Wir möchten, dass bei der Durchführung der Zellsortierung bei der Entwicklung dieses Protokolls V. Kapoor in der CCR ETIB Flow Cytometry Kern für ihre Hilfe zu danken. Wir danken auch M. Raffeld und die CCR LP Molecular Diagnostics Unit und J. Zhu und die NHLBI DNA-Sequenzierung und Genomics Core-für ihre Hilfe in der qPCR bei der Entwicklung dieses Protokolls durchgeführt wird. Diese Forschung wurde von der Intramural Programm des NIH unterstützt.

<ol>
	<li>Feinerman, O., Veiga, J., Dorfman, J. R., Germain, R. N., Altan-Bonnet, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variability+and+Robustness+in+T+Cell+Activation+from+Regulated+Heterogeneity+in+Protein+Levels.">Variability and Robustness in T Cell Activation from Regulated Heterogeneity in Protein Levels.</a> Science. 321 (5892), 1081-1084 (2008).</li><li>Spencer, S. L., Gaudet, S., Albeck, J. G., Burke, J. M., Sorger, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-genetic+origins+of+cell-to-cell+variability+in+TRAIL-induced+apoptosis.">Non-genetic origins of cell-to-cell variability in TRAIL-induced apoptosis.</a> Nature. 459 (7245), 428-432 (2009).</li><li>Geva-Zatorsky, N., Rosenfeld, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oscillations+and+variability+in+the+p53+system.">Oscillations and variability in the p53 system.</a> Mol. Syst. Biol. 2 (1), (2006).</li><li>Colman-Lerner, A., Gordon, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulated+cell-to-cell+variation+in+a+cell-fate+decision+system.">Regulated cell-to-cell variation in a cell-fate decision system.</a> Nature. 437 (7059), 699-706 (2005).</li><li>Chong, S., Chen, C., Ge, H., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+Transcriptional+Bursting+in+Bacteria.">Mechanism of Transcriptional Bursting in Bacteria.</a> Cell. 158 (2), 314-326 (2014).</li><li>Raj, A., Peskin, C. S., Tranchina, D., Vargas, D. Y., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+mRNA+Synthesis+in+Mammalian+Cells.">Stochastic mRNA Synthesis in Mammalian Cells.</a> PLoS Biol. 4 (10), e309+ (2006).</li><li>Senecal, A., Munsky, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+Factors+Modulate+c-Fos+Transcriptional+Bursts.">Transcription Factors Modulate c-Fos Transcriptional Bursts.</a> Cell Rep. 8 (1), 75-83 (2014).</li><li>Dey, S. S., Foley, J. E., Limsirichai, P., Schaffer, D. V., Arkin, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orthogonal+control+of+expression+mean+and+variance+by+epigenetic+features+at+different+genomic+loci.">Orthogonal control of expression mean and variance by epigenetic features at different genomic loci.</a> Mol. Syst. Biol. 11 (5), 806+ (2015).</li><li>Dar, R. D., Razooky, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+burst+frequency+and+burst+size+are+equally+modulated+across+the+human+genome.">Transcriptional burst frequency and burst size are equally modulated across the human genome.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (43), 17454-17459 (2012).</li><li>Thattai, M., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+gene+expression+in+fluctuating+environments.">Stochastic gene expression in fluctuating environments.</a> Genetics. 167 (1), 523-530 (2004).</li><li>Porter, J. R., Fisher, B. E., Batchelor, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p53+Pulses+Diversify+Target+Gene+Expression+Dynamics+in+an+mRNA+Half-Life-Dependent+Manner+and+Delineate+Co-regulated+Target+Gene+Subnetworks.">p53 Pulses Diversify Target Gene Expression Dynamics in an mRNA Half-Life-Dependent Manner and Delineate Co-regulated Target Gene Subnetworks.</a> Cell Syst. 2 (4), 272-282 (2016).</li><li>Lahav, G., Rosenfeld, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+the+p53-Mdm2+feedback+loop+in+individual+cells.">Dynamics of the p53-Mdm2 feedback loop in individual cells.</a> Nat. Genet. 36 (2), 147-150 (2004).</li><li>Levine, A. J., Oren, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+first+30+years+of+p53:+growing+ever+more+complex.">The first 30 years of p53: growing ever more complex.</a> Nat. Rev. Cancer. 9 (10), 749-758 (2009).</li><li>Riley, T., Sontag, E., Chen, P., Levine, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+control+of+human+p53-regulated+genes.">Transcriptional control of human p53-regulated genes.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9 (5), 402-412 (2008).</li><li>Ye, J., Coulouris, G., Zaretskaya, I., Cutcutache, I., Rozen, S., Madden, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primer-BLAST:+A+tool+to+design+target-specific+primers+for+polymerase+chain+reaction.">Primer-BLAST: A tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction.</a> BMC Bioinf. 13 (1), 134 (2012).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> PCR Technologies: A Technical Guide. , (2014).</li><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , (2001).</li><li>Batchelor, E., Mock, C. S., Bhan, I., Loewer, A., Lahav, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recurrent+initiation:+a+mechanism+for+triggering+p53+pulses+in+response+to+DNA+damage.">Recurrent initiation: a mechanism for triggering p53 pulses in response to DNA damage.</a> Mol. Cell. 30 (3), 277-289 (2008).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Flow Cytometry: Principles and Applications. , (2007).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Real-time PCR. , (2006).</li><li>Song, L., Langfelder, P., Horvath, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+co-expression+measures:+mutual+information,+correlation,+and+model+based+indices.">Comparison of co-expression measures: mutual information, correlation, and model based indices.</a> BMC Bioinf. 13 (1), 328 (2012).</li><li>Margolin, A. A., Nemenman, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ARACNE:+An+Algorithm+for+the+Reconstruction+of+Gene+Regulatory+Networks+in+a+Mammalian+Cellular+Context.">ARACNE: An Algorithm for the Reconstruction of Gene Regulatory Networks in a Mammalian Cellular Context.</a> BMC Bioinf. 7 (Suppl 1), (2006).</li><li>Haff, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+quantitative+PCR+using+nested+primers.">Improved quantitative PCR using nested primers.</a> PCR Methods Appl. 3 (6), 332-337 (1994).</li><li>Hashimshony, T., Senderovich, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CEL-Seq2:+sensitive+highly-multiplexed+single-cell+RNA-Seq.">CEL-Seq2: sensitive highly-multiplexed single-cell RNA-Seq.</a> Genome Biol. 17, 77 (2016).</li><li>Ronander, E., Bengtsson, D. C., Joergensen, L., Jensen, A. T. R., Arnot, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Single-cell+Gene+Transcription+by+RNA+Fluorescent++In+Situ+Hybridization+(FISH).">Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization (FISH).</a> J. Vis. Exp. (68), e4073 (2012).</li><li>Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+individual+mRNA+molecules+using+multiple+singly+labeled+probes.">Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes.</a> Nat. Methods. 5 (10), 877-879 (2008).</li><li>Lubeck, E., Cai, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+systems+biology+by+super-resolution+imaging+and+combinatorial+labeling.">Single-cell systems biology by super-resolution imaging and combinatorial labeling.</a> Nat. Methods. 9 (7), 743-748 (2012).</li><li>Battich, N., Stoeger, T., Pelkmans, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image-based+transcriptomics+in+thousands+of+single+human+cells+at+single-molecule+resolution.">Image-based transcriptomics in thousands of single human cells at single-molecule resolution.</a> Nat. Methods. 10 (11), 1127-1133 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Wir haben zur Isolierung von einzelnen Säugerzellen aus einer Population von anhaftenden Zellen in der Kultur und zur Untersuchung der Expression von etwa 96 Gene in jeder Zelle gezüchtet ein Verfahren dargestellt. Gute rechtzeitige Vorbereitung ist entscheidend für diese Methode gut zu funktionieren. Insbesondere Entwerfen und Testen Primerpaare spezifisch für die Transkripte von Interesse (Schritte 1,2-1,3) sind zeitaufwendig, aber wichtige Schritte, wie die Primer, die Qualität der Einzelzellmessungen bestimmen. Sobald zuverlässige Primerpaare erhalten wurden, werden sie verwendet, um cDNA aus den Transkripten von Interesse zu verstärken; die Amplifikate werden miteinander kombiniert dann äquimolar Standards zu machen (Schritt 1.4). Dieser Schritt ist von entscheidender Bedeutung, da die Standards der absoluten Transkript zählt zu schätzen sind erforderlich; Standards sollten einmal, aliquotiert und für alle nachfolgenden Runden der Zellsortierung und Genexpressionsmessungen vorgenommen werden. Ebenfalls am Tag, dass die Zellen sortiert werden, ist es besonders important, die Standards zu verdünnen sorgfältig mit Low-bindenden Pipettenspitzen und Reaktionsgefäße, wenn Platten Lysepuffer machen (Schritte 3.7 und 3.11). Ziel, die Zellsortierer (Schritt 4.2) ist ein weiterer wichtiger Schritt; Dieses muss sehr sorgfältig erfolgen, um für die Zellen, um erfolgreich das Ziel von 9 &amp; mgr; l Lysepuffer in einer PCR-Platte treffen. Es gibt mehrere Modifikationen des Protokolls, das hergestellt werden kann, es zu einer Vielzahl von Forschungsbedarf anzupassen. Hier konzentrieren wir uns auf einem DNA-bindenden Farbstoff-basierte qPCR-Ansatz, der zur Quantifizierung der Genexpression eine relativ kostengünstige Methode zur Verfügung stellt. Jedoch hat dieses Verfahren das Potential für einen hohen Hintergrundsignal, da jede amplifizierte DNA zu schaffen, auch die des off-Zielsequenzen führt zu einem Fluoreszenzsignal. Ein solcher Hintergrund kann , indem sichergestellt wird, daß das Primerpaar ein bestimmtes Ziel zu amplifizieren minimiert werden , um eine Schmelzkurve mit einem einzigen Peak ergibt und ein einzelnes PCR - Produkt mit der richtigen Größe (Abbildung 2). Wenn der Hintergrund noch ein Anliegen ist eine solche Qualitätskontrollverfahren nach der Verwendung, eine sondenbasierte qPCR Ansatz kann verwendet werden, Off-Target-Erkennung zu minimieren, wenn auch zu höheren Kosten von Reagenzien. Eine andere Möglichkeit wäre eine nested PCR Ansatz, in dem ein Satz von Primern in der RTSTA Schritt verwendet wird, um revers transkribieren und eine große Region des Transkripts verstärken und einen zweiten Satz von Primern, die einen kleineren Bereich innerhalb dieses großen Bereich enthalten verstärkt wird verwendet, um die Genexpression durch qPCR zu messen. Dieser Ansatz wurde die Spezifität der DNA - Bindungsfarbstoffbasis qPCR 23 gezeigt , zur Verbesserung. Es sind mehrere Verfahren zur Isolierung einzelner Zellen für die Genexpressionsanalyse zur Verfügung. Die Wahl der Zellisolierungsmethode hängt von mehreren Faktoren ab, einschließlich der Verfügbarkeit von Geräten (wie zB einem fluoreszenzaktivierten Zellsortierer), die Quelle der Zellen (wie etablierte Zelllinien gegenüber Primärzellen aus einem Gewebe) ausgewertet werden, oderdie Geschwindigkeit, mit der die Zellen isoliert werden müssen. In dem Beispiel in diesem Protokoll vorgestellt, verwendeten wir FACS einer Zelllinie, ein klar nachweisbares Fluoreszenz-markiertes Protein exprimiert. FACS hat die Vorteile der seltenen Fähigkeiten Zelldetektion und relativ schnelle Zellisolierung. Eine Herausforderung des Verfahrens besteht darin, daß die Abscheidung der Zellen von Interesse in der erforderlichen kleinen Volumen Lysepuffer in einer 96-Well-PCR-Platte ineffizient sein kann und kann die Optimierung der Zellsortierung Geometrie erfordern eine erfolgreiche Isolierung zu gewährleisten. Alternative Ansätze , die zu einer höheren Präzision in Zellisolierung bei niedrigeren Drehzahlen und / oder höhere Kosten umfassen die Mikropipettiervorrichtung einzelner Zellen, die Laser Mikrodissektion spezifischer Zellen aus einer Tumorprobe oder die Verwendung von mikrofluidischen Systemen (beispielsweise die Fluidigms C1 führen System). Ein großer Vorteil des Protokolls hier beschrieben ist, dass die internen Kontrollen, eine Verdünnungsreihe von gereinigtem PCR-Produkte, e<html> Nable die Abschätzung der absoluten Nummer jedes Transkript in jeder Zelle. Ohne diese Standards können nur relative Niveaus der Genexpression , die aus den C t - Werte abgeleitet , auf Berechnungen beruhen. Doch mit diesen Standards können absolute Transkript zählt geschätzt werden, idealerweise durch Interpolation im Bereich von genau quantifizierte Amplikon Standards (Abbildung 8). Wie bei jedem PCR-basierte Methode der Quantifizierung der Genexpression, genaue absolute Quantifizierung erfordert die Kenntnis der Leistungsfähigkeit jedes Prozesses, einschließlich der reversen Transkription. Eine aktuelle Herausforderung Transkriptspiegel in einzelnen Zellen zu quantifizieren ist , dass die Nachweisgrenze für viele Methoden geschätzt 10-100 mRNAs pro Zelle 24, verhindern , dass die zuverlässige Quantifizierung eines bedeutenden Prozentsatz der Transkriptom zu sein. Als alternativer Ansatz kann man smRNA FISH zu quantifizieren Ziele von besonderem Interesse nutzenass = &quot;xref&quot;&gt; 25, 26, mit sehr wenigen Transkripte einschließlich. Advances in smRNA FISH haben die Anzahl der verschiedenen Transkripte erweitert, die zugleich 27 und die Anzahl der Zellen nachgewiesen werden können, die gleichzeitig 28 profiliert sein kann, die geeignete Ausrüstung gegeben. Obwohl smRNA FISH seine eigenen Grenzen hat (Potential falsch-positive und falsch-negative Transkript Erkennung, Einschränkungen auf nur wenige Zielgene pro Zelle, die Kosten für die Ausrüstung und Reagenzien), kann es eine leistungsfähige Methode zur Verfügung stellen, um Ergebnisse aus einer Ergänzung und Validierung qPCR-basierte Analyse einer Teilmenge von Zielgenen von Interesse.

Einzelne Zellen in einer Population kann zu einem einheitlichen physiologischen Reiz 1, 2, 3, 4 sehr unterschiedliche Reaktionen zeigen. Die genetische Veränderung der Zellen in einer Population eines Mechanismus für diese Vielzahl von Antworten, aber es gibt auch einige nicht-genetischen Faktoren, die die Variabilität von Antworten erhöhen können, selbst in einer klonalen Population von Zellen. Zum Beispiel können die Ebenen der einzelnen Proteine ​​und andere wichtige Signalmoleküle variieren auf einer Zelle-für-Zelle-Basis, was zu geben Variation in nachgeschalteten Genexpressionsprofilen. Zusätzlich können kurzzeitige Bursts von Transkripten 5 treten Genaktivierung in 6, der 7 auf eine relativ kleine Anzahl von Transkripten pro Burst begrenzt sein kann, 8, 9. Eine solchestochasticity in Genaktivierung kann stark von Schwankungen der biologischen Reaktionen beitragen und einen selektiven Vorteil in Mikroorganismen 10 und in Säugetierzellen 1, 2 reagiert auf einen physiologischen Reiz bieten kann. Aufgrund beiden genetischen und nicht-genetischen Variationsquellen kann das Genexpressionsprofil eines beliebigen gegebenen Zelle in Reaktion auf einen Reiz deutlich vom Durchschnitt Genexpressionsprofil unterscheiden sich von der Messung der Massenantwort erhalten. Das Ausmaß, in dem einzelne Zellen Variabilität in Reaktion auf einen Reiz zeigen, erfordert Techniken zur Isolierung von einzelnen Zellen, die Messung der Expressionsspiegel für Transkripte von Interesse, und die Computeranalyse der resultierenden Expressionsdaten. Es gibt mehrere Ansätze zur Untersuchung der Genexpression in einzelnen Zellen, eine breite Palette von Kosten abdeckt, die Anzahl der Transkripte sondiert, undGenauigkeit der Quantifizierung. So bietet zum Beispiel Single-Cell-RNA-Seq eine große Tiefe transcript Abdeckung und der Möglichkeit, Tausende von verschiedenen Transkripte für den am höchsten exprimierten Gene in einzelnen Zellen zu quantifizieren; jedoch verbunden sind die Kosten, die mit solchen Sequenzierungstiefe kann unerschwinglich sein, auch wenn die Kosten weiter sinken. Im Gegensatz dazu bietet Einzelmolekül RNA Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH smRNA) genaue Quantifizierung von Transkripten für sogar Low-Expression von Genen zu vernünftigen Kosten pro Gen von Interesse; jedoch nur eine geringe Anzahl von Zielgenen können durch diese Vorgehensweise in einer gegebenen Zelle untersucht werden. Quantitative PCR-basierten Assays, in diesem Protokoll beschrieben, einen Mittelweg zwischen diesen Techniken bereitzustellen. Diese Assays verwenden eine mikrofluidische Echtzeit-PCR-Maschine zu einem Zeitpunkt, zu 96 Transkripte von Interesse zu quantifizieren bis in bis zu 96 Zellen. Während jedes der vorgenannten Verfahren erforderliche Hardwarekosten hat, sind die Kosten eines einzelnen qPCR Assay relativniedrig. Dieses Protokoll wird von einem durch den Hersteller eines mikrofluidischen Echtzeit-PCR-Maschine (Protokoll ADP 41, Fluidigm) vorgeschlagen angepasst. Um die Abschätzung der absoluten Nummer jedes Transkript in einem PCR-basierten Ansatz zu ermöglichen, haben wir das Protokoll erweitert, um die Verwendung von internen Kontrollen vorbereiteter Zielgen Amplikons machen, die über mehrere Experimente verwendet werden kann. Als ein Beispiel für diese Technik ist 11 beschrieben die Quantifizierung der Expression von Genen durch den Tumorsuppressor p53 in menschlichen MCF-7 - Brustkarzinomzellen reguliert. Die Zellen werden mit einem chemischen Mittel in Frage gestellt, die DNA-Doppelstrangbrüche induziert. Frühere Studien haben gezeigt , dass die p53 - Antwort auf DNA - Doppelstrangbrüchen eine große Heterogenität in einzelnen Zellen aufweist, sowohl in Bezug auf p53 Ebenen 12 und bei der Aktivierung verschiedener Zielgene 11. Darüber hinaus reguliert p53 die Expression von mehr als 100gut charakterisierten Zielgene in zahlreichen Downstream Wegen beteiligt, einschließlich Zellzyklusarrest, Apoptose und Seneszenz 13, 14. Da die p53-vermittelte Reaktion in jeder Zelle sowohl komplex und variabel ist, kann die Analyse des Systems profitiert von einem Ansatz, bei dem nahezu 100 Zielgene gleichzeitig in einzelnen Zellen werden untersucht, wie das unten beschrieben wird. Mit leichten Modifikationen (wie alternative Verfahren zur Einzelzellisolierung und Lyse), kann das Protokoll leicht ein breites Spektrum von Säugerzelltypen, Protokolle und zelluläre Antworten zu untersuchen angepasst werden. Mit der richtigen rechtzeitige Vorbereitung kann eine Runde der Zellsortierung und Genexpressionsmessung durchgeführt werden, gemäß diesem Protokoll über einen Zeitraum von drei Tagen. Das folgende Zeit wird vorgeschlagen: im Voraus, die Transkripte von Interesse auswählen, zu identifizieren und die Primerpaare zu validieren, die die cDNA von jenen transcr verstärkenIPTS und bereite die Standards und Zündmittelmischungen diese Primer verwendet. Am Tag 1 nach Zellbehandlung, Ernte und sortieren Sie die Zellen, führen die reverse Transkription und spezifische Ziel-Amplifikation und Behandlung der Proben mit einer Exonuklease unincorporated Primer zu entfernen. Am Tag 2, führen an der sortierten Zellen Qualitätskontrolle mit qPCR. Schließlich, am Tag 3, messen die Genexpression in den sortierten Zellen mikrofluidischen qPCR verwendet wird. In Abbildung 1 sind die Schritte beteiligt.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="988">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:488px;">RNeasy Plus Mini Kit</td>
			<td style="width:187px;">Qiagen</td>
			<td style="width:147px;">74134</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit with RNase Inhibitor</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>4374966</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Phusion High-Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0530S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">QIAquick Gel Extraction Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Quant-iT High-Sensitivity dsDNA Assay Kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Q33120&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">2.0-mL low adhesion microcentrifuge tubes</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1420-2600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DNA Suspension Buffer</td>
			<td>Teknova</td>
			<td>T0221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Axygen 0.2-mL Maxymum Recovery Thin Wall PCR Tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>PCR-02-L-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GE 96.96 Dynamic Array DNA Binding Dye Sample &#38; Assay Loading Reagent Kit</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>100-3415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HyClone RPMI 1640 media</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>SH30027.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fetal Bovine Serum, Certified (US)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>16000-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Antibiotic-Antimycotic Solution</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-004-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Neocarzinostatin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N9162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ELIMINase</td>
			<td>Decon Labs</td>
			<td>1101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SUPERase-In</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM2696</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CellsDirect One-Step qRT-PCR Kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11753500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">E. coli DNA</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>14380 10 MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ThermalSeal Sealing Film, Sterile</td>
			<td>Excel Scientific</td>
			<td>STR-THER-PLT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">BD FACSAria IIu</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HyClone Trypsin 0.05%</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>SH30236.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PBS, 1x</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Falcon 40&#181;m Cell Strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Exonuclease I</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0293S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SsoFast EvaGreen Supermix with Low ROX</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>172-5210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">96.96 Dynamic Array IFC for Gene Expression (microfluidic qPCR chip)</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>BMK-M-96.96</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">IFC Controller HX (loading machine)</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">BioMark or BioMark HD (microfluidic qPCR machine)</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Real-Time PCR Analysis software&#160;</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MATLAB software</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-cell gene expression profiling using facs and qpcr with internal standards

Gene expression measurements from bulk populations of cells can obscure the considerable transcriptomic variation of individual cells within those populations. Single-cell gene expression measurements can help assess the role of noise in gene expression, identify correlations in the expression of pairs of genes, and reveal subpopulations of cells that respond differently to a stimulus. Here, we describe a procedure to measure the expression of up to 96 genes in single mammalian cells isolated from a population growing in tissue culture. Cells are sorted into lysis buffer by fluorescence-activated cell sorting (FACS), and the mRNA species of interest are reverse-transcribed and amplified. Gene expression is then measured using a microfluidic real-time PCR machine, which performs up to 96 qPCR assays on up to 96 samples at a time. We also describe the generation and use of PCR amplicon standards to enable the estimation of the absolute number of each transcript. Compared with other methods of measuring gene expression in single cells, this approach allows for the quantification of more distinct transcripts than RNA FISH at a lower cost than RNA-Seq.

Eine allgemeine Übersicht über das Protokoll ist in Abbildung 1, mit Schritten zur Zellbehandlung, die Isolierung von einzelnen Zellen durch FACS, die Erzeugung gezeigt und Vorverstärkung von cDNA - Bibliotheken aus single-Zelllysaten, die Bestätigung der Einzelzell - cDNA - Bibliotheken in sortierter Wells, und die Messung der Genexpression durch qPCR. In Vorbereitung auf die Analyse Einzelzellisolierung und Genexpression, ist es notwendig, zuerst gültige Oligonukleotid-Primerpaare für jedes Ziel-Gen von Interesse zu identifizieren. Abbildung 2 zeigt zwei Beispiele von Primerqualitätskontrollverfahren. Die Schmelzkurven werden folgende qPCR erzeugt mit dem Primerpaar getestet. Gültige Primer resultieren in einer Schmelzkurve mit einer einzigen Spitze (2A, grüne Kurve). Wenn mehrere Spitzen (2A, blaue Kurve) oder einer Kurve mit einer ausgeprägten Schulter (Figure 2A, sind rote Kurve) vorhanden ist , dieses das Vorhandensein multipler PCR - Produkte zeigt, und die Primer neu gestaltet werden soll. Als zweite Qualitätskontrollverfahren kann Agarose - Gelelektrophorese , um visuell verwendet werden , sicherzustellen , dass eine einzelne Bande mit der richtigen Größe für jedes Primerpaar vorhanden ist , getestet (2B). Mehrere Bands oder Bands der falschen Größe zeigen , dass die Primer nicht gültig sind (2B). Folgende Primer-Validierung und die Erzeugung von Bibliotheken von qPCR-Standards von der korrekten Amplicons können Zellsortierung durchgeführt werden. Ein Beispiel Sortierschema ist in Abbildung 3 dargestellt. Jede sortiert Platte sollte Brunnen umfassen eine Verdünnungsreihe von Amplicon Standards enthält, mit 10, 100, 1.000 oder 10.000 Kopien jedes Ziel-Amplikon. Es wird auch empfohlen, Vertiefungen umfassen, in welche keine Zellen, 10-Zellen oder 100 Zellen sortiert werden, zusätzlich zu den Einzelzellen-Wells.Wegen Unwirtschaftlichkeit Sortierung, ist es oft notwendig, die Vertiefungen der Platte zu identifizieren, in denen einzelne Zellen erfolgreich hinterlegt. Aus diesem Validierungsschritt, nach dem Verfahren für die reverse Transkription und spezifische Zielamplifikation sollte qPCR durchgeführt werden , um die Expression eines Housekeeping - Gen (Figur 4) zu messen. Die Vertiefungen für die Amplicon - Standards (Abbildung 4, schwarze Kurven) soll zeigen , gleichmäßig Amplifikationskurven Abstand. Es sollte auch eine klare Trennung in den Kurven sein , entsprechend den &quot;No-Zelle&quot; Brunnen (Abbildung 4; rote Kurven), &quot;10-cell&quot; Brunnen (Abbildung 4; blaue Kurven) und &quot;100-cell&quot; Brunnen (Abbildung 4 ; lila Kurven). Eine klare Trennung erfolgen sollte auch für die &quot;1-Zelle&quot; Brunnen zur erfolgreichen Zellaufbringeinrichtung entsprechenden (Abbildung 4; grün Amplifikationskurven mit C t - Werten kleiner als die für die nicht-Zell - Kontrollen , sondern größere als die für die 10-Zell - Kontrollen) im Vergleich zu nicht erfolgreichen Zellablage (Abbildung 4; grüne Kurven mit C t - Werte in der Nähe von den für die nicht-Zell - Kontrollen). Sobald Vertiefungen mit einer einzigen Zelllysat identifiziert wurden, cDNA aus den Vertiefungen (möglicherweise von mehreren Platten) können pro Vertiefung mit einem single-Zelllysat zu einem mikrofluidischen Chip qPCR, übertragen werden. Zum Beispiel zeigt 5 eine hypothetische Array , das cDNA aus einzelnen Zellen kombiniert aus verschiedenen drei 96-Well - Platten in einem einzigen neuen Platte für die qPCR - Analyse sortiert. Um die mikrofluidische qPCR Ergebnisse analysieren, die Proben , die wahrscheinlich nicht eine Zelle erhalten haben sollte zuerst entfernt werden, wie sie von vielen fehlenden oder Null Genexpression Messungen (Abbildung 7, Zeilen , die durch Pfeile) oder ungewöhnlich niedrige Housekeeping Genexpression angezeigt. Für jeden Test werden alle Messungen mit Schmelzpeaks, die nicht denen der othe entsprechenr Proben im gleichen Test sollte auch entfernt werden. Nach dem Entfernen von schlechten Proben und Messungen kann die lineare Regression auf, die an die Amplikon Standards entsprechende Messungen durchgeführt werden, um die absolute Zahl jedes Transkript von Interesse in jedem Einzelzellprobe abzuschätzen. 8 zeigt eine Visualisierung dieser Genexpressions Schätzungen, gemessen in Einheiten von × Molekülen reversen Transkriptionseffizienz, wie beeswarm und Violine Parzellen. In diesem Beispiel zeigen unbehandelte Zellen , die ein breites Spektrum von CDKN1A Expressionsniveaus, mit vielen Zellen nicht CDKN1A überhaupt exprimiert und mit anderen , die das Gen in Mengen Spanning zwei Grßenordnungen exprimieren. Nach der Behandlung mit Neokarzinostatin (NCS) für 3 Stunden, zum Ausdruck bringen die meisten Zellen CDKN1A bei viel höheren Ebenen, und die Variabilität verringert sich auf etwa eine einzige Größenordnung. Da die Dauer der Behandlung erhöht, verringert sich die durchschnittliche Höhe der CDKN1A Ausdruck und die Variabilität in<html> Ausdruck erweitert. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/55219/55219fig1.jpg" /> Abbildung 1: Überblick über die Schritte in Einzelzell - Genexpressionsprofilen. Behandelten Zellen werden geerntet und mittels FACS direkt in Lysepuffer sortiert. mRNA-Spezies von Interesse werden revers transkribiert und die sich ergebende cDNA wird durch PCR amplifiziert. Housekeeping Genexpression in jeder Probe wird durch qPCR gemessen, um zu bestimmen, welche Proben tatsächlich eine Zelle empfangen. Bei den Proben dieses Qualitätskontrolltest besteht, die Expression von bis zu 96 Gene mit mikrofluidischen qPCR gemessen. Diese Zahl hat sich von einer früheren Veröffentlichung 11 geändert. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55219/55219fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55219/55219fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> 19 / 55219fig2.jpg &quot;/&gt; Abbildung 2: Beispiel Ergebnisse der Primer - Tests. (A) Schmelzkurven von qPCR. Die blaue Schmelzkurve (TNFRSF10D) hat mehrere Spitzen und die rote Schmelzkurve (TRIM22) hat eine &quot;Schulter&quot;, die in der Nähe der ersten Spitze zu einer zweiten Spitze beträgt. Diese zeigen an, dass die verwendeten Primer in diesen Reaktionen verstärken mehrere Ziele und müssen neu gestaltet werden. Die grüne Schmelzkurve (SCN3B) hat einen einzigen Peak, im Einklang mit den Primern, die ein einziges Ziel zu verstärken. (B) amplifizierte DNA - Lauf auf einem Agarose - Gel. Die Bahnen für SCN3B, TRIM22 und TRPM2 enthalten mehrere Bänder; die Primer verwendet, um diese DNA-Amplikons verstärken mehrere Ziele machen und neu gestaltet werden müssen. Die Spur für TNFRSF10D hat eine einzelne Bande, die mit Primern, die ein einziges Ziel zu verstärken. Es ist erwähnenswert, dass die Primer für SCN3B die Schmelzkurve Test bestehen, aber das Gel Test nicht bestehen, während die für TNFRSF10D das Gel Test bestehen, aber die Schmelzkurve scheiternTest; Diese beiden Methoden der Primer-Validierung sind komplementär. In diesem Beispiel kann man schließen, dass alle vier Primersätze neu gestaltet werden müssen. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55219/55219fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55219/55219fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/55219/55219fig3.jpg" /> Abbildung 3: Platte Karte für Zellsortierung. Diese Platte Karte umfasst 1-Zelle Brunnen (rot), 10- und 100-Zellen-Brunnen (dunkler rot), Standards (grün), und keine Zell Brunnen (weiß). Inklusive zwei Wiederholungen jeder Standard auf jeder Platte trägt dazu bei, Schwankungen der Standards zu kompensieren. 10-Zellen und 100-Zellen-Brunnen Inklusive ist hilfreich als Plausibilitätsprüfung für die Genexpression. Die nicht-Zell-Brunnen dienen als Negativkontrolle. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55219/55219fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55219/55219fig3large.jpg" target="_blank">eine größere Version t anzuzeigen</a>seine Figur. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/55219/55219fig4.jpg" /> Abbildung 4: Beispiel für qPCR Amplifikationskurven von Art Qualitätskontrolle Messung GAPDH Ausdruck. Keine-Zellproben (rot) zeigen einen Hintergrundwert des Ausdrucks. 1-Zellproben (grün) teilen sich in zwei Gruppen, eine mit hoher Expression und eine mit niedriger Expression ähnlich wie die No-Zellproben. Die High-Expression Proben meisten erhalten wahrscheinlich eine reale Zelle während der Sortierung; die Low-Ausdruck Proben meisten tat wahrscheinlich nicht. 10-Zellen (blau) und 100-Zellen (lila) Proben zeigen eine höhere Expression als die 1-Zellproben; die 10-Zellproben sind in der Nähe zu den höchsten exprimierenden 1-Zellproben wegen Art Ineffizienz. Standards (schwarz) gleichmäßig verteilt sind, wie erwartet. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55219/55219fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55219/55219fig4large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> &lt;/ P&gt; <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/55219/55219fig5.jpg" /> Abbildung 5: Beispiel der Probe Mischt Platte Karte. Diese Platte Karte umfasst 1-Zellproben von drei verschiedenen Platten (Reihen AG), gemischt Standards aller drei Platten (H1-H8), no-Zellkontrollen (H9-H10) und no-Template-Kontrollen für qPCR (H11-H12 ). <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55219/55219fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55219/55219fig5large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 6" src="/files/ftp_upload/55219/55219fig6.jpg" /> Abbildung 6: Schematische Darstellung der mikrofluidischen qPCR - Chip mit der Reihenfolge der Beladung (1, 2, 3 ...). Die Kerbe (A1) ist die linke obere Ecke der Platte. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55219/55219fig6large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55219/55219fig6large.jpg" target="_blank">eine größere Version von thi zu sehen</a>Wert. <img alt="7" src="/files/ftp_upload/55219/55219fig7.jpg" /> Abbildung 7: Wärmekarte der qPCR Ergebnisse. Jede Zeile stellt eine 1-Zelle Probe, Standard oder Kontrolle; jede Spalte stellt eine gemessene Transkript. Zeilen mit einer ungewöhnlichen Anzahl von schwarzen Quadraten oder Xs (Pfeile) wahrscheinlich zeigen Proben, die keine tatsächliche Zelle erhalten haben. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55219/55219fig7large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55219/55219fig7large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 8" src="/files/ftp_upload/55219/55219fig8.jpg" /> Abbildung 8: Beeswarm und Violine Plots. In einem beeswarm Grundstück (blaue Punkte), stellt jeder Punkt der Genexpression in einer bestimmten Zelle. In einer Violine Grundstück (grau Form), die Breite der &quot;Violine&quot; stellt die Frequenz der Genexpression measurungen um ein bestimmtes Niveau in der Population der analysierten Zellen. Hellblaue Balken stellen den niedrigsten Standard. Messungen über den blauen Balken sind zwischen den Standards interpoliert, während der Messung in den blauen Balken hochgerechnet werden. Die hier gezeigten Daten sind Messungen der CDKN1A Expression in MCF-7 - Zellen Venus-markiertes p53 behandelt mit Neocarzinostatin (NCS) für die angegebenen Zeiten , um Expression von DNA - Doppelstrangbrüche zu induzieren. Diese Zahl wurde von früheren Veröffentlichung geändert 11. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55219/55219fig8large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55219/55219fig8large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Bedingung </td><td> Temperatur </td><td> Zeit </td></tr><tr><td> Halt </td><td> 50 ° C </td><td> 15 Minuten </td></tr><tr><td> Halt </td><td> 95 ° C </td><td> 2 Minuten </td></tr><tr><td rowspan="2"> 20 Zyklen </td><td> 95 ° C </td><td> 15 Sek </td></tr><tr><td> 60 ° C </td><td> 4 min </td></tr><tr><td> Halt </td><td> 4 ° C </td><td> ∞ </td></tr></tbody></table> Tabelle 1: Die reverse Transkription und spezifische Ziel - Amplifikation (RTSTA) Temperaturwechselprogramm. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Bedingung </td><td> Temperatur </td><td> Zeit </td></tr><tr><td> Halt </td><td> 37 ° C </td><td> 30 Minuten </td></tr><tr><td> Halt </td><td> 80 ° C </td><td> 15 Minuten </td></tr><tr><td> Halt </td><td> 4 ° C </td><td> ∞ </td></tr></tbody></table>Tabelle 2: Exonuclease I - Behandlung (ExoI) Temperaturwechselprogramm. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Komponente </td><td> Volumen / Vertiefung (ul) </td><td> 96 Bände w / 10% overage (ul) </td></tr><tr><td> 2x Reaktionsmischung </td><td> 5.00 </td><td> 528,00 </td></tr><tr><td> Reverse-Transkriptase / Polymerase-Mix </td><td> 0,20 </td><td> 21,12 </td></tr><tr><td> 10x STA Primer Mix </td><td> 1,00 </td><td> 105,60 </td></tr><tr><td> 2,64 U / ul (verdünnt) RNAse-Inhibitor </td><td> 0,02 </td><td> 2.00 </td></tr><tr><td> Nuklease-freies Wasser </td><td> 0,78 </td><td> 82,48 </td></tr><tr><td> Gesamt </td><td> 7.00 </td><td> 739,20 </td></tr></tbody></table>Tabelle 3: Komponenten des Lysepuffers für die Zellen. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Komponente </td><td> Volumen / Vertiefung (ul) </td><td> 96 Bände w / 10% overage (ul) </td></tr><tr><td> Nuklease-freies Wasser </td><td> 2,52 </td><td> 266,00 </td></tr><tr><td> Exonuclease I Reaktionspuffer (10x) </td><td> 0.36 </td><td> 38.00 </td></tr><tr><td> Exonuclease I (20 U / ul) </td><td> 0,72 </td><td> 76.00 </td></tr><tr><td> Gesamt </td><td> 3.60 </td><td> 380,00 </td></tr></tbody></table> Tabelle 4: Komponenten des Exonuklease mischen die verstärkten cDNA - Proben zu behandeln.

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Einzelzell-Genexpressionsprofilierung mithilfe von FACS und qPCR mit internen Standards | Genetik | Video

Single-cell Gene Expression Profiling Using FACS and qPCR with Internal Standards

We describe a method to sort single mammalian cells and to quantify the expression of up to 96 target genes of interest in each cell. This method includes the use of internal qPCR standards to enable the estimation of absolute transcript counts.

Einzellige Genexpressionsprofile mittels FACS und qPCR mit internen Standards

Gene expression measurements from bulk populations of cells can obscure the considerable transcriptomic variation of individual cells within those ...

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16.3K Aufrufe.  National Cancer Institute. We describe a method to sort single mammalian cells and to quantify the expression of up to 96 target genes of interest in each cell. This method includes the use of internal qPCR standards to enable the estimation of absolute transcript counts.

Serie: Single-cell Gene Expression Profiling Using FACS and qPCR with Internal Standards

Parallel Measurement of Circadian Clock Gene Expression and Hormone Secretion in Human Primary Cell Cultures

Circadian clocks are functional in all light-sensitive organisms, allowing for an adaptation to the external world by anticipating daily environmental changes. Considerable progress in our understanding of the tight connection between the circadian clock and most aspects of physiology has been made in the field over the last decade. However, unraveling the molecular basis that underlies the function of the circadian oscillator in humans stays of highest technical challenge. Here, we provide a detailed description of an experimental approach for long-term (2-5 days) bioluminescence recording and outflow medium collection in cultured human primary cells. For this purpose, we have transduced primary cells with a lentiviral luciferase reporter that is under control of a core clock gene promoter, which allows for the parallel assessment of hormone secretion and circadian bioluminescence. Furthermore, we describe the conditions for disrupting the circadian clock in primary human cells by transfecting siRNA targeting CLOCK. Our results on the circadian regulation of insulin secretion by human pancreatic islets, and myokine secretion by human skeletal muscle cells, are presented here to illustrate the application of this methodology. These settings can be used to study the molecular makeup of human peripheral clocks and to analyze their functional impact on primary cells under physiological or pathophysiological conditions.

Here, we describe settings to monitor in parallel circadian bioluminescence and the secretory activity of human islet cells and primary myotubes. For this, we employed lentiviral gene delivery of a luciferase core clock reporter, followed by in vitro synchronization and collection of outflow medium by continuous cell perifusion.

Parallel Messung von Circadian Clock Genexpression und Hormon-Sekretion in primären humanen Zellkulturen

Circadian clocks are functional in all light-sensitive organisms, allowing for an adaptation to the external world by anticipating daily environmental ...

Forschung

Genetik

Perturbations of Circulating miRNAs in Irritable Bowel Syndrome Detected Using a Multiplexed High-throughput Gene Expression Platform

The gene expression platform assay allows for robust and highly reproducible quantification of the expression of up to 800 transcripts (mRNA or miRNAs) in a single reaction. The miRNA assay counts transcripts by directly imaging and digitally counting miRNA molecules that are labeled with color-coded fluorescent barcoded probe sets (a reporter probe and a capture probe). Barcodes are hybridized directly to mature miRNAs that have been elongated by ligating a unique oligonucleotide tag (miRtag) to the 3&#39; end. Reverse transcription and amplification of the transcripts are not required. Reporter probes contain a sequence of six color positions populated using a combination of four fluorescent colors. The four colors over six positions are used to construct a gene-specific color barcode sequence. Post-hybridization processing is automated on a robotic prep station. After hybridization, the excess probes are washed away, and the tripartite structures (capture probe-miRNA-reporter probe) are fixed to a streptavidin-coated slide via the biotin-labeled capture probe. Imaging and barcode counting is done using a digital analyzer. The immobilized barcoded miRNAs are visualized and imaged using a microscope and camera, and the unique barcodes are decoded and counted. Data quality control (QC), normalization, and analysis are facilitated by a custom-designed data processing and analysis software that accompanies the assay software. The assay demonstrates high linearity over a broad range of expression, as well as high sensitivity. Sample and assay preparation does not involve enzymatic reactions, reverse transcription, or amplification; has few steps; and is largely automated, reducing investigator effects and resulting in high consistency and technical reproducibility. Here, we describe the application of this technology to identifying circulating miRNA perturbations in irritable bowel syndrome.

We describe the use of a multiplexed high-throughput gene expression platform that quantitates gene expression by barcoding and counting molecules in biological substrates without the need for amplification. We used the platform to quantitate microRNA (miRNA) expression in whole blood in subjects with and without irritable bowel syndrome.

Störeinflüsse von Zirkulierende miRNAs in Irritable Bowel Syndrome erkannt einen Multiplexed Hochdurchsatz-Gene Expression-Plattform

The gene expression platform assay allows for robust and highly reproducible quantification of the expression of up to 800 transcripts (mRNA or miRNAs) in ...

Single-cell Gene Expression Using Multiplex RT-qPCR to Characterize Heterogeneity of Rare Lymphoid Populations

Gene expression heterogeneity is an interesting feature to investigate in lymphoid populations. Gene expression in these cells varies during cell activation, stress, or stimulation. Single-cell multiplex gene expression enables the simultaneous assessment of tens of genes1,2,3. At the single-cell level, multiplex gene expression determines population heterogeneity4,5. It allows for the distinction of population heterogeneity by determining both the probable mix of diverse precursor stages among mature cells and also the diversity of cell responses to stimuli.
Innate lymphoid cells (ILC) have been recently described as a population of innate effectors of the immune response6,7. In this protocol, cell heterogeneity of the ILC hepatic compartment is investigated during homeostasis.
Currently, the most widely used technique to assess gene expression is RT-qPCR. This method measures gene expression only one gene at a time. Additionally, this method cannot estimate heterogeneity of gene expression, since multiple cells are needed for one test. This leads to the measurement of the average gene expression of the population. When assessing large numbers of genes, RT-qPCR becomes a time-, reagent-, and sample-consuming method. Hence, the trade-offs limit the number of genes or cell populations that can be evaluated, increasing the risk of missing the global picture.
This manuscript describes how single-cell multiplex RT-qPCR can be used to overcome these limitations. This technique has benefited from recent microfluidics technological advances1,2. Reactions occurring in multiplex RT-qPCR chips do not exceed the nanoliter-level. Hence, single-cell gene expression, as well as simultaneous multiple gene expression, can be performed in a reagent-, sample-, and cost-effective manner. It is possible to test cell gene signature heterogeneity at the clonal level between cell subsets within a population at different developmental stages or under different conditions4,5. Working on rare populations with large numbers of conditions at the single-cell level is no longer a restriction.

This protocol describes how to assess the expression of a large array of genes at the clonal level. Single-cell RT-qPCR produces highly reliable results with a strong sensitivity for hundreds of samples and genes.

Einzellige Gene Expression Mit Multiplex-RT-qPCR zum Charakterisieren Heterogene Rare Lymphatische Populations

Gene expression heterogeneity is an interesting feature to investigate in lymphoid populations. Gene expression in these cells varies during cell ...

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and microbial populations. Traditional methods for assessing genetic heterogeneity have been limited by low resolution, low sensitivity, and/or low specificity. Single cell sequencing has emerged as a powerful tool for detecting genetic heterogeneity with high resolution, high sensitivity and, when appropriately analyzed, high specificity. Here we provide a protocol for the isolation, whole genome amplification, sequencing, and analysis of single cells. Our approach allows for the reliable identification of megabase-scale copy number variants in single cells. However, aspects of this protocol can also be applied to investigate other types of genetic alterations in single cells.

Single cell sequencing is an increasingly popular and accessible tool for addressing genomic changes at high resolution. We provide a protocol that uses single cell sequencing to identify copy number alterations in single cells.

Der Nachweis von Copy Number Änderungen Single Cell-Sequenzierung

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Detection of microRNA Expression in Peritoneal Membrane of Rats Using Quantitative Real-time PCR

MicroRNAs (miRNAs) are small noncoding RNAs that regulate messenger RNA expression post-transcriptionally. The miRNA expression profile has been investigated in various organs and tissues in rat. However, standard methods for the purification of miRNAs and detection of their expression in rat peritoneal membrane have not been well established. We have developed an effective and reliable method to purify and quantify miRNAs using quantitative real-time reverse-transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR) in rat peritoneal membrane. This protocol consists of four steps: 1) purification of peritoneal membrane sample; 2) purification of total RNA including miRNA from peritoneal membrane sample; 3) reverse transcription of miRNA to produce cDNA; and 4) qRT-PCR to detect miRNA expression. Using this protocol, we successfully determined that the expression of six miRNAs (miRNA-142-3p, miRNA-21-5p, miRNA-221-3p, miRNA-223-3p, miRNA-327, and miRNA-34a-5p) increased significantly in the peritoneal membrane of a rat peritoneal fibrosis model compared with those in control groups. This protocol can be used to study the profile of miRNA expression in the peritoneal membrane of rats in many pathological conditions.

Here we present a protocol for the detection of microRNA expression in rat peritoneal membrane using quantitative real-time reverse-transcription polymerase chain reaction. This method is suitable for studying the microRNA expression profile in rat peritoneal membrane in several pathological conditions.

Nachweis der microRNA-Expression in der peritonealen Membran von Ratten unter Verwendung der quantitativen Echtzeit-PCR

MicroRNAs (miRNAs) are small noncoding RNAs that regulate messenger RNA expression post-transcriptionally. The miRNA expression profile has been ...

Studying Cell Cycle-regulated Gene Expression by Two Complementary Cell Synchronization Protocols

The gene expression program of the cell cycle represents a critical step for understanding cell cycle-dependent processes and their role in diseases such as cancer. Cell cycle-regulated gene expression analysis depends on cell synchronization into specific phases. Here we describe a method utilizing two complementary synchronization protocols that is commonly used for studying periodic variation of gene expression during the cell cycle. Both procedures are based on transiently blocking the cell cycle in one defined point. The synchronization protocol by hydroxyurea (HU) treatment leads to cellular arrest in late G1/early S phase, and release from HU-mediated arrest provides a cellular population uniformly progressing through S and G2/M. The synchronization protocol by thymidine and nocodazole (Thy-Noc) treatment blocks cells in early mitosis, and release from Thy-Noc mediated arrest provides a synchronized cellular population suitable for G1 phase and S phase-entry studies. Application of both procedures requires monitoring of the cell cycle distribution profiles, which is typically performed after propidium iodide (PI) staining of the cells and flow cytometry-mediated analysis of DNA content. We show that the combined use of two synchronization protocols is a robust approach to clearly determine the transcriptional profiles of genes that are differentially regulated in the cell cycle (i.e. E2F1 and E2F7), and consequently to have a better understanding of their role in cell cycle processes. Furthermore, we show that this approach is useful for the study of mechanisms underlying drug-based therapies (i.e. mitomycin C, an anticancer agent), because it allows to discriminate genes that are responsive to the genotoxic agent from those solely affected by cell cycle perturbations imposed by the agent.

We report two cell synchronization protocols that provide a context for studying events related to specific phases of the cell cycle. We show that this approach is useful for analyzing the regulation of specific genes in an unperturbed cell cycle or upon exposure to agents affecting the cell cycle.

Das Studium der Zellzyklus-regulierten Genexpression durch zwei komplementäre Zellsynchronisationsprotokolle

The gene expression program of the cell cycle represents a critical step for understanding cell cycle-dependent processes and their role in diseases such ...

Sample Preparation and Analysis of RNASeq-based Gene Expression Data from Zebrafish

The analysis of global gene expression changes is a valuable tool for identifying novel pathways underlying observed phenotypes. The zebrafish is an excellent model for rapid assessment of whole transcriptome from whole animal or individual cell populations due to the ease of isolation of RNA from large numbers of animals. Here a protocol for global gene expression analysis in zebrafish embryos using RNA sequencing (RNASeq) is presented. We describe preparation of RNA from whole embryos or from cell populations obtained using cell sorting in transgenic animals. We also describe an approach for analysis of RNASeq data to identify enriched pathways and Gene Ontology (GO) terms in global gene expression data sets. Finally, we provide a protocol for validation of gene expression changes using quantitative reverse transcriptase PCR (qRT-PCR). These protocols can be used for comparative analysis of control and experimental sets of zebrafish to identify novel gene expression changes, and provide molecular insight into phenotypes of interest.

This protocol presents an approach for whole transcriptome analysis from zebrafish embryos, larvae, or sorted cells. We include isolation of RNA, pathway analysis of RNASeq data, and qRT-PCR-based validation of gene expression changes.

Probenvorbereitung und Analyse der RNASeq-basierte Genexpressionsdaten von Zebrafisch

The analysis of global gene expression changes is a valuable tool for identifying novel pathways underlying observed phenotypes. The zebrafish is an ...

Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

Typical methods for the elucidation of the function of a particular gene involve comparative phenotypic analyses of the wild-type strain and a strain in which the gene of interest has been disrupted. A gene-disruption DNA construct containing a suitable antibiotic resistance marker gene is useful for the generation of gene-disrupted strains in bacteria. However, conventional construction methods, which require gene cloning steps, involve complex and time-consuming protocols. Here, a relatively facile, rapid, and cost-effective method for targeted gene disruption in Streptococcus mutans is described. The method utilizes a 2-step fusion polymerase chain reaction (PCR) to generate the disruption construct and electroporation for genetic transformation. This method does not require an enzymatic reaction, other than PCR, and additionally offers greater flexibility in terms of the design of the disruption construct. Employment of electroporation facilitates the preparation of competent cells and improves the transformation efficiency. The present method may be adapted for the generation of gene-disrupted strains of various species.

Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

We describe a facile, rapid, and relatively inexpensive method for the generation of gene-disrupted Streptococcus mutans strains; this technique may be adapted for the generation of gene-disrupted strains of various species.

Generation von einem Gen gestört Streptococcus Mutans Belastung ohne Gene Klonen

Typical methods for the elucidation of the function of a particular gene involve comparative phenotypic analyses of the wild-type strain and a strain in ...

Measuring Gene Expression in Bombarded Barley Aleurone Layers with Increased Throughput

The aleurone layer of barley grains is an important model system for hormone-regulated gene expression in plants. In aleurone cells, genes required for germination or early seedling development are activated by gibberellin (GA), while genes associated with stress responses are activated by abscisic acid (ABA). The mechanisms of GA and ABA signaling can be interrogated by introducing reporter gene constructs into aleurone cells via particle bombardment, with the resulting transient expression measured using enzyme assays. An improved protocol is reported that partially automates and streamlines the grain homogenization step and the enzyme assays, allowing significantly more throughput than existing methods. Homogenization of the grain samples is carried out using an automated tissue homogenizer, and GUS (&#946;-glucuronidase) assays are carried out using a 96-well plate system. Representative results using the protocol suggest that phospholipase D activity may play an important role in the activation of HVA1 gene expression by ABA, through the transcription factor TaABF1.

An improved protocol is presented for the measurement of transient gene expression from reporter constructs in barley aleurone cells after particle bombardment. The combination of automated grain grinding with 96-well plate enzyme assays provides high throughput for the procedure.

Messung der Genexpression in bombardierten Gerste Aleuronschicht Schichten mit erhöhter Durchsatz

The aleurone layer of barley grains is an important model system for hormone-regulated gene expression in plants. In aleurone cells, genes required for ...

Metabolic Labeling and Profiling of Transfer RNAs Using Macroarrays

Transfer RNAs (tRNA) are abundant short non-coding RNA species that are typically 76 to 90 nucleotides in length. tRNAs are directly responsible for protein synthesis by translating codons in mRNA into amino acid sequences. tRNAs were long considered as house-keeping molecules that lacked regulatory functions. However, a growing body of evidence indicates that cellular tRNA levels fluctuate in correspondence to varying conditions such as cell type, environment, and stress. The fluctuation of tRNA expression directly influences gene translation, favoring or repressing the expression of particular proteins. Ultimately comprehending the dynamic of protein synthesis requires the development of methods able to deliver high-quality tRNA profiles. The method that we present here is named SPOt, which stands for Streamlined Platform for Observing tRNA. SPOt consists of three steps starting with metabolic labeling of cell cultures with radioactive orthophosphate, followed by guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction of radioactive total RNAs and finally hybridization on in-house printed macroarrays. tRNA levels are estimated by quantifying the radioactivity intensities at each probe spot. In the protocol presented here we profile tRNAs in Mycobacterium smegmatis mc2155, a nonpathogenic bacterium often used as a model organism to study tuberculosis.

We describe an original transfer RNA analysis platform named SPOt (Streamlined Platform for Observing tRNA). SPOt simultaneously measures cellular levels of all tRNAs in biological samples, in only three steps, and in less than 24 hours.

Metabolische Etikettier- und Profilierung des Transfer-RNAs mit Macroarrays

Transfer RNAs (tRNA) are abundant short non-coding RNA species that are typically 76 to 90 nucleotides in length. tRNAs are directly responsible for ...