponenten Herstellung sehr begrenzt, wenn Schäden auftreten. Aus diesem Grund research wird zur Zeit auf dem Engineering von hyalinem Knorpelersatz konzentriert, die an der defekten Stelle implantiert werden können. Um einen autologe Ersatz einige Forschungsgruppen untersuchen die Verwendung von autologem Chondrozyten als Zellquelle 10, 11, zu erzeugen , während andere die Fähigkeit der mesenchymalen Stammzellen (MSC) in 12 betonen Chondrozyten zu differenzieren, 13. In früheren Studien hier rekapituliert, wählten wir MSC, als ihr Knochenmark Probenahme ist ziemlich einfach und erfordert nicht das Opfer von gesunden Chondrozyten, die ihren Phänotyp 14 verlieren riskieren. Ein früher Schritt wesentlich für die chondrogene Differenzierung von Stammzellen Einleitung ist ihre Kondensation. Zellaggregate werden unter Verwendung entweder Zentrifugation oder Mikromassenkultur 15 allgemein gebildet; jedoch neithe diese Kondensationsverfahrenr stellen die potentiellen Zellcluster innerhalb dicken Gerüste noch das Potential zu schaffen, die Fusion von Aggregaten zu steuern. unter Verwendung von MSC magnetische Markierung und magnetische Anziehung In diesem Papier beschreiben wir einen innovativen Ansatz Stammzellen zu kondensieren. Diese Technik hat sich bewährt miteinander zu erhalten , die eine Millimeterskala knorpeligen Gewebe 9 gerüstfreie 3D - Konstrukte über die Fusion von Aggregaten zu bilden. Magnetische Aussaat von dicken und großen Gerüsten hat auch die Möglichkeit der Erhöhung die Größe des erzeugten Gewebes erlaubt, eine Form leichter nützlich für die Implantation der Gestaltung und das Potenzial für die klinische Anwendung bei der Knorpelreparatur zu diversifizieren. Hier stellen wir detailliert das Protokoll für das magnetische Aussäen von MSC in poröse Gerüste , bestehend aus natürlichen Polysacchariden, Pullulan und Dextran, Gerüste bisher verwendeten Stammzellen beschränken 16, 17. Chondrogene Differenzierung war finally durchgeführt in einem Bioreaktor kontinuierliche Nährstoff- und Gasdiffusion in die Matrixkerne der Gerüste mit einer hohen Dichte von Zellen ausgesät zu gewährleisten. Neben Nährstoffe, chondrogene Wachstumsfaktoren und Gas zu den Zellen bereitstellt, bot der Bioreaktor mechanische Stimulation. Insgesamt ist die magnetische Technologie zu beschränken Stammzellen verwendet, kombiniert mit dynamischer Reifung in einem Bioreaktor, kann deutlich chondrogene Differenzierung verbessern.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Iron&#160; oxide (maghemite) nanoparticules ( &#947;-Fe2O3)</td>
			<td>PHENIX - University Paris 6</td>
			<td>Made and given by C. M&#233;nager</td>
			<td>Mean diameter of 8.1 nm and negative surface charge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polysaccharide Pullulan/Dextran scaffolds</td>
			<td>LIOAD - University Nantes</td>
			<td>Made and given by C. Le Visage</td>
			<td>Prepared from a 75:25 mixture of pullulan/dextran in alkaline conditions (10M NaOH). Porosity: 185-205&#181;m; Thickness: 7mm; Surface area: 1.8cm2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TisXell Regeneration System</td>
			<td>QuinXell Technologies</td>
			<td>QX900-002</td>
			<td>Biaxial bioreactor with 500 mL culture chamber&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cage for scaffolds: Histosette II M492&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>720-0909</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mesenchymal Stem Cell (MSC)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>PT-2501</td>
			<td>Three independant batches have been used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MSCGM BulletKit medium</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>PT-3001</td>
			<td>For the complete medium, add the provided BulletKit (containing serum, glutamine and antibiotics) to the MSCGM medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM with Glutamax I</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>31966-021</td>
			<td>No sodium pyruvate, no HEPES</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI medium 1640, no Glutamine</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>31870-025</td>
			<td>No sodium pyruvate, no HEPES</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS w/o CaCl2 w/o MgCl2</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin-EDTA (1x)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin (10.000U/mL)/Streptomicin (10.000&#181;g/mL)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITS Premix Universal Culture Supplement (20x)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate solution 100mM</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Ascorbic Acid 2-phosphate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8960</td>
			<td>Prepare the concentrated solution (25 mM) in distilled water extemporaneously</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Proline</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5607</td>
			<td>Prepare the 175 mM stock solution diluted in distilled water and store at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4902</td>
			<td>Prepare the 1 mM stock solution diluted in Ethanol 100% and store at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TGF-beta 3 protein 10&#181;g</td>
			<td>Interchim</td>
			<td>30R-AT028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tri-sodium citrate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>33615.268</td>
			<td>Prepare the 1M stock solution diluted in distilled water and store at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pullulanase from Bacillus acidopullulyticus</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2986</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextranase from Chaetomium erraticum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D0443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoSpin RNA Extraction Kit</td>
			<td>Macherey-Nagel</td>
			<td>740955.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript II Reverse Transcriptase</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>18064-014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Random Primer - Hexamer&#160;</td>
			<td>Promega</td>
			<td>C1181</td>
			<td>500 &#181;g/mL: Use diluted 1/2 and put 1 &#181;L per sample</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant RNAsin ribonuclease inhibitor</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2511</td>
			<td>40 U/&#181;L: put 1 &#181;L per sample</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR nucleotide dNTP mix (10mM each)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10842321</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SyBr Green PCR Master Mix</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4368708</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Step One Plus Real-Time PCR System</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4381792</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formalin solution 10% neutral buffered</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>HT5012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT solution</td>
			<td>VWR</td>
			<td>361603E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopentane</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M32631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluidine blue O</td>
			<td>VWR</td>
			<td>1.15930.0025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol absolute</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20821.310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluene</td>
			<td>VWR</td>
			<td>1.08323.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting medium Pertex</td>
			<td>Histolab</td>
			<td>840</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPLP0 Primer for qPCR</td>
			<td>Eurogentec</td>
			<td></td>
			<td>5&#39;-TGCATCAGTAC 
			CCCATTCTATCAT-3&#39; ; 
			5&#39;-AAGGTGTAATC 
			CGTCTCCACAGA-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aggrecan Primer for qPCR</td>
			<td>Eurogentec</td>
			<td></td>
			<td>5&#39;-TCTACCGCTGCGAGGTGAT-3&#39; ; 3&#39;-TGTAATGGAACACGATGCCTTT-5&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen II Primer for qPCR</td>
			<td>Eurogentec</td>
			<td></td>
			<td>5&#39;-ACTGGATTGACCCCAACCAA-3&#39; ; 3&#39;-TCCATGTTGCAGAAAACCTTCA-5&#39;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

3d magnetic stem cell aggregation and bioreactor maturation for cartilage regeneration

Cartilage Engineering bleibt eine Herausforderung aufgrund der Schwierigkeiten in einer in - vitro - Funktions Implantat ähnlich dem nativen Gewebe zu schaffen. Ein Ansatz vor kurzem für die Entwicklung von autologem Ersatz erforscht beinhaltet die Differenzierung von Stammzellen in Chondrozyten. Zur Einleitung dieses Chondrogenese, einen Verdichtungsgrad der Stammzellen erforderlich ist; Somit haben wir gezeigt, die Machbarkeit der magnetisch Kondensieren Zellen sowohl innerhalb dicken Gerüste und Gerüstfrei, unter Verwendung von miniaturisierten Magnetfeldquellen als Zell Attraktoren. Dieser magnetische Ansatz wurde auch zur Führung Aggregat Fusion verwendet und gerüstfrei organisiert, dreidimensionale (3D) Gewebe mehr Millimeter groß zu bauen. Zusätzlich zur Bereitstellung einer verbesserten Größe aufweist, wobei die durch magnetische angetriebene fusion gebildete Gewebe stellte eine signifikante Zunahme der Expression von Kollagen II, und ein ähnlicher Trend wurde für Aggrecan Expression beobachtet. Da die nativen Knorpel wurde Kräfte t ausgesetztHut seine 3D-Struktur, dynamische Reifung beeinflusst wurde ebenfalls durchgeführt. Ein Bioreaktor, die mechanischen Reiz liefert wurde, um die magnetisch ausgesät Gerüste über einen Zeitraum von 21 Tagen zur Kultur verwendet. Bioreactor Reifung weitgehend Chondrogenese in die cellularized Gerüste verbessert; die extrazelluläre Matrix unter diesen Bedingungen erhalten wurde, war reich an Kollagen II und Aggrecan. Diese Arbeit beschreibt das innovative Potential der magnetischen Kondensation von markierten Stammzellen und dynamischer Reifung in einem Bioreaktor für eine verbesserte chondrogene Differenzierung, beide Gerüstfrei und innerhalb Polysaccharid Gerüste.

Erstens können Aggregate gebildet werden , einzeln Mikromagnete unter Verwendung von 2,5 x 10 5 markierten Stammzellen (2A) abzuscheiden. Diese einzelnen Aggregate (~ 0,8 mm groß), kann dann in größeren Strukturen durch sequenzielle, magnetisch induzierte Fusion fusioniert werden. Zum Beispiel am Tag 8 der chondrogenen Reifung wurden Aggregate in Kontakt paarweise angeordnet Dubletts zu bilden; Vierlinge wurden am Tag versammelt 11 von 2 Dubletten vermischt; und schließlich am Tag 15 wurden die 4 quadruplets fusionieren , um ein 3D - Konstrukt zu bilden , 16 des anfänglich gebildeten Aggregats enthält, mit einer Gesamtzahl von 4 × 10 6 Zellen (~ 4 mm in der Größe) (2B). Zweitens hat die gleiche magnetische Anziehung Technik verwendet wurden Zellaggregate innerhalb Gerüste zu bilden. Scaffolds wurde über die Magneteinrichtung ausgesät und zeigte dicht kondensierte Zellen innerhalb der Poren des Gerüstes, um genauer Mikromagneten Stellen (2C). Im Gegensatz dazu, wenn die Zellen in einem Gerüst ohne magnetische Anziehung (passives seeding) ausgesät wurden, wurden sie gefunden, gleichmäßig verteilt werden. Cellularized Gerüste wurden dann in Käfigen (3A) eingefügt an der Bioreaktorkammer die chondrogene Prozess unter dynamischen Reifungsbedingungen (3B) durchzuführen. Solche verbessert ein Bioreaktor Nährstoff- und Gasaustausch und eine mechanische Stimulation durch Transduktion. Die Drehzahl sowohl des Arms und die Kammer wurde auf 5 Umdrehungen pro Minute eingestellt, wie durch den Konstruktor für Soft 3D Geweberegeneration empfohlen. Eine peristaltische Pumpe, die eine kontinuierliche Zufuhr von Medium ermöglicht wurde bei 10 Umdrehungen pro Minute eingestellt. Für alle Bedingungen der Zellorganisation (verschmolzenen Aggregate und seeding innerhalb Gerüste) und Gewebereifung (innerhalb oder ohne einen Bioreaktor) wurde am Tag analysiert Genexpression 25. Die durch magnetische fusion gebildeten Gewebe zeigten einen significant Anstieg der Expression von Kollagen II im Vergleich zu dem Pellet durch Zentrifugation (4A) erhalten wird, zusammen mit einer erhöhten Tendenz der Aggrecan - Expression. Für cellularized Gerüste, erhielten wir eine Zunahme des Aggrecan und Kollagen-II-Expression signifikant für Kollagen II-wenn magnetischen Seeding verwendet wurde, im Vergleich zu den Gerüsten ohne Magnetkräfte ausgesät. Darüber hinaus war die Expression beider Gene viel höher (signifikant für Col II) , wenn magnetische Impfen mit dynamischer Differenzierung (4B) kombiniert wurden. Die histologischen Analysen wurden ebenfalls durchgeführt, zum Beispiel einer Toluidinblau-Färbung mit den Glykosaminoglykanen offenbaren (GAG). Die sequenzielle magnetische Fusion von 16 Aggregaten reichlich Ablagerung von GAG zeigte, wie sie in der blau-lila Farbe (5A) zeigte. Für die Gerüste, nur die magnetisch wurden mit Toluidinblau ausgesät gefärbt. GAG content war höher , wenn die Gerüste in einem Bioreaktor (5B) differenziert wurden statt statisch (5C). Zusammengenommen zeigen diese Ergebnisse das Potenzial der magnetischen Aggregation und magnetischer Seeding innerhalb Gerüste Chondrogenese zu verbessern. Es zeigt auch, dass die dynamischen Reifungsbedingungen im Bioreaktor sind viel günstiger für eine effiziente Differenzierung. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/55221/55221fig1.jpg" /> Abbildung 1. Konstruktion der magnetischen Vorrichtungen. (A) Beispiel einer Magnetvorrichtung zur Aggregatbildung: die Aluminiumplatte gebohrt wurde (0,8 &amp; mgr; m-Durchmesser - Loch) und Spitzen wurden in jedem Loch eingeführt und dann auf einem permanenten Neodymmagneten gelegt, die Magnetisierung bis zur Sättigung gewährleistet. (B) magnetische Vorrichtung auf Saatgut das Gerüst: Hart Polystyrol (24 mm 2) mit 9 Löchern manuell vorgenommen wurdeauf einem permanenten Neodymmagneten gelegt, die Magnetisierung bis zur Sättigung gewährleistet. Kleine Magnete (3 mm Durchmesser) wurde dann in jedes Loch eingeführt, um die Vorrichtung zu bilden. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55221/55221fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55221/55221fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/55221/55221fig2.jpg" /> Abbildung 2. Magnetische Markierung von Stammzellen und Aussaat. (A) Stammzellen wurden für 30 min bei 37 ° C mit Eisenoxid - Nanopartikeln markiert. (B) Sphäroide wurden von markierten Zellen , die durch ein Netzwerk von 16 Mikro Magneten angezogen. Die Aggregate wurden in Vierergruppen am Tag fusionieren 11 durch Fusion der Dubletten vor 3 Tagen gebildet. Die Vierlinge wurden dann am Tag fusionierten 15 die endgültige technisch hergestellte Gewebe zu konstruieren. (C) ein Gerüst, platziert in einem Glasbodenschale ausgesät wurde mit oder mitaus magnetischen Kräften. Am Tag 4 spots verdichteter Stammzellen wurden in dem magnetisch seeded Gerüst beobachtet, während die Zellen in das Gerüst, ohne einen Magneten ausgesät gleichmäßig verteilt erschien. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55221/55221fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55221/55221fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/55221/55221fig3.jpg" /> Abbildung 3. Dynamische Reifung von cellularized Gerüste. (A) Nach dem magnetischen oder passiven Aussäen cellularized Gerüste wurden in Käfige gesetzt Störung zu vermeiden. (B) Cages, fixiert , um die Nadeln der Kappe verwendet wird , wurden in das Gefäß mit der chondrogenen Medium gefüllten Bioreaktor gegeben. Der Bioreaktor biaxiale Drehung mit einer unabhängig gesteuerten Geschwindigkeit (1-12 rpm und 1-35 rpm für den Arm und die Kammer, jeweils) aufgetragen. Eine peristaltische Pumpe kontinuierlich medi vorgesehenÄh. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55221/55221fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55221/55221fig3large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/55221/55221fig4.jpg" /> Abbildung 4. Expression spezifischer Gene chondrogene am Tag 25 (A) , um die magnetisch induzierte Fusion von MSC Sphäroiden zeigte einen signifikanten Anstieg in Kollagen II im Vergleich zu dem Pellet durch Zentrifugation gebildet. * Bezeichnet einen statistischen Unterschied T-Test (p-Wert &lt;0.05) verwendet wird. (B) Die Expression von Aggrecan und Kollagen II mit einer Kombination von magnetischem Aussäen und dynamischer Reifung in einem Bioreaktor differenzierten in Gerüsten deutlich erhöht wurden. Genexpression wurde normalisiert auf RPLP0 mRNA und ausgedrückt in willkürlichen Einheiten relativ zur Kontrolle (~ 1 ± SEM). Ergebnisse sind als Mittelwert ± SEM von zwei bis vier unabhängigen Experimenten. * denoTes einen statistisch signifikanten Unterschied unter Verwendung des Kruskal-Wallis-Test (one-way ANOVA nichtparametrischer Test) (p-Wert &lt;0.05). (-): Impfen ohne Magneten; (+): Mit magnetischen Kräften Säen. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55221/55221fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55221/55221fig4large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/55221/55221fig5.jpg" /> Abbildung 5. histologische Färbung von Glykosaminoglykanen am Tag 25. Glycosaminoglycan (GAG) Einlagen von blau-lila Färbung nachgewiesen werden. (A) Eine positive Toluidinblau-Färbung wurde in den 8 &amp; mgr; m-Gefrierschnitten der fertigen knorpeligen Struktur vom sequenziellen Fusion von 16 Aggregaten erhalten beobachtet. Die 12 &amp; mgr; m-Gefrierschnitten von Gerüsten magnetisch ausgesät nach statischem (B) oder dynamisch (C) Bedingungen zeigten deutlich ,dass GAG-Gehalt höher war in Gerüsten in einem Bioreaktor unterscheiden. Die Pfeile zeigen die Aggregate von differenzierten Zellen. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55221/55221fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55221/55221fig5large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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3D Magnetic Stem Cell Aggregation and Bioreactor Maturation for Cartilage Regeneration

Chondrogenese aus Stammzellen erfordert Feinabstimmung der Kulturbedingungen. Hier präsentieren wir einen magnetischen Ansatz für Zellen Kondensation, ein wesentlicher Schritt Chondrogenese zu initiieren. Darüber hinaus zeigen wir, dass dynamische Reifung in einem Bioreaktor mechanische Stimulation auf die Zellkonstrukte und verbessert knorpelige extrazelluläre Matrixproduktion gilt.

3D Magnetic Stem Cell Aggregation und Bioreactor Ausreifung für Knorpelregeneration

Cartilage engineering remains a challenge due to the difficulties in creating an in vitro functional implant similar to the native tissue. An approach ...

3d-magnetic-stem-cell-aggregation-bioreactor-maturation-for-cartilage

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

9.7K Aufrufe.  UMR 7057 CNRS and University Paris Diderot.  Chondrogenese aus Stammzellen erfordert Feinabstimmung der Kulturbedingungen. Hier präsentieren wir einen magnetischen Ansatz für Zellen Kondensation, ein wesentlicher Schritt Chondrogenese zu initiieren. Darüber hinaus zeigen wir, dass dynamische Reifung in einem Bioreaktor mechanische Stimulation auf die Zellkonstrukte und verbessert knorpelige extrazelluläre Matrixproduktion gilt. 

Serie: 3D Magnetic Stem Cell Aggregation and Bioreactor Maturation for Cartilage Regeneration

Use of Human Perivascular Stem Cells for Bone Regeneration

Human perivascular stem cells (PSCs) can be isolated in sufficient numbers from multiple tissues for purposes of skeletal tissue engineering1-3. PSCs are a FACS-sorted population of 'pericytes' (CD146+CD34-CD45-) and 'adventitial cells' (CD146-CD34+CD45-), each of which we have previously reported to have properties of mesenchymal stem cells. PSCs, like MSCs, are able to undergo osteogenic differentiation, as well as secrete pro-osteogenic cytokines1,2. In the present protocol, we demonstrate the osteogenicity of PSCs in several animal models including a muscle pouch implantation in SCID (severe combined immunodeficient) mice, a SCID mouse calvarial defect and a femoral segmental defect (FSD) in athymic rats. The thigh muscle pouch model is used to assess ectopic bone formation. Calvarial defects are centered on the parietal bone and are standardly 4 mm in diameter (critically sized)8. FSDs are bicortical and are stabilized with a polyethylene bar and K-wires4. The FSD described is also a critical size defect, which does not significantly heal on its own4. In contrast, if stem cells or growth factors are added to the defect site, significant bone regeneration can be appreciated. The overall goal of PSC xenografting is to demonstrate the osteogenic capability of this cell type in both ectopic and orthotopic bone regeneration models.

Human perivascular stem cells (PSCs) are a novel stem cell class for skeletal tissue regeneration similar to mesenchymal stem cells (MSCs). PSCs can be isolated by FACS (fluorescence activated cell sorting) from adipose tissue procured during standard liposuction procedures, then combined with an osteoinductive scaffold to achieve bone formation in vivo.

Verwenden Sie für Menschenrechte Perivaskuläre Stammzellen für die Knochenregeneration

Human perivascular stem cells (PSCs) can be isolated in sufficient numbers from multiple tissues for purposes of skeletal tissue engineering1-3. PSCs are ...

Forschung

Biotechnik

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells (hESC) to Different Lineages

Human embryonic stem cells (hESC) are emerging as an attractive alternative source for cell replacement therapy since they can be expanded in culture indefinitely and differentiated to any cell types in the body. Various types of biomaterials have also been used in stem cell cultures to provide a microenvironment mimicking the stem cell niche1-3. The latter is important for promoting cell-to-cell interaction, cell proliferation, and differentiation into specific lineages as well as tissue organization by providing a three-dimensional (3D) environment4 such as encapsulation. The principle of cell encapsulation involves entrapment of living cells within the confines of semi-permeable membranes in 3D cultures2. These membranes allow for the exchange of nutrients, oxygen and stimuli across the membranes, whereas antibodies and immune cells from the host that are larger than the capsule pore size are excluded5. Here, we present an approach to culture and differentiate hESC DA neurons in a 3D microenvironment using alginate microcapsules. We have modified the culture conditions2 to enhance the viability of encapsulated hESC. We have previously shown that the addition of p160-Rho-associated coiled-coil kinase (ROCK) inhibitor, Y-27632 and human fetal fibroblast-conditioned serum replacement medium (hFF-CM) to the 3D platform significantly enhanced the viability of encapsulated hESC in which the cells expressed definitive endoderm marker genes1. We have now used this 3D platform for the propagation of hESC and efficient differentiation to DA neurons. Protein and gene expression analyses after the final stage of DA neuronal differentiation showed an increased expression of tyrosine hydroxylase (TH), a marker for DA neurons, &gt;100 folds after 2 weeks. We hypothesized that our 3D platform using alginate microcapsules may be useful to study the proliferation and directed differentiation of hESC to various lineages. This 3D system also allows the separation of feeder cells from hESC during the process of differentiation and also has potential for immune-isolation during transplantation in the future.

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells hESC to Different Lineages

We have optimized a microencapsulation technique as an effective 3D platform for propagation and differentiation of embryonic stem cells to endoderm and dopaminergic (DA) neurons. It also provides an opportunity for immune-isolation of cells from the host during transplantation. This platform can be adapted for other cell types.

Alginat-Mikrokapseln als 3D-Plattform für die Vermehrung und Differenzierung von humanen embryonalen Stammzellen (hES) auf verschiedenen Linien

Human embryonic stem cells (hESC) are emerging as an attractive alternative source for cell replacement therapy since they can be expanded in culture ...

Preparation of 3D Fibrin Scaffolds for Stem Cell Culture Applications

Stem cells are found in naturally occurring 3D microenvironments in vivo, which are often referred to as the stem cell niche 1. Culturing stem cells inside of 3D biomaterial scaffolds provides a way to accurately mimic these microenvironments, providing an advantage over traditional 2D culture methods using polystyrene as well as a method for engineering replacement tissues 2. While 2D tissue culture polystrene has been used for the majority of cell culture experiments, 3D biomaterial scaffolds can more closely replicate the microenvironments found in vivo by enabling more accurate establishment of cell polarity in the environment and possessing biochemical and mechanical properties similar to soft tissue.3 A variety of naturally derived and synthetic biomaterial scaffolds have been investigated as 3D environments for supporting stem cell growth. While synthetic scaffolds can be synthesized to have a greater range of mechanical and chemical properties and often have greater reproducibility, natural biomaterials are often composed of proteins and polysaccharides found in the extracelluar matrix and as a result contain binding sites for cell adhesion and readily support cell culture. Fibrin scaffolds, produced by polymerizing the protein fibrinogen obtained from plasma, have been widely investigated for a variety of tissue engineering applications both in vitro and in vivo 4. Such scaffolds can be modified using a variety of methods to incorporate controlled release systems for delivering therapeutic factors 5. Previous work has shown that such scaffolds can be used to successfully culture embryonic stem cells and this scaffold-based culture system can be used to screen the effects of various growth factors on the differentiation of the stem cells seeded inside 6,7.
 This protocol details the process of polymerizing fibrin scaffolds from fibrinogen solutions using the enzymatic activity of thrombin. The process takes 2 days to complete, including an overnight dialysis step for the fibrinogen solution to remove citrates that inhibit polymerization. These detailed methods rely on fibrinogen concentrations determined to be optimal for embryonic and induced pluripotent stem cell culture. Other groups have further investigated fibrin scaffolds for a wide range of cell types and applications - demonstrating the versatility of this approach 8-12.

This work details the preparation of 3D fibrin scaffolds for culturing and differentiating plutipotent stem cells. Such scaffolds can be used to screen the effects of various biological compounds on stem cell behavior as well as modified to contain drug delivery systems.

Erstellung von 3D-Fibrin-Gerüste für Stem Cell Culture Anwendungen

Stem cells are found in naturally occurring 3D microenvironments in vivo, which are often referred to as the stem cell niche 1. Culturing stem cells ...

Nonhuman Primate Lung Decellularization and Recellularization Using a Specialized Large-organ Bioreactor

There are an insufficient number of lungs available to meet current and future organ transplantation needs. Bioartificial tissue regeneration is an attractive alternative to classic organ transplantation. This technology utilizes an organ&#39;s natural biological extracellular matrix (ECM) as a scaffold onto which autologous or stem/progenitor cells may be seeded and cultured in such a way that facilitates regeneration of the original tissue. The natural ECM is isolated by a process called decellularization. Decellularization is accomplished by treating tissues with a series of detergents, salts, and enzymes to achieve effective removal of cellular material while leaving the ECM intact. Studies conducted utilizing decellularization and subsequent recellularization of rodent lungs demonstrated marginal success in generating pulmonary-like tissue which is capable of gas exchange in vivo. While offering essential proof-of-concept, rodent models are not directly translatable to human use. Nonhuman primates (NHP) offer a more suitable model in which to investigate the use of bioartificial organ production for eventual clinical use.
The protocols for achieving complete decellularization of lungs acquired from the NHP rhesus macaque are presented. The resulting acellular lungs can be seeded with a variety of cells including mesenchymal stem cells and endothelial cells. The manuscript also describes the development of a bioreactor system in which cell-seeded macaque lungs can be cultured under conditions of mechanical stretch and strain provided by negative pressure ventilation as well as pulsatile perfusion through the vasculature; these forces are known to direct differentiation along pulmonary and endothelial lineages, respectively. Representative results of decellularization and cell seeding are provided.

Whole-organ decellularization produces natural biological scaffolds that may be used for regenerative medicine. The description of a nonhuman primate model of lung regeneration in which whole lungs are decellularized and then seeded with adult stem cells and endothelial cells in a bioreactor that facilitates vascular circulation and liquid media ventilation is presented.

There are an insufficient number of lungs available to meet current and future organ transplantation needs. Bioartificial tissue regeneration is an ...

Engineering 3D Cellularized Collagen Gels for Vascular Tissue Regeneration

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. Collagen has been extensively used for a wide range of biomedical applications and is considered a valid alternative to synthetic materials due to its inherent biocompatibility (i.e., low antigenicity, inflammation, and cytotoxic responses). However, the limited mechanical properties and the related low hand-ability of collagen gels have hampered their use as scaffold materials for vascular tissue engineering. Therefore, the rationale behind this work was first to engineer cellularized collagen gels into a tubular-shaped geometry and second to enhance smooth muscle cells driven reorganization of collagen matrix to obtain tissues stiff enough to be handled.
The strategy described here is based on the direct assembling of collagen and smooth muscle cells (construct) in a 3D cylindrical geometry with the use of a molding technique. This process requires a maturation period, during which the constructs are cultured in a bioreactor under static conditions (without applied external dynamic mechanical constraints) for 1 or 2 weeks. The &#8220;static bioreactor&#8221; provides a monitored and controlled sterile environment (pH, temperature, gas exchange, nutrient supply and waste removal) to the constructs. During culture period, thickness measurements were performed to evaluate the cells-driven remodeling of the collagen matrix, and glucose consumption and lactate production rates were measured to monitor the cells metabolic activity. Finally, mechanical and viscoelastic properties were assessed for the resulting tubular constructs. To this end, specific protocols and a focused know-how (manipulation, gripping, working in hydrated environment, and so on) were developed to characterize the engineered tissues.

In this work, we present a technique for the rapid fabrication of living vascular tissues by direct culturing of collagen, smooth muscle cells and endothelial cells. In addition, a new protocol for the mechanical characterization of engineered vascular tissues is described.

Engineering 3D cellularized Kollagengele für Gefäßgeweberegeneration

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. ...

3D Hydrogel Scaffolds for Articular Chondrocyte Culture and Cartilage Generation

Human articular cartilage is highly susceptible to damage and has limited self-repair and regeneration potential. Cell-based strategies to engineer cartilage tissue offer a promising solution to repair articular cartilage. To select the optimal cell source for tissue repair, it is important to develop an appropriate culture platform to systematically examine the biological and biomechanical differences in the tissue-engineered cartilage by different cell sources. Here we applied a three-dimensional (3D) biomimetic hydrogel culture platform to systematically examine cartilage regeneration potential of juvenile, adult, and osteoarthritic (OA) chondrocytes. The 3D biomimetic hydrogel consisted of synthetic component poly(ethylene glycol) and bioactive component chondroitin sulfate, which provides a physiologically relevant microenvironment for in vitro culture of chondrocytes. In addition, the scaffold may be potentially used for cell delivery for cartilage repair in vivo. Cartilage tissue engineered in the scaffold can be evaluated using quantitative gene expression, immunofluorescence staining, biochemical assays, and mechanical testing. Utilizing these outcomes, we were able to characterize the differential regenerative potential of chondrocytes of varying age, both at the gene expression level and in the biochemical and biomechanical properties of the engineered cartilage tissue. The 3D culture model could be applied to investigate the molecular and functional differences among chondrocytes and progenitor cells from different stages of normal or aberrant development.

Cartilage repair represents an unmet medical challenge and cell-based approaches to engineer human articular cartilage are a promising solution. Here, we describe three-dimensional (3D) biomimetic hydrogels as an ideal tool for the expansion and maturation of human articular chondrocytes.

3D-Hydrogel Scaffolds für Articular Chondrozyten-Kultur und Knorpel-Generation

Human articular cartilage is highly susceptible to damage and has limited self-repair and regeneration potential. Cell-based strategies to engineer ...

Using Adhesive Patterning to Construct 3D Paper Microfluidic Devices

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct both planar and nonplanar 3D paper microfluidic devices. By spraying an aerosol adhesive through a metal stencil, the overall amount of adhesive used in assembling paper microfluidic devices can be significantly reduced. We show on a simple 4-layer planar paper microfluidic device that the optimal adhesive application technique and device construction style depends heavily on desired performance characteristics. By moderately increasing the overall area of a device, it is possible to dramatically decrease the wicking time and increase device success rates while also reducing the amount of adhesive required to keep the device together. Such adhesive application also causes the adhesive to form semi-permanent bonds instead of permanent bonds between paper layers, enabling single-use devices to be non-destructively disassembled after use. Nonplanar 3D origami devices also benefit from the semi-permanent bonds during folding, as it reduces the likelihood that unrelated faces may accidently stick together. Like planar devices, nonplanar structures see reduced wicking times with patterned adhesive application vs uniformly applied adhesive.

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct 3D paper microfluidic devices. This method of adhesive application forms semi-permanent bonds between layers, enabling single-use devices to be non-destructively disassembled after use and to ease folding complex nonplanar structures.

Mit Adhesive Patterning 3D Paper Mikrofluidik-Vorrichtungen bauen

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct both planar and nonplanar 3D paper microfluidic devices. By spraying an aerosol ...

Micropatterning and Assembly of 3D Microvessels

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass based substrates, and hydrogel-based tube formation assays. These assays, while informative, do not recapitulate lumen geometry, proper extracellular matrix, and multi-cellular proximity, which play key roles in modulating vascular function. This manuscript describes an injection molding method to generate engineered vessels with diameters on the order of 100 &#181;m. Microvessels are fabricated by seeding endothelial cells in a microfluidic channel embedded within a native type I collagen hydrogel. By incorporating parenchymal cells within the collagen matrix prior to channel formation, specific tissue microenvironments can be modeled and studied. Additional modulations of hydrodynamic properties and media composition allow for control of complex vascular function within the desired microenvironment. This platform allows for the study of perivascular cell recruitment, blood-endothelium interactions, flow response, and tissue-microvascular interactions. Engineered microvessels offer the ability to isolate the influence from individual components of a vascular niche and precisely control its chemical, mechanical, and biological properties to study vascular biology in both health and disease.

This manuscript presents an injection molding method to engineer microvessels that recapitulate physiological properties of endothelium. The microfluidic-based process creates patent 3D vascular networks with tailorable conditions, such as flow, cellular composition, geometry, and biochemical gradients. The fabrication process and examples of potential applications are described.

Mikrostrukturierung und Montage von 3D-Micro-Ader

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass ...

Bioprinting of Cartilage and Skin Tissue Analogs Utilizing a Novel Passive Mixing Unit Technique for Bioink Precellularization

Bioprinting is a powerful technique for the rapid and reproducible fabrication of constructs for tissue engineering applications. In this study, both cartilage and skin analogs were fabricated after bioink pre-cellularization utilizing a novel passive mixing unit technique. This technique was developed with the aim to simplify the steps involved in the mixing of a cell suspension into a highly viscous bioink. The resolution of filaments deposited through bioprinting necessitates the assurance of uniformity in cell distribution prior to printing to avoid the deposition of regions without cells or retention of large cell clumps that can clog the needle. We demonstrate the ability to rapidly blend a cell suspension with a bioink prior to bioprinting of both cartilage and skin analogs. Both tissue analogs could be cultured for up to 4 weeks. Histological analysis demonstrated both cell viability and deposition of tissue specific extracellular matrix (ECM) markers such as glycosaminoglycans (GAGs) and collagen I respectively.

Cartilage and skin analogs were bioprinted using a nanocellulose-alginate based bioink. The bioinks were cellularized prior to printing via a single step passive mixing unit. The constructs were demonstrated to be uniformly cellularized, have high viability, and exhibit favorable markers of differentiation.

Bioprinting von Knorpel und Haut-Gewebe-Analoga nutzen eine neuartige Passive Einheit Mischtechnik für Bioink Precellularization

Bioprinting is a powerful technique for the rapid and reproducible fabrication of constructs for tissue engineering applications. In this study, both ...

Patterning the Geometry of Human Embryonic Stem Cell Colonies on Compliant Substrates to Control Tissue-Level Mechanics

Human embryonic stem cells demonstrate a unique ability to respond to morphogens in vitro by self-organizing patterns of cell fate specification that correspond to primary germ layer formation during embryogenesis. Thus, these cells represent a powerful tool with which to examine the mechanisms that drive early human development. We have developed a method to culture human embryonic stem cells in confined colonies on compliant substrates that provides control over both the geometry of the colonies and their mechanical environment in order to recapitulate the physical parameters that underlie embryogenesis. The key feature of this method is the ability to generate polyacrylamide hydrogels with defined patterns of extracellular matrix ligand at the surface to promote cell attachment. This is achieved by fabricating stencils with the desired geometric patterns, using these stencils to create patterns of extracellular matrix ligand on glass coverslips, and transferring these patterns to polyacrylamide hydrogels during polymerization. This method is also compatible with traction force microscopy, allowing the user to measure and map the distribution of cell-generated forces within the confined colonies. In combination with standard biochemical assays, these measurements can be used to examine the role mechanical cues play in fate specification and morphogenesis during early human development.

Extracellular matrix ligands can be patterned onto polyacrylamide hydrogels to enable the culture of human embryonic stem cells in confined colonies on compliant substrates. This method can be combined with traction force microscopy and biochemical assays to examine the interplay between tissue geometry, cell-generated forces, and fate specification.

Musterung der Geometrie menschlicher embryonaler Stammzellkolonien auf konformen Substraten zur Kontrolle der Gewebe-Level-Mechanik

Human embryonic stem cells demonstrate a unique ability to respond to morphogens in vitro by self-organizing patterns of cell fate specification that ...